枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物中的应用的制作方法

专利名称：枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及血管钙化领域，是枸橼酸铁在防治血管钙化中的用途，尤其是涉及防治心血管异位钙化的研究领域，具体地说，是枸橼酸铁在防治心血管异位钙化中的应用。
背景技术：
血管钙化(也称心血管系统异位钙化)是与临床心血管疾病密切相关的一种病理改变，主要发生于动脉血管壁及心脏瓣膜，与衰老、动脉粥样硬化性血管病变、主动脉瓣狭窄以及糖尿病、终末期肾病等密切相关，可增加急性心肌梗死、外周血管疾病缺血发作及血管成形术后内膜撕裂等严重临床事件的发生，是心血管疾病发生率和死亡率的预测因素。
血管钙化主要发生在血管壁的两个部位点内膜和中膜。钙化发生于内膜称为内膜性钙化(内膜钙化)，主要与动脉粥样硬化性疾病相关联；钙化发生于中膜称为中膜性钙化(中膜钙化)，其独立于冠状动脉硬化病变存在，主要发生于衰老、糖尿病、尿毒症等病理状态。两个位点的钙化有不同的形态学及病理学特征，参见下表。内膜钙化发生于脂质条纹形成期，形态为小的呈弥漫分布的羟基磷灰石晶体钙沉积，并形成与生理性骨化类似的细胞内基质小泡。中膜钙化发生于无炎性细胞浸润及脂质沉积的环境中，在人颈动脉中膜钙化位点并未发现巨噬细胞及肥大细胞，已在人动脉中膜的弹力层发现基质小泡，中膜钙化的机制目前不清楚。
表内膜钙化与中膜钙化的对比


心血管系统异位钙化是一个特殊的、主动的、可调节的过程。应用免疫组化及原位杂交的方法发现在生理性骨化过程中出现的羟基磷灰石、基质小泡、I型胶原及非胶原性骨结合蛋白(NCPs)，包括骨桥蛋白、基质Gla蛋白、骨钙素、骨连接素及骨形态发生蛋白(BMPs)等存在于动脉粥样硬化斑块、钙化的动脉及瓣膜；MGP基因敲除小鼠出生2个月内因主动脉瓣、弹力及肌性大动脉发生广泛钙化死于动脉破裂及心脏衰竭；CVCs细胞的克隆揭示血管壁中存在类似旁细胞或间充质细胞的细胞，可自发形成钙化小结，GF-β1、25-羟胆固醇、17β-雌二醇及1，25-维生素D3等可促进体外培养的牛主动脉平滑肌细胞钙化。血管钙化与生理性骨质形成类似，是主动的、可调节的过程。
心血管系统钙化是一个多病因、多途径、由多种分子参与的十分复杂的过程，其中心环节是靶细胞在各种外界因素(如衰老、脂质沉积、粥样硬化、坏死等)的启动作用及体内外多种因素(如1，25-维生素D3、TGF-β1等)的促进作用下，基因表型发生改变，逐渐向成骨细胞分化，分泌成骨细胞样基质，而分泌的骨基质又可作用于细胞，两者互相作用，最终形成钙化。
现代医学研究虽然已经认识到心血管系统异位钙化的危害，但目前仍没有有效的治疗方法。目前业内比较认可并采用的钙通道阻断剂治疗方法，动物实验表明在减少动脉钙沉积方面是有效的，但是在不同的血管钙化区域对钙通道阻断剂的治疗反应是不同的，总体来说临床效果亦不甚满意。有报道绝经后服用激素替代疗法的妇女比没有服用激素的妇女冠脉钙化程度低，但雌激素不能作为动脉钙化治疗的首选剂。临床研究结果表明维生素K减轻血管钙化同时还能改善部分患者的骨质疏松症，维生素K治疗的耐受性好，并未引起高凝状态。在目前所有能够阻止动脉钙化进展的药物中，3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(3-hydroxyl-3-methyl glutaryl CoA，HMG CoA)还原酶抑制剂可能是最具有潜能的药物。HMG CoA还原酶抑制剂可能对血管钙化与骨质疏松并存的患者有特殊的益处，因为HMG CoA还原酶抑制剂还能抑制破骨细胞的形成和骨的再吸收，并促进新骨的生成。
现有技术中枸橼酸铁的应用目前枸橼酸铁主要为补铁的食品添加剂或为营养增补剂(铁质强化)，例如，可以添加于饼干、改质的奶粉和小麦粉等，印度也用于食盐；也有用于治疗慢性肾衰患者高磷血症的报道，Wu-Chang Yang等报道枸橼酸铁作为新的磷结合剂可用于慢性肾功能衰竭的血液透析患者，其与食物同时服用，可以结合食物中的磷酸盐，减少胃肠道对磷酸盐的吸收，从而降低慢性肾功能衰竭患者的高磷血症。由于慢性肾脏疾病患者也存在心血管钙化的现象，有观点认为高磷血症是引起ESRD(终末期肾衰)患者心血管钙化的影响因素，高磷血症参与了ESRD的血管异位钙化，但实验证明有部分血管钙化的ESRD患者的血磷及血钙仍然正常，另外动脉粥样硬化等伴发的血管钙化与人体血磷水平没有直接关系。因此，慢性肾衰的心血管系统钙化是多病因、多途径、由多种分子参与的十分复杂的过程，血磷水平对钙化的影响未知。

发明内容
发明人经研究发现，枸橼酸铁可有效防治由维生素D3和尼古丁造成的大鼠的动脉钙化，从而证明了枸橼酸铁通过干预软组织钙化形成过程，可有效抑制心血管异位钙化，并有可能逆转异位钙化的发生。
本发明的目的在于提供枸橼酸铁的新用途，即，枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物的应用。
本发明的目的还在于提供枸橼酸铁的一种新用途，尤其是，枸橼酸铁在制备防治心血管系统钙化相关疾病的药物中的应用。
本发明提供了枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物中的应用。
上述血管钙化尤其指的是心血管异位钙化。
本发明提供了枸橼酸铁的一种新的用途，即对心血管异位钙化的防治作用。
本发明还提供了枸橼酸铁在制备防治心血管异位钙化的药物中的应用。
其中所述的心血管异位钙化包括内膜钙化和/或中膜钙化，所述的内膜钙化包括发生于动脉粥样硬化或相关病理状态下的血管钙化；所述的中膜钙化包括发生于衰老及糖尿病、尿毒症等病理状态下的血管钙化。
本发明所述的防治心血管异位钙化既包括预防心血管异位钙化，同时也包括治疗心血管异位钙化，其中，本发明所述的预防血管钙化包括预防由血管钙化引起的并发症，如高血压等。实验证明，枸橼酸铁在预防和治疗异位钙化的过程中均能达到预期的效果。
本发明上下文中的术语“预防”，不仅指完全预防某一种影响，也指在疾病发作前或发作早期任何部分基本上预防、减弱、降低、减退或消除这种影响。
本发明上下文中的术语“治疗”，指任何对疾病的进展有益的效果，包括在疾病发作后减弱、降低、减退或消除病理的发展。
本发明提供的枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物中的应用，该应用包括枸橼酸铁在制备防治由衰老、糖尿病、终末期肾病或动脉粥样硬化等病症伴发或引起的血管钙化的药物中的应用。
曾有过枸橼酸铁治疗慢性肾衰患者高磷血症的报道，而高磷血症是引起ESRD(终末期肾衰)患者心血管钙化的影响因素，高磷血症参与了ESRD的血管异位钙化，所以有观点认为枸橼酸铁也许可通过降低血磷值来影响心血管钙化，但本发明的大量实验证明，有部分血管钙化的ESRD患者的血磷及血钙仍然正常，说明异位钙化的机制是复杂的，虽然不排除可能存在高血磷的影响，但是不可质疑的是，局部因素(如PDGF)或抑制钙化因素(如fetuin-A、MGP等)也在起作用，例如，MGP基质Gla蛋白，在局部组织强烈抑制钙磷盐的沉积，PDGF血小板源生长因子能增加平滑肌细胞对磷的摄取并不增加对磷的亲和力，同时PDGF也在以一种时间和剂量依赖的方式诱导NPC的活化和表达，并促进平滑肌细胞的钙化，说明PDGF介导的钙化可发生在血磷正常的情况下。另外动脉粥样硬化等伴发的血管钙化与人体血磷水平没有直接关系。因此，慢性肾衰的心血管系统钙化是多病因、多途径、由多种分子参与的十分复杂的过程，血磷水平对钙化的影响未知。
本发明采用与人体心血管系统钙化相关性很好的大鼠VDN动物模型。维生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的弹性动脉钙化，是与由年龄和年龄相关的血管病理变化最相关的血管钙化动物模型，在人动脉粥样硬化病变过程中发现的钙结合蛋白--S-100，与VDN大鼠动脉中膜钙化相关，VDN大鼠模型动脉钙化的机理和结果与人动脉粥样硬化血管钙化十分相似，人动脉钙化的基本特征是老龄或年龄相关的血管病变，如动脉粥样硬化、糖尿病和肾脏疾病，而大鼠是研究与老龄和/或年龄相关的病理改变等发生血管钙化的最常用动物模型。采用维生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的弹性动脉钙化的强度与人相近，可作为用于研究人血管钙化导致动脉硬化的动物模型，具体参见Nathalie Niederhoffer，Yuri V.Bobryshev，et al.Aortic calcification produced by Vitamin D3 plus nicotine.Journal ofvascular research 1997；34386-398。
为评价枸橼酸铁在防治心血管系统异位钙化方面的有效性，本发明做以下述药理药效实验。
一、枸橼酸铁给药对于异位钙化的治疗作用1.材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～180g，由北京大学医学部实验动物中心提供(合格证号SCXK京2002-0001)；尼古丁、维生素D3购自Sigma公司；45CaCl2购自美国New England Nuclear公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定试剂盒购自北京利德曼公司；其余试剂为国产分析纯；枸橼酸铁由协和药业有限公司提供，用4％淀粉溶液制成混悬液，按不同给药剂量灌胃给药。
2.实验方法2.1大鼠血管钙化模型制备和实验分组参照Niederhoffer方法，制备大鼠血管钙化动物模型。雄性SD大鼠54只，体重150～180g，随机分为5组(1)血管钙化组(VDN)(n＝12)实验第一天9:00给大鼠肌注维生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重复灌胃1次，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续4周；(2)空白对照组(control，n＝10)给予等量大豆油肌注、单纯大豆油灌胃代替维生素D3和尼古丁，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续4周；(3)血管钙化+枸橼酸铁低剂量组(VDN+L)(n＝12)钙化处理同(1)，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天按剂量370mg/kg给予枸橼酸铁，连续灌胃给药4周；(4)血管钙化+枸橼酸铁中剂量组(VDN+A)(n＝10)给药方法同(3)，剂量为740mg/kg；(5)血管钙化+枸橼酸铁高剂量组(VDN+H)(n＝10)给药方法同(3)，剂量为1110mg/kg枸橼酸铁，连续灌胃给药4周。
各组动物常规饲养，3天测一次体重，每周测一次尾动脉压；8周后，乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉动物，眼底取血，测定血液生化指标；摘取心脏和全长胸腹主动脉，用生理盐水冲洗后，心脏称重，-70℃储存备用。
2.2von Kossa染色从主动脉弓起，取1～1.5cm的胸主动脉血管条，用4％多聚甲醛固定；用石蜡包埋胸主动脉并切片，7μm，常规脱蜡、脱水；浸入1％硝酸银溶液，在日光下照射30min后，将玻片放于5％硫代硫酸钠溶液中1min，碱性品红返染；脱水、透明、封片，光镜观察。
2.3组织45Ca沉积取胸主动脉(约20mg)，制备成0.3mm左右的组织薄片，置于1ml DMEM孵育液中，加入37kBq/mL45CaCl2，通体积分数为95％O2-5％CO2气体，37℃恒温水浴中持续平衡孵育10h后，用双蒸水冲洗3次；烤干(80℃，2h)，称重，取0.5mL甲酸消化组织；取0.4mL消化液置于闪烁瓶中，加4mL闪烁液，用β-液闪计数仪测45Ca2+放射活性(CPM/mg)。
2.4血管钙含量取腹主动脉(约10mg)，80℃烤干(2-3h)，称重，转移至石英杯内，加入2mol/L硝酸1ml，2滴高氯酸，180℃消化并烤干，冷却后用去离子水复溶，定容至2ml。原子发射光谱在422.7nm读取吸光度，换算成组织的钙含量(μmol/g dw)。
2.5ALP(碱性磷酸酶)活性测定取腹主动脉约10mg，以等渗PBS制备组织匀浆(匀浆缓冲液20mmol/LHEPES，pH7.4，0.2％NP-40，20mmol/L MgCl2，PBS定容至50ml)。匀浆后8000×g离心10min，吸取上清液。BCA法进行蛋白定量。按ALP测定试剂盒说明，采用SFBC速率法测定血管组织ALP活性[U/(mg·Pro)]。具体方法将待测样品，试剂1，试剂2按1∶50∶10的比例混合，混合物在37℃保温60秒后，用酶标仪在405nm处读取2分钟内吸光度变化。ALP活性用ρ-2硝基苯酚作为标准值计算，1单位表示30min内生成1nmol硝基苯酚。结果用蛋白含量进行标准化。
2.6血磷、血钙含量测定大鼠麻醉后，眼底取血，采用磷钼酸法和邻甲酚酞络合铜(OCPC)法测定血磷、血钙含量(mmol/L)。
2.7大鼠尾动脉压测定采用RBP-1B型大鼠无创血压计测量大鼠尾动脉压(mmHg)，每周一次。
2.8统计学处理数据以均值士标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
表1实验各组大鼠心肌和主动脉组织一般特征(x±s)

**表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.05；##表示与control组相比有显著性差异P＜0.05表2实验各组大鼠尾动脉血压(x士s)


**与VDN组相比有显著性差异P＜0.05；##表示与对照组相比有显著性差异P＜0.05。
2.9结果(1)大鼠血管钙化的一般特征与对照组相比，见表1，维生素D3和尼古丁诱导的VDN组大鼠的血管碱性磷酸酶的活性高1.9倍(P＜0.05)，血管组织钙含量高1.2倍(P＜0.05)，45Ca沉积高1.7倍(P＜0.05)，血浆中磷的含量降低了10.68％(P＜0.05)，血液中钙含量无显著性差异，心脏与体重比值无显著性差异。
(2)枸橼酸铁对大鼠钙化的影响与模型组(VDN组)相比，见表2，VDN+L组，VDN+A组，VDN+H组大鼠的碱性磷酸酶的活性分别降低3.96％，7.45％，25.52％；血管组织钙含量分别降低17.90％(P＜0.05)，4.65％，2.93％；钙沉积分别降低19.26％(P＜0.05)，17.08％，12.90％；血浆中钙磷含量各组与VDN组相比则没有显著性差异，心脏与体重比值无显著性差异；各组大鼠的尾动脉压较VDN组平均降低11.22％，10.2％，8.7％，均P＜0.05。
二.枸橼酸铁对大鼠血压和血磷、血钙浓度的影响1.与空白对照组相比，经维生素D3和尼古丁诱导的大鼠VDN模型组的血压和血钙、血磷浓度没有明显变化；与模型组(VDN组)相比，四周给药期间，除VDN+枸橼酸铁高剂量组在第二周血压降低6.5％外，P＜0.05，其余各组在四周内血压没有显著变化，见表3。
表3实验各组大鼠血压测定值的比较


*P＜0.05与正常组相比；**P＜0.05与模型组相比。
第一周各组血压之间无明显差异；药物空白组第二、三周分别比正常组血压升高8.5％和11.5％，且有显著性差异；大剂量组第二周比模型组血压降低6.5％，且有显著性差异；第四周各组血压之间无显著性差异。
2.与模型组(VDN组)相比，VDN+枸橼酸铁低剂量、中剂量、高剂量组的血钙浓度均升高，P＜0.05，而血磷浓度没有显著差异，见表4。
表4实验各组大鼠血磷、血钙测定值的比较

*P＜0.05与模型组相比血钙含量方面，药物各剂量组比模型组血钙含量分别高52.4％、8％、4.3％，模型与空白无显著性差异，药物空白组较高；血磷含量方面，药物各剂量组与模型组相比无显著性差异，各组之间也无明显的趋势，表明枸橼酸铁并非如业内推测是通过降低血磷含量来降低血钙含量的。
三.血管钙含量及血管碱性磷酸酶活性测定(枸橼酸铁的预防钙化作用)。
1.材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～180g，由北京大学医学部实验动物中心提供(合格证号SCXK京2002-0001)；尼古丁、维生素D3购自Sigma公司；45CaCl2购自美国New England Nuclear公司；碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)测定试剂盒购自北京利德曼公司；其余试剂为国产分析纯。
2.方法2.1大鼠血管钙化模型制备和实验分组参照Niederhoffer方法，制备大鼠血管钙化动物模型。雄性SD大鼠50只，体重150～180g，随机分为5组(1)血管钙化组(VDN，n＝10)实验第一天9:00给大鼠肌注维生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重复灌胃1次，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续4周；(2)空白对照组(control，n＝10)给予等量大豆油肌注、单纯大豆油灌胃代替维生素D3和尼古丁，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续4周；(3)血管钙化+枸橼酸铁低剂量组(VDN+L，或VDN+低)(n＝10)钙化处理同(1)，每天按剂量370mg/kg给予枸橼酸铁，连续灌胃给药4周；(4)血管钙化+枸橼酸铁中剂量组(VDN+A，或VDN+中)(n＝10)给药方法同(3)，剂量为740mg/kg；(5)血管钙化+枸橼酸铁高剂量组(VDN+H，或VDN+高，n＝10)给药方法同(3)，剂量为1110mg/kg枸橼酸铁，连续灌胃给药4周。
各组动物常规饲养，3天测一次体重，每周测一次尾动脉压。4周后，乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉动物，眼底取血，测定血液生化指标；摘取心脏和全长胸腹主动脉，用生理盐水冲洗后，心脏称重，-70℃储存备用。
2.2von Kossa染色从主动脉弓起，取1～1.5cm的胸主动脉血管条，用4％多聚甲醛固定。用石蜡包埋胸主动脉并切片，7μm，常规脱蜡、脱水；浸入1％硝酸银溶液，在日光下照射30min后，将玻片放于5％硫代硫酸钠溶液中1min，碱性品红返染；脱水、透明、封片，光镜观察。
2.3血管钙含量取腹主动脉约10mg，80℃烤干(2-3h)，称重，转移至石英杯内，加入2mol/L的硝酸1ml，2滴高氯酸，180℃消化并烤干，冷却后用去离子水复溶，定容至2ml。原子发射光谱在422.7nm处读取吸光度，换算成组织的钙含量(μmol/g dw)。
2.4ALP(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)活性测定取腹主动脉约10mg，以等渗PBS制备组织匀浆(匀浆缓冲液20mmol/LHEPES，pH7.4，0.2％NP-40，20mmol/L MgCl2，PBS定容至50ml)。匀浆后8000×g离心10min，吸取上清液。BCA法进行蛋白定量。按ALP测定试剂盒说明，采用SFBC速率法测定血管组织ALP活性[U/(mg·Pro)]。具体方法将待测样品，试剂1，试剂2按1∶50∶10的比例混合，混合物在37℃保温60秒后，用酶标仪在405nm处读取2分钟内吸光度变化。ALP活性用ρ-2硝基苯酚作为标准值计算，1单位表示30min内生成1nmol硝基苯酚。结果用蛋白含量进行标准化。
2.5血磷、血钙含量测定大鼠麻醉后，眼底取血，采用磷钼酸法和邻甲酚酞络合铜(OCPC)法测定血磷、血钙含量(mmol/L)。
2.6大鼠尾动脉压测定采用RBP-1B型大鼠无创血压计测量大鼠尾动脉压(mmHg)，每周一次。
2.7统计学处理数据以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
表5实验各组大鼠血管钙及血管碱性磷酸酶活性测定值比较

注x±s，n＝10，**P＜0.01，钙化模型组与空白组比较；##P＜0.01，表5结果表明，与对照组比较，经维生素D3和尼古丁诱导的血管钙化大鼠(VDN组)的血管和心肌钙含量分别升高。
本实验的VDN组动物与对照组相比血管钙含量及血管ALP活性均显著增高(P＜0.01)。
四、枸橼酸铁给药治疗三个月对于异位钙化的治疗作用1.材料雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，150～180g，由北京大学医学部实验动物中心提供(合格证号SCXK京2002-0001)。尼古丁、维生素D3购自Sigma公司；45CaCl2购自美国New England Nuclear公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测定试剂盒购自北京利德曼公司；其余试剂为国产分析纯。
2.方法2.1大鼠血管钙化模型制备和实验分组参照Niederhoffer方法，制备血管钙化动物模型。雄性SD大鼠54只，体重150～180g，随机分为5组(1)血管钙化模型组(VDN)(n＝12)实验第一天9:00给大鼠肌注维生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重复灌胃1次，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续12周；(2)空白对照组(control)(n＝10)给予等量大豆油肌注、单纯大豆油灌胃代替维生素D3和尼古丁，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续12周；(3)治疗组[1]血管钙化+枸橼酸铁低剂量组(VDN+L)(n＝12)钙化处理同模型组，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天按剂量180mg/kg给予枸橼酸铁，连续灌胃给药12周；[2]血管钙化+枸橼酸铁中剂量组(VDN+A)(n＝10)给药方法同(1)，剂量为370mg/kg；[3]血管钙化+枸橼酸铁高剂量组(VDN+H)(n＝10)给药方法同模型组，剂量为740mg/kg。
各组动物常规饲养，3天测一次体重，每周测一次尾动脉压。16周后，乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉动物，眼底取血，测定血液生化指标；摘取心脏和全长胸腹主动脉，用生理盐水冲洗后，心脏称重，-70℃储存备用。
2.2组织45Ca沉积取胸主动脉(约20mg)，制备成0.3mm左右的组织薄片，置于1ml DMEM孵育液中，加入37kBq/mL45CaCl2，通体积分数为95％O2-5％CO2气体，在37℃恒温水浴中持续平衡孵育10h后，用双蒸水冲洗3次；烤干(80℃，2h)，称重，取0.5mL甲酸消化组织；取0.4mL消化液置于闪烁瓶中，加4mL闪烁液，用β-液闪计数仪测45Ca2+放射活性(CPM/mg)。
2.3血管钙含量取腹主动脉(约10mg)，烤干(80℃2～3h)，称重，转移至石英杯内，加入2mol/L的硝酸1ml，2滴高氯酸，180℃硝化并烤干，冷却后用去离子水复溶，定容至2ml。原子发射光谱在422.7nm处读取吸光度，换算成组织的钙含量(μmol/gdw)。
2.4 ALP(碱性磷酸酶)活性测定取腹主动脉约10mg，以等渗PBS制备组织匀浆(匀浆缓冲液20mmol/LHEPES，pH7.4，0.2％NP-40，20mmol/L MgCl2，PBS定容至50ml)。匀浆后8000×g离心10min，吸取上清液。BCA法进行蛋白定量。按ALP测定试剂盒说明，采用SFBC速率法测定血管组织ALP活性[U/(mg·Pro)]。具体方法将待测样品，试剂1，试剂2按1∶50∶10的比例混合，混合物在37℃保温60秒后，用酶标仪在405nm处读取2分钟内吸光度变化。ALP活性用ρ-2硝基苯酚作为标准值计算，1单位表示30min内生成1nmol硝基苯酚。结果用蛋白含量进行标准化。
2.5血磷、血钙含量测定大鼠麻醉后，眼底取血，采用磷钼酸法和邻甲酚酞络合铜(OCPC)法测定血磷、血钙含量(mmol/L)。
2.6大鼠尾动脉压测定采用RBP-1B型大鼠无创血压计测量大鼠尾动脉压(mmHg)，每周一次。
2.7统计学处理数据以均值±标准差表示，组间比较采用t检验。
2.8结果见表6和7。治疗三个月的实验结果表明，枸橼酸铁治疗组的钙化明显减轻，模型组的血压远高于枸橼酸铁治疗组和正常组，治疗组血压已恢复至正常水平。
表6钙化大鼠心肌和主动脉组织一般特征(x±s)

*表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.05；**表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.01；***表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.005。
表7.大鼠尾动脉血压测定结果(x±s)

*表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.05；**表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.01；***表示与VDN组相比有显著性差异P＜0.005。
结果1.枸橼酸铁对大鼠血管钙含量、ALP活性的影响枸橼酸铁可以有效降低维生素D3和尼古丁诱导的大鼠血管钙化中血管钙含量，抑制碱性磷酸酶(ALP)活性；与空白对照组比较，经维生素D3和尼古丁诱导的血管钙化大鼠(VDN组)的血管钙含量升高67％，血管碱性磷酸酶活性是空白对照组的2.79倍；与模型组相比，枸橼酸铁低剂量组、中剂量组和高剂量组的血管钙含量分别降低43.1％(P＜0.01)，27.3％(P＜0.01)和45.9％(P＜0.01)；碱性磷酸酶活性分别降低21.1％(P＜0.05)，16.0％和55.2％(P＜0.01)。
本发明采用与人体心血管系统钙化相关性很好的大鼠VDN动物模型，具体参见Nathalie Niederhoffer，Yuri V.Bobryshev，et al.Aortic calcification produced byVitamin D3 plus nicotine.Joumal of vascular research 1997；34386-398，采用维生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的弹性动脉钙化，其为与年龄和年龄相关的血管病理变化相关的血管钙化动物模型。在人动脉粥样硬化病变过程中发现的钙结合蛋白--S-100，与VDN大鼠动脉中膜钙化相关。VDN大鼠模型动脉钙化的机理和结果与人动脉粥样硬化血管钙化十分相似。人动脉钙化的基本特征是老龄或年龄相关的血管病变，如动脉粥样硬化、糖尿病和肾脏疾病，另外，大鼠是研究与老龄和/或年龄相关的病理改变等发生血管钙化的最常用动物模型，采用维生素D和尼古丁(VDN)造成成年大鼠的弹性动脉钙化的强度与人相近，可作为用于研究人血管钙化导致动脉硬化的动物模型。
为评价枸橼酸铁防治心血管系统异位钙化的有效性，本发明采用维生素D3和尼古丁诱导的大鼠VDN模型，分别在建立模型同时给予枸橼酸铁，考察枸橼酸铁对VDN模型大鼠血管钙化的影响；在建立模型后给予枸橼酸铁，考察枸橼酸铁对血管钙化的治疗作用。研究结果如下枸橼酸铁可有效减少VDN大鼠模型血管钙化斑块的产生、降低血管钙含量，对血管钙化的进程产生有益疗效。同时对于已经产生血管钙化的VDN大鼠，枸橼酸铁可以降低血管和组织钙含量，有效减少钙化，同时维持血压在正常水平。
枸橼酸铁可以有效预防和治疗心血管系统钙化，同时减少血管钙化引起的高血压等并发症。


图1空白对照组von Kossa染色结果；图2模型组von Kossa染色结果；图3枸橼酸铁低剂量组von Kossa染色结果；图4枸橼酸铁中剂量组von Kossa染色结果；图5枸橼酸铁高剂量组von Kossa染色结果；图6枸橼酸铁治疗大鼠VDN诱导的血管钙化模型组von Kossa染色结果；图7枸橼酸铁治疗大鼠VDN诱导的血管钙化的小剂量组von Kossa染色结果；图8枸橼酸铁治疗大鼠VDN诱导的血管钙化的中剂量组von Kossa染色结果；图9枸橼酸铁治疗大鼠VDN诱导的血管钙化的大剂量组von Kossa染色结果。
具体实施例方式
实施例1枸橼酸铁的制备参照《食品添加剂手册》化学工业出版社收载的制备方法，采用氢氧化铁与柠檬酸反应制备枸橼酸铁。
称取经微粉化处理的氢氧化铁106.9g与220.7g一水柠檬酸，置于带搅拌的烧瓶中，加入1000ml水，用水浴加热至60℃，持续搅拌反应72小时，反应终点判断，吸取1ml上清液，加入10ml水，用分光光度法检测，溶液基本澄清即达到反应终点。
将反应溶液在60℃以下浓缩至溶液相对密度为1.26，得褐色粘稠浓缩液。
该浓缩液在60℃以下减压干燥，得枸橼酸铁粗品307g。
将上述枸橼酸铁置于烧杯中，加入300ml乙醇浸泡15分钟，滤出乙醇后，继续加入300ml乙醇，重复浸泡15分钟，过滤在60℃以下减压干燥即得枸橼酸铁成品。
实施例2枸橼酸铁小鼠急性毒性试验在预试验基础上，取昆明种小鼠70只(19～21g，雌雄各半)，禁食15小时后，随机分为7组，每组10只。用4％淀粉糊将实施例1制备的枸橼酸铁配制成7种浓度的均匀混悬液，设置7个剂量组，给药剂量由高到低依次为10.00、8.00、6.40、5.12、4.10、3.28和2.62g/kg。按20ml/kg分别给予小鼠灌胃，即刻观察并记录给药后动物的活动、进食、皮肤、粘膜、粪便和死亡情况，并于给药后两周内至少每天观察一次。对死亡动物进行尸体解剖，观察各组织器官的变化情况。用Bliss法计算半数致死量。结果参见下表8；表8.各剂量组动物死亡数

用Bliss法计算半数致死量，其中LD50＝4.2821g/kg；95％可信限为3.7019-4.8935g/kg(见表9)。
表9.小鼠口服枸橼酸铁急性毒性LD50计算表(Bliss法)

回归方程Y(Probit)＝0.53937+7.0617Log(D)半数致死量LD50＝4.2821g/kg
LD50(Feiller校正)95％可信限＝3.7019-4.8935g/kgLD5＝2.5046g/kgLD95＝7.3214g/kg小鼠口服枸橼酸铁的LD50为4.28g/kg，动物在给药后即刻无明显变化，约1小时后出现活动减少，状态萎靡，呼吸困难等反应。约1.5小时后开始出现死亡，死亡均发生在用药后24小时之内。死亡动物经解剖，各脏器未见明显异常。
实施例3枸橼酸铁治疗动脉钙化的研究将实施例1制备的枸橼酸铁用4％淀粉溶液制成混悬液，按不同给药剂量灌胃给药。
实验方法参照Niederhoffer方法制备大鼠血管钙化动物模型。
雄性SD大鼠54只，体重150～180g，随机分为5组(1)血管钙化组(VDN)(n＝12)实验第一天9:00给大鼠肌注维生素D3(3×105U/kg)和尼古丁溶于大豆油(25mg/kg，5ml/kg)灌胃，18:00尼古丁重复灌胃1次，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续4周；(2)空白对照组(control，n＝10)给予等量大豆油肌注、单纯大豆油灌胃代替维生素D3和尼古丁，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天4％淀粉溶液灌胃，连续4周；(3)血管钙化+枸橼酸铁低剂量组(VDN+L)(n＝12)钙化处理同(1)，此后不做任何处理，常规喂养4周后，每天按剂量370mg/kg给予枸橼酸铁，连续灌胃给药4周；(4)血管钙化+枸橼酸铁中剂量组(VDN+A)(n＝10)给药方法同(3)，剂量为740mg/kg；(5)血管钙化+枸橼酸铁高剂量组(VDN+H)(n＝10)给药方法同(3)，剂量为1110mg/kg枸橼酸铁，连续灌胃给药4周。
各组动物常规饲养，3天测一次体重，每周测一次尾动脉压；8周后，乌拉坦1g/kg腹腔注射麻醉动物，眼底取血，测定血液生化指标；摘取心脏和全长胸腹主动脉，用生理盐水冲洗后，心脏称重，-70℃储存备用。
常规方法von Kossa染色，组织45Ca沉积，用β-液闪计数仪测45Ca2+放射活性(CPM/mg)，测血管钙含量和ALP(碱性磷酸酶)活性，结果用蛋白含量进行标准化；采用磷钼酸法和邻甲酚酞络合铜法测定血磷、血钙含量。
结果显示枸橼酸铁对大鼠钙化的影响与模型组(VDN组)相比，VDN+枸橼酸铁低剂量组，VDN+枸橼酸铁中剂量组，VDN+枸橼酸铁高剂量组大鼠的碱性磷酸酶的活性分别降低3.96％，7.45％，25.52％；血管组织钙含量分别降低17.90％(P＜0.05)，4.65％，2.93％；钙沉积分别降低19.26％(P＜0.05)，17.08％，12.90％；血浆中钙磷含量各组与VDN组相比则没有显著性差异，心脏与体重比值无显著性差异；各组大鼠的尾动脉压较VDN组平均降低11.22％，10.2％，8.7％，均P＜0.05。
枸橼酸铁对大鼠血压和血磷、血钙浓度的影响与空白对照组相比，经维生素D3和尼古丁诱导的大鼠VDN模型组的血压和血钙、血磷浓度没有明显变化；与模型组(VDN组)相比，四周给药期间，除VDN+枸橼酸铁高剂量组在第二周血压降低6.5％外，P＜0.05，其余各组在四周内血压没有显著变化。
血钙含量方面，药物各剂量组比模型组血钙含量分别高52.4％、8％、4.3％，模型与空白无显著性差异，药物空白组较高；血磷含量方面，药物各剂量组与模型组相比无显著性差异，各组之间也无明显的趋势，表明枸橼酸铁并非如业内推测是通过降低血磷含量来降低血钙含量的。
枸橼酸铁的预防钙化作用结果表明，本实验的VDN组动物与对照组相比，血管钙含量及血管ALP活性均显著增高(P＜0.01)。
实验结果见图1至图9，其中图1-5是空白组、对照组以及枸橼酸铁各剂量组von Kossa染色结果，图6是枸橼酸铁治疗大鼠VDN诱导的血管钙化模型组von Kossa染色结果，图7-9是枸橼酸铁治疗大鼠VDN诱导的血管钙化各剂量组von Kossa染色结果。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
权利要求
1.枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的血管钙化为心血管异位钙化。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述的心血管异位钙化为内膜和/或中膜钙化。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述的血管钙化为衰老伴发或引起的血管钙化。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述的血管钙化为糖尿病伴发或引起的血管钙化。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述的血管钙化为终末期肾病伴发或引起的血管钙化。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述的血管钙化为动脉粥样硬化伴发或引起的血管钙化。
8.根据权利要求1所述的应用，其为枸橼酸铁在制备预防血管钙化的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的预防血管钙化包括预防由血管钙化引起的并发症。
10.根据权利要求1所述的应用，其为枸橼酸铁在制备治疗血管钙化的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及枸橼酸铁在制备防治血管钙化的药物中的应用，其中包括枸橼酸铁在防治心血管异位钙化等方面的用途，该用途疗效确切，实验证明，枸橼酸铁通过干预钙化形成过程，可以有效抑制钙化并有可能逆转钙化的发生。
文档编号A61P13/12GK101019848SQ200710079180
公开日2007年8月22日 申请日期2007年2月15日 优先权日2006年11月17日
发明者苏荣仁 申请人:苏荣仁