专利名称：：隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用。
背景技术：
：自身免疫性疾病本质是免疫机制介导的病理过程，即免疫系统对自身组织造成损害。这种疾病改变可为全身性，也可发生为局部。如类风湿性关节炎UA)是一种以关节组织慢性炎症病变为主要表现的全身性疾病，系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明的自身免疫病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)是以患者自身的血小板为免疫原的自身免疫病。其他自身免疫性疾病还包括自身免疫性溶血性贫血、肺肾综合征、器官特异性重症肌无力、多发性硬化症、曱状腺功能亢进症、胰岛素依赖性糖尿病等等。自身免疫性疾病的治疗包括采用糖皮质激素治疗，或采用环磷酰胺、环孢霉素A等免疫抑制剂治疗，也有采用免疫调节剂骁悉，通过抑制核苷S臾合成而控制淋巴细胞增殖来治疗如系统性红斑狼疮的报导。在采用前述药物治疗的同时，由于患者机体免疫力下降，同时须合理的防治感染。通过这些治疗，部分患者得到治愈或緩解。而另外的部分患者最终死于感染和肾功能衰竭。中药丹参是唇形科鼠尾草属的多年生草本植物丹参(salvianiltiorrhizaB皿ge)的干燥根及根茎。丹参作为一传统中药在我国沿用已久，具有祛瘀止痛、活血通经、清经除烦的功效，主治冠心病、心绞痛、心烦不眠、月经不调、经闭痛经等症。关于丹参化学成份的研究陆续有报导。在脂溶性成份中，邻醌型丹参酮类二萜化合物在丹参中含量较高，主要有-丹参酮丄、丹参酮IIA、IIB、隐丹参酮等。隐丹参酮(cryptotanshinone)的分子式为C:9H2。03，结构式为他他化学名邻二氮杂菲[l，2-b]呋喃-10,ll-二酮系橙色针状结晶，熔点183~185°C,不溶于水，比iM[a]D21_91.4°(氯仿)。其紫外吸收峰(腿)(乙醇溶液)为221,263，272，290，355，447;红外吸收光谱ro-H,c=o(KBr)(厘米—)1680,1648。丹参酮类化合物的药理作用，据报导，有抗肿瘤作用、抗氧化作用、心血管药理作用(包括抗动脉粥样石更化、缩小心月/L梗死面积、降^氐心月几4毛氧量、抗心律失常、对心肌保护、对出血性休克再灌注f损伤的保护、对神经细胞保护作用等)，此外还有抗菌抑菌作用和性激素样的活性作用。而隐丹参酮在抗菌作用上是最强的，且主要针对的为革兰阳性细菌。迄今为止，未见隐丹参酮在制备自身免疫性疾病药物中的应用的报道。
发明内容本发明的目的就是为了提供隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药物中的应用。进一步地，本发明提供隐丹参酮在制备类风湿性关节炎药物中的应用。本发明还将提供隐丹参酮的相关制剂。本发明是这样实现的。隐丹参酮是邻二薛酮类化合物，从丹参中已分离出隐丹参酮，另外，从唇形科鼠尾草属(salvia)植物中可能分离得到。另外，从RosmarinusofficinalisL中已分离得到。我们在临床观察中发现隐丹参酮对于自身免疫性疾病患者如类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)患者的治疗有效；进一步的深入乂见察发现隐丹参酮对系统性红斑狼瘙(SLE)患者和特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者也有效。进一步研究，我们用大鼠足跖皮内注射弗氏完全佐剂(FCA)0.lml诱发大鼠佐剂性关节炎(AA)模型，以隐丹参酮作为治疗用药，白芍总苷为阳性对照药。观察动物的体重变化情况；足容积法测量继发侧足爪肿胀度并进行多发性关节炎评分；测定大鼠胸腺、脾重量；小鼠胸腺细胞增殖法测白细胞介素1，2(IL-1，IL-2)活性；MTT法检测C0nA诱导的胸腺T细胞、LPS诱导的脾B淋巴细胞的增殖反应；吞噬法检测巨噬细胞的吞噬功能。结果隐丹参酮可明显减轻AA大鼠的足胂胀度，抑制AA大鼠全身继发性关节病变；对AA大鼠低下的T淋巴细胞增殖反应无明显恢复作用，给药后能有效P争低AA大鼠过度升高的的IL-1水平；对于AA大鼠关节表现的滑膜组织增厚、充血、水肿，排列不规则、有大量炎性细胞浸润和血管翳形成等病理变化，各用药组均有不同程度的减轻。结论表明隐丹参酮对大鼠佐剂性关节炎具有治^f作用，可能主要是通过调节AA大鼠的免疫功能，降低AA大鼠体内的IL-1水平而实现的。隐丹参酮具有脂溶性而不溶于水，采用通常的口服剂型存在溶出度低、生物利用度低的缺点。本发明采用羟丙基-(3-环糊精(HPCD)或(3-环糊精(P-CD)作为包合剂制备隐丹隐酮包合物、或采用PVP(聚乙烯吡咯酮)或PEG(聚乙二醇4000)作为固体M剂，在制备成包合物或M体后，进一步添加常规辅料制成口服制剂。本发明也可以将隐丹参酮制成金属盐的配位体，如通过与金属离子Fe3+、Z,制成配位体后，进一步制成口服剂型。也可以采用添加增溶剂制成以水为溶剂的注射液、或采用有机溶剂按常规方法制成注射液(如丙二醇作溶剂)。本发明的隐丹参酮也可以与目前常用的制剂辅料，按照常规的制剂方法制成口服或注射剂型或局部外用制剂。本发明的隐丹参酮的使用剂量为5~80mg'kg—i(毫升每千克体重)口服注射剂量降低一半。本发明的隐丹参酮不能与环磷酰胺制成复方制剂，因动物实验表明，其可能会促进恶性肿瘤的转移。以下具体实施方法是对本发明的进一步说明，决非对本发明的任何限制。具体实施方式实施例1隐丹参酮的提取、精制将丹参药材粉碎后，称重，置于圆底烧瓶中，加520倍量的95%(体积百分比)工业乙醇，回流提取2次，每次2小时，浓缩，母液通过氧化铝制备柱，得到三个主要色带，上层为丹参酮IIB(TanshinoneIIB)，粗品中层为隐丹参酮粗品，下层为丹参酮IIA((TanshinoneIIA)粗品；切开制备柱后，取中层，用乙醇洗脱，再用氧化铝柱精制，即得隐丹参酮精制品。实施例2隐丹参酮(Cryptotanshin。ne，CT)对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用试验。l.l大鼠AA模型诱导'参照徐叔云主编《药理实验方法学》的文献方法，将卡介苗(BCG)80°C、lh灭活后，以高压灭菌的液体石蜡配成10mg/ml的乳剂，充分研磨、混匀，即得弗氏完全佐剂(FCA)，于每只大鼠左后足跖皮内注射FCA0.lml致炎。1.2动物分组及给药方案SD大鼠随机分成6组，每组10只，即正常对照组、佐剂型关节炎(AA)模型组、白芍总苷(TGP)(60mg/kg)组、隐丹参酮(CT)(25,50,100mg/kg)组。丹参提取物(CT)白芍总苷(TGP)以上药物实验时均以0.5%羧曱基纤维素钠配制成所需浓度供灌胃给药用。除正常组外，其余各组均以FCA于每只大鼠左后足跖皮内注射FCA0.lml致炎。致炎后d17d24连续灌胃给药(lml/100g体重)，每曰一次，连续8d;体外实验分组方法分别无菌取正常大鼠和AA大鼠胸腺、脾脏，常规制备胸腺淋巴悬液、脾淋巴悬液和腹腔巨噬细胞悬液，加入CT(0.1,1.0,10,100，1000(Ag/ml)，进行T、B淋巴细胞功能测定及检测IL-l、IL-2生物活性。1.3关节肝1^度測定大鼠于致炎前、致炎后第14、17、21、24天(dl4、d17、d21、d24)分别在足容积测量仪上测定大鼠右侧(非致炎侧)足容积，某一时间致炎后与致炎前足容积的差值即为该时大鼠足肿胀度。1.4多发性关节炎指数(arthritisindex,AI)评分致炎后dl4、d17、d21、d24观察并记录全身关节病变程度，全身病变按5级评分法评价，根据未注射佐剂的其余3个肢体的病变程度累计积分，计算出AI。具体评分标准如下G分无红肿；1分趾关节红肿；2分趾关节和足跖关节红肿；3分踝关节以下的足爪红肿；4分包括踝关节在内的全部足爪肿胀。1.5IL-2的诱生与测定1.5.1IL-2的谦生常规制备大鼠胸腺淋巴细胞悬液，用含10%NBS的DMEM培养液调至5X10"丄—^在无菌24孔培养板中，备孔加入100(il细胞悬液，lOO(alConA(终浓度5mg'L—800plDMEM营养液，置37°C、5%0)2培养箱中培养48h，体外实验加500)il细胞悬液，250(!lConA和250W不同浓度的CT,置37°C、5%0)2培养箱中培养48h后离心(500g,10min)收集上清液，-M。C冻存待测。1.5.2IL-2活性的测定采用小鼠胸腺细胞增殖法检测。常规制备C57BL/6小鼠胸腺细胞悬液2X10、L—1。于96孔无菌培养板中，每孔加入lOOW细胞悬液(细胞终浓度为1x108.1/再加12[ag/mlConA50(^1(终浓度为3pg/ml)和不同稀l爭度的待测样品100pl，同时设相应浓度的ConA及培养液对照。置37。C、5%0)2培养箱培养48h，在培养结束前6h每孔加入MTT溶液(5g'L/1)10^1，于振荡器上振荡1min,再放入37。C、5%C02培养箱中继续培养6h。培养结束后以76Og,离心1Omin,吸弃上清后每孔加入120^1的曱亚砜，于振荡器上振荡30s,在酶标仪于570nm波长处读取每孔A值，结果以A的均值表示。1.6腹腔巨噬细胞(PM(J))培养上清液的制备常规制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液，用含10%NBS的DMEM培养液调至2X10、L—',加入24孔培养板，每孔lml，置37°C、5%0)2培养箱中培养2h,弃去培养液，用含5%NBS-Hank's液洗涤细胞3遍，获单层PMd),加入100[ilLPS(终浓度4mg.1/1)，用DMEM培养液补至每孔总体积lml;体夕卜实验力口5(%1LPS，500^1不同浓度的CT，置37°C、5%0)2培养箱中培养48h，收集上清液，-20。C冻存待测。1.7IL-1的测定采用ConA诱导的小鼠胸腺淋巴细胞增殖法检测。处死C57BL/6小鼠无菌摘取胸腺，用DMEM培养液调成1.5X10ie'L—',加入ConA混匀成ConA-胸A泉细月包悬液(ConA的浓度为22.4叫/ml)，加入96孔板，每孔100pl，再加入lOOjil不同稀释度含IL-1的上清。置37。C、5%0)2培养箱培养4811，在培养结束前6h每孔加入MTT溶液(5g'L_1)10^1,于振荡器上振荡lmin，再放入37。C、5%002培养箱中继续培养6h。培养结束后以760g,离心10min，吸弃上清后每孔加入120的二甲亚砜，于振荡器上振荡3'0s,在酶标仪于570nm波长处读取每孔A值，结果以A的均值表示。1.8皿巨噬细il&^虔功能实验常规制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液，用DMEM营养液调至2X10'.L—、加入96孔板，每孔10(^1,置37°C、5%C02培养箱中培养2h后弃去上清，每孔加入0.075%中性红生理盐水溶液10(^1，继续培养lh,甩弃中性红，用预温的PBS洗3次，每孔加入水醋酸-无水乙醇(0.1M冰醋酸无水乙醇=1:1)200|xl,静置过夜，用酶标仪于540nm处测A值。1.9关节病理学检查处死大鼠，取右后足膝关节作标本，10%甲醛溶液固定、脱钙、脱水、切片、HE染色，观察关节组织的病理改变并摄片。2.实验结果本实验各免疫大鼠注射FCA后第1~3天(dl~d3)表现为急性局部炎症；后逐渐减轻；后因迟发性超敏反应，出现继发性反应表现为对侧和前肢足爪肿胀，耳、尾部出现炎性结节和红斑并伴有体重明显下降。将AA大鼠于致炎后d16随机分组，各组大鼠于免疫后d17~d24灌胃给药，进行以下指标检测。2.1对AA大鼠继发側关节肿胀度的影响AA模型组大鼠在致炎后d17、d21、d24继发侧足肿胀度与正常组比较明显增加；与模型组比较，CT(50，100mg'kg—0于用药d5后可明显减轻AA大鼠的足肿胀度；CT25mg'kg—M乍用不明显;与CT50mg'kg—'相近，TGP(60mg'kg—》对AA大鼠继发侧关节胂胀具有抑制作用(结果见表l)。_表lCT对AA大鼠继发侧关节肿胀度的影响(S土A'，n-10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*p<0.05'**p〈0.01VSnormal;#p〈0.05,鄉<0.01VSAAmodel2.2CT对多发性关节炎指数的影响注射FCA致炎后dl4dl6,各冲莫型大鼠开始出现全身症状，表现为未注射佐剂的其余三个肢体关节的红肿、变形，耳部及尾部结节，行走不便。CT100mg'kg—'于用药d5后可明显抑制AA大鼠全身继发性关节病变，d8各剂量组均有明显抑制(表2)。表2CT对AA大鼠多发性关节炎指数的影响(x±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>CT256.00±1.25506.10±0.741006.30±1.16TGP606.20±0.79*p<0.05，**p〈0.01VSAAmodel2.3CT治疗用药对IL-1、IL-2活性的影响AA大鼠表现为腹腔巨噬细胞(PM(b)释放IL-l功能亢进，T细胞产生的IL-2水平明显下降，CT100mg'kg—4合药后能有效降低过度升高的的IL-l水平，而对IL-2则无明显影响；TGP能有效降低IL-l水平，升高体内IL-2含量(见表3)。表3CT治疗用药对IL-1、IL-2活性的影响G土s，n=4)剂量吸光度/570nm组别(ing-kg')化-1IL-2正常0.489±0.2960.404±0.065AA模型—1.067±0.304*0.300±0.044*CT250.729±0.2330.368±0.051500.748±0.0770.294±0.0621000.622±0.136s0.342±0.090TGP600.531±0.193*0.424±0.068"*p〈0.05VSnormal,#p<0.05VSAAmodel2.4CT体外用药对AA大鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖功能的影响对AA大鼠胸腺和脾淋巴细胞体外用药可见其增殖功能明显低下，CT(100，1000wml—')体外用药对T、B淋巴细胞增殖功能均具有显著恢复作用(见表4)。表4CT体外用药对AA大鼠胸腺和脾淋巴细胞增殖功能的影响(；士a'，n=6)组别.剂量吸光度/570tTcellproliferationBimcellproliferation止常—0.657±0.0860.587±0.166AA投M—0.5丄2±0.107'0.387=0.107'7.30±1.257.20±0.926.80±1.23*7.20±1.487.70±1.16'6.80±1.32*6.10±0.99*6.90士0.99'<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*p<0.05，**p〈0.01VSnormal;##p〈0.01VSAAmodel2.5CT体外用药对IL-1、IL-2活性的影响AA大鼠RI空巨噬细胞(PM*)体外培养所产生的IL-1水平显著升高，T细胞产生的IL-2有所下降，CT100(Hig'm"给药后能有效降低过度升高的IL-l水平，且能显著升高IL-2的水平(见表5)。表5CT体外用药对IL-1、IL-2活性的影响G土s，n=6)剂量吸光度/570nm<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>**p〈0.01VSnormal;ftp<0.05VSAAmode丄2.7CT对大鼠关节病理的影响光学显微镜下观察，正常大鼠膝关节的组织形态特点是滑膜组织内膜多由单层体积较大、核深染的扁平型或低立方型滑膜细胞组成，表面光滑；正常关节软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐。AA大鼠关，病变主要表现为滑膜组织增厚，滑膜细胞多成卵圆形，-滑膜组织充血、水肺，排列疏松、不规则，有大量炎性细胞浸润和血管翳形成。各用药组均可不同程度减轻以上病理变化，镜下表现为关节滑膜组织中轻度的滑膜增生，淋巴细胞浸润减少，滑膜下有少量纤维增生，血管翳明显减轻，新生毛细血管数量减少，骨髓腔中脂肪细胞明显减少，软骨受损程度明显减轻。3结论类风湿性关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病，是以关节病变为主并伴有多系统受累的慢性炎症性疾病，其主要临床表现为对称性多关节炎，关节滑膜的持续性炎症和增生，发病后出现关节疼痛、肺胀和僵硬，并常有皮下结节、关节侵蚀性改变和进行性关节畸形。以弗氏完全佐剂(FCA)诱导的大鼠佐剂性关节火(AA)模型与人的RA有许多相似之处，是筛选和研究治疗RA药物常用的模型之一，其组织学特点包括滑膜增生、单核细胞浸润、新生血管形成核关节软骨及骨组织的破坏。本实验观察到AA大鼠在致炎dl4dl6开始出现继发侧足肿胀、多发性关节炎病变和体重减轻，表明AA大鼠具有与RA相似的关节肿胀和活动受限等症状。本实验研fe结果显示CT治疗用药能抑制AA大鼠的关节足肿胀，明產改善AA大鼠全身多发性关节炎指数，有效减轻了AA大鼠膝关节病理损伤程度，表明CT(50，100mg/kg)对大鼠AA具有治疗作用。与临床观察中发现的情况相类似。实施例3隐丹参酮(CT)对特发性血小板减少性紫癜(ITP)的初步临床观察。经过临床初步观察，使用隐丹参酮2.5mg/kg的ITP患者(15岁，女性)，其血小板计数有明显升高(20x107L升至51xx107L)。实施例4隐丹参酮注射液的制备。精密称取隐丹参酮100克，加入200毫升丙二醇搅拌使溶解，补足注射用水至1000毫升，0.22iam微孔滤膜过滤，滤液lml灌入安瓿中，充氮气，熔封。10(TC流通蒸汽灭菌即得成品。实施例5隐丹参酮胶嚢剂的制备。取隐丹参酮与羟丙基-P-环糊精按摩尔比1:1混合均匀后，加入适量乙醇，研磨均匀后置球磨机中球磨30分钟，取出置于真空干燥箱内干燥过液，粉碎后过80目筛。得到隐丹参酮-羟丙基-环糊精包合物。精密称取包含物，加入适量淀粉，用淀粉浆混合，制粒，干燥，过40目筛，加入硬脂酸镁、滑石粉适量，灌装中另胶嚢。每粒胶嚢含隐丹参酮500mg。实施例6隐丹参酮透皮吸收制剂的制备。取十八醇1000克、羊毛脂2000克，氮酮120克，在8CTC水溶上熔融；另称取100毫升隐丹参酮，用无水乙醇100毫升溶解，加入前述熔融物中，搅匀，降温至5(TC以下，均匀涂布于控释^f表背材料上，即制得隐丹参酮贴膏。本发明不限于上述实施例，本发明的隐丹参酮具有疗效好，治疗指数高，使用安全，毒性作用小的优点。权利要求1、隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用。2、根据权利要求1所述的隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用，其特征在于隐丹参酮在制备防治类风湿关节炎药中的应用。3、根据权利要求1所述的隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用，其特征在于隐丹参酮与其他辅料制成口服剂型。4、根据权利要求1所述的隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用，其特征在于隐丹参酮与其他辅料制成注射剂型。5、才艮据权利要求1所述的隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用，其特征在于隐丹参酮与其他辅料制成外用剂型。全文摘要隐丹参酮在制备防治自身免疫性疾病药中的应用，尤其是其在制备防治类风湿关节炎药中的应用，可制成口服、注射、外用剂型；本发明的隐丹参酮具有疗效好，治疗指数高，使用安全，毒性作用小的优点。文档编号A61P37/00GK101108190SQ200710028609公开日2008年1月23日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者刘培庆,古练权,郑芙林,伟魏,民黄申请人:中山大学