一种组织工程气管移植物及其构建方法和用途的制作方法

专利名称：：一种组织工程气管移植物及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及一种组织工程气管移植物及其构建方法和用途。
背景技术：
：各种原因(先天畸形、外伤、肿瘤等)引起的气管缺损临床常见并可危及生命，长段气管狭窄死亡率可高达77%，长段气管闭锁死亡率基本为100%。长段气管缺损因无法直接吻合，需要气管替代物进行修复。目前临床上常用的有三类气管移植替代物，但均存在各自的缺点，见表1。因此目前仍缺乏理想的气管替代物，长段气管缺损的修复也因而成为临床治疗难题。组织工程的发展为解决这一难题提供了新思路。理论上讲，组织工程气管如果构建成功，完全有可能避免上述各类气管替代物的诸多缺点，成为真正理想的气管移植替代物(表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>从1994年开始，国内外逐渐有学者在研究构建组织工程气管并用于尝试修复气管缺损。但迄今为止仅在对气管局部缺损的片状修补研究中获得了初步成功，而对气管节段缺损的环状修补方面未取得突破性进展，术后实验动物存活均不超过1个月，迄今为止未构建出令人满意的组织工程气管。其失败的原因有-1)单纯在体外构建的组织工程气管的软骨支撑强度不足，难以维持通气功能；2)单纯在体内构建虽然对提高软骨的力学强度有一定帮助，但直接置入体内会由于常用的PGA材料在动物体内的酸性降解产物会引起较强烈的炎症反应，也难以形成良好的组织工程气管；3)—些研究选择先在裸鼠体内构建以减少上述的炎症反应，但导致组织工程气管中混入了鼠源细胞，再移植到免疫能力健全的实验动物则会引起异种免疫排斥反应；4)即往研究都是采用组织工程气管游离移植，移植后需要时间与周围组织建立起血供联系，而气管床并不是一个血供丰富的区域，因此游离移植不利于组织工程气管存活及其与正常组织的整合；5)节段性修补伤口环绕气管，伤口术后早期的肿胀和后期的肉芽增生常导致吻合口狭窄，堵塞气道；6)构建的组织工程气管无纤毛上皮，术后若邻近纤毛上皮不能及时覆盖则无法有效清除气道分泌物。这些原因还会相互促进形成恶性循环，例如吻合口缺乏上皮覆盖将会加重肉芽增生。以往实验构建中存在的这些不足最终阻碍了组织工程气管移植后的快速整合，未能体现出组织工程技术的优越性而导致失败。以上这些长期以来存在于组织工程气管构建中的困难说明气管并不是一个简单的管形结构，而是和其它组织器官如血管一样具有复杂的组织学和生物力学特性，并且是在一个与外界相通、有菌的环境中行使多种重要的生理功能，组织工程气管的构建具有相当的复杂性和特殊性。本领域迫切需要提供一种能实现节段型气管缺损功能重建的组织工程气管移植物及其构建方法。
发明内容本发明旨在提供一种可满意修复气管缺损的组织工程气管移植物。本发明的另一目的就是提供所述组织工程气管移植物的构建方法。本发明的再一个目的是提供所述组织工程气管移植物的用途。在本发明的第一个方面，提供了一种组织工程气管移植物，所述的移植物包括(a)管状本体，所述的管状本体包括螺旋形组织工程化软骨和纤维结缔组织；(b)包绕在所述管状本体之外的组织，所述的组织包括肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织、或其组合。在另一优选例中，所述的组织包括自体组织或异体组织。在另一优选例中，所述的纤维结缔组织带有血供。在另一优选例中，在所述的管状本体中，纤维结缔组织包裹着软骨，主要位于软骨(环)之间，也位于软骨内侧和外侧。在另一优选例中，所述的肌肉组织包括胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌、或颈阔肌、或其组合。在另一优选例中，所述的肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织带有血供。在另一优选例中，所述的移植物的长度为l-15cm。在另一优选例中，所述的组织是哺乳动物的组织。在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人、兔、羊、猪、狗、猴等。在本发明的第二方面，提供了一种构建上述的组织工程气管移植物的方法，它包括步骤将螺旋形支架上形成的组织工程化软骨样组织埋植入活体哺乳动物体内组织中培养，得到本发明提供的组织工程气管移植物，所述的体内培养组织包括肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织、或其组合。在另一优选例中，所述的体内培养组织包括胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌、或颈阔肌。在另一优选例中，在体内组织中的培养时间为7-70天。在另一优选例中，它包括步骤(1)将软骨形成细胞接种于由生物可降解材料制备的螺旋形支架上形成细胞-材料复合物；(2)体外培养细胞-材料复合物得到组织工程化软骨样组织；(3)将体外培养的组织工程化软骨埋植入活体哺乳动物体内组织中，培养后获得本发明提供的组织工程气管移植物，所述的体内培养组织包括肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织、或其组合。在另一优选例中，在步骤(l)前先进行软骨形成细胞的分离与培养，所用培养液的配方可以参见文献，有很多种类，其主要成份可以是DMEM，Ham'sF-12等，添加物也可以有很多种类。在另一优选例中，所述的软骨形成细胞是自体或异体的人或动物的软骨细胞或具有软骨分化潜能的其它细胞。在另一优选例中，所述的软骨细胞来源于关节软骨、肋软骨、耳软骨、或气管软骨等各种软骨组织。在另一优选例中，组织工程化软骨的体外培养方式有静态培养模式或在各种反应器内进行的动态培养模式。在另一优选例中，体外培养组织工程化软骨的时间为3-90天，在体内组织中培养组织工程气管移植物的时间为7-70天。在另一优选例中，体外培养时间和体内培养时间可任意组合，如体外3天+体内6周，或体外1月+体内2周等等，以构建软骨发育成熟并与所在培养组织建立稳定的血供联系为时间标准。在另一优选例中，所述的生物可降解材料除了可用聚羟基乙酸(PGA)之外，还包括药学上可接受的、生物相容性良好的可降解材料，可选自下组聚乳酸(PLA)、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及这些成分的各种组合等等。在另一优选例中，所述的生物可降解材料制备的螺旋形支架与所要修复的气管缺损的尺寸相符。在本发明的第三方面，提供了一种如上述的组织工程气管移植物的用途，所述的移植物用于制备修复哺乳动物的气管组织缺损的移植物。在另一优选例中，所述组织工程气管移植物成熟后可携带其所在培养组织及其血供一起移植，方式可以是局部瓣、邻位瓣、远位瓣和吻合血管瓣。据此，本发明提供了一种能实现节段型气管缺损功能重建的组织工程气管移植物及其构建方法。图l显示了构建组织工程气管的软骨细胞与材料；其中，a表示体外培养的软骨细胞的免疫荧光染色；b表示无纺PGA材料；C表示在硅胶管上缠绕成形的螺旋PGA材料支架；d表示细胞接种材料后1周倒置显微镜照片，可见大量软骨细胞在PGA纤维周围(X100);e表示接种1周后扫描电镜照片，显示软骨细胞粘附在PGA纤维上(X2000);f表示接种2周后扫描电镜照片，显示软骨细胞已分泌大量基质(X2000)。图2显示了体外与体内培养结合形成的组织工程气管移植物；其中，a表示已在体外培养2周的螺旋形软骨细胞-PGA材料复合物，准备植入颈部肌肉内；b表示复合物已包裹在肌肉里；c表示在体内4周后复合物形成类似正常气管的组织工程气管，由螺旋形软骨和软骨环之间的结缔组织组成；d表示组织工程气管纵向剖开后的内面观，类似正常气管。图3显示了组织工程气管的相关检测；其中，a表示新形成软骨横截面HE染色可见完整的软骨环；b表示图a中蓝色框放大图，可见软骨陷窝清晰，基质丰富，并在内腔面形成一层纤维结缔组织，外侧与肌肉紧密相连(X100);c表示II型胶原免疫组织学染色可见新软骨含有大量的II型胶原(XIOO);d表示Safranin-0染色可见丰富的染成红色的蛋白多糖基质；e表示组织工程气管管腔在外力压縮后可完全复原；f表示横向应力-应变测试显示组织工程气管(右曲线)与正常气管(左曲线)具有类似的生物力学特性。图4显示了用构建的组织工程气管修复节段性气管缺损的手术方法；其中，a表示解剖出毗邻气管(A)在颈部肌肉内已形成的组织工程气管(☆)，保护胸骨舌骨肌的两个蒂完整、不切断；b表示将组织工程气管带蒂转移至气管缺损处，安置缝线准备端-端吻合；c表示组织工程气管与气管断端吻合中置入硅胶气道支架；d表示全部吻合完毕，可见组织工程气管与胸骨舌骨肌相仍保持连接。图5显示了修复手术后不同时期组织工程气管中部的横截面HE染色(X400)和内腔面的扫描电镜观察(X2000);其中，a、b表示修复术后1周，可见内腔面已被一至两层扁平上皮细胞覆盖，这层扁平细胞没有纤毛；c、d表示术后2周，这层扁平上皮细胞高度开始增加，少量细胞开始形成纤毛；e、f表示术后4周，上皮细胞继续增高至立方形，多数细胞形成纤毛，并开始出现粘膜下层；g、h表示术后3个月，内腔已完全为一层成熟的、类似正常气管粘膜的假复层柱状纤毛上皮所覆盖，其中含有分泌细胞，并有明显的粘膜下层。图6显示了修复术后3个月时移植入的组织工程气管(箭头之间)；其中，a表示其外侧大体观；b表示其纵行剖开后的内腔面，可见组织工程软骨管已完全整合入邻近的正常气管，肉眼看不到明为的界线，除一侧吻合口有轻微狭窄外整个管腔通畅；c表示吻合口处的组织学HE染色(X100)，众示组织工程软骨，A示正常气管软骨，显示3个月后组织工程软骨不仅保持了软骨表型，并且与正常气管软骨很好地融合，粘膜与粘膜下层形成良好，交界处组织学平稳过渡。具体实施方式发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现将经培养扩增的软骨细胞接种于聚羟基乙酸(polyglycolicacid，PGA)螺旋形支架形成细胞-材料复合物，经体外培养后植入胸骨舌骨肌内，一段时间后可形成含有螺旋形软骨的组织工程气管移植物。以胸骨舌骨肌瓣为蒂转移该气管移植物修复自体节段性气管缺损后，移植物能稳定维持气管的支持和呼吸功能，动物可以自主呼吸并长期存活。术语术语"组织工程化软骨"指将软骨细胞或具有软骨分化潜能的干细胞接种于生物可降解材料，通过体外培养和/或体内植入，生物材料部分或全部降解后所形成的软骨样组织。"血供"或"带有血供"是指具有血管、血管中流动的血液、和能保持血液正常生理状况的与之相关的组织等所构成的供血系统。术语"软骨形成细胞的分离培养"指将存在于人或动物软骨组织中的软骨细胞通过酶消化的方法选取出来并进行体外培养的过程。或将具有软骨分化潜能的干细胞进行诱导分化形成软骨细胞的过程，所述的具有软骨分化潜能的干细胞包括但不限于间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)、胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)或成体干细胞。干细胞来源广泛(可以来自骨髓、骨膜、软骨膜、脂肪、皮肤、血管周膜、胚胎中胚层未分化的间充质细胞以及建系的胚胎干细胞等)。术语"接种"指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。术语"构建"指体外分离培养种子细胞，并将细胞与生物材料混合，通过体外培养和/或体内植入，使细胞-材料复合物形成组织工程化组织的过程。组织工程气管移植物本发明提供的组织工程气管移植物内面光滑，为一薄层结缔组织构成，有丰富的血管与包绕在外面的组织交通。运用本发明提供的组织工程气管移植物进行动物气管缺损修复术后，动物可以自主呼吸，工程化软骨一直保持软骨组织特征。本发明提供的组织工程气管移植物与周围组织整合良好，在1-2周时管腔被一层扁平上皮覆盖，经过6-8周可逐步转化为与正常气道上皮类似的假复层纤毛柱状上皮并形成粘膜下层。证明这是一种较令人满意的组织工程气管。所述的包绕在外面的组织包括肌肉、皮肤、筋膜或大网膜，其中优选胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌、或颈阔肌。构建组织工程气管移植物本发明提供的组织工程气管移植物由软骨形成细胞和生物可降解材料复合后经体外和体内联合培养构建，与所在的体内培养组织有丰富的血供连接。其细胞材料复合物在体内培养组织内形成的软骨与正常气管软骨相似，由新螺旋形软骨和软骨环之间的结缔组织共同构成组织工程气管，其大体观、组织学和生物力学检测均与正常气管相似。所述的体内培养组织包括肌肉、皮肤、筋膜或大网膜，其中优选胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌、或颈阔肌。在本发明的一个优选例中，所述的构建组织工程气管移植物的方法包括以下步骤(a)软骨细胞的分离与培养；(b)将生物可降解材料制备成螺旋形支架，并将步骤(a)分离培养获得的软骨细胞种植于螺旋形支架材料上形成细胞-材料复合物；(c)体外培养细胞-材料复合物形成组织工程化软骨；9(d)将组织工程化软骨植入活体哺乳动物的胸骨舌骨肌中培养，得到组织工程气管移植物。细胞-材料复合物先经2周的体外培养，生物材料已部分降解，自体软骨组织初步形成，再植入实验动物自体气管旁胸骨舌骨肌内。经过孵育，复合物转变为组织工程气管，其管腔内形成的光滑结缔组织将有利于未来的上皮爬行长入，同时组织工程气管与胸骨舌骨肌建立了广泛的血管联系，就可以以此肌肉为蒂移植组织工程气管进行气管修补。这种体外与自体体内构建相结合的模式，可以避免经裸鼠构建引起的异种免疫排斥，减轻生物材料引起的炎症反应，提高了新生软骨质量，较以往单纯在体外或体内培养的都要好，并为其下一步移植及整合做好了准备。软骨形成细胞本发明中软骨形成细胞的来源没有特别限制，可以是人或动物的软骨细胞，可来源于关节软骨、肋软骨、耳软骨、鼻中隔软骨、气管软骨等各种软骨组织；也可以是具有软骨分化潜能的人或动物其它种类细胞，可来源于骨髓、脂肪、肌肉、皮肤等组织。一种优选的来源是来自人或动物的耳软骨或关节软骨。分离获得软骨细胞的方法是文献多次报道的公认方法。一种优选的方法是全麻或局麻下无菌切取软骨组织，经磷酸缓冲液(PBS)清洗后，加入5-IO倍软骨体积的胶原酶溶液(浓度一般在0.5-3mg/ml，以PBS或培养液配制)，37"C恒温振荡消化4-20小时(依软骨组织的来源及消化进展程度而定)，过滤收集软骨细胞悬液，离心、洗涤、台盼蓝染色、显微镜下计数，原代软骨细胞活力一般应在80%以上。将干细胞诱导分化成软骨细胞的方法也是本领域常规的方法。软骨细胞的培养、传代方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在C02培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)l)F-12培养基或DMEM培养基+5%-20%胎牛血清；2)F-12培养基或DMEM培养基+5%-20%自体(或异体)人血清；3)F-12/DMEM培养基(1:1)+2%-20%胎牛血清或人血清。一类特别优选的软骨细胞是体外分离培养的原代-第3代的软骨细胞。此时的软骨细胞功能和活力均良好，具有很强的软骨形成能力，经免疫细胞化学染色证明有n型胶原表达，RT-PCR及原位杂交检测证明有II型胶原及蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表达。组织工程化软骨样组织本发明所称的组织工程化软骨样组织包括软骨形成细胞与医学上可接受的生物可降解材料混合所形成的组织工程化软骨移植物。本发明的软骨细胞-生物材料复合物的制备方法是本领域中熟知的。一种优选的制备方法是将软骨细胞直接接种到可降解生物材料上。软骨细胞-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为1X107ml至7X107ml或更高。生物材料的种类和来源没有特别限制，一类优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原及其多聚物和混合物等。制备细胞-材料复合物时，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例也没有特别限制，以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。软骨形成细胞构建组织工程化软骨的方法是本领域中熟知的。一类优选的方法是将原代-第3代的软骨细胞接种到可降解生物材料形成软骨细胞-材料复合物，再进行体外培养，使细胞充分与材料接触并分泌细胞外基质，同时材料被逐渐降解，最终形成软骨组织。软骨细胞-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为1X107ml至7X107ml或更高。生物材料的种类和来源没有特别限制，一类优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原及其多聚物和混合物等。制备细胞-材料复合物时，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例也没有特别限制，以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。在本发明的另一优选例中，可以将干细胞接种于螺旋形的医学上可接受的生物可降解材料上，形成干细胞-支架复合物，所述的复合物在软骨诱导液中培养2-4周，使得干细胞诱导分化形成软骨样细胞，从而形成组织工程化软骨样组织。软骨细胞构建组织工程化软骨的体外培养方法没有特别限制，一类优选的培养方法是置于培养瓶、培养皿、离心管或生物反应器中培养，培养过程中可以对组织工程化软骨施加各种物理的或化学的剌激。软骨细胞构建组织工程化软骨的体外和体内培养时间没有特别的限制，优选的体外培养时间为3天-3个月，软骨组织形成的时间为1周-8周，以构建软骨发育成熟并与所在培养组织建立稳定的血供联系为时间标准。生物可降解材料可用于构建本发明组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyaminoacid)、假聚氨基酸(pesudo-polyaminoacid)、聚原酸酉旨(polyorthoesters)、聚酉旨尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酉旨(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；(c)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原等。当材料为固体型材料时，可以直接将材料预制成需要的大小与形状，也可以通过计算机辅助及快速成型技术定制的模型对材料进行精确的塑性。用途本发明提供的组织工程气管移植物，可用于制备人工气管组织。可以使用本领域熟知的方法将人工气管组织植入体内。一种优选的方法是采取组织工程气管带血供移植修复气管缺损，实现了节段性气管缺损的功能重建。修复手术采用双蒂胸骨舌骨肌瓣带蒂移植组织工程气管，这样组织工程气管就没有血供中断、需要重建循环联系之虞，加快了与周围组织的整合，保证了修复手术的良好愈后。发明人构建出了各方面与正常气管类似的组织工程气管移植物，用它来修复自体气管节段性缺损后，动物均可自主呼吸并长期存活，实现了真正意义上的气管功能重建，是一种较理想的组织工程气管。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本发明的主要优点在于1.创立了体外与体内构建相结合的带血供组织工程气管的制备模式；2.对应这种制备模式，采用组织工程气管带血供移植修复气管缺损，实现了节段性气管缺损的永久性功能重建。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。烦请给出各实验材料购自何处。谢谢！实施例l细胞分离与培养无菌切取适量软骨块，剪碎成lnW大小的软骨颗粒，先以0.05%胰蛋白酶溶液液37r下振荡消化30分钟，然后经PBS冲洗后加入0.259&II型胶原酶溶液(Sigma公司)，37。C恒温振荡消化7-8小时。消化液经100um滤网过滤，离心后细胞沉淀用软骨细胞培养液重悬、计数，以1.0xl04/cm2细胞密度接种到10mm培养皿(DownCorning公司)，加入软骨细胞培养液；细胞在37°C，5%C02，饱和湿度条件下培养，3天后首次换液，以后隔日换液。软骨细胞培养液配方为DMEM(Dulbecco'smodifiedEagle，smedium)培养液(Gibco公司)加入10%胎牛血清(Hyclone公司)、L-谷氨酰胺0.3mg/L(Sigma公司)、维生素C50ug/ml(Sigma公司)、碳酸氢钠3.7g/L、青霉素100U/ml及链霉素100U/ml。细胞生长达融合状态时进行传代，扩增到足够的细胞量时用0.05%胰酶消化收集，准备接种材料。实施例2支架材料制备取无纺聚羟基乙酸纤维(polyglycolicacid，PGA，自行研制)60mg，将其螺旋13形缠绕在长为1.5cm、直径为6mm硅胶管上成为圆筒形支架材料(图1)，两端用可吸收缝线缝合固定，用75%酒精浸泡60分钟消毒，PBS冲洗2次后备用。实施例3细胞-材料复合物形成与体外培养软骨细胞调整细胞浓度至60xl07ffll，取lml细胞悬液均匀接种于螺旋形材料，于37°C，5%C02，饱和湿度条件放置4小时后移入50ml聚丙烯离心管(BDBiosciences公司)，加入30ml软骨细胞培养液，隔日换液于上述条件下继续培养2周。实施例4复合物埋植入体内培养实验动物用氯氨酮(5rag/kg)和速眠新(0.05-lml/kg)肌注麻醉，常规消毒铺巾，行颈部正中切口分层切开颈前皮肤和筋膜，解剖出一侧胸骨舌骨肌，将软骨细胞-PGA复合物包裹入胸骨舌骨肌中，3-0丝线将肌肉两侧缘拉拢缝合(图2)。术毕逐层缝合关闭切口。术后待动物麻醉苏醒后送回饲养室，术后三天肌注青霉素，每日2次。实施例5获取组织工程气管并用于修复气管节段性缺损植入手术后4周，实验动物如上述麻醉。颈部逐层切开，解剖出上次手术的一侧胸骨舌骨肌，抽出复合物中的硅胶管，可见细胞材料复合物已转化形成组织工程气管，它与肌肉紧密相连，是由螺旋形软骨与软骨环之间的结缔组织共同形成的一管样结构(图2，3)。游离出颈部气管，切除6个气管环长节段，两断端各缝一针3-0丝线牵引，保持气道通畅。保留胸骨舌骨肌上下两端与骨的附着点和与组织工程气管的联结，充分游离肌肉形成双蒂肌瓣，转移肌瓣将组织工程气管插至气管两断端中间，用6-0可吸收PGA缝线分别与气管两断端进行端端吻合(图4)。手术后处理同前，每天观察动物呼吸情况。实施例6修复后组织工程气管发挥良好功能组织工程气管植入缺损部位后发挥了良好的支撑与呼吸功能，实验动物气管可以自主呼吸，活动如常。组织工程气管在12周时管腔被一层扁平上皮覆盖，经过6-8周可逐步转化为与正常气道上皮类似的假复层纤毛柱状上皮并形成粘膜下层(图5)。实验动物术后存活时间大幅度提高，最长者已存活l年，远期观察发现构建的软骨组织一直保持软骨特征，组织工程气管与周围组织整合良好(图6)。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。权利要求1.一种组织工程气管移植物，其特征在于，所述的移植物包括(a)管状本体，所述的管状本体包括螺旋形组织工程化软骨和纤维结缔组织；(b)包绕在所述管状本体之外的组织，所述的组织包括肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织、或其组合。2.如权利要求l所述的移植物，其特征在于，所述的组织包括自体组织或异体组织。3.如权利要求l所述的移植物，其特征在于，所述的纤维结缔组织带有血供。4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，在所述的管状本体中，纤维结缔组织包裹着软骨，主要位于软骨之间，也位于软骨内侧和外侧。5.如权利要求l所述的移植物，其特征在于，所述的肌肉组织包括胸骨舌骨肌、胸锁乳突肌、或颈阔肌、或其组合。6.如权利要求l所述的移植物，其特征在于，所述的肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织带有血供。7.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物的长度为l一15cm。8.如权利要求l所述的移植物，其特征在于，所述的组织是哺乳动物的组织。9.一种构建如权利要求l所述的组织工程气管移植物的方法，其特征在于，它包括步骤将螺旋形支架上形成的组织工程化软骨样组织埋植入活体哺乳动物体内组织中培养，得到如权利要求l所述的组织工程气管移植物，所述的体内培养组织包括肌肉组织、皮肤组织、筋膜组织或大网膜组织、或其组合。10.—种如权利要求1所述的组织工程气管移植物的用途，其特征在于，所述的移植物用于制备修复哺乳动物的气管组织缺损的移植物。全文摘要本发明提供了一种组织工程气管移植物，由软骨形成细胞和可降解生物材料复合后经体外和体内联合培养构建，与所在的体内培养组织有丰富的血供连接。本发明的组织工程气管移植物可以有效地修复气管节段性缺损。本发明还提供了它的构建方法及使用方法。文档编号A61F2/04GK101322859SQ20071004203公开日2008年12月17日申请日期2007年6月15日优先权日2007年6月15日发明者伟刘,周广东,磊崔,曹谊林,罗旭松申请人:上海国睿生命科技有限公司