专利名称：磁性壳聚糖载药纳米粒子及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药的药物载体领域，尤其是壳聚糖载药粒子，具体地说，是具有磁性的壳聚糖载药纳米粒子。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰基的产物。它是一种氨基多糖，有许多独特的物理、化学特性和生物功能。壳聚糖具有良好的生物黏附特性和生物可降解性(蒋挺大.壳聚糖.北京化学工业出版社20011～32)，可增强穿透作用及酶抑制作用，因此被研制成为生物大分子药物的运送载体，以增加药物在体内的有效浓度，提高疗效。与其它种类的高分子药物载体相比，壳聚糖不仅原料丰富，而且具有成本低、可生物降解、良好的生物相容性和生物亲和性、无毒、易于化学改性等优点，本身还具有抗菌、止血、抑制癌细胞转移等作用。
磁性载药纳米粒子的制备(如磁性壳聚糖载药纳米粒子)是当前药物载体的研究热点之一。在外加磁场的作用下，温度上升至40～45℃，磁性粒子本身可达到杀死肿瘤的目的；另一方面，磁性载药纳米粒子可通过外加磁场选择性定位于肿瘤靶区，使药物在肿瘤组织的细胞或亚细胞水平发挥药效作用，从而减小对体内正常组织产生的毒副作用。与粒径为毫米或微米级的粒子相比，纳米粒子由于尺寸小，能够在体内长循环，较易进入细胞或组织内部/均匀地分布在病灶部位，从而更好地发挥疗效(杨文胜，高明远.纳米材料与生物技术北京化学工业出版社200594～111)。
研制具有磁性的壳聚糖载药纳米粒子，不仅保留了壳聚糖作为药物载体所具备的各种优点，如缓释、生物相容性和可降解性等，而且在药物靶向定位应用于肿瘤治疗等方面，具有积极的意义。目前，壳聚糖及其衍生物包裹着DNA、阿霉素、紫杉醇、胰岛素等药物均已有报道。
从目前壳聚糖在制备磁性载药纳米粒子上的相关研究来看，普遍存在着分散性较差、粒径较大(多为微米级粒子)等问题(何强芳，李国明，巫海珍等.应用化学2004，21(02)192～196)。
发明内容
本发明目的在于提供一种磁性壳聚糖载药纳米粒子。
本发明的另一个目的在于提供制备这种磁性壳聚糖载药纳米粒子的方法。
5-氟脲嘧啶是目前用于临床的一种广谱抗肿瘤药物，尤其适用于治疗各种消化道肿瘤；γ-Fe2O3是目前医学研究涉及较多的磁性物质，其低毒性和优良的磁性能等都已被广泛验证。
选用5-氟脲嘧啶(5-Fu)为活性组分，选用γ-Fe2O3粒子(平均粒径为15-25nm)为磁性物质。本发明的磁性壳聚糖载药纳米粒子，包裹了5-氟脲嘧啶，为单分散的规则球体，粒径可以控制在70-130nm。以K562细胞进行细胞生长实验，结果显示本发明的磁性载药纳米粒子对肿瘤细胞有明显的促凋亡作用。
制备方法采用了乳液-交联法，包括如下步骤(1)以含有壳聚糖、γ-Fe2O3纳米粒子、5-氟脲嘧啶的醋酸水溶液作为水相，以含有表面活性剂司班80的液体石蜡溶液为油相，将水相与油相混合，在35-40℃的恒温条件下搅拌2～3小时，制备微乳液。
(2)接着用柠檬酸三钠作交联剂，将壳聚糖包裹的药物和磁性纳米粒子从微乳液中固化析出，用石油醚和异丙醇洗涤粒子，真空干燥后保存。即可制得载有5-氟脲嘧啶的磁性壳聚糖载药纳米粒子(以下简称为CS/5-Fu MNPs)。
所述的壳聚糖、司班80、柠檬酸三钠、γ-Fe2O3的质量比为500-4000∶1000-2000∶80-160∶1-10。
其中壳聚糖与5-氟脲嘧啶的质量比为1∶1-4∶1，优选为1.5∶1-3∶1。
醋酸水溶液中醋酸含量为0.5％-1％(质量比)。
液体石蜡溶液中含0.4％-0.6％表面活性剂司班80(体积比)。
本方法中，5-Fu的包封率在40％-50％，粒子的载药量在15％-25％。
本发明的磁性载药纳米粒子对肿瘤细胞有明显的促凋亡作用，粒子直径为纳米级别，分散性好，无团聚现象，且具有缓释作用。对于建立磁性载药纳米粒子的制备与应用技术平台具有重要的参考价值。
图1 CS/5-Fu MNPs及各组成成分的红外光谱2 CS/5-Fu MNPs透射电镜3 CS/5-Fu MNPs对k562细胞生长抑制效果图具体实施方式
实施例1采用乳液-交联法，用壳聚糖对5-氟脲嘧啶和γ-Fe2O3纳米粒子进行包裹，得到粒径大小约为70-130nm的球形粒子，具体步骤如下(1)、将100mg的壳聚糖、0.1mg γ-Fe2O3纳米粒子(平均粒径20nm)与含40mg 5-氟脲嘧啶的0.5％稀醋酸溶液(质量比)2ml混合，加入到已溶有0.5％司班80的40ml液体石蜡(体积比)中，在35℃条件下恒温搅拌2小时；(2)、在混合液中加入0.5ml 2％柠檬酸三钠，反应30min后固化析出粒子；将所得到的粒子分别用石油醚和异丙醇洗涤，并将粒子真空干燥保存。
用红外光谱仪(FT-IR)、透射电子显微镜(TEM)等测试仪器进行粒子表征。结果见附图1和附图2附图1表明，在CS/5-Fu MNPs的IR光谱上，在1395cm-1处出现了CS中的-CH2-曲振动；在1105cm-1处出现了5-Fu中的C-N伸缩振动蓝移的吸收峰；在620cm-1和678cm-1处出现γ-Fe2O3的特征吸收峰；此外，979cm-1处峰是由5-Fu中的-CF＝CH-中的C-H的面外弯曲振动峰红移所产生。红移现象说明经包裹后，5-Fu分子之间的作用力被削弱。此图说明所制得的粒子中包含壳聚糖、5-Fu和γ-Fe2O3，成功实现了壳聚糖的包裹目的。
附图2表明，制成的CS/5-Fu MNPs为球型粒子，这些粒子分散均匀，无团聚现象，粒径范围控制为100±30nm。从该图可以清楚地看出γ-Fe2O3粒子被包裹在粒子中。
实施例2(1)、将120mg的壳聚糖、0.2mg γ-Fe2O3纳米粒子(平均粒径20nm)与含50mg 5-氟脲嘧啶的0.5％稀醋酸溶液(质量比)2ml混合，加入到已溶有0.5％司班80的35ml液体石蜡(体积比)中，在35℃条件下恒温搅拌2小时。
(2)、在混合液中加入0.5ml 2％柠檬酸三钠，反应30min后固化析出粒子；将所得到的粒子分别用石油醚和异丙醇洗涤，并将粒子真空干燥保存。
实施例3(1)、将180mg的壳聚糖、0.1mg γ-Fe2O3纳米粒子(平均粒径20nm)与含100mg 5-氟脲嘧啶的1％稀醋酸溶液(质量比)2ml混合，加入到已溶有0.4％司班80的40ml液体石蜡(体积比)中，在40℃条件下恒温搅拌2小时。其余步骤同实施例1。
(2)、在混合液中加入0.5ml 2％柠檬酸三钠，反应30min后固化析出粒子；将所得到的粒子分别用石油醚和异丙醇洗涤，并将粒子真空干燥保存。
实施例1-3中，将所得到的CS/5-Fu MNPs溶解于0.1mol/L盐酸溶液中，可测定5-Fu的包封率为40％-50％，粒子的载药量在15％-25％。
对照例(1)、将100mg的壳聚糖、0.1mg γ-Fe2O3纳米粒子(平均粒径20nm)加入到已溶有0.5％司班80的40ml液体石蜡(体积比)中，在35℃条件下恒温搅拌2小时。
(2)、在混合液中加入0.5ml 2％柠檬酸三钠，反应30 min后固化析出粒子；将所得到的粒子分别用石油醚和异丙醇洗涤，并将粒子真空干燥保存。
实施例4将实施例1制备的包裹5-氟脲嘧啶的磁性壳聚糖载药纳米粒子，和对照例所制备的未包裹5-氟脲嘧啶的磁性壳聚糖纳米粒子进行对照试验。
将实施例1所制备的磁性壳聚糖载药纳米粒子分散在含有牛血清的1640细胞培养液中，分别取20μl不同浓度的磁性壳聚糖载药纳米粒子(5μg/μl、2.5μg/μl、1.25μg/μl)和未载药壳磁性聚糖纳米粒子(5μg/μl)的细胞培养液于三块96孔板中，每孔先加入30μl k562细胞，再加入50μl含有牛血清的1640细胞培养液，使每孔体积为100μl。将这三块培养板放入细胞培养箱，培养时间分别为48h、72h和96h，用MTT法观察所制的粒子对细胞的促凋亡作用效果(每个样平行测定12次)。实验结果如附图3所示。附图3表明1、载药磁性纳米粒子显著促进了k562细胞的凋亡，且细胞凋亡率随着培养时间的增长而升高；2、粒子浓度对细胞凋亡有影响。培养时间相同时，粒子浓度越大，细胞凋亡率越高；3、与未载药的磁性纳米粒子相比，载药磁性纳米粒子对细胞的促凋亡作用显著，凋亡率随时间增长而逐渐增高，说明药物被成功包覆在粒子中，载药磁性纳米粒子具有缓释作用。
权利要求
1.一种磁性壳聚糖载药纳米粒子，包括壳聚糖、γ-Fe2O3，其特征在于，以5-氟脲嘧啶为活性组分，所述磁性壳聚糖载药纳米粒子为球形颗粒，粒径大小为70-130nm。
2.权利要求1的磁性壳聚糖载药纳米粒子，其特征在于，所述磁性壳聚糖载药纳米粒子中5-氟脲嘧啶质量百分比为15％-25％。
3.一种磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)以含有壳聚糖、γ-Fe2O3纳米粒子、5-氟脲嘧啶的醋酸水溶液作为水相，以含有表面活性剂司班80的液体石蜡溶液为油相，将水相与油相混合，在35-40℃的恒温条件下搅拌2～3小时，制备微乳液；(2)以用柠檬酸三钠作交联剂，将壳聚糖包裹的磁性载药纳米粒子从微乳液中固化析出，用石油醚和异丙醇洗涤粒子，真空干燥；所述的壳聚糖、司班80、柠檬酸三钠与γ-Fe2O3的质量比为500-4000∶1000-2000∶80-160∶1-10。
4.权利要求3的磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，壳聚糖与5-氟脲嘧啶的质量比为1∶1-4∶1。
5.权利要求4的磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，壳聚糖与5-氟脲嘧啶的质量比为1.5∶1-3∶1。
6.权利要求3的磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述醋酸水溶液中醋酸质量浓度为0.5％-1％。
7.权利要求3的磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述在液体石蜡溶液中所含表面活性剂司班80的体积百分比浓度为0.4％-0.6％。
8.权利要求3的磁性壳聚糖载药纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述γ-Fe2O3纳米粒子的平均粒径为15-25nm。
全文摘要
本发明涉及一种磁性壳聚糖载药纳米粒子及其制备方法。磁性壳聚糖载药纳米粒子为球形颗粒，粒径大小为70－130nm，以5－氟脲嘧啶为活性组分。制备方法包括以含有壳聚糖、γ－Fe
文档编号A61K9/14GK101085359SQ20071004201
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月14日 优先权日2007年6月14日
发明者沈鹤柏, 马经纬, 陈艳 申请人:上海师范大学