专利名称：：蛇莓酚性提取物、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药有效成分提取物，尤其涉及一种从植物蛇莓中提取得到的酚性提取物，本发明还涉及该该提取物的制备方法和该提取物的用途，属于中药领域。
背景技术：
：蛇莓[i>c/^wea!>u^aFoc&]为蔷薇科蛇莓属植物，别名三匹风、地莓、一点红、蛇含草、野杨梅等，为民间常用草药。蛇莓以全草入药，具有清热解毒、消肿散瘀，收敛止血、凉血之功效。已有文献报道蛇莓具有显著的抗肿瘤活性，但所报道的都是蛇莓的水提或醇提的粗提取物，迄今为止，尚未得到蛇莓的抗肿瘤活性组分。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种蛇莓的抗肿瘤活性组分，即蛇莓酚性提取物(Drchesneapolyphenolicextract，DPE)。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种制备蛇莓酚性提取物的方法，包括(1)用水、50-80%乙醇或乙醇与水以任意比例所组成的混合液为提取溶剂浸泡提取蛇莓(提取溶剂没过蛇莓即可)，过滤得蛇莓提取液；(2)将蛇莓提取液减压浓縮去除乙醇后通过大孔吸附树脂柱，先用水洗去非有效成分后，再用50-95%乙醇(更优选为90-95%乙醇)洗脱大孔吸附树脂柱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮至干得蛇莓酚性提取物(DPE)。上述制备方法中，优选的，步骤(1)中用水、50-80%乙醇或乙醇与水以任意比例所组成的混合液为提取溶剂浸泡提取蛇莓3次，每次提取1小时;更优选用80°C热水为提取溶剂浸泡提取蛇莓3次，每次提取1小时。步骤(2)中所述的非有效成分是糖、有机盐、氨基酸、蛋白质、色素等；步骤(2)中大孔吸附树脂柱优选为用AB-8，D3520,DM130，D8，D101或D201大孔吸附树脂柱。本发明蛇莓酚性提取物具有抑制多种肿瘤细胞的增殖和生长作用，可用于多种癌症的治疗，包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等；此外，本发明蛇莓酚性提取物可提高细胞和体液免疫功能。因此，本发明蛇莓酚性提取物可用于制备成抗肿瘤或提高人体免疫力的药物。本发明蛇莓酚性提取物提取物可以加入制备不同剂型时所需的各种辅料和药学上可接受的赋形剂或载体后，以常规的中药制剂方法制备成任何一种适宜的临床制剂，例如可以是注射剂(粉针、冻干粉针、水针、输液等)、片剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊或滴丸等；其中，所述的辅料可以是抗氧络合剂、填充剂、骨架材料等；所述的药学上可接受的载体是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯垸酮、低分子右旋糖酐、氯化钠、葡萄糖酸钙或磷酸钙中的一种或几种。为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。具体实施例方式实施例l取蛇莓全草200g，加入80°C热水3L，浸泡提取3次，每次1小时。过滤除去药渣，合并提取液，将提取液缓缓通过AB-8型大孔吸附树脂柱，以10L水洗去糖、有机盐、氨基酸等非有效成分后，再以6L90。/。乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮至干得蛇莓酚性提取物llg。以分光光度法(ScalbertA,MontiesB，Jannin，G.Taninsinwood:comparisonofdifferentestimationmethods.JournalofAgriculturalandFoodChemistry1989，37:1324-1329.)测得，此提取物中含酚总量以表儿茶精计为46.1%。实施例2取蛇莓全草150g，加入水2.5L，使浸过药面，浸泡提取3次，每次1小时。过滤除去药渣，合并提取液，将提取液缓缓通过AB-8型大孔吸附树脂柱，以10L0.1%盐酸水溶液洗去糖、有机盐、氨基酸等非有效成分后，再以6L95。/。乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮至干得蛇莓酚性提取物9.6g。以分光光度法(ScalbertA,MontiesB,Jannin，G.Taninsinwood:comparisonofdifferentestimationmethods.JournalofAgriculturalandFoodChemistry1989，37:1324-1329.)测得，此提取物中含酚总量以表儿茶精计为41.9%。实施例3取蛇莓全草130g，加入80%乙醇2L浸泡提取3次，每次1小时。过滤除去药渣，合并提取液，将提取液减压浓縮除去乙醇后，加5L水稀释，滤液通过D3520型大孔吸附树脂柱，先以10L水洗去糖、有机盐、氨基酸等非有效成分，再以6L90%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮至干得蛇莓酚性提取物5.2g。以分光光度法(ScalbertA，MontiesB,Jannin，G.Taninsinwood:comparisonofdifferentestimationmethods.JournalofAgriculturalandFoodChemistry1989，37:1324-1329.)测得，此提取物中含酚总量以表儿茶精计为40.2%。试验例1蛇莓酚性提取物对人肿瘤细胞生长的抑制作用取对数生长期的肿瘤细胞(购自中国协和医科大学基础学院细胞中心)，以5000个/孔接种于96孔板中，于37i:5%C02条件下培养10-12小时后，给药组加入DPE(本发明实施例1、2或3所制备)，使其终浓度为20-240pg/mL，空白对照组为0.08%二甲基亚砜，阳性对照组为20nmol/L的顺铂，采用MTT比色法，于波长570nm/650nm处测定吸光度A值。根据A值计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。肿瘤细胞的生长抑制率=(1-实验组的A值/阴性对照组的A值)xl00X试验结果表明，DPE对多种肿瘤细胞具有抑制增殖作用(表l)，特别对肺癌、鼻咽癌和肝癌细胞具有很强的抑制作用，对妇科肿瘤细胞亦有较好的抑制作用。表1.蛇莓酚性提取物对肿瘤细fll<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>试验例2蛇莓酚性提取物对小鼠移植性肿瘤U14的抑制作用取生长良好的腹水癌细胞(购自中国医学科学院药物研究所)，洗涤后以适量无菌生理盐水制成含细胞数为2.5xl(^个/mL的瘤细胞悬液。分别于小鼠(购自中国医学科学院动物中心)右腋窝皮下接种此瘤细胞悬液0.2mL(含瘤细胞5xl(^个)。接种次日将荷瘤鼠随机分为5组，每组10只，其中3个组为给药组，分别口服灌胃给予DPE(本发明实施例l、2或3所制备)以3个不同剂量(0.25，0.5和lg/kg)，模型组为口服灌胃给予等体积蒸馏水。给药组和模型组均连续灌服20天。阳性对照组为腹腔注射环磷酰胺(CTX)60mg/kg，在接种瘤细胞后于次日仅给予一次。各组动物均常规饲养，饮水，食物不限。小鼠在21日时全部脱颈椎处死，剥取皮下实体瘤瘤块，称重，按下列公式计算肿瘤抑制率(％)。肿瘤抑制率(％)=(模型组平均瘤重一实验组平均瘤重)/模型组平均瘤重x100%。试验结果(表2)显示，低剂量的DPE(0.25g/kg)对小鼠子宫颈癌U14的生长有促进作用；而高剂量的DPE(0.5g/kg和lg/kg)能明显抑制U14的生长，抑瘤率分别为27%和63%;DPE各剂量组均未见明显的毒性反应，治疗结束时小鼠全部存活。表2.DPE体内抗肿瘤作用(均值±SD,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**,P<0.01同对照组相比试验例3蛇莓酚性提取物免疫功能试验1.对细胞免疫功能的影响一T淋巴细胞转化试验在试验例2中，将连续给药20日的U14荷瘤小鼠处死后，立即在无菌下取脾，用冷的无菌PBS冲洗后研磨，研磨后的脾细胞经PBS洗涤后以含10X胎牛血清的RPMI-1640制成5xl0VmL的细胞悬液。加此细胞悬液于96孔板，100^L/L。并加入ConAlOinL(终浓度2.5/xg/mL)。培养60小时后，每孔加入MTT20pL(终浓度0.5mg/mL),继续培养4小时后，加入三联液IOO/iL[含SDS10%(w/v)，异丁醇5%(v/v)和HC10.01mol/L(v/v)],37t:过夜。酶标仪570nm处测吸收值A。2.对体液免疫功能的影响一溶血素分光光度法选用昆明雌性小鼠(购自中国医学科学院动物中心)，U14瘤细胞接种后，动物分组及给药途径、方法、剂量和时间均与试验例2中相同，于接种后第16日给小鼠腹腔注射0.4mL的5XSRBC使动物致敏。于21日停药处死动物并取脾。脾经研磨、洗涤后，用冷PBS制成含2xlO,L的细胞悬液。将此脾细胞悬液lmL与0.2XSRBClmL和l:10稀释补体lmL充分混匀，于37t水浴60min后，3000rpm离心5min。取上清于413nm处测吸收值A。以上T淋巴细胞转化实验和溶血素分光光度实验结果(表3)显示，与正常小鼠相比，荷瘤小鼠的细胞和体液免疫功能均明显减弱。蛇莓酚性提取物lg/kg能明显促进荷瘤小鼠的T淋巴细胞的增殖；但低剂量的DPE(0.25g/kg)明显抑制淋巴细胞的增殖。不同剂量的DPE均可使荷瘤小鼠的体液免疫功能增强，表现为剂量依赖性的抗体量增加。表3DPE对T淋巴细胞增殖和B淋巴细胞抗体释放的影响(均值±SD.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>##，P<0.01,同正常组相比*,P<0.05，**，P<0.01，同模型组相比权利要求1、一种制备蛇莓酚性提取物的方法，包括(1)用水、50-80%乙醇或乙醇与水以任意比例所组成的混合液为提取溶剂浸泡提取蛇莓，过滤去除药渣得蛇莓提取液；(2)将蛇莓水提取液或减压去除乙醇后的蛇莓提取液通过大孔吸附树脂柱，先用水或0.1%盐酸洗去非有效成分后，再以50-95%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓縮至干，得蛇莓酚性提取物。2、按照权利要求l的方法，其特征在于步骤(1)中用水、50-80%乙醇或乙醇与水以任意比例所组成的混合液为提取溶剂浸泡提取蛇莓时，提取3次，每次提取l小时。3、按照权利要求2的方法，其特征在于步骤(1)中用8(TC热水为提取溶剂浸泡提取蛇莓。4、按照权利要求l的方法，其特征在于步骤(2)中所述的非有效成分包括糖、有机盐、氨基酸、蛋白质或色素。5、按照权利要求1的方法，其特征在于步骤(2)中所述的大孔吸附树脂柱选自AB-8，D3520,DM130,D8，D101或D201大孔吸附树脂柱。6、一种蛇莓酚性提取物，其特征在于由权利要求1-5任何一项方法制备得到的产品。7、按照权利要求6的蛇莓酚性提取物，其特征在于按照常规中药制剂方法制备成片剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或口服液。8、权利要求6的蛇莓酚性提取物在制备治疗肿瘤药物中的用途。9、按照权利要求8的用途，其特征在于所述的肿瘤包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌、子宫颈癌、子宫内膜癌或卵巢癌。10、权利要求5的蛇莓酚性提取物在制备增强机体免疫力药物中的用途。全文摘要本发明公开了一种从蛇莓全草中提取的蛇莓酚性提取物，还涉及该提取物的制备方法以及该提取物的用途。该蛇莓酚性提取物的制备方法如下，包括用水、乙醇或乙醇与水以任意比例所组成的混合液为提取溶剂浸泡提取蛇莓，将蛇莓提取液减压浓缩去除乙醇后通过大孔吸附树脂柱，先用水洗去非有效成分后，再用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至干得蛇莓酚性提取物。本发明蛇莓酚性提取物具有抑制多种肿瘤细胞的增殖和生长作用，可用于多种癌症的治疗，包括肺癌、肝癌、鼻咽癌、胃癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等；此外，本发明蛇莓酚性提取物还具有提高机体免疫功能的活性。文档编号A61K9/20GK101120970SQ200710063000公开日2008年2月13日申请日期2007年1月24日优先权日2007年1月24日发明者刘新民,唐劲天,琪常,博彭,王予祺,王立为,琴胡申请人:中国医学科学院药用植物研究所;清华大学