专利名称：一种n-甲基-d-天冬氨酸受体抑制剂在制备避孕药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种N—甲基一D—天冬氨酸(NMDA) 受体抑制剂在制备避孕药物中的应用
背景技术：
世界人口已经超过60亿，并且以每年平均新增7700万的速度飞速增长，因而，控制人口 数量，已经成为全人类面临的重大问题,避孕是育龄夫妇面临的重大现实问题。目前避孕方法 主要有药物避孕和手术避孕，其中，药物避孕包括口服用药及外用避孕药两种方法，最常 用的口服避孕药为甾体避孕药，由于它是激素类药物，除了对生殖系统各环节有明显作用外， 几乎对人体各系统都有不同程度的影响，同时存在一些并发症和禁忌症。外用避孕药例如阴 道用药，是人类用以控制生育的最古老方法之一。在口服避孕药和宫内节育器问世之前，阴 道避孕法与安全期避孕、节欲、体外排精、人工流产等是人类控制生育的常用方法。直到上 世纪50年代后期，口服避孕药及宫内节育器相继发展，开创了节育的新时代。但是上世纪 70年代，随着口服避孕药及宫内节育器的广泛应用，从流行病的研究发现了它们所引起的全 身性不良反应和使用禁忌症，并日益引起人们的关注。因此，人们又转向研究安全，不良反 应小的外用避孕药。目前，人们使用的外用避孕药多为烷苯聚醇醚壬、苯醇醚制成的制剂， 外用避孕药物作用环节的重点在杀精子剂的研究，而本发明是以人类精子尾部存在的受体的 特异性转运蛋白为靶点，药物干预使精子不能正常运动，从而达到避孕的目的。本发明人经研究发现谷氨酸受体在人类精子上的存在， 一种N—甲基—D —天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate (NR2B)， NMDA (NR2B))受体特异性存在于人精子尾部，针对该 受体的药物干预人类精子后可使其失去达到受精的活动能力，这一研究将为人类的避孕提供 了新途径。谷氨酸是中枢神经系统(CNS)最主要的兴奋性神经递质，其功能由谷氨酸受体介导， 谷氨酸受体分为离子型谷氨酸受体和代谢性谷氨酸受体。谷氨酸的神经传递作用通过多种配 体门控离子通道(离子型谷氨酸受体)介导。根据序列同源性以及配体亲和力，离子型谷氨 酸受体分为三种亚型N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate， NMDA)受体、a-氨基-3-P5基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(a-amino陽3-hydroxy-5陽methyl-4-isoxazole propionate, AMPA)受体、 和红藻氨酸(kainate ， KA)受体，通常AMPA/KA受体被称为非NMDA受体。[Hollmann M， Heinemann S: loned glutamate receptors. Ann Rev Neurosci 17: 31-108, 1994; Nakanishi S: Molecular diversity of glutamate receptors and implications for brain function. Science 258: 597-603， 1992]。其中NMDA受体主要有两类亚基NR1和NR2; NR2有四种， NR2A. NR2B. NR2C禾tl NR2D，在不同发育过程中替换表达，在成年动物和人中以NR2B 表达最高。所有谷氨酸受体在中枢神经系统中均有表达并参与许多生理病理因素 [Collingridge GL, Lester RA: Excitatory amino acid receptors in the vertebrate central nervous system. Pharmacol Rev 40: 143-210, 1989; Sims KD， Robinson MB: Expression patterns and regulation of glutamate transporters in the developing and adult nervous system. Crit Rev Neurobio 13: 169-197, 1999]。然而，在外周组织中，谷氨酸受体是否存在、功能如何却还不 清楚。已经明确的是一些谷氨酸受体在肾上腺、垂体、松果体和胰岛上存在。近期的研究表 明代谢型谷氨酸受体在大鼠及人类的睾丸上有表达[Storto M， Sallese M, Salvatore L, Poulet R Condorelli DF， Albani PD, Marcello, MF, Romeo R, Piombone P, Barone N, Nicolette F, Blasi AD: Expression of metabotropic glutamate receptors in the rat and human testis. J Endocrinol 170: 71-78. 2001]，代谢性谷氨酸受体是G蛋白偶联受体。本发明发现了在人类精子上确有NMDA (NR2B)受体的存在并具有功能。发明内容本发明要解决的技术问题在于怎样应用NMDA受体抑制剂降低人类精子的活动度和宫 颈粘液的穿透，设计新的避孕药物。本发明提供了一种N—甲基一D—天冬氨酸(NMDA)受体抑制剂在制备避孕药物中的 应用。本发明人揭示了 NMDA受体在人类精子上的存在，免疫荧光实验显示NMDA受体在人 类精子上存在，NMDA (NR2B)受体表达于人类精子尾部。用NMDA受体的抑制剂(+)5-甲 基-10,ll-二氢-5H-二苯并(a，d)环更烯-5,10-亚胺(MK—801)阻断精子上NMDA受体的功能， 发现精子的运动受到了显著影响，尤其是精子的直线运动率显著下降；同时发现精子穿透宫 颈粘液的能力显著减弱了，说明以NMDA受体为靶点的抑制剂可以在临床上用于避孕。本发明所述NMDA受体的抑制剂具有下列结构式式中R为H,烷基，烯烃基，芳烷基，环烷基，环烯烃基； !^为H，卤素；R2为烷基，烯经基，芳烷基，环烷基，环烯烃基； 其中优选的NMDA受体抑制剂为MK—801:化学名(+)-5-甲基-10，ll-二氢-5H-二苯并(a,d)环更烯-5,10-亚胺，具有下列结构式:目前，NMDA受体抑制剂是用于抑制中枢神经系统的药物,本发明提供了此类药物用于避 孕的新用途。本发明所述NMDA受体抑制剂在用于避孕时,可按常规方法制成外用霜剂、膏剂、搽齐U、 涂剂或凝胶剂。使用时,可将本发明制剂的有效量施于男性生殖器外表皮肤或女性阴道内,即可 达到避孕的效果。本发明所述NMDA受体抑制剂是非激素类药物，因此不会有激素类药物的副作用。安 全有效、使用简便、有较大的临床应用价值。
具体实施例方式一、实施例1NMDA受体在人类精子上存在试验1. 方法实验所需药品的来源抗谷氨酸初级抗体购自Sigma公司，抗NB2B抗体购自Santa Cruz公司。FITC标记的二抗购自Sigma公司。人类精子样品从21 _43岁男子节欲3天后手 淫获得。精子于37'C液化30分钟检测正常精子，在含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定30 分钟，涂于明胶包被的载玻片上，干燥、固定。人类精子涂片用0.01M PBS洗涤，然后用含10%山羊或兔血清及0.1%Triton X-100的PBS 缓冲液封闭以降低非特异性免疫染色。用初级抗体或作为阴性对照的正常非免疫血清4'C过 夜，孵化后，涂片用PBS漂洗3次，并与相应的二抗(连接FITC)室温下孵化2小时，然 后用PBS漂洗，最后涂片在Leica荧光显微镜下检测并拍照。2、 结果实验发现在精子尾部可清楚地观察到NR2B特异性的荧光但精子头部无免疫活性 (图l)，说明离子型谷氨酸受体NMDA定位于人类精子尾部。二、 实施例2NMDA受体抑制剂MK—801对人类精子活动度的影响试验1、 方法实验所需药品的来源MK-801购自Sigma公司，人类精子手淫法取自25-40岁禁欲 5-7天，有婚育史的健康男子，精子液化后，以BWW液37。 C水浴中悬浮30分钟，调整精子 密度为6X 107，标本分别加入不同浓度MK-801 37° C水浴中哺育30分钟，用美国 Hamilton-IVOS精子分析仪检测，重复3次，实验结果用origin统计软件分析。2、 结果加入100inm和500|imMK-801后精子的直线运动速度(VSL )和平均路径速度(VAP) 明显降低与空白对照组相比差异有显著性。显示MK801能显著干扰精子的运动方向和速度。 见图2和图3。三、 实施例3NMDA受体抑制剂MK—801对人类精子穿透宫颈粘液的影响试验1、 方法实验所需药品的来源MK-801购自Sigma公司,人类精子手淫法取自25-40岁禁 欲5-7天，有婚育史的健康男子，精子液化后，以BWW液37。 C水浴中悬浮30分钟,调整 精子密度为6X 107,标本分别加入不同浓度MK-801 37° C水浴中哺育30分钟用于实验，宫 颈粘液，采用吸取法，在排卵前l-2天获取，入选标准为25-40岁有婚育史的健康女性，按 Moghissi评分系统，分值>10分，应用宫颈粘液相互作用实验(玻片法)，实验重复3次， 实验结果用origin统计软件分析。2、 结果 空白对照组与加入10pM、 30nM 、 100nM和300nM 、 MK-801组精子穿透精 液-宫颈粘液接触界面的数目相比较差异有显著性。显示MK-801能显著抑制精子通过宫颈粘 液。见图4以上实施例药物来源，(+)5-甲基-10，11-二氢-5H-二苯并(a， d)环更烯-5，10-亚胺(MK —801)购自Sigma公司。
图1免疫荧光实验显示NMDA (NR2B)受体特异性表达在人类精子尾部。 图2 NMDA受体抑制剂MK—801对人类精子直线运动速度的影响+p0.05横轴表示不同浓度MK—801的干预纵轴表示人类精子直线运动速度的数值空白对照组
100^ MK—801干预结果 500MM MK—801干预结果
图3 NMDA受体抑制剂MK—801对人类精子平均路径速度的影响 0.05 横轴表示不同浓度MK—801的干预
纵轴表示人类精子平均路径速度的数值
空白对照组
100MM MK—801干预结果 500MM MK—801干预结果
图4 NMDA受体抑制剂MK—801对人类精子穿透宫颈粘液的影响*p<0.05， **p<0.01， ***p<0.001
横轴表示不同浓度MK—801的干预
纵轴表示精子 一 宫颈粘液接触试验(sperm cervical mucus contact test, SCMC, 玻片法)通过界面的精子数。
空白对照
10 MM MK—801干预结果 30 , MK—801干预结果 100 MM MK—801干预结果
300MM MK_801干预结果
权利要求
1、一种N-甲基-D-天冬氨酸受体抑制剂在制备避孕药物中的应用。
2、 根据权利要求1所述的一种N—甲基_D —天冬氨酸受体抑制剂在制备避孕药物中的应 用，其特征在于所述受体抑制剂具有下式的化合物K式中R为H,烷基，烯烃基，芳烷基，环垸基，环烯烃基； R^为H,卤素；R2为垸基，烯烃基，芳垸基，环垸基，环烯烃基。
3、根据权利要求1所述的一种N—甲基—D—天冬氨酸受体抑制剂在制备避孕药物中的应 用，其特征在于所述受体抑制剂为下式的10,11-二氢-5H-二苯并(a,d〕环更烯-5，10-亚胺，具 有下列结构式
4、根据权利要求1所述的一种N—甲基一D —天冬氨酸受体抑制剂在制备避孕药物中的应 用，其特征在于所述药物为外用霜剂、膏剂、搽剂、涂剂或凝胶剂。
全文摘要
本发明公开了N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体抑制剂在制备避孕药物中的应用。本发明将NMDA受体抑制剂(+)5-甲基-10，11-二氢-5H-二苯并〔a，d〕环更烯-5，10-亚胺(MK-801)在人类精子上进行试验，结果显示NMDA受体在人类精子上存在，表达于人类精子尾部，MK-801能显著干扰精子的运动方向和速度。过NMDA受体抑制剂MK-801对人类精子穿透宫颈粘液的影响，结果显示MK-801能显著抑制精子通过宫颈粘液。本发明所述NMDA受体抑制剂是非激素类药物，因此不会有激素类药物的副作用。安全有效、使用简便、有较大的临床应用价值。
文档编号A61P15/18GK101317844SQ20071004178
公开日2008年12月10日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者张文萍, 章劲夫, 胡佳华 申请人:章劲夫