专利名称：递送用于长效产生抗体的人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗的方法
递送用于长效产生抗体的人绒毛膜
促性腺激素(hCG)疫苗的方法
背景技术：
由于缺少使很多新开发的疫苗有效和安全用于医疗用途的合适佐 剂/递送系统，它们的应用受到阻碍。使用抗原分子的片断或亚基开发 了很多新疫苗，使用重组DNA技术或肽合成制备所述的片断或亚基， 已显示当对它们的免疫应答充分时，所述的新疫苗是有效的。在很多 情况下，引发充分的免疫应答(抗体或细胞激活)的条件包括使用产 生在注射部位的不能接受的局部炎症反应或其他不期望的副作用的佐 剂或赋形剂。唯一被批准在人疫苗中使用的佐剂是铝盐，其在被抗原 吸收时，增强对抗原的免疫应答。令人遗憾的是，这些佐剂仅仅对有 限数目的抗原充分地有效，并且对使用亚基或肽抗原的新疫苗很少有 用。 一般而言，这些疫苗是弱免疫原性的并且需要比铝盐提供的效果 更强的佐剂效果。当使用其他一般可利用的佐剂，例如矿物油/水乳剂 时，可以显示功效，但是副作用，例如在注射部位的疼痛和组织炎症， 经常阻碍其在人中的一般用途。
对给定的抗原产生免疫库答取决于一系列生物事件，包括抗原 递送至可到达淋巴样细胞的部位；这些细胞吸引到其中T淋巴细胞 (T-细胞)将抗原识别为异质的微环境；抗原表位与淋巴细胞受体的结 合；以及由抗原呈递细胞(APCs)、 T细胞和B淋巴细胞(B细胞)(它 们是抗体-产生性细胞和/或细胞毒细胞的克隆扩充所需要的)产生适 当的细胞因子。有很多天然的和合成的可以吸引并且刺激这些淋巴样 细胞的分子。另外，持续的体液免疫需要通过保留与小结树突细胞结 合的非降解的表位序列或通过从储库或微粒持续释放抗原，将B细胞 持久暴露于抗原。这种抗原的持久性对保持高水平的抗体产生同时不 必使用频繁的加强免疫来说是必要的。困惑。历史上，将术语"佐剂"指定为当与抗原一同给予时，能够刺 激比仅给予抗原时更强的对所述抗原的免疫应答的任何物质。通常， 由佐剂引起的非特异性刺激淋巴样细胞而影响这种增强的应答。很多
佐剂，例如对于人使用来说是不能接受的佐剂，弗氏(Freund)完全 佐剂(FCA)，可以刺激很多较早涉及的生物学件，而其他佐剂仅仅显 示这些活性中的一些。因此，随着用于鉴定更好的免疫增强剂的研究 进展，将这些化合物的性质更精确地定义为例如细胞引诱剂、巨噬细 胞(APC)活化剂、T-细胞促分裂原、B-细胞促分裂原或抗原递送系 统已成为必需的。已经根据很多这些物质的主要活性定义它们，尽管 它们可能产生多种生物效果。很多制剂和免疫方法显示了活性的组合。 本发明集中在疫苗制剂方法，该方法被设计用于诱导升高的抗体水平 并且使用新型递送系统保证持久供应抗原并且因此在延长的期间内维 持抗体产生，伴随最少的副作用。
例如，几个新开发的疫苗设计用于治疗感染性疾病以外的医学状 况。为了避孕或治疗癌症，开发了至少两种hCG疫苗。已经使用这些 疫苗进行了临床试验并且已经报道了结果(7Ww W, i7/7g力《尸a7W,
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C///7/ca/ C露er / esearc力《,厕4-旭J, ，2)。尽管这些疫苗中 有一些显示有希望用于人，但经常报道那些显示效用的疫苗在注射部 位的疼痛和/或肿胀的高发病率或需要多重免疫。有时该副作用对某些 患者来说是无法忍受的。
本申请描述的hCG疫苗制剂的一个主要用途是治疗癌症。将hCG分类为癌胚抗原(一种在胚胎发育期间高表达的抗原)，但是正常成
人组织表达的量可忽略不计。hCG在瘤组织中过度-表达。尽管仅仅 可能表达片断，但目前没有证据表明由瘤细胞表达的hCG是突变的。 从滋养层细胞/生殖细胞中产生的肿瘤(包括绒毛膜癌、水泡状脂块和 睾丸胚胎性瘤)产生hCG是这些疾病活性的必要标记，并且其量度在这 些疾病的临床处理中起到中心性作用。广泛多种非-滋养层起源的肿瘤 也表达hCG，这也是众所周知的。因此，滋养层癌和非-滋养层癌症的 hCG表达镨代表一组用于疫苗治疗的可能靶点。
Braunstein (Braunstein GD: Placental proteins as tumor markers. In: Immunodiagnosis of Cancer. Herberman RB and Mercer DW (eds) Marcel Dekker， Inc.,纽约，pp 673-701， 1990) 在1990年综述了癌症细胞的hCG表达，并且推测可以在大约18%患有 非-滋养层癌的患者的血清中显示免疫反应性hCG。最通常在患有子宫 颈癌(34%)、卵巢癌(29%)、胰腺癌(27%)、膀胱癌(23%)、肝癌(22%) 和胃癌(21%)的患者的血清中检测到hCG。但是，大部分这些被综述 的研究以由多克隆或单克隆抗体对hCG、 hCG-样材料或游离的hCG亚 基的识别为基础，所述抗体不完全是特异性的或不完全具有高亲和力。 最近，更灵敏的、对完整的hCG、 a-hCG、 p-hCG、 (3亚基的羧基末端肽 (CTP)和|3-核片断具有高特异性的以单克隆为基础的测定法已经使研 究人员可以再评价肿瘤产生hCG。例如，使用高灵敏的时间分辨免疫 荧光测定法已经在72%患有胰腺癌的患者以及在9%患有非-恶性疾病 的患者中发现升高的血清-hCG。已经报道了在正常受试者的血清中由 免疫放射分析测定法测定的低-水平hCG和游离的a-hCG亚基是常见 的。但是，游离的p-hCG fe 100 pg/ml)胂瘤特异性更强并且在除了 大部分患有生殖细胞肿瘤的患者外，还在47%膀胱癌、32%胰腺癌以及 3 0%颈癌患者的血清中被检测到。正常受试者具有的游离的(3-hCG血清 水平小于100 pg/ml。
膜相关hCG和/或亚基是培养的癌细胞系的共同特征。在临床肿瘤 样品的免疫组织化学研究中也经常检测到膜相关hCG。在Braunstein
13的概述中，在结肠直肠癌(52%)、肺癌(34%)、胰腺癌(31%)、食管 癌(28%)、乳腺癌(24%)和膀胱癌(21%)中，最频繁地在肿瘤组织中 检测到hCG。在大约8-19%胃癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌和子宫 内膜癌中也报道了免疫组织化学检测。另外，被报道的膜相关hCG的 表达发生变化，取决于研究的技术和患者人群。在癌症，例如胃癌和 前列腺癌中的表达率可能大于最初考虑的表达率，即大于50%。在其 他研究中，当使用特异性单克隆抗体进行免痕组织化学检测时，由人 结肠直肠癌样品表达的P-hCG CTP是85%。其他研究人员报道事实上 在所有癌细胞系的膜上检测到了 hCG "cep^/o fr/c力eF; iT J, C,6e" /lcer油 "，&/， ,G Sw/To #/, ^a"雄ir i /.
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将完整的hCG激素用作疫苗抗原是不合适的，因为针对它产生的 抗体将与其他激素反应。因此，已经将对hCG有特异性的亚基或肽片 断用作抗原。为了避孕(7Wfrar M, 57/7g/ 《户a/W, C力a〃eryee ^ /3//<2/.尸，/ a力// & 爿p^cc//7e /7rere/7fs preg/7a/zc/ //z fro/se/L /Yoc ;Va〃 Jcsd5c/ (^萄J夕7.U"-《7"W和ao/ es附，/i/c^ i7， /"g 户o『e// /, AracT/e7 /, / e/2力o7/z#we//er W, "//TV;
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和为了癌症治疗(#oi/"o/7 ^/, ros/ /力ara,尸《#aso/ /^， i>e"e/ 户丄， 7>ozzi 户Z. Jc">e i^ec/Z7c /迈/z7wz6^力era/ / / 一^"/ <2/2
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20。2,和(Tr2'oz//尸Z， Coc力/70wr / ， #arf//2 iT，力/cTr/c力^户( 『e/// 0/7co/ 乂. /W7-W, 7"W,在人中检测了使用这种抗原的疫 苗。在这些检测中使用需要多次注射的铝盐和油包水乳剂。使用明矾 佐剂的疫苗需要频繁给药以保持有效的抗体水平，这使它不能实际使 用。同样地，多次注射以乳剂为基础的疫苗，尽管是更有效的，但有 时引起不期望水平的注射部位疼痛和肿胀。如果将这些hCG疫苗重新 配制以使用更合适的佐剂/递送系统(使疫苗有效并且刺激更少)，那 么广泛应用这些hCG疫苗中的任何一种是更可能的。
本申请描述的特异性hCG疫苗使用与白喉类毒素缀合的!3-hCG的 两个肽区段CTP部分(残基109-145)和代表氨基酸38-57区的第二 肽的缀合物。在本发明的这个实施方案中，使用38-57肽序列的类似 物，而不是天然序列。产生的结合免疫原更有效地诱导hCG反应性抗 体，但是更重要的是，这些抗体在体外和体内hCG生物中和中更有效 得多，这在某些应用中可以是有价值的。
使用包含如上描述的缀合物的疫苗的免疫引起了患有转移性结肠 直肠癌的患者的存活时间增加，但是没有解决在注射部位的疼痛和肿 胀的问题。也没有解决很多疫苗制剂需要多次注射以获得高并且持久 的抗体应答问题广#。"/"/7 r。s力/力ara,尸《laso力"《iVei^e/7尸丄， 7>ozz2.尸丄.力cf/ye 5^ec/Z7c //zwz7w30fAera;77/ 一〃w/zza" C力or/o/ /c
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在最近二十年期间进行了广泛的研究，以鉴定更合适的递送疫苗 的系统。通过使用脂质体、生物可降解的聚合物微球体和用于點膜免 疫的制剂，取得了很多改善。这些系统中的一些正处于临床试验中并 且可能被证明对将来的疫苗有用。最近开发了用于药物递送(包括疫 苗递送)的另一种独特的系统，其为处于上述开发下的其他系统提供 了显著优势。当用于递送疫苗时，疫苗抗原被包埋在无机盐/生物聚合 物基质中，并且将固体基质磨成用于所需用途的非常细的颗粒。为了给予疫苗接受者，将所述微粒悬浮在乳剂介质中。这个方法(经证实
可以用于递送hCG疫苗制剂，该制剂引发非常有效的免疫应答，伴随 最少的副作用)构成了本发明。
发明内容
发明概述
本发明描述了制备以hCG为基础的疫苗的新型方法，该方法包括 将一种或多种hCG肽/白喉类毒素(DT)或破伤风类毒素(TT)缀合
油包水为基础的乳剂中的它们给予人。与类毒素缀合的hCG肽包括那 些代表P亚基序列109-145和38-57以及所述序列的类似物的hCG肽。 前面提到的基质由硫酸钙半水合物和硫酸葡聚糖组成。在将固体基质 悬浮在用于递送的乳剂前，将其磨成细粉。通过不同的标准筛网连续 地筛，得到需要的粒度的颗粒。 一种形式的悬浮乳剂可以由角鲨烯、 二缩甘露醇单油酸酯(MM)和磷酸盐緩沖盐水组成。在乳化前，可以将 合成的佐剂化合物，例如去甲(nor)-MDP掺入乳剂的含水部分。将多 个剂量的疫苗肌肉内给予接受者。这类制剂和其变体的实例已经显示 在动物模型中从单次接种开始超过6个月的期间引发高水平的对 hCG有反应性的抗体，没有产生不能接受的在注射部位的局部组织反 应。由这些制剂产生的抗体可以用于治疗患有癌症的患者并且可以用 于预防妊娠。
发明详述
将hCG肽抗原掺入无机盐/生物聚合物基质是通过Royer描述的 方法(美国专利第6， 391,336、 6, 497, 901和6, 630, 486号，通过引 用将它们完整地并入本申请)完成的。为了用于本发明而使用的无机盐
是硫酸钙半水合物，并且使用的生物聚合物是硫酸葡聚糖，优选的形 式具有的平均分子量是8000道尔顿。两个被包埋的hCG肽抗原代表 以指定的肽比DT的比率与DT缀合的hCG P亚基序列109-145和 38-57或这些肽的类似物或这些缀合物的组合。可以用TT代替DT。按重量比例l-10份盐比1份抗原，优选的比率是4:1，将每个缀合物抗 原，优选在干燥状态下，分别与硫酸钙半水合物混合。在彻底地混合 干燥成分以后，在连续的搅拌下，将一定体积的含水IO %硫酸葡聚 糖(wt/体积)加入适当重量的干燥缀合物/盐预混合物以形成浆，其中 所述缀合物均匀分散。记录在湿状态下的混合物重量。在室温、使用 通风的情况下，干燥混合物2-5天，直到观察不到混合物重量的进一 步变化。在使用研钵和研扦或机械研磨机将固体基质磨成细粉前，记 录最终的重量，并且测定所述粉末的水含量。将水含量加干燥产生的 水损失的量用于计算抗原在固体基质中的浓度(质量平衡)。通过一系 列标准筛网过篩，得到供使用的期望的微-粒度。用于疫苗制剂的颗粒 尺寸范围是10-800微米，优选的尺寸范围是45-150微米。
干燥的包含抗原的颗粒通常在室温下可以稳定地长期保存，但是， 如果具体的抗原性质期望或需要，可以在冷冻下保存。
为了制备疫苗，将包含抗原的基质颗粒悬浮在具有足够黏滞度的 液体介质中以保持颗粒在整个混悬液中均匀分散。或者，只要颗粒可
以容易地在注射前再悬浮，可以使用较不黏滞的液体介质。可以使用 不同的液体赋形剂，例如油包水乳剂、水包油乳剂、0. 1-2. 0%羧曱基 纤维素、透明质酸溶液、卵磷脂溶液或其他可接受的药物赋形剂。一 种用于hCG缀合物抗原的优选赋形剂是角篁烯和磷酸盐緩冲盐水 (PBS)在比率为3份油相比2份PBS (v/v)的油包水乳剂。 一种可接 受的油是由4份角篁烯与1份MM的混合物提供的，其作为乳化剂起 作用并且稳定乳剂。使用机械混合器或使用三路活栓连接的皮下注射 器由手制备乳剂。油相比PBS的其他比率可以用于其他抗原，取决于 疫苗需要的它们的溶解性和/或剂量。也可以使用其他油，例如角鲨烷。 最弱的抗原，包括本发明使用的hCG缀合物，需要将佐剂化合物 与抗原一起给予以刺激期望的免疫应答。可以在制备基质时，将这类 化合物加入基质并且和抗原混合或在形成乳剂前，将这类化合物加入 乳剂的含水相。已经显示对于这个目的来说是有效的佐剂化合物包括 分支杆菌、细菌膜的合成片断或这些的合成类似物、铝盐、镁盐、脂质和很多其他化合物(Adams A. Synthetic Adjuvants. 纽约John Wiley & Sons, 1985)。本申请公开的用于本发明的优选佐剂是细菌膜 的合成类似物，去曱胞壁酰二肽(nor MDP),在化学上将其定义为N-乙酰基-D-葡糖胺-3-y-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺钠盐。这个化合物非常 溶于水并且以不同浓度被加入角鲨烯/PBS乳剂的含水相以使最终的 乳剂具有的浓度是5-100微克/毫升。
为了疫苗的最终制剂，通过使油/含水混合物在注射器之间前后运 动直到得到光滑、乳状的乳剂，在双注射器系统中首先形成PBS和油 乳剂。然后，分离包含乳剂的注射器，并且将其与包含干燥抗原颗粒 的新注射器再连接。然后通过前后混合直到在介质中得到颗粒的均匀 混悬液，将选择剂量的基质颗粒(由在基质中的抗原浓度和需要的抗原 重量测定)悬浮在递送介质。为了将单位剂量分散在无菌小瓶、安瓿、 注射器或其他合适的递送工具中，可以在免疫时将干燥的基质颗粒与 介质混合或将颗粒与大体积介质分批混合。在乳剂中制备的疫苗优选 在2-8 'C的温度保存。
抗原在基质中的浓度可以在12-24%重量变化，优选的浓度是 16-18 %。用于人免疫的hCG缀合物的剂量可以是10-500微克并且 可以在0. 1-1. 5毫升中给予。将在适当的体积中的选择的抗原和佐剂 剂量在医学上可接受的部位肌肉内注射给接受者。在人中，这通常是 在上臂、大腿或臀部。
当颗粒悬浮在乳剂中时，被包埋的抗原释放比当悬浮在含水介质 中时慢得多(图1)。
图1说明了缀合物DT/ p亚基肽109-145 (CTP/DT)的体外释 放速率的比较，所述缀合物包埋在无机/生物聚合物基质中，直接悬浮 在提取介质(PBS)中或在首次使用角鲨烯/二缩甘露醇单油酸酯/PBS 乳剂以后。将颗粒或乳化的颗粒放在13 x100 mm含有等分1, 0 mL PBS 的一次性管中，通过涡旋混合并且在37 。C在培养箱中旋转。以所示次数，将管在低速(900 x g)离心5-7分钟以沉淀颗粒或分配乳剂/ 油/PBS。使用微量移液管吸出上清PBS并且由劳里(Lowry)蛋白测 定方法检测提取的缀合物的存在。将另一份1. Oml PBS加回至每个管， 将样品通过涡旋混合然后如前所述地在37 。C旋转。曲线显示从直接 悬浮在PBS的颗粒(菱形)以及悬浮在乳剂然后同PBS混合的颗粒 (正方形)提取出的缀合物总量。
图2说明了在单次注射在1. Oml角鲨烯/PBS乳剂中包含1. Omg 缀合物DT/hCG P亚基肽109-145 (CTP/DT)的基质颗粒以后在4只兔 中得到的平均抗体水平，所述乳剂包含0.025 mg去曱-MDP佐剂。
图3说明了在单次注射在l. 0ml角鲨烯/PBS乳剂中包含1. 0mg 缀合物DT/ P亚基肽38-57类似物(Loop/DT)的基质颗粒以后在4只 兔中得到的平均抗体水平，所述乳剂包含0.025 mg去甲-MDP佐剂。
图4说明了在注射(a) 3次接种不含被包埋在基质颗粒中的缀合 物的疫苗(菱形)或(b)单次接种含有被包埋在基质颗粒中的缀合物的 疫苗(正方形)以后在两组兔(4-8只兔/组)中得到的平均抗体水平，其 中每个制剂包含等量缀合物DT/ P亚基肽109-145 (CTP/DT)和38-57 类似物(Loop/DT)。所有剂量在包含0. 025 mg去曱-MPD佐剂的角篁烯 /PBS乳剂中给予。每次接种包括O. 05mg缀合物并且被施用给兔。对 于接受包含基质的疫苗的组，在第1天(左箭头)给予单剂量在0.5 ml乳剂中的疫苗并且没有给予进一步的注射。对于接受不含基质颗粒 的疫苗的组，在第l天(左箭头)给予在1. Oml乳剂中的剂量并且在 第3周和第6周(中间和右箭头)再次进行给药。
图5说明了在使用在第1天和在24周给予每只兔的0.045、 0. 090或0. 135 mg的组合剂量，注射包含等量缀合物DT/ P亚基肽 109-145 (CTP/DT)和38-57类似物(Loop/DT)的基质颗粒以后在3组 兔(4-8只兔/组)的平均抗体水平。在包含O. 025 mg去曱-MPD佐剂的 0.5 ml角鲨烯/PBS乳剂中给予所有剂量。
具体实施方式
实施例I
为了考察免疫原从无机/生物聚合物基质的释放，发展了体外方法
以确定释放速率。将缀合物DT/ P亚基肽109-l45 (CTP/DT)包埋在 无机/生物聚合物基质中，然后直接悬浮在提取介质(PBS)中，或首先 在预先形成的角篁烯/MM/PBS乳剂中悬浮颗粒后悬浮在PBS中。然后 将颗粒或乳化的颗粒放在含有等分1. 0 mL PBS的13 x 100 mm —次 性管中，由涡旋混合，然后在培养箱在37 。C旋转。以指定的次数， 将管在低速(900 x g)离心5-7分钟以沉淀颗粒或分配乳剂/油 /PBS。使用微量移液管吸出上清PBS并且由劳里蛋白测定方法检测提 取出的缀合物的存在。然后将另一份1. 0 ml PBS加回每个管，通过涡 旋混合样品，然后如前所述地在37 。C旋转。
得到的提取曲线显示在图1。在两个例子中，无机/生物聚合物基 质保留显著量的缀合物并且将其在若干天期间内释放。但是，从直接 悬浮在PBS中的颗粒(菱形)比从悬浮在乳剂中然后与PBS混合的颗 粒(正方形)更快得多地提取出缀合物。缀合物的这些较慢释放速率可 能是在免疫研究中观察到的高滴定度以及滴定度的长持续时间的原因 (下列实施例II和III),因为已知从注射部位慢释放增强对疫苗的免 疫应答。以由乳化的颗粒引起的缀合物较强保留为基础，进一步的研 究集中在缀合物的这个制剂。
实施例II
使用兔作为疫苗接受者进行与被掺入无机/生物聚合物基质的DT (CTP/DT)缀合的抗原P hCG肽109-145的免疫原性检验。4只兔各自 被注射给予包含在1. 0 ml角篁烯/PBS (60%/40% v/v)乳剂中的1. 0 mg 缀合物的制剂，所述乳剂包含0.025 mg去曱MDP。每周使用放射免 疫测定法测量抗体水平并且将其表达为nM/L结合能力。到注射以后 两周，单次肌肉内注射引起了增加的抗体的产生。到7周达到大于 1,500 nM/L的抗体峰水平并且几个月保持在高于100 nM/L的水平。这 些水平比在结肠癌患者中提供来自治疗的益处所需要的水平高40-100倍(图2)。
这个研究显示所述制剂是非常有效的。与以前在使用相同量的缀 合物但是其中缀合物没有被包埋在基质颗粒中的接种中得到结果相 比，该数据显示可以使用比使用非基质-包埋的制剂更低剂量的包埋在 基质中的抗原，以得到治疗必需的抗体水平。
实施例III
除了使用与DT (Loop/DT)缀合的P hCG 38-57类似物肽作为抗 原以外，使用同实施例II中相同的条件进行另一个试验。得到非常 相似的结果(图3)。与以前在使用相同量的缀合物但是其中缀合物没 有被包埋在基质颗粒中的接种中得到结果相比，该数据显示对于在疫 苗中使用来说，更低剂量的包埋在基质中的抗原比非基质-包埋的制剂 更有效。
实施例IV
使用兔作为疫苗接受者，进行除了存在或不存在无机/生物聚合物 基质以外是相同的疫苗功效对比。对4只兔各自肌肉内注射给予制剂， 在所述制剂中两个缀合物(同上述实施例II和III 一样的CTP/DT和 Loop/DT)各自为0. 5mg，所述缀合物在0. 5 ml角篁烯/PBS (60%/锡) 乳剂中，所述乳剂包含0.025 mg去甲MDP。每周使用放射免疫测定 法测量抗体水平并且将其表达为nM/L结合能力。将单次肌肉内注射 包含无机/生物聚合物基质的疫苗与3次注射缺少无机/生物聚合物 基质的疫苗相比，以获得近似相同的效果。图4显示两种接种疫苗方 案到注射以后两周都引起了增加的抗体的产生。但是，与来自缺少无 机/生物聚合物基质的疫苗的那些滴定度相比，从包含无机/生物聚合 物基质的疫苗的注射得到的滴定度达到了显著更高的水平并且保持更 高水平，尽管缺少无机/生物聚合物基质的疫苗被注射3次而包含无机 /生物聚合物基质的疫苗被注射1次。
表1比较了免疫得到的组织反应。对于没有被包埋在无机/生物聚合物基质中的疫苗来说，如在实施例VI中测量的在注射部位的组织反应在所有动物中是最小至适度，但是平均反应(损害得分)是1.4，实质上高于临床上可接受的1.0水平。相反，包含无机/生物聚合物基质的疫苗的组织反应是可以忽略不计的，并且完全在临床上可接受的极限内。
表1.在注射部位的组织反应
不含基质含有基质兔ABCDEFGH
损害得分*0. 51. 02. 02. 00. 00. 00. 00. 0
组平均值1. 40. 0*按照实施例VI中的描述进行测量
实施例V
一系列使用单独的缀合物的测试显示每个被掺到基质中的hCG缀合物的安全和有效的剂量在0. OIO和0. 10mg之间。然后开始研究，其中得到等比例CTP/DT和Loop/DT抗原的组合的剂量反应。检测包含共O. 045-0.135 mg组合的缀合物(50/50的比率，w/w)的剂量在兔中引起hCG-特异性抗体产生的能力。在从首次注射起的第l天和在24周进行注射。来自这个研究的抗体性质显示在图5中。抗体水平，甚至在研究的最低剂量，比足以供临床使用的水平更高。
按照实施例VI中测量的组织反应在最低剂量时是最小限度的并且在使用的最高剂量时是适度的，但是可接受的。
实施例VI肉眼评价在注射部位的组织反应。
为了评价在注射测试材料以后大腿肌肉的大体(肉眼)外观，通过造成横向的和纵向的切口然后剥离皮肤，将安乐死的动物剥离检查的大腿的皮肤。小心进行与肌肉组织干净利落的分离，不损伤肌肉组织。使用锋利的柳叶刀，切开每个注射部位以暴露大腿肌肉的内部。如果为了保证完全的病理学观察和评估是必需的，那么制造附加的切口 。
活检标本保存在10%緩沖的福尔马林中。用于评价大体外观的量表0:正常组织
没有可见的病理现象。在肌肉组织中的炎症完全溶解以后有时出现黄色脂肪状的/纤维状的组织。不将这种变化评定为病理学的。1: 最小限度的病理现象
典型的外观包括小的(<3 mm直径)硬的小结，其代表包裹的并且分辨的无菌脓肺或炎症的部位。需要这类病变的组合体积小于总大腿肌肉体积的5%。
2: 适度的病理现象
小结更大(直径3-10mm)并且包括接触时为硬的(老的纤维质生成)或软的(更最近包裹的)病变。在挤这类病变时，有时挤出脓或注射物质。偶尔观察到游离的(非包裹的)物质。在那种例子中，病变的纵向直径需要不大于10 mm。病变的组合体积需要在总大腿肌肉体积的5-10°/。之间。
3: 严重的病理现象
大的、包裹的或非包裹的病变，纵向的直径大于10 mm。通常，病变包含脓(无菌脓肿)或注射物质(乳剂)。病变的总体积大于总大腿肌肉体积的10%。
中间等级
当病变没有明确地落入某个等级定义中时，将中间等级指定为0-1、 1-2或2-3。为了计算组平均值，将中间等级指定为半值(例如将0-1指定为值0.5)。
权利要求
1. 一种递送抗原的方法，该抗原有效引发针对人绒毛膜促性腺激素(hCG)的抗体，该方法包括将所述抗原掺入无机/生物聚合物基质中，将掺入了抗原的基质悬浮在包含佐剂的油包水乳剂中，并且将含有掺入了抗原的基质的乳剂注射到人体中，用于治疗患有癌症的患者。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述抗原是载体蛋白例如白喉类 毒素和hCG p亚基序列109-145的肽或hCG P亚基序列109-145的类 似物肽的缀合物。
3. 根据权利要求1的方法，其中所述抗原是载体蛋白和hCG p 单位序列38-57的肽或hCG |3单位序列38-57的类似物肽的缀合物。
4. 根据权利要求1的方法，其中所述抗原是以下缀合物的任意组合载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的类似物肽的缀合物， 栽体蛋白和hCG ^单位序列38-57的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P单位序列38-57的类似物肽的缀合物，或 载体蛋白和hCG p亚基的肽的缀合物。
5. 根据权利要求1的方法，其中所述无机/生物聚合物基质包括 硫酸钾半水合物/硫酸葡聚糖基质，或磷酸钙/硫酸葡聚糖基质。
6. 根据权利要求1的方法，其中所述油包水乳剂包含角篁烯和磷 酸盐緩冲盐水(PBS)。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述乳剂进一步包含乳化剂。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述乳化剂是二缩甘露醇单油酸酯。
9. 根据权利要求8的方法，其中所述角鲨烯和二缩甘露醇单油酸 酯以4:1的比率混合。
10. 根据权利要求9的方法，其中所述角鲨烯二缩甘露醇单油酸 酯混合物用作所述乳剂的油相。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述乳剂的油相是乳剂体积的 60%并且PBS是40 0/。。
12. 根据权利要求l的方法，其中所述佐剂是N-乙酰基-D-葡糖胺 _3-y-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺钠盐(nor MDP)。
13. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有结肠癌 的患者的疫苗。
14. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有胰腺癌 的患者的疫苗。
15. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有膀胱癌 的患者的疫苗。
16. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有前列腺 癌的患者的疫苗。
17. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有卵巢癌 的患者的疫苗。
18. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有肺癌的 患者的疫苗。
19. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有宫颈癌 的患者的疫苗。
20. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有乳腺癌 的患者的疫苗。
21. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有肾癌的 患者的疫苗。
22. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有肝癌的 患者的疫苗。
23. 根据权利要求1的方法，通过该方法配制用于治疗患有黑素瘤 癌的患者的疫苗。
24. —种递送抗原的方法，该抗原有效引发针对人绒毛膜促性腺激素(hCG)的抗体，该方法包括将所述抗原掺入无机/生物聚合物基质中，将掺入了抗原的基质悬浮在包含佐剂的油包水乳剂中，并且将含有掺入了抗原的基质的乳剂注射到人体中，用于治疗患有激素相关疾病的患者或预防激素相关状况，其中所述激素相关疾病选自水泡状脂块、异位妊娠和癌症。
25. 根据权利要求24的方法，其中所述抗原是载体蛋白例如白喉 类毒素和hCG 「亚基序列109-145的肽或hCG |3亚基序列109-145的 类似物肽的缀合物。
26. 根据权利要求24的方法，其中所述抗原是载体蛋白例如白喉 类毒素和hCG (3单位序列38-57的肽或hCG P单位序列38-57的类似 物肽的缀合物。
27. 根据权利要求24的方法，其中所述抗原是以下缀合物的任意 组合栽体蛋白和hCG (3亚基序列109-145的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的类似物肽的缀合物， 载体蛋白和hCG ^单位序列38-57的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P单位序列38-57的类似物肽的缀合物，或 载体蛋白和hCG P亚基的肽的缀合物。
28. 根据权利要求24的方法，其中所述被预防的激素相关状况是 妊娠。
29. 根据权利要求24的方法，其中所述无机/生物聚合物基质包括 硫酸4丐半水合物/硫酸葡聚糖基质，或磷酸钾/硫酸葡聚糖基质。
30. 根据权利要求24的方法，其中所述油包水乳剂包含角鲨烯和 磷酸盐緩冲盐水(PBS)。
31. 根据权利要求24的方法，其中所述乳剂进一步包含乳化剂。
32. 根据权利要求31的方法，其中所述乳化剂是二缩甘露醇单油3曰，
33.根据权利要求32的方法，其中所述角鲨烯和二缩甘露醇单油酸酯以4: 1的比率混合。
34. 根据权利要求33的方法，其中所述角簠烯二缩甘露醇单油酸 酯混合物用作所述乳剂的油相。
35. 根据权利要求34的方法，其中所述乳剂的油相是乳剂体积的 60%并且PBS是400/。。
36. 根据权利要求24的方法，其中所述佐剂是N-乙酰基-D-葡糖 胺-3-y-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺钠盐(nor MDP)。
37. —种递送抗原的方法，该抗原有效引发针对人绒毛膜促性腺激 素(hCG)的抗体，该方法包括将抗原掺入无机盐/生物聚合物基质，将掺入了抗原的基质悬浮在包含佐剂的油包水乳剂中，并且 将含有掺入了抗原的基质的乳剂注射到人体中，用于治疗患有hCG 相关疾病的患者或预防hCG相关状况。
38. 根据权利要求37的方法，其中所述无机盐/生物聚合物基质包 括硫酸钾半水合物/硫酸葡聚糖基质。
39. 根据权利要求37的方法，其中所述无机盐选自硫酸4丐半水合 物、硫酸钓和磷酸钓，并且所述生物聚合物选自透明质酸、硫酸软骨素、 蛋白质、糖胺聚糖、葡聚糖、硫酸葡聚糖、淀粉、黄原胶、壳聚糖、纤 维素和纤维素衍生物。
40. 根据权利要求37的方法，其中所述抗原是载体蛋白例如白喉 类毒素和hCG P亚基序列109-145的肽或hCG P亚基序列109-145的 类似物肽的缀合物。
41. 根据权利要求—3了的方法，其中所迷抗原是载体蛋白例如白喉 类毒素和hCG P单位序列38-57的肽或hCG P单位序列38-57的类似 物肽的缀合物。
42. 根据权利要求37的方法，其中所述抗原是以下缀合物的任意 组合载体蛋白和hCG |3亚基序列109-145的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的类似物肽的缀合物，载体蛋白和hCG P单位序列38-57的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P单位序列38-57的类似物肽的缀合物，或 载体蛋白和hCG P亚基的肽的缀合物。
43. 根据权利要求37的方法，其中所述被预防的激素相关状况是 妊娠。
44. 根据权利要求37的方法，其中所述无机/生物聚合物基质是硫 酸钩半水合物/硫酸葡聚糖基质，或磷酸钙/硫酸葡聚糖基质。
45. 根据权利要求37的方法，其中所述油包水乳剂包含角鲨烯和 磷酸盐緩沖盐水(PBS)。
46. 根据权利要求37的方法，其中所述乳剂进一步包含乳化剂。
47. 根据权利要求46的方法，其中所述乳化剂是二缩甘露醇单油 酸酯。
48. 根据权利要求47的方法，其中所述角鲨烯和二缩甘露醇单油 酸酯以4: 1的比率混合。
49. 根据权利要求48的方法，其中所述角鲨烯二缩甘露醇单油酸 酯混合物用作所述乳剂的油相。
50. 根据权利要求49的方法，其中所述乳剂的油相是乳剂体积的 60%并且PBS是40 0/。。
51. 根据权利要求37的方法，其中所述佐剂是N-乙酰基-D-葡糖 胺-3-y-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺钠盐(nor MDP)。
52. 根据权利要求37的方法，通过该方法配制用于治疗患有结肠癌的患者的疫苗。
53. 根据权利要求37的方法，通过该方法配制用于治疗患有胰腺癌的患者的疫苗。
54. 根据权利要求37的方法，通过该方法配制用于治疗患有膀胱癌的患者的疫苗。
55. 根据权利要求37的方法，通过该方法配制用于治疗患有前列腺癌的患者的疫苗。
56. 根据权利要求37的方法，通过该方法配制用于治疗患有卵巢癌的患者的疫苗。
57. 根据权利要求37的方法 的患者的疫苗。
58. 根据权利要求37的方法癌的患者的疫苗。
59. 根据权利要求37的方法 癌的患者的疫苗。
60. 根据权利要求37的方法 的患者的疫苗。
61. 根据权利要求37的方法的患者的疫苗。
62. 根据权利要求37的方法 瘤癌的患者的疫苗。
63. 根据权利要求37的方法 脂块、异位妊娠和癌症。
64. —种递送抗原的方法，该抗原有效引发针对人绒毛膜促性腺激 素(hCG)的抗体，该方法包括将肽抗原与载体缀合以形成缀合的抗原，将所述缀合的抗原掺入无机/生物聚合物基质，其中所述缀合的抗 原与硫酸钙半水合物和硫酸葡聚糖混合，由此将其包埋在硫酸钙半水合 物/硫酸葡聚糖基质中，干燥所述包埋了缀合的抗原的基质，将干燥的基质悬浮在包含佐剂的油包水或水包油乳剂中，并且 将含有包埋了缀合的抗原的基质的乳剂注射到人体中，用于治疗患 有hCG相关疾病的患者或预防hCG相关状况。
65. 权利要求64的方法，其中所述hCG相关疾病选自水泡状脂块， 异位妊娠和癌症。
66. 根据权利要求64的方法，其中所述抗原是载体蛋白例如白喉 类毒素和hCG fi亚基序列109-145的肽或hCG P亚基序列109-145的，通过该方法配制用于治疗患有肺癌 ，通过该方法配制用于治疗患有宫颈 ，通过该方法配制用于治疗患有乳腺 ，通过该方法配制用于治疗患有肾癌 ，通过该方法配制用于治疗患有肝癌 ，通过该方法配制用于治疗患有黑素 ，其中所述hCG相关疾病选自水泡状类似物肽的缀合物。
67. 根据权利要求64的方法，其中所述抗原是载体蛋白例如白喉 类毒素和hCG P单位序列38-57的肽或hCG P单位序列38-57的类似 物肽的缀合物。
68. 根据权利要求64的方法，其中所述抗原是以下缀合物的任意 组合载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的类似物肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P单位序列38-57的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG p单位序列38-57的类似物肽的缀合物，或 载体蛋白和hCG P亚基的肽的缀合物。
69. 根据权利要求64的方法，其中所述被预防的激素相关状况是 妊娠。
70. 根据权利要求64的方法，其中所述无机/生物聚合物基质包括 硫酸钙半水合物/硫酸葡聚糖基质，或磷酸钙/硫酸葡聚糖基质。
71. 根据权利要求64的方法，其中所迷油包水乳剂包含角鲨烯和 磷酸盐緩冲盐水(PBS)。
72. 根据权利要求71的方法，其中所迷乳剂进一步包含乳化剂。
73. 根据权利要求72的方法，其中所述乳化剂是二缩甘露醇单油 酸酯。
74. 根据权利要求73的方法，其中所述角鲨烯和二缩甘露醇单油 酸酯以4: 1的比率混合。
75. 根据权利要求74的方法，其中所述角鲨烯二缩甘露醇单油酸 酯混合物用作所述乳剂的油相。
76. 根据权利要求75的方法，其中所述乳剂的油相是乳剂体积的 60%并且PBS是40 0/。。
77. 根据权利要求64的方法，其中所述佐剂是N-乙酰基-D-葡糖 胺-3-y-L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺钠盐(nor MDP)。
78. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有结肠癌的患者的疫苗。
79. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有胰腺癌的患者的疫苗。
80. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有膀胱癌的患者的疫苗。
81. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有前列腺癌的患者的疫苗。
82. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有卵巢癌的患者的疫苗。
83. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有肺癌的患者的疫苗。
84. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有宫颈癌的患者的疫苗。
85. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有乳腺癌的患者的疫苗。
86. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有肾癌的患者的疫苗。
87. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有肝癌 的患者的疫苗。
88. 根据权利要求64的方法，通过该方法配制用于治疗患有黑素瘤癌的患者的疫苗。
89. —种疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，它包含(a) hCG P亚基的片段，(b) 钩盐，以及(c) 基质聚合物，其中所述片段基本上被包埋在由钙盐和基质聚合物形成的无机/生 物聚合物基质中。
90. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中所述抗原是以下缀合物的任意组合载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P亚基序列109-145的类似物肽的缀合物， 载体蛋白和hCG P单位序列38-57的肽的缀合物， 载体蛋白和hCG (3单位序列38-57的类似物肽的缀合物，或 载体蛋白和hCG p亚基的肽的缀合物。
91. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中 所述钙盐选自硫酸钙半水合物、硅酸钙、铝酸盐、氢氧化物、磷酸盐和 磷酸钾。
92. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中 所述基质聚合物选自葡聚糖、硫酸葡聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、蛋 白质、糖胺聚糖、壳聚糖、淀粉、黄原胶、纤维素、纤维素衍生物、胶 原蛋白、纤维蛋白原、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚核苷酸、阳离子型多 肽和脱脂白蛋白。
93. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中 所述钩盐是硫酸钓半水合物。
94. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中 所述钓盐是硫酸4丐。
95. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中 所述钓盐是磷酸4丐。
96. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中 所述基质聚合物是葡聚糖。
97. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中所述基质聚合物是硫酸葡聚糖。
98. 根据权利要求89的疫苗-无机/生物聚合物基质组合物，其中所 述无机/生物聚合物基质是硫酸4丐半水合物/疏酸葡聚糖基质，或磷酸钩 /硫酸葡聚糖基质。
全文摘要
本发明包括免疫方法，其中使用简单的制备方法将人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗抗原掺入无机盐/生物聚合物络合物。以微粒的形式将产生的固体基质给予人受试者。该方法包括将微粒悬浮在包含适于人使用的佐剂化合物的天然油和水的乳剂中以及肌肉内注射药物剂量的悬浮液。疫苗抗原是hCG β亚基的肽片断与载体蛋白，白喉类毒素的缀合物。本制剂中递送的疫苗抗原在接受者中引发抗体用于治疗癌症或激素相关的疾病中是有效的。
文档编号A61K39/00GK101466403SQ200780021850
公开日2009年6月24日 申请日期2007年5月2日 优先权日2006年5月4日
发明者G·P·罗耶 申请人:罗耶生物医药公司