专利名称：：珍珠菜总皂苷抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种珍珠菜总皂苷的抗肿瘤用途。
背景技术：
：恶性肿瘤是造成人类死亡的仅次于心血管疾病的第二号杀手，随着工业化进展和老龄人口比例的增加，肿瘤发病率近20年来呈显著的上升趋势。药物治疗在临床上是最重要的治疗癌症的方法，但目前抗肿瘤药物均有严重的不良反应，因此，从中药中寻找作用显著、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是国际医药界的重点、热点课题。珍珠菜，英文名LysimachiaclethroideDuby，系报春花科植物虎尾珍珠菜的根或全草，味苦、辛，性平，具有清热利湿，活血散瘀，解毒消痈之功效。国外学者从70年代开始，相继从中分离得到槲皮素苷，山奈素，黄芪素等黄酮类化合物，国内学者近年来对其化学成分也有所研究，多数着重于其黄酮类的研究，并且已有文献报道其黄酮类具有一定的抗肿瘤作用，因此研究者在研究中大多是提取其黄酮类，并以此作用质量控制指标。
发明内容本发明公开了珍珠菜总皂苷的抗肿瘤用途，特别是其具有优良的抗肝癌作用。珍珠菜总皂苷可以用文献方法制备，也可以用下列方法制备得到将珍珠菜粉碎，用溶剂回流提取，过滤，滤液经回收溶媒得浸膏，浸膏加水溶解，滤过，滤液浓缩，调节pH值至46，然后通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱，蒸发除去溶剂并干燥，得珍珠菜粗提物，粗提物加水溶解，滤过，滤液用氯仿、醋酸乙酯或正丁醇萃取，减压回收溶媒，萃取物减压干燥即得。其中所述溶剂选自水、乙醇、丙酮、醋酸乙酯或d-4的脂肪族醇；所述大孔树脂选自AB-8、D4020、NKA-9、ZTC大孔吸附树脂或聚酰胺树脂。溶剂优选乙醇。乙醇浓度优选30%~80%,为重量百分比。洗脱用的乙醇浓度优选2095%，为重量百分比。下面是本发明的部分药理药效学试验及结果，本发明药理部分所用的药物即珍珠菜总皂苷，由实施例l方法制备。一、药物的体外抗肿瘤活性1采用MTT法测定肿瘤细胞对药物的敏感性采用常规MTT法测定肿瘤细胞株对药物的敏感性。取对数生长期肿瘤细胞人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人结肠癌细胞(Caco-2)、人肝癌细胞(SMMC-7721)，用完全培养基调整细胞浓度为7xl04/ml，接种于96孔培养板中，100pl/L，37°C、5%C02条件下培养过夜，次日进行分组治疗组加入珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100pg/ml)，阳性对照组加入5-FU(25吗/ml)，100^1/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，每组均设6复孔，培养48h。终止培养前4h加入MTT(5mg/ml)，10p1/孔，培养结束后每孔加入酸化的10%SDS100pl，放置过夜，于酶标仪检测波长为570nm时的吸光度A值。肿瘤细胞生长抑制率(InhibitionRate)按以下公式计算InhibitionRate(%)=[(A对照组-A实验组)/A对照组]xlOOc/0试验结果MCF-7、SMMC-7721、Hela、Caco-2细胞的抑制率分别为81.98X、91.92%、73.94%及34.16%，与阴性对照组相比具有极显著性差异(PO.Ol)。可见珍珠菜总皂苷对肝癌的抑制效果明显好于其它癌症。2药物对SMMC-7721细胞增殖抑制作用2.1MTT法取对数生长期SMMC-7721细胞、Hela细胞，调整细胞浓度后接种于96孔培养板中，37°C，5WC02条件下培养，次日分组给药组加入不同浓度珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100pg/ml)，阴性对照组加入等体积生理盐水，每组均设6复孔，分别培养24、48、72h。MTT法同上，每组均设6复孔。试验结果药物对人肝癌SMMC-7721、人宫颈癌Hela细胞株有很强的抑制作用，且作用有明显的时间、浓度依赖性，且药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制效果明显好于Hela细胞。与对照组相比，不同浓度的药物对SMMC-7721细胞增殖均有明显的抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24h、48h、72h的IC5o分别为46.19ng/ml、24.0吗/ml、14.6ng/ml，见表1。与对照组相比，不同浓度的ZE4对Hela细胞增殖也有明显的抑制作用，且呈时间、浓度依赖性。24h、48h、72h的ICso分别为95.64pg/ml、47.53ng/ml、42.38ng/ml，见表2。表1药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.23H-TdR法接种细胞至24孔培养板中，培养24小时后给予不同浓度的珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100|ag/ml)，阳性对照组加入DXR(10ng/ml)，lml/孔，阴性对照组加入等体积完全培养基，同时加入稀释的SH-TdR(2.4X104Bq)lOpl,继续培养48h。收获细胞在培养孔中加入蒸馏水，吹打均匀，将细胞转移至49型玻璃纤维滤膜上，依次用生理盐水、5%三氯醋酸、无水乙醇洗涤。取下49型玻璃纤维滤膜，置红外干燥箱干燥，80'C，20-30分种。将滤膜片置入闪烁瓶底部，加入闪烁液3ml，在液体闪烁测量仪上测量每个样品的cmp值。结果表明，药物作用48h可有效抑制细胞增殖，其中25、50、100jxg/ml剂量组的抑制率分别为43.5%、74.2%、83.9%，且与阴性对照组相比具有极显著性差异(PO.01)见表3。表3给药48h后药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用(x土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*P<0.05**P<0.012.3集落形成试验取对数生长期细胞，用含10X小牛血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为2.5X102/ml于35mm培养皿，2ml/孔，每组均设3复孔，37°C、5%<:02条件下培养过夜，次日进行分组给药组加入珍珠菜总皂苷提取物(终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml)，阳性组加入5-FU(25ng/ml)，2ml/孔，阴性对照组加入等体积培养基，在含37。C、5%C02条件下静置10天，弃去培养基，用Gimesa染色后镜下计数含50个细胞以上的集落，并摄影。试验结果药物12.5、25、50、100ng/ml及5-FU(25pg/ml)剂量组均无集落形成；阴性对照组、3.125tig/ml剂量组、6.25pg/ml剂量组的集落形成率分别为54.9X、36.0%和10.2%,3.125ng/ml、6.25pg/ml药物组对SMMC-7721细胞集落形成的抑制率分别为28.5。/6和79.8%，普通光镜放大20倍拍照，见图l。3药物对抗肝癌肿瘤细胞转移作用3.1划痕实验细胞接种于六孔板，培养过夜使其完全贴壁，用枪尖在孔中央部划一条直线，PBS洗一遍，加入受试药物2ml，阴性对照组加入等体积完全培养基，分别培养24、48、72h，Gimesa染色，显微镜下观察并拍照。试验结论各时间点药物100ng/ml处理组细胞迁移距离均小于阴性对照组。3.2人肝癌细胞与内皮细胞粘附试验取对数生长期的内皮细胞(ECV304)，用无血清培养液洗三次，收集并重新悬浮在含O.lWBSA的无血清培养液中，加入受试药物，使其终浓度分别为12.5、25、50、100、200、400Hg/ml，阴性对照为不含药物的无血清培养基，细胞浓度均为5X105/ml。室温下孵育60min后，将细胞加入96孔板，各组设6个平行孔，37'C培养90min。用Dulbecco，sPBS清洗细胞4次，除去未粘附的细胞，粘附细胞用20%甲醇稀释的0.5%结晶紫染色固定，漂洗，空气晾干。用比例1:1的乙醇和0.1mmol/L枸橼酸钠溶液溶解染色细胞，酶标仪在540nm处测OD值。试验结论各给药剂量组均可抑制人肝癌细胞SMMC-7721与人内皮细胞ECV304之间的粘附，且随给药剂量的增加抑制作用增强。100pg/ml的药物组对两种细胞粘附的抑制率均为46.3%。二、考察珍珠菜总皂苷的体内抗肿瘤活性1药物对小鼠H22肝癌的增殖抑制作用小鼠分别设阴性对照组、药物高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(IOOmg/kg)剂量组、CTX(25mg/kg)组。抽取小鼠腹水，用无菌生理盐水1:4稀释后接种于小鼠右侧腋下，每只接种O.lml。接种后随机分组，第2天起灌胃给药，每天一次，共10天。各组给药容积均为每10g体重0.2ml，阴性对照组与予相同体积的0.5XCMC-Na。末次给药24h后处死小鼠，称取瘤重。按下式计算抑瘤率抑瘤率(％)=[(阴性对照组平均瘤重一给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]X100W。实验结果显示药物可显著抑制小鼠H22肝癌的增殖，抑制率均在30%以上，且与对照组相比差异显著或非常显著(P<0.05，P<0.01)，其中中剂量(200mg/kg)组的抑瘤效果最好，可达到57.8%，见表4。表4药物对小鼠H22肝癌的增殖抑制作用(;土s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*户<0.05，**尸<0.012药物对小鼠肝癌转移作用的研究2.1对小鼠肺重的影响分别取接种10天腹水型肝癌小鼠，颈椎脱臼处死，腹部皮肤消毒后剪开并剥去腹部皮肤，用空针穿过腹部肌肉，抽吸腹水，腹水应为乳白色浓稠液体，若为黄色或有大量红细胞之血性腹水则弃之不用，所抽之腹水放入无菌容器内，并置冰块上。取昆明种小鼠(每批实验均为同一性别)，尾静脉注射接种肿瘤细胞悬液(2Xl()S个/ml)0.2ml/只，注射尾部用手术灯光照射使静脉血管扩张。实验设对照组、高剂量组(400mg/kg)、中剂量组(200mg/kg)、低剂量组(100mg/kg)、CTX组(25mg/kg)。小鼠接种后随机分组，第2天起灌胃给药，各组给药体积均为每10g体重0.2ml，对照组给予相同体积的0.5"y。CMC-Na。末次给药60min后，颈椎脱臼处死小鼠，称小鼠肺重。小鼠肝癌肺转移结果表明药物高(400mg/kg)、中(200mg/kg)、低(100mg/kg)三个剂量组均对小鼠肺重的增加均有抑制作用，其中200mg/kg对肺重增加的抑制率为33.1%，但组内变异系数较CTX组比偏大，见表5。表5药物对小鼠肺重的影响(i士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*P<0.05，**P<0.012.2对肝癌转移小鼠肺转移结节数的影响小鼠肺于Bouin氏液(l份冰醋酸+15份饱和苦味酸液+5份10%甲醛混合放置24小时即可)固定48小时，置于解剖显微镜下计数肺表面转移灶数、拍照。肺组织经石蜡包埋、50pm连续切片后HE染色观察。I级直径0.5mmII级0.5mnK直径〈1.0mmIII级1.0mnK直径〈2.0mmIV级直径〉2.0mm总转移灶数=1级(结节数)X1+II级X2+III级X3+IV级X4肺转移灶计数结果表明，CTX组肺转移灶平均数与阴性对照组相比有极显著性差异(PO.Ol)，药物各剂量组的转移灶数和阴性对照组相比均有所下降，其中200mg/kg组的抑制率为48.1%，见表6。表6对肝癌转移小鼠肺转移结节数的影响(i土s)组别(mg.kg".d)动物数量(pre/post)动物体重(pre/post)肺重(g)抑制率(％)药物40010/1018.6/24.667.0±36.5*34.320010/1018.5/25.152.9±18.3**48.110010/1018.2/26.169.5±41.331.2环磷酰胺2510/1018.7/22.130.7±8.3"69.9对照组10/1018.8/26.3102.1±42.8—*P<0.05，**P<0.01以上药理结果显示，珍珠菜总皂苷具有优良的抗肝癌活性。图1是药物对SMMC-7721细胞集落形成的抑制作用。(A):对照组；(B)给药组6.25pg/ml;(C)给药组3.125pg/ml(20X)。具体实施例方式实施例1取珍珠菜600g，粉碎，分别用12、10、8倍量的80%乙醇回流提取三次，每次1.5小时，合并滤液，减压回收乙醇得浸膏，浸膏加水溶解、过滤，滤液浓縮至0.9ml/g生药。浓縮液用稀盐酸调节pH值至5.0，然后以1.0ml/min的流速通过AB-8大孔吸附树脂吸附，水洗至洗脱液接近无色，再以40%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸发除去乙醇后，加正丁醇萃取3次，每次100ml，合并萃取液，加正丁醇饱和的水洗涤3次，每次10ml，减压回收正丁醇至无味，萃取物80。C真空干燥2小时，得2.1g珍珠菜提取物，总皂苷含量约为55%。权利要求1、珍珠菜总皂苷用于制备治疗肝癌药物的用途。2、权利要求1的用途，其中珍珠菜总皂苷用下列方法制备将珍珠菜粉碎，用溶剂回流提取，过滤，滤液经回收溶媒得浸膏，浸膏加水溶解，滤过，滤液浓縮至0.52.0ml/g生药，调节pH值至46，然后通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱，蒸发除去溶剂并干燥，得珍珠菜粗提物，粗提物加水溶解，滤过，滤液用氯仿、醋酸乙酯或正丁醇萃取，减压回收溶媒，萃取物减压干燥即得，其中所述溶剂选自水、乙醇、丙酮、醋酸乙酯或C1-4的直链或支链的脂肪族醇；所述大孔树脂选自AB-8、D4020、NKA-9、ZTC大孔吸附树脂或聚酰胺树脂。3、权利要求2的用途，其中所述溶剂是乙醇。4、权利要求3的用途，其中乙醇浓度是30%~80%，为重量百分比。5、权利要求l的用途，其中洗脱用的乙醇浓度为20~95%，为重量百分比。全文摘要本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种珍珠菜总皂苷的用途，其特征是珍珠菜总皂苷可用于制备治疗肿瘤药物的用途，特别是其具有优良的抗肝癌作用。文档编号A61K36/185GK101199563SQ20071019173公开日2008年6月18日申请日期2007年12月14日优先权日2007年12月14日发明者唐丽华,李新章,游本刚,潘海敏,黄荣华申请人:苏州大学