专利名称：：一种鸡柔嫩艾美耳球虫复合免疫调节型dna疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物兽药
技术领域：
，是一种具有预防鸡球虫病作用的免疫调节型的DNA疫苗。技术背景鸡球虫病是一种严重危害集约化养鸡业生产的、全球性流行的寄生原虫病，每年由此而导致的经济损失高达20亿英镑以上(WilliamsRB.Acompartmentalizedmodelforestimationofthecostcoccidiosistotheworld'schickenproductionindustry.IntJParasitol1999;29:1209-1229.)。目前抗球虫药仍是防治鸡球虫病的主要手段，随着鸡球虫抗药性问题的日趋严重以及人们对食品安全的日益关注，人们期待用更理想的方法代替抗球虫药的使用。球虫活囊疫苗的成功研制和应用提供了一种可代替药物控制鸡球虫病的技术手段，但活囊疫苗不可避免地存在成本高、难保存、散毒及潜在的致病威胁等缺点。随着分子生物学和现代生物技术的发展，DNA疫苗以其独特的优势显示其在未来畜禽疫病控制中的诱人前景。特别是在球虫免疫过程中，细胞免疫占主要作用，而DNA疫苗能够诱导强烈的细胞免疫反应，因此，DNA疫苗作为新型预防家禽球虫病的措施逐渐受到重视。鸡球虫的生活史复杂、基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异。Jeurissen等(1996)研究表明子孢子是免疫有关的最重要的发育阶段(JeurissenSHM,JanseEM,VermeulenAN,etal.加e〃ainfectionsinchickens:aspectsofhost-parasite:interaction.VetImmunolImmunopathol1996;54:231-238.)，McDougald、Jeffers和Rose实验证明至少柔嫩和巨型艾美耳球虫能诱导机体产生免疫的虫体主要集中在第二代裂殖子阶段(McDonaldV，RoseME，JeffersTK.五/附en.afewe〃a:immunogenicityofthefirstgenerationofschizogony.Parasitol1986;93:1-7.)。本实验室用柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段抗原基因5401(黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAXl-5401-IFN-Y的研究.南京农业大学硕士学位论文2006.)、TA4(徐前明.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pcDNA-TA4-IL-2的研究.南京农业大学硕士学位论文2004.)、S07(仇保丰.鸡柔嫩艾美耳球虫S07基因免疫调节型核酸疫苗的研究.南京农业大学硕士论文2005.)和第二代裂殖子阶段抗原基因MZ5-7(格日勒图.鸡柔嫩艾美尔球虫MZ5-7基因免疫调节型DNA疫苗的构建及其免疫保护性试验.南京农业大学博士学位论文2005.)构建了核酸疫苗，并在动物实验中获得了良好的保护效果。为了构建包含多个发育阶段抗原基因的DNA疫苗，选择柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段抗原基因S07和第二代裂殖子阶段抗原基因MZ5-7为研究对象。球虫感染鸡后，既可引起体液免疫应答也可引起细胞免疫应答，体液免疫主要通过依赖腔上囊B淋巴细胞实现，细胞免疫主要是通过依赖胸腺的T淋巴细胞实现。分别摘除胸腺和腔上囊的实验结果表明抗体作用居于次要地位，而细胞免疫居于主要地位。T细胞免疫应答反应在球虫免疫应答中处于核心地位，T细胞反应与整个抗球虫免疫效应的表达过程密切相关。对柔嫩艾美耳子孢子阶段抗原基因S07和第二代裂殖子阶段抗原基因MZ5-7进行分析，各选定出两段T细胞表位比较集中的序列进行克隆，用来构建DNA疫苗。鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，这些细胞因子多数在体内或体外有抑杀球虫的作用，研究较多的是鸡Y干扰素和鸡IL-2。鸡Y干扰素的产生及其活性虽然没有特异性，但据Kaspers的研究(KasperB，LillehojHS，JenkinsMC,etal.Chickeninterferon-mediatedinductionofmajorhistocompatibilitycomplexClassIIantigensonperipheralbloodmonocytes.VetImmunolImmunopathol1994;44:71-84.)，它可以通过激活淋巴细胞和促进主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原的表达来调节特异性免疫。鸡Y干扰素在体外可抑制鸡成纤维细胞和巨噬细胞内的发育。鸡IL-2是另一个重要的细胞因子，鸡初次和再次感染cerra"""，脾和十二指肠鸡IL-2mRNA显著增多，也使十二指肠TCR1细胞的百分比升高。Gaarter等(CaarterLL,etal.RegulationofTcellsubsetsfronmnativetomemory.JImmunol.1998;21(3):181-187.)报道在感染第3天和第5天给鸡注射IL-2可使卵囊排出量降低。这些结果提示球虫抗原对鸡IL-2的产生具有潜在的刺激作用，而这种细胞因子具有广泛的免疫调节功能，若能诱导它们大量产生，则对宿主抗球虫感染十分有利。本发明利用鸡Y干扰素基因作为佐剂连接到球虫抗原基因上，旨在增强DNA疫苗的免疫效果。
发明内容技术问题本发明的目的在于提供一种有预防或治疗鸡球虫病作用的复合免疫调节型的DNA疫苗。该DNA疫苗编码鸡柔嫩艾美耳球虫多阶段部分抗原(子孢子和第二代裂殖子阶段抗原)，编码的抗原含有集中的T细胞表位。并且连接有chIFN-Y基因作为免疫佐剂。将chIFN-Y基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。技术方案本发明提供了一种鸡柔嫩艾美耳球虫(&附en'afe"e/Za)复合免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入鸡柔嫩艾美耳球虫T细胞表位集中的基因片断sl、s2、ml和m2的真核质粒载体，其中sl和s2选自子孢子阶段基因S07，ml和m2选自第二代裂殖子阶段基因MZ5-7。ml、m2、sl和s2核苷酸序列分别为SEQIDNO.l的第1-324个碱基，第334-684个碱基，第691-975个碱基，第982-1221个碱基。该DNA疫苗还包含鸡Y干扰素基因(chIFN-Y)，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第1231-1725个碱基，chIFN-Y与所述基因连接在一起组成一融合基因011-1112-3"2《1^>1-Y，插入真核质粒载体。所述的融合基因ml-m2-sl-s2-chlFN-Y的核苷酸序列为SEQIDNO.l。所述的真核质粒载体为pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAXl或pcDNA4/HisMax。该DNA疫苗可以在制备预防或治疗鸡球虫病的药物制剂中应用。本发明部分建立在本实验室下列发现之上含有柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段抗原基因S07和第二代裂殖子阶段抗原基因MZ5-7的真核质粒载体能够为鸡提供针对柔嫩艾美耳球虫的有效免疫保护；将chIFN-Y基因与球虫保护性基因一起引入真核质粒，能够进一步增强所述球虫保护基因的免疫保护效果。在本发明的另一个方面，提供了一种生产鸡柔嫩艾美耳球虫复合免疫调节型DNA疫苗的方法。简而言之，其技术路线如下-1.四个基因片断的选定对S07和MZ5-7基因的抗原表位进行分析，每个基因都选定两段T细胞表位比较集中的序列(S07为sl和s2，MZ5-7为ml和m2)。2.sl、s2,ml和m2的克隆与重组质粒的构建(构建流程见附图1一6)3.重组质粒的体内检测4.动物免疫保护性实验本发明具有以下优点和效果1.该疫苗是DNA疫苗，与传统疫苗相比，具有安全性高、在体内维持时间长、制备简单、热稳定性良好、便于贮藏和运输、使用省时省力等优点。2.鸡球虫的生活史复杂、基因组庞大，不同发育阶段的免疫原性和抗原构成都有差异。该疫苗包含编码鸡柔嫩艾美耳球虫子孢子和第二代裂殖子阶段抗原的基因，与单阶段抗原基因相比，能够诱导更为全面、强烈的免疫应答反应。3.T细胞免疫应答反应在球虫免疫应答中处于核心地位。该疫苗所选用的四个基因，都编码集中的T细胞表位，特异性地诱导T细胞免疫应答反应；通过选择最佳和最具免疫保护潜力的T细胞表位诱生特异性免疫应答，能尽量减少无关、干扰和抑制序列可能产生的负面影响；四个片断串联以增加表位浓度和密度，增强重组抗原的反应范围。4.鸡感染球虫后会产生多种细胞因子，包括chIFN-Y。这些细胞因子在免疫反应中具有广泛的调节作用，并且多数在体内或体外有抑杀球虫的作用。该疫苗分别含有chIFN-Y基因，增强了该疫苗的免疫保护效果。试验证明，复合免疫调节型DNA疫苗PVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-Y在抗球虫感染中，具有良好的免疫保护效果。图1为本发明柔嫩艾美耳球虫复合免疫调节型DNA疫苗的结构示意2为重组质粒pVAXl-ml的构建流程3为重组质粒pVAXl-ml-m2的构建流程4为重组质粒pVAXl-ml-m2-sl的构建流程5为重组质粒pVAXl-ml-m2-sl-s2的构建流程6为重组质粒pVAXl-ml-m2-sl-s2-chlFN-Y的构建流程7为ml、m2、sl和s2的选定示意8为pVAXl-ml-m2-sl-s2-cMFN-Y的酶切鉴定图M:DNA分子量标准物DL2000;1-6:pVAXl-ml-m2陽sl陽s2-chlFN-Y的M/1、JHwI双酶切鉴定(chlFN-7，510bp)。图9为pVAXl-ml-m2-sl-s2-chlFN-Y的RT-PCR检测图M:DNA分子量标准物DL2000;1-5:分别为ml(345bp)、m2(375bp)、sl(309bp)、s2(258bp)、chlFN-Y(510bp)的检测；6:空白对照。图10为pVAXl-ml-m2-sl-s2-chlFN-Y的Western-blot检测基础材料1.孢子化卵囊江苏株柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，每三个月经鸡体复壮并孢子化，孢子化率在80%以上(索勋，李国清.鸡球虫病学[M].北京:中国农业大学出版社，1998.本实验室对外提供)。2.实验动物O龄的小公雏购自南京某种鸡场，自出壳至实验结束时词养在严格消毒，无球虫的环境中，自由采食和饮水。3.质粒与菌种宿主菌￡.co//DH5a、BL21、质粒PET32a-S07、PET28b-MZ5-7、真核表达载体pVAXl(Invitrogen公司)；pMD18-Tvector克隆载体，购自大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司4.工具酶与试剂Trizol试剂为Promega公司产品；DEPC为Amresco公司产品；e-巯基乙醇为Fluka公司产品；反转录酶AMV、01igo(dT)18、rTaq酶、dNTP、DNA分子量标准物DL2000、T4DNALigase、限制性内切酶，水饱和酚、琼脂糖胶回收试剂盒均为大连宝生物(TaKaRa)工程有限公司产品；其余试剂为国产分析纯。5.主要仪器设备冷冻台式离心机(Eppendorfcentriftige5417R);紫外可见分光光度计(Bio-Rad);PCR仪(HYBAID公司)；空气浴摇床(THZ，江苏太仓市实验设备厂)；紫外分析仪(WD-9304C型，北京市六一仪器厂)；电泳仪(DYY-11B，北京市六一仪器厂)。实施例l.S07和MZ5-7基因的抗原表位分析(见图7)利用DNAstar软件对两个基因序列进行抗原表位分析，各确定两段T细胞表位比较集中的序列，S07为sl和s2，MZ5-7为ml和m2。sl、s2、ml和m2核苷酸序列分别为SEQIDNO.l的第1-324个碱基，第334-684个碱基，第691-975个碱基，第982-1221个碱基。选择参数(图7)为1.Hydropathy—Hopp-Woods—通过计算蛋白质序列上的最大局部亲水性寻找蛋白质的抗原决定簇2.Antigenicity—AMPHI—根据序列预测免疫优势辅助性T淋巴细胞抗原位点3.Antigenicity—Rothbard-Taylor—预测含有特定基序(motif)的潜在T淋巴细胞抗原决定簇4.Antigenicity—Jameson-Wolf_通过联合现有的蛋白质结构预测方法预测潜在的蛋白质抗原决定簇实施例2."、s2，ml和m2的克隆与重组质粒的构建(见图8)根据所构建的重组质粒对酶切位点以及对阅读框的不同要求，利用软件primerpremier5.0设计五对特异性引物，并送往大连宝生物(TaKaRa)合成引物。序列如下ml上游弓l物5'aaagctagcatgcaggaagtgccag3，ml下游弓l物5'gggaagcttttggataaggacttcatca3，m2上游引物5，aagcttatgcaaacacttgaa3，m2下游弓I物5，ggtaccttgagttagcatgccgata3,s1上、游弓I物5'ttaggtaccgacctcttcagcggactcg3's1下游弓I物5，aaagaattccagcgcgcagcagct3，s2上游弓I物5，ccccccgaattcaaactggccctcg3，s2下游弓I物5，aaagcggccgccgccccgtagct3，chIFN-Y上游引物5，ttagcggccgcaatgacttgcca3'chIFN-Y下、游引物5，ccctctagattagcaattgcatctcctc3，利用特异性引物，分别以质粒S07、MZ5-7和chIFN-Y为模板，按分子克隆方法进行PCR扩增(SambrookJ,RussellDW.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001.)。PCR产物克隆到pMD18-T载体中。鸡Y干扰素基因(chIFN-Y)(黄欣梅.鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pVAXl-5401-IFN-Y的研究.南京农业大学硕士学位论文,2006)，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第1231-1725个碱基。按照分子克隆方案(SambrookJ，RussellDW.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)构建重组质粒pVAXl國ml、pVAXl陽m2、pVAXl-sl、pVAXl陽s2、pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-Y。构建好的质粒测序，与原序列比对，融合基因pVAXl-ml-m2-sl-s2-chlFN-Y的核苷酸序列为SEQIDNO.l。实施例3重组质粒RT-PCR检测(见图9)大量提取重组质粒，分别经腿部肌肉注射7日龄雏鸡(100ug/只)，一周后分别取注射部位(腿肌)和非注射部位肌肉(胸部)，一步法分别提取总RNA，加入DnaRase除去残余的重组质粒和基因组DNA,以总mRNA为模板做RT-PCR分别扩增目的基因。实施例4.重组质粒的westernblot检测1.天然子孢子抗血清的制备将孢子化卵囊重悬于100mLPBS(含有适量胃蛋白酶)溶液中，用浓盐酸调pH值为2.5，37。C作用约2h，当子孢子完全游离出来时，加入5mol/L的NaOH溶液至pH值为7.4终止酶消化反应。8000r/min离心20min收集子孢子，重悬于一定体积的PBS溶液(含0.1mol/LPMSF)中进行超声破碎(400W,工作10s、间隔10s、50个循环)，最大速度离心收集上清，用PEG20000浓縮使其终浓度约为0.5mg/mL。上述上清物用弗氏佐剂乳化后，在SD大鼠背部皮下注射免疫(200ug/只)，首次免疫和二次免疫相隔15天，之后每隔78天加强免疫1次。当琼脂扩散反应呈现阳性时，扑杀大鼠，收集高免血清，置-20'C保存备用。1.westernWot检测大量提取重组质粒，腿部肌肉注射一周龄鸡(100ug/只)，一周后分别取注射部位(腿肌)和非注射部位肌肉(胸部)，裂解液裂解lh，12000r/min离心5min取上清制样，Western-blot检测目的基因的表达情况(见图10)。表l.实验设计与免疫程序组别14曰龄21日龄28日龄口服孢子化卵囊pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-Y100ug/只100ug/只5Xl()4个/只pVAXl-ml100ug/只100lig/只5乂104个/只pVAXl-m2100ng/只100yg/只5Xl()4个/只pVAXl-sl100ug/只腦ug/只5Xl()4个/只pVAXl-s2訓iig/只100ixg/只5Xl()4个/只pVAXl腦ug/只100"g/只5Xl()4个/只非免疫非攻虫TETE0非免疫攻虫TETE5乂104个/只实施例5.免疫保护性实验1.实验设计(见表l)0日龄小鸡词养在严格消毒，无球虫的环境中，自由饮水采食。14日龄逐只称重并编号，淘汰偏重和偏轻的鸡只，随机分组并调整个实验组间的总体重或平均体重。使它们接近一致，每组30只。设立非免疫非攻虫组(白对照)、非免疫攻虫组(红对照)和空载体对照组。14日龄首免，实验组腿部肌肉注射重组质粒？￥^1-1111-1112-51-32《11^^Y(100ug/只)，红白对照组腿部肌肉注射TE，空载体对照组腿部肌肉注射pVAXl空载体(100ixg/只)。21日龄加强免疫，28日龄逐只称重，除了白对照组外，全部鸡口服柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊(5乂104个/只)。35日龄逐只称重，全部扑杀，分别取每只鸡的盲肠，进行病变记分和卵囊计数。2.免疫保护效果的观察2.l.增重效果平均增重1=攻虫时重一首免时重平均增重2=宰杀时重一攻虫时重增重率二(宰杀时平均体重一攻虫时平均体重)/攻虫时平均体重X100%2.2.0PG值(克盲肠内容物卵囊数)(见表2)表2.卵囊值的转换方法盲肠内容物卵囊百万数(X106)卵g于0.0.11.012.05.0106.010.020大于U.O40按麦克马斯特法计算卵囊，具体为攻虫后第7天，宰杀全部鸡，逐羽取其盲肠内容物，各取2g，力卩10mL水，搅匀，然后再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止1-2分钟，镜检计数两个计数室的卵囊数。计数室容积为1X1X0.15=0.15mL，0.15mL内含粪便2X0.15/(10+50)=0.005g，两个计数室则为O.Olg所得卵囊数乘IOO即为OPG值。2.3.盲肠病变记分攻虫后第8天，宰杀全部鸡只，逐羽观察盲肠病变，并按Johnson方法进行盲肠病变记分。即将盲肠病变分为0~+4五个等级。0分表示正常，无肉眼病变；+1分盲肠壁有很少量散在的淤点，肠壁不在增厚，内容物正常；+2分病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常；+3分盲肠内有多量血液或盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少；+4分因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记+4分。两侧盲肠病变不一致时，以严重的一侧为准。2.4.抗球虫指数(ACI)ACI是包括存活率、增重、病变、卵囊产量等多项参数，综合评定后作为判定球虫耐药性或药物效力的指标，也可用于球虫疫苗保护效果检测的指标。但是，不同的研究者在计算ACI采用的参数指标、计算方法和判定标准不尽相同，我们釆用如下ACI判定公式进行判定。ACI=(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)存活率=(实验结束时存活鸡只数/实验组鸡只数)X100%相对增重率=(实验组增重率/非感染非免疫组增重率)xioo%病变值(040)=各实验组的平均病变记分(04)X10卵囊值(040)按表2方法计算以ACI^180为保护效果明显，ACI=160179为保护效果一般，ACK160为无保护效果。2.5.卵囊减少率卵囊减少率=(红对照卵囊产量一实验组卵囊产量)/红对照卵囊产量X100。/。3.免疫保护效果分析(见表3)实验过程中没有死亡的鸡只。从平均增重看来，实验组明显高于对照组，差异显著p〈0.05，而pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-y组高于其他实验组，差异显著p<0.05。pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-Y组的卵囊减少率最高，达到68.93%。pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-y组的平均盲肠病变记分1.03最低，ACI最高，为189.92，大于180，免疫保护效果明显。其他实验组ACI大于160小于180，免疫保护效果一般，空载体对照组和非免疫攻虫组ACI小于160，没有免疫保护效果。综上所述，复合免疫调节型DNA疫苗pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-y在抗球虫感染中，具有良好的免疫保护效果。表3.疫苗对免疫鸡抗球虫感染的综合保护效果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表<110>南京农业大学<120>—种鸡柔嫩艾美耳球虫复合免疫调节型DNA疫苗<130>说明书<140>00<141>2007-1卜02<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<21>1725<212>DNA<213>人工序列<220><221>pVAX1-m1-m2-s1-s2-chIFN-y<222>(1)..(1725)融合基因<223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>ml基因片段("(324)m2基因片段(334)..(684)sl基因片段(691)..(975)s2基因片段(982)..(1221)CDS(鸡IFN-Y基因)(1231)..(1725)1atgcaggaagtgccagcgcgcacggtcacagctcgcctggcgaagcctttgctgcttctt60tctgctcttgctgcgactttggcagcagctttcctcgttttgcaatgcttcaacatcatc120tccagcaacaaccagcaaaccagcgtcaggagactggccgccggaggtgcatgcggagat180gaggaagatgcagatgagggaacttcacagcaggccagccggaggaggagaaaacctgat240acccctgcagcagataaatacgattttgttggcggaactccagtttcggtcactgagccg300aatgttgatgaagtccttatccaaaagcttatgcaaacacttgaaggatatcttggtagt加0caagctcttgcacaggacggaaagactgctaaagaagagaaagttgaaggaggcaaaact420cacagaagatataaagtcaagagcagcgacccaggatatggattcccatacaccacggtg480ctcgacggggttcctgtgggaac8gacg肌gacggatecgtcgtcgaagttcttatgaaa540accggacccc3tgg鄉agtcgscatgatgcatcacaaggaaaattctgc600tgg3tg3Cggaaaaggaaacctagtcgatgg3C6Laggg3g660gccgttetgggg3tgCt肌Ctcaaggteccgacctcttcagcggactcgtgggcggcgtc720gtcggcgctgttgctgcagcagatttgcctgcgg鄉gcg卿gggccccccgccccgcc780cccggcactgcctggacttgctgctgcagcaaactgcaag卿gggcccgcg3gctgga^g840ggttttgtgcagcagctgagttttgttgcagggaagctggcctgctgcctgcgggtgggg900gCg眺C3gCtggcgcgctgcgctgcggaggggcggctgccc3gcagcagcagcagcagc960agctgctgcgcgctggaattcaaactggccctcgaggccctcctcgagggggcccgcgtt1020gcagcaacgcggggtttgctgctggtcgagacacggtgctgcgcagcatt1080CCCC3C6LCCCagg卿agctggcccaggcctacagttctttcctgcggggctaccagggg1140gcagcggggaggtctctgggctecggggcccctgctgctgcttacggccagcagcag1200cagcccagcagctacggggcggcggccgcaatgacttgccagacttacaacttgtttgtt1260ctgtctgtcatcatgatttattatggacatactgcaagtagtctaaatcttgttcaactt1320caagatgatatagacaaactga肌gctgactttaactcaagtcattcagatgtagctgac1380ggtgg紅tattattgtagaaactgg3c3gga^犯ggatc1440atactgagccagattgtttcgatgtacttggaaatgcttgaaaacactgacaagtcaaag1500ccgcacatcaaacacatatctg鄉agctctatactctgaaaaacaaccttcctgatggc1560gtga卿aggtgaaagatatcatggacctggccaagctcccgatgaacgacttgagaatc1620ca^gcgraaagccgcgaatgaactcttcagcatcttacaga3gCtggtgg3tcctccgagt1680权利要求1、一种鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)复合免疫调节型DNA疫苗，该疫苗包含其中插入鸡柔嫩艾美耳球虫T细胞表位集中的基因片断s1、s2、m1和m2的真核质粒载体，其中s1和s2选自子孢子阶段基因SO7，m1和m2选m2第二代裂殖子阶段基因MZ5-7，m1、m2、s1和s2核苷酸序列分别为SEQIDNO.1的第1-324个碱基，第334-684个碱基，第691-975个碱基，第982-1221个碱基。2、根据权利要求1所述的DNA疫苗，其中进一步还包含鸡y干扰素基因chIFN-y，核苷酸序列为SEQIDNO.l的第1231-1725个碱基，与权利要求1所述所述基因连接在一起组成一融合基因pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-y，插入所述真核质粒载体。3、根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中所述的融合基因pVAXl-ml-m2-sl-s2-chIFN-y的核苷酸序列为SEQIDNO.l。4、根据权利要求1-3中任一项所述的DNA疫苗，其中所述的真核质粒载体为pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAXl或pcDNA4/HisMax。5、权利要求1-4中任一项所述的DNA疫苗在制备预防或治疗鸡球虫病的药物制剂中的用途。全文摘要本发明涉及一种鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)复合免疫调节型DNA疫苗，属于生物兽药
技术领域：
。利用分子生物学技术分别将鸡柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段基因SO7和第二代裂殖子阶段基因MZ5-7T细胞表位集中的基因片断克隆出来，SO7的两个片段分别命名为s1和s2，MZ5-7的两个片段分别命名为m1和m2。将这四个片段串连到真核表达载体pVAX1上，并串连鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因，产生了一个既含有T细胞表位集中的多阶段抗原基因片断，又含有chIFN-γ基因作为免疫佐剂的复合免疫调节型的DNA疫苗pVAX1-m1-m2-s1-s2-chIFN-γ，能够有效地预防和治疗鸡的球虫病。文档编号A61K39/012GK101244268SQ20071019169公开日2008年8月20日申请日期2007年12月14日优先权日2007年12月14日发明者严若峰,宋小凯,徐立新,李祥瑞申请人:南京农业大学