专利名称：一种sis组织修复材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织修复材料的制备方法，具体地说，涉及一种
SIS ( small intestinal submucosa，小肠黏膜下层)组织修复材料的制备 方法。
背景技术：
哺乳动物小肠主要由4层组成，由里到外分别为黏膜层，黏膜下 层、肌层和浆膜层。黏膜下层由一层致密的结締组织构成，主要成分
为i、 ni型胶原纤维，含有少量细胞及部分较大的血管、淋巴管和神
经。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，以下简称SIS)是天然 细胞外基质类生物衍生材料。由于SIS具有无免疫原性、抗微生物活 性，能促进组织再生等，在体内能通过生物降解得到代谢，因而得到 了广泛的研究。
SIS—般由猪空肠制备，将新鲜的猪空肠反复用清水冲洗，釆用 机械方法去除外面的浆膜层和肌层，翻转后取出黏膜层。釆用高渗盐 水或酶-去港剂消化法可彻底去除材料中的残留细胞。为避免人畜共 患疾病的交叉传染，常用过氧乙酸-乙醇混合溶液处理，这样可达到 完全消毒作用。有研究指出，用这样的消毒液处理猪小肠和同类的 SIS,通过测定荚膜病毒、无荚膜病毒，包括猪细小病毒、猪呼吸道 肠道病毒、鼠白血病逆转录酶病毒和猪伪狂犬病毒，证明荚膜病毒容 易出去，5分钟即可灭活，处理30分钟后所有病毒均被灭活，因而不 易导致疾病的交叉感染。
SIS含有大量的胶原蛋白，主要由主要成分为I、 III型胶原纤维， 含有少量V型和VI型胶原纤维，均由on、 a2、 (X3肽链组成。其中od肽链 可与细胞表面的特异受体结合，激活信号传导通路，促进细胞的粘附、增殖和分化。大量的羟基基团也能促进细胞粘附。胶原蛋白参与细胞 分化，控制细胞粘附，调节细胞生长，有助于维持细胞基质的网状结 构。同时SIS是一种天然细胞外基质生物材料，含有多种活性生长因 子，比用于组织工程的其他合成材料具有更过的优越性。例如有研究
者曾经从SIS中提取出转化生长因子TGF(31和bFGF,尽管在制备过程 中经过消毒、冻干等处理，但最终材料仍具有生物活性。TGFP1可以 促进间充质细胞分化增殖，增加I型胶原、骨连接蛋白和骨桥蛋白的 合成，同时能够调节多种基质蛋白的转录，包括胶原、纤维结合素、 葡糖胺、基质降解蛋白酶及其抑制物等，最终使基质蛋白积聚和增加。 bFGF能够刺激大多数与创面愈合有关的细胞增殖，包括血管内皮细 胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成骨细胞和软骨细胞等，能够刺激毛 细血管内皮细胞的增殖和迁移并创造其他血管在生长入的条件。
也有研究证实SIS的细胞外基质中有VEGF,以及与促进内皮细胞 分裂素有密切关系的血小板源生长因子。SIS所固有的这些生长因子 在组织的修复和重构中起着重要的促进作用。此外，SIS具有部位特 异性的组织再生的能力，能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主 细胞的长入和分化，产生的再生组织在结构和功能上均与原组织相 似。因此无论是实验还是临床，SIS都具有良好的组织修复性能。
组织工程支架材料应该具备如下条件l.有良好的生物相容性和 无抗原作用，不会与受体发生免疫排斥反应；2.可降解性和降解速率 可控性；3.维持生长其上的细胞形态和表型，并增进细胞的粘附和生 殖，诱导组织再生最终形成完整的生物组织；4.有一定的空隙率便于 组织间的营养和物质空气的交换；5.有一定的机械强度能够对组织的 生长起到支持作用。
SIS作为一种天然细胞外基质生物材料，几乎拥有上述所有特性。 SIS用作组织工程支架材料已经进行了广泛的研究，，在生物体内能引 导、支持宿主细胞的生长，最终逐渐完全降解，再生的组织结构得到重塑成形。可以用于神经、膀胱、血管、肌腱、腹壁等组织缺损的修 复，并具有独特的优势。
目前在生物材料领域内也有很多关于利用SIS作为组织修复材料 的制备和相关动物实验的报道，但工艺过程简单，大多都局限在单独 脱细胞和去港上，总体来说都会存在脱脂脱蛋白或者消毒不充分的问 题，从而导致材料存在一定的免疫性和抗原性，也有的方法存在一些 去除有机溶剂不充分的问题，从而会导致材料对受体存在一定的抗原 性。国外也有注射型和粉末状SIS制备和使用的相关报道，但其制备 方法相对较为复杂，并且也没有涉及到对材料进行脱脂和脱细胞的步 骤，因而材料也会存在一定的抗原性，并且在使用上也受到一定程度 的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种SIS ( small intestinal submucosa，小肠黏
膜下层)组织修复材料的制备方法，该方法可获得无抗原性、无免疫 性天然无毒的生物材料。
为了实现本发明目的，本发明的 一 种SIS ( small intestinal submucosa，小肠黏膜下层)组织修复材料的制备方法，其釆用机械 法、物理化学法和生物学等处理方法，经过分别经过消毒，脱脂，脱 细胞，去垢，灭菌等工艺处理，脱水加工和碾压成特定形状制备而成。
本发明的组织修复支架材料SIS (small intestinal submucosa)是 釆用天然细胞外基质类生物衍生材料。
SIS组织修复材料的原料来源为猪、羊、狗等哺乳动物小肠黏膜 下层。主要是通过机械法去除动物小肠外面的浆膜层、黏膜层和肌层， 而取出黏膜下层。
所述对SIS的处理方法是机械法、物理化学法和生物学等处理方 法间的组合。
本发明的SIS组织修复材料的制备方法，其包括如下步骤将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢 处理，最后经冷冻干燥而成。
其中，所述的消毒处理为在常温下釆用消毒液对小肠黏膜下层
(SIS)进行浸泡处理，SIS与消毒液的质量体积比1:1 10。
具体消毒方式为用0.08-1.5%的过氧乙酸和5~20%的乙醇的混 合水溶液浸泡10-60分钟，或者0.05~1.5%的乙二胺四乙酸溶液与 0.01~2%氢氧化钠的单独或混合溶液浸泡6~12小时，5~20%的硫酸新 霉素溶液浸泡15 60分钟，碘伏(聚维酮碘)浸泡10 30分钟等具有消 毒作用的溶液浸泡消毒。
消毒处理完后用纯化水彻底超声清洗，根据需要清洗时可换纯化 水进行多次清洗， 一般清洗2 4次。
所述脱脂处理为釆用有机溶剂常温下对SIS经1 5次浸泡处理，每 次浸泡8~20小时。SIS与有机溶剂的质量体积比1:1~10。
所述有机溶剂为甲醇、氯仿、甲醛、二氯甲烷、三氯甲烷中一种 或多种混合的溶液，优选混合比例为1:6 1:1。每次要换新鲜溶液，为 保证充分脱脂，处理过程可通过超声作用的辅助处理；处理完后用纯 水分1 5次超声清洗。
所述脱细胞处理是常温下用具有脱细胞作用的溶液浸泡处理， SIS与脱细胞溶液的体积比1:1 10。所述脱细胞溶液为高渗盐水(浸 泡4-10小时)、酶溶液(如0.1~0.5%的胰蛋白酶溶液浸泡10~30小时)、 酸溶液(如0.1 1M盐酸，2~8%乙酸溶液或0.08~1%的丙烯酸溶液浸泡 3~6小时)、碱溶液(如0.02~0.1%氢氧化钠溶液或0.5~1.5%氨水溶液 浸泡1~2.5小时)中的一种或两种以上混合溶液。
所述去垢处理是常温下用表面活性剂溶液分1~5次浸泡清洗处 理，每次更换新鲜溶液。每次用0.1~15%的表面活性剂溶液浸泡8~24 小时。所述表面活性剂为曲拉通(Triton X114)、十二烷基磺酸钠 (SDS)、 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)或胆酸钠等。
本发明的小肠黏膜下层(SIS)在处理前，可以先对小肠黏膜下 层进行表面消毒处理，比如用碘酒进行消毒处理。
在本发明的消毒、脱脂、脱细胞和去垢过程中，还可适当加入磷 酸盐、叠氮化纳、氯化钠等缓冲溶液来调节工艺处理中的溶液体系平 衡。
所述的冷冻干燥可采用本领域常规的方法及设备进行。
本发明所述的SIS组织修复材料可以进一步加工成单层厚度为 10 20(^m的薄膜状材料，可以分为单层、双层、四层、八层等。复 合层通过脱水加工和碾压而成。
为了进一步灭菌，经过内包装后，加工成成品的SIS组织修复材 料还要经过辐照灭菌，剂量范围在5 25kGy。
本发明所述的SIS组织修复材料的制备方法，其工艺过程严格完
整，具有很强的系统性和完整性，能够在保证产品性能的同时，达到
有效去除产品免疫性，减少组织修复时产生的排斥和过敏反应，降低 病人痛苦和手术风险，提高安全性。
本发明所述的SIS组织修复材料可以作为生长因子、细胞、药物 等的单独和共同的支架载体，通过体外培养成为组织工程材料。其为 无抗原性、无免疫性天然无毒的生物材料。
SIS组织修复材料在临床上可用于疝，皮肤缺损，泌尿系统组织 缺损，粘膜缺损及其他体表体内软组织缺损的修复。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l
取屠宰4小时内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层 去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗干净。将制 得的515浸泡在0.5%的过氧乙酸-10%乙醇混合溶液中进行消毒处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡l小时；浸泡完之后用纯水超声 清洗2次，每次20分钟并换水；取出漂洗干净，放入2免的SDS溶液中 进行去垢处理，SIS与溶液的质量体积比为L5，浸泡18小时；超声清 洗2次，每次20分钟并换水；漂洗到溶液清亮；用lmmol/L的NaCl的 磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡16小时，SIS与溶液的质量体积比为1: 10。用纯水清洗到pH值为5.8之间；再用含有0.05呢叠氮化纳的PBS清 洗2小时，用纯水超声清洗30分钟并漂洗后，将材料置于0.4%的胰蛋 白酶按质量体积比为1: 4的比例在室温下消化14小时进行脱细胞处 理。超声清洗后用质量体积比为1:5的比例甲醇溶液进行浸泡处理8小 时，取出材料超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送 检直到有机溶剂含量合格为止，然后-80度预冻2小时，-55度冻干48 小时。 实施例2
取屠宰4小时内的新鲜羊小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层 去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的 SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在1.5%的过氧乙酸-10%乙醇混 合溶液中，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡40分钟；浸泡完之后 用纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水；漂洗干净后放入lmmol/L 的HCl和lmmol/LNaCl的混合溶液中(pH值为0 l之间)浸泡6小时进 行脱细胞处理，SIS与溶液的质量体积比为1:10;用纯水超声清洗2次 每次20分钟，漂洗干净后用lmmol/L的NaCl的磷酸盐缓冲溶液(PBS) 浸泡16小时，SIS与溶液的质量体积比为l:lO。纯水清洗30分钟后用 体积比为1:5的甲醇和三氯甲烷混合溶液浸泡18小时进行脱脂处理， SIS与溶液的质量体积比为1:5。取出材料纯水超声清洗2次，每次20 分钟并换水。漂洗干净后放入3呢的SDS溶液中进行去垢处理，浸泡IO 小时，SIS与溶液的质量体积比为1:5;取出材料超声清洗5次，每次 30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止，冻干保存，-80度预冻2小时，-55度冻干48小时。 实施例3
取屠宰4小时内的新鲜狗小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层 去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的 SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在0.05呢的氢氧化钠中浸泡1小 时，在1.5%的508溶液中浸泡10小时，进行脱细胞和去垢处理，SIS 与溶液的质量体积比为1:5，每5小时换一次新鲜溶液；浸泡完之后用 纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水；漂洗干净后，放入质量体积 比为0.1%的聚丙烯酸溶液中浸泡4小时再次脱细胞，SIS与溶液的质量 体积比为1:5，用纯水超声清洗到pH值为7.0之间；将材料用含有0.8% 的过氧乙酸和12%酒精溶液浸泡消毒5小时，SIS与溶液的质量体积比 为1:5;再用含有0.05呢叠氮化纳的PBS清洗2小时，纯水超声清洗3次 每次15分钟；浸泡完之后用纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水。 最后用体积比为1:1的甲醇和二氯甲垸混合溶液浸泡15小时进行脱脂 处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5。用纯水超声清洗5次，每次30 分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止。完毕 后-26度预冻24小时，-55度冻干72小时。 实施例4
取屠宰4小时内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层 去除保留凝膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的 SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在0.8呢的过氧乙酸-10呢乙醇混 合溶液中进行消除病毒处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡50 分钟。取出材料后用清水超声清洗2次，每次20分钟并换水，漂洗至 清亮。将材料取出放在0.5%的胰蛋白酶溶液中消化10小时进行脱细胞 处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，取出材料在清水中清洗超声清 洗2次，每20分钟换一次清水，然后漂洗到无胰蛋白酶活性残留。将 溶液用体积比为3: 1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡12小时进行脱脂处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，中途换液l-3次至溶液清亮，超声 清洗2次，每20分钟并换纯水，最后漂洗至无有机溶剂残留。将材料 浸泡在浓度为2.5%的805中16小时进行去垢处理，SIS与溶液的质量 体积比为I:IO。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将 清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止。将材料-80度冷冻5小时，-55 度冷冻干燥48小时。 实施例5
取屠宰4小时内的新鲜羊小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层 去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的 SIS浸泡在将机械方法制得的材料浸泡在0.25呢的过氧乙酸-15呢乙醇 混合溶液中，材料与溶液的质量体积比为1:5，浸泡1小时。取出材料 后用清水超声清洗至清亮。将材料取出放在0.5%的胰蛋白酶溶液中消 化12小时，材料与溶液的质量体积比为1:5，取出材料在清水中清洗 超声清洗2次，每次20分钟并换水。然后漂洗到无胰蛋白酶活性残留。 将溶液用体积比为3:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡20小时，材料与 溶液的质量体积比为1:5，中途换液l-3次至溶液清亮。取出材料用纯 水超声清洗2次，每20分钟并换纯水，最后漂洗至无有机溶剂残留。 将材料浸泡在1.25%的SDS中20小时，材料与溶液的质量体积比为 1:10。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送 检直到有机溶剂含量合格为止。将材料-80度冷冻5小时，-55度冷冻干 燥48小时。 实施例6
取屠宰4小时内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层 去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的 SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在0.08呢的乙二胺四乙酸溶液中 浸泡10小时进行消除病毒处理，SIS与溶液的体积比为1:5。取出材料 后用清水超声清洗2次，每次20分钟并换水，漂洗至清亮。将材料取出放在5%氨水中处理10小时进行脱细胞处理，SIS与溶液的质量体积
比为1:5，取出材料在清水中清洗超声清洗2次，每20分钟换一次清水， 然后漂洗到无溶剂残留。将溶液用甲醛溶液浸泡12小时进行处理，SIS 与溶液的体积比为1:5，中途换液l-3次至溶液清亮，超声清洗2次，每 20分钟并换纯水，最后漂洗至无有机溶剂残留。将材料浸泡在浓度为 8.5呢的Triton X114中16小时进行去裙处理，SIS与溶液的质量体积比 为I:IO。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液 送检直到有机溶剂含量合格为止。将材料-80度冷冻5小时，-55度冷冻 干燥48小时。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1. SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢处理，最后经冷冻干燥而成。
2. 根据权利要求1所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征 在于，所述的消毒处理为在常温下釆用消毒液对小肠黏膜下层进行浸 泡处理。
3. 根据权利要求2所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征 在于，所述消毒液的处理方式为用0.08~1.5%的过氧乙酸和5~20% 的乙醇的混合水溶液浸泡10 60分钟，或者0.05~1.5%的乙二胺四乙酸 溶液浸泡6 12小时，或者0.01~2%氢氧化钠溶液浸泡6~12小时，5~20% 的硫酸新霉素溶液浸泡15~60分钟，碘伏浸泡10~30分钟。
4. 根据权利要求1-3任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方 法，其特征在于，所述脱脂处理为采用有机溶剂常温下对SIS经1 5 次浸泡处理，每次浸泡8 20小时。
5. 根据权利要求4所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征 在于，所述有机溶剂为甲醇、氯仿、甲醛、二氯甲烷、三氯甲烷中一 种或多种混合的溶液。
6. 根据权利要求l-5任意 一项所述的SIS组织修复材料的制备方 法，其特征在于，所述脱脂处理完后用纯水分1 5次超声清洗。
7. 根据权利要求1-6任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方 法，其特征在于，所述脱细胞处理是常温下用高渗盐水、酶溶液、酸 溶液或碱溶液中的一种或两种以上混合溶液进行浸泡处理。
8. 根据权利要求7所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征 在于，所述酶溶液处理为0.1~0.5%的胰蛋白酶溶液浸泡10~30小时； 所述酸溶液处理为0.1 1M盐酸、2 8呢乙酸溶液或0.08 1呢的聚丙烯酸 溶液浸泡3~6小时；所述碱溶液处理为0.02~0.1%氢氧化钠溶液或(0.5~1.5%氨水溶液浸泡1~2.5小时。
9. 根据权利要求1-8任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方 法，其特征在于，所述去港处理是常温下用表面活性剂溶液分1 5次 浸泡清洗处理。
10. 根据权利要求9所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征 在于，所述去垢处理是常温下用0.1~15%的曲拉通、十二烷基磺酸钠、 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或胆酸钠溶液浸泡8~24小时。
全文摘要
本发明提供了一种SIS组织修复材料的制备方法，其包括如下步骤将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢处理，最后经冷冻干燥而成。本发明所述的SIS组织修复材料可以作为生长因子、细胞、药物等的单独和共同的支架载体，通过体外培养成为组织工程材料。其为无抗原性、无免疫性天然无毒的生物材料。SIS组织修复材料在临床上可用于疝，皮肤缺损，泌尿系统组织缺损，粘膜缺损及其他体表体内软组织缺损的修复。
文档编号A61L27/00GK101433735SQ20071017728
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月13日 优先权日2007年11月13日
发明者李次会 申请人:北京大清生物技术有限公司