专利名称：一种刺激隐核虫幼虫油佐剂灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种灭活疫苗，具体涉及一种刺激隐核虫幼虫油佐剂灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown 1951)是一种鱼类专性寄生虫，寄生于热带、亚热带海水鱼身体引起“白点病”，刺激隐核虫的宿主范围很广泛，除软骨鱼类对刺激隐核虫有较强抵抗力外，海水硬骨鱼类普遍能被刺激隐核虫感染，严重感染会导致鱼类大量死亡。
近年来刺激隐核虫病在世界各地频繁爆发，危害日益严重。我国南海海水养殖区也年年爆发“白点病”，造成了很大的经济损失。但目前防治海水鱼类“白点病”的方法很有限，虽然一些物理和化学方法能起到一定效果，但它们都或多或少存在一些缺陷，如对鱼有毒性、效果不确定或者不适用于大水体等等。
Colorni(1985)曾提出鱼类对刺激隐核虫可能会产生获得性免疫保护，此后他进一步提出由于刺激隐核虫生长于宿主的上皮层内，与宿主有着更密切的关系，合适的疫苗可能成为防治刺激隐核虫的有效方法。但是要对某种鱼采用免疫预防措施，首先就要弄清楚该种鱼是否能对刺激隐核虫的感染产生获得性免疫力，是否能得到足够的免疫保护。Burgess等(1995)首次证明了鲻鱼(Chelon labrosus)可以对刺激隐核虫产生获得性免疫保护，且保护力与感染强度成正比。Yoshinaga等(1997)发现经刺激隐核虫免疫后底鳉(Fundulusheteroclitus)能产生抗血清，该血清能使寄生虫的幼虫纤毛凝集，并发生阻动(Immobiliazation)。
我们在以卵形鲳鲹作为动物模型进行刺激隐核虫标准化传代过程中也发现，随着被感染次数的增加，卵形鲳鲹的抗感染能力逐渐加强，感染上鱼的寄生虫数量逐渐减少。迄今为止，世界上尚无任何疫苗防治海水鱼类的刺激隐核虫病即“白点病”。
相对于引起淡水鱼类“白点病”的多子小瓜虫细致而深入的免疫学研究，刺激隐核虫的研究工作才刚刚开始。刺激隐核虫与多子小瓜虫具有相似的生活史、感染模式和病理特征，鱼类对这两种纤毛虫的免疫防御机制可能也有很多相似之处，因此我们可以借鉴一些研究多子小瓜虫的方法来对刺激隐核虫加以研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种可以有效地预防海水鱼类的“白点病”的刺激隐核虫幼虫油佐剂灭活疫苗。
本发明的另一个目的是提供上述刺激隐核虫幼虫油佐剂灭活疫苗的制备方法。
本发明的刺激隐核虫幼虫灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤 (1)收集刺激隐核虫幼虫液，灭活，离心，收集沉淀得到灭活幼虫，于-80℃保存； (2)将上述幼虫解冻后，向幼虫中加入0.15mol/L PBS重悬后混合振荡，作为水相；按体积比，将94％的10号白油和6％的司本-80混合，再加入2％(体积比)的硬脂酸铝作为稳定剂，此混合物混合搅拌加热至透明，高压灭菌处理后作为油相；按体积比，将水相与油相以水相∶油相＝3∶7的比例，高速搅拌乳化，重复3次，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(体积比)的柳硫汞溶液，即制备成刺激隐核虫幼虫灭活疫苗。
在上述制备方法中，步骤(1)中所述的灭活方法优选为加入100ppm的福尔马林杀死全部幼虫，离心时间为10min。
在上述制备方法中，步骤(2)中所述的高速搅拌乳化的速度优选为13000rpm，时间为5min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明的刺激隐核虫幼虫灭活疫苗免疫海水鱼类，可以使卵形鲳鲹的寄生虫感染强度下降37.2％，死亡率降低40％；可以使斜带石斑鱼的寄生虫感染强度下降30.8％，死亡率降低56.7％，说明该疫苗的免疫保护效果很好，完全能满足实际生产的需要。
图1为卵形鲳鲹经致死剂量幼虫(2×104个幼虫/鱼)攻毒后的死亡情况； 图2为斜带石斑鱼经致死剂量幼虫(4×104个幼虫/鱼)攻毒后的死亡情况。
具体实施例方式 实施例1刺激隐核虫幼虫的收集和灭活 用脱包2小时内的刺激隐核虫幼虫感染海水鱼，60小时后鱼皮肤和鳃上出现明显可见的滋养体，在接下来的24小时内几乎所有的滋养体都从鱼体上脱落形成包囊前体，收集脱落的包囊前体，培养60小时后，包囊开始释放出幼虫，幼虫孵出后，收集虫液，混匀后吸取5份(每份50ul)，加10ul福尔马林杀死幼虫，在显微镜下计数，记算出幼虫的浓度，然后加入100ppm的福尔马林杀死全部幼虫，用离心机(KUBOTA 5100)3500rpm离心10min，收集在1.5ml离心管里-80℃保存。
实施例2刺激隐核虫幼虫灭活疫苗的制备方法 将上述幼虫解冻后，向幼虫中加入0.15mol/L PBS重悬后混合振荡，作为水相；按体积比，将94％的10号白油和6％的司本-80混合，再加入2％(体积比)的硬脂酸铝作为稳定剂，此混合物混合搅拌加热至透明，高压灭菌处理后作为油相；按体积比，将水相与油相以水相∶油相＝3∶7的比例，以13,000rpm高速搅拌乳化5min，重复3次，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％(体积比)的柳硫汞溶液，即制备成刺激隐核虫幼虫灭活疫苗。
实施例3疫苗的无菌检测 将少量制备好的疫苗用涂抹棒涂于BHI固体培养基板上28℃恒温培养48h，无任何菌落生长。
实施例4疫苗的质量检测 取制备的疫苗1滴轻轻滴在水中，静止观测30min没有发现油滴散开；取制备疫苗3,000rmp离心15min未见分层现象；考马斯亮兰R250(水溶性染料)和苏丹II(油溶性染料)检测，疫苗为苏丹II染料颜色，疫苗为油包水剂型。
实施例5疫苗的安全性检测 同时用刺激隐核虫活幼虫(2.0×104幼虫/鱼)和含有相同幼虫数量的灭活疫苗感染卵形鲳鲹(124.5±38.1g)，4天内被刺激隐核虫活幼虫感染的鱼全部死亡，体表和鳃上分布着大量的刺激隐核虫滋养体，而被刺激隐核虫灭活疫苗感染的鱼没有出现死亡现象，体表和鳃上也没有发现有刺激隐核虫滋养体的分布。证明该疫苗在生产上使用是安全的。
实施例6疫苗的免疫保护力试验 将制备好的疫苗经腹腔注射卵形鲳鲹(1.5×105个幼虫/尾鱼)和斜带石斑鱼(5000个幼虫/尾鱼)，在第8周分别用亚致死剂量的幼虫和致死剂量的幼虫感染鱼，统计各实验组鱼的寄生虫感染程度和实验鱼的死亡情况，结果发现，与对照组比较，免疫过的卵形鲳鲹其寄生虫感染强度降低了37.2％，如表1所示 表1卵形鲳鲹用刺激隐核虫幼虫攻毒后的感染情况 死亡率降低了40％，如图1所示。
斜带石斑鱼的寄生虫感染强度降低了30.8％，如表2所示 表2斜带石斑鱼用刺激隐核虫幼虫攻毒后的感染情况 死亡率降低了56.7％，如图2所示。
实验证明该疫苗具有较好的免疫保护效果，完全能满足实际生产的需要。
权利要求
1.一种刺激隐核虫幼虫油佐剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤
(1)收集刺激隐核虫幼虫液，灭活，离心，收集沉淀得到灭活幼虫；
(2)向上述幼虫中加入0.15mol/L PBS重悬后混合振荡，作为水相；按体积比，将94％的10号白油和6％的司本-80混合，再加入2％的硬脂酸铝作为稳定剂，此混合物混合搅拌加热至透明，高压灭菌处理后作为油相；按体积比，将水相与油相以水相∶油相＝3∶7的比例，高速搅拌乳化，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％的柳硫汞溶液，即制备成刺激隐核虫幼虫灭活疫苗。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述的灭活方法为加入100ppm的福尔马林杀死全部幼虫，离心时间为10min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的高速搅拌乳化的速度为13000rpm，时间为5min。
4.一种刺激隐核虫幼虫灭活疫苗，其特征在于由权利要求1所述方法制备而成。
全文摘要
本发明公开了一种刺激隐核虫幼虫油佐剂灭活疫苗及其制备方法，包括(1)收集刺激隐核虫幼虫液，灭活，离心后收集沉淀于-80℃保存；(2)将幼虫解冻，加入0.15mol/L PBS重悬后混合振荡，作为水相；按体积比，将94％的10号白油和6％的司本-80混合，再加入2％的硬脂酸铝作为稳定剂，此混合物混合搅拌加热至透明，高压灭菌处理后作为油相；(3)按体积比，将水相与油相以水相∶油相＝3∶7的比例，高速搅拌乳化，在终止搅拌前加入终浓度为0.01％的柳硫汞溶液，即制备成刺激隐核虫幼虫灭活疫苗。本发明的灭活疫苗用于防治海水鱼类的寄生虫感染，其免疫保护效果好，完全能满足实际生产的需要。
文档编号A61K39/002GK101185755SQ200710032018
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月3日 优先权日2007年12月3日
发明者李安兴, 但学明, 柏建山 申请人:中山大学