专利名称：利用Dll4拮抗剂治疗血管性眼病的治疗方法
技术领域：
本发明一般地涉及通过施用抑制D114与Notch受体相互作用和/或 Notch受体激活的组合物来治疗血管性和局部缺血性病症的方法。更具体 地，本发明涉及通过施用抑制D114与Notch受体相互作用的组合物来治疗 眼睛的血管性和/或局部缺血性病症的方法。
背景
血管发生是组织和器官正常发育和生长所需的基本过程，涉及从已有血 管形成新的血管。血管发生和血管内环境稳定受到高度调节的血管发生调 节剂系统的紧密控制。偏离此紧密控制常常会导致疾病或与疾病相关。
尽管不受调节的"过度，，或异常血管发生是众多疾病状态的特征，但不充 分的血管发生、血管的损失或者功能性或结构性血管闭塞也可成为严重的 医学问题。在组织局部缺血的情况下，例如在视网膜、脑、心血管和四肢 局部缺血中，以及在必需建立、重建、增强或扩大血管供应的情况下，例 如在创伤愈合中和在组织或器官移植之后、或者为了刺激侧支血管建立或 增加具有不充分血液循环的组织或器官的灌注，促进血管发生和/或阻止现 有血管的退化是期望的。
Notch信号通路是细胞与细胞间通讯的系统，被广泛的真核生物用于许 多生物学过程，例如分化、增殖和内环境稳定(Artavanis-Tsakonas等人 (1999) Science 284:770-776)。也已经提示Notch信号参与控制血管发育 (Iso等人(2003) ArteriosclerThromb Vase Biol. 23:543-553)。
Delta样4 ( DI4 )或delta样配体4 ( D114 )(下文称"D114")是Notch 配体的Delta家族成员，其显示出由血管内皮的高度选择性表达(Shutter 等人(2000) Genes Dev. 14:1313-1318)。 D114是Notch受体(包括Notchl和Notch4)的配体。人和小鼠D114的核酸和氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:l-2和SEQIDNO:3-4中。基因打靶D114小鼠已经产生(见，例如， I)uarte等人(2004) Genes Dev. 18:2474 - 2478; Krebs等人(2004) Genes Dev. 18:2469-2473: Gale等人(2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:15949-15954 )。这些研究显示D114高度表达于小鼠胚胎的正在发育的 血管中，并显示甚至单个DU4等位基因的遗传缺失也导致了与显著的血管 异常相关的胚胎致死。
发明概述
本发明涉及利用能够阻断D114与其受体相互结合的药剂("D114拮抗 剂，，)来治疗影响心血管系统的疾病的方法。本文中所提供的实验结果支持 了 D114拮抗剂用于治疗如下疾病的用途，所述疾病以病理性新血管形成和 血管功能不全为特征，其中血管功能不全的原因是血管损失或功能性血管 改变从而导致组织灌注不足。D114拮抗剂尤其可以用于治疗血管性眼病， 例如，糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变和其它以病理性血管发生 和/或视网膜局部缺血为特征的眼睛疾病，例如视网膜静脉或动脉闭塞。
D114的药物抑制显示出在局部缺血性视网膜病变模型中产生几种有益 效果，包括当在导致血管损失的损伤之时施用时减少血管的损失，以及当 在局部缺血建立之后施用时阻抑血管系统中病理改变的发展，同时增强更 为正常的功能性血管的再生。
预期抑制D114信号的药剂在治疗其它形式的局部缺血性损伤(包括脑 缺血、心脏缺血、及影响四肢和其它身体器官或组织的局部缺血性状况) 中同样有益。也预期D114抑制剂在需要建立或重建血管供应或将受益于增 强的组织灌注的其它状况中是临床上有益的。此类状况的例子有动静脉畸 形、创伤愈合、器官或组织移植、和胎盘功能不全。如下面所报告的实验 工作所示，D114抑制可以阻止动脉狭窄和闭塞，表明D114抑制剂在治疗全 身性高压或肺动脉高压和相关病症中也将是有效的。
目前证实D114拮抗剂在正常和病理性状况中均可以有效地促进生成性
4血管发生(productive angiogenesis)。特别地，证实阻断D114-Notch信号可 以在发育的视网膜血管系统中增强血管生成性芽生(angiogenic sprouting) 和血管内皮细胞增殖，并可以在局部缺血性-现网膜中抑制病理性的异位新 生血管形成和动静脉短路的发展而利于更为恰当的血管的形成。而且，证 实在血管损伤时施用D114阻断剂可以显著地减少后续的血管损失。这些发 现支持了 D114拮抗剂在治疗以血管异常为特征的眼睛疾病中的用途，特别 是当伴有局部缺血和正常血管损失时。此类眼病的例子包括缺血性视网膜 病变，例如年龄相关性黄斑变性、视网膜中央静脉阻塞或视网膜分支静脉 阻塞、糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变。
在第一方面，本发明涉及治疗以血管异常为特征的眼睛病症或疾病的方 法，包括对有需要的受试者施用D114拮抗剂。本发明的方法促进功能性正 常血管的生长，抑制异常或患病血管的生长并阻止血管的病理性退化。
在一个实施方案中，D114拮抗剂是抗体或抗体片段，其特异结合D114 并阻断D114结合至Notch受体(例如，Notch 1和Notch 4受体)。在另一 实施方案中，本发明的D114拮抗剂是包含D114的胞外域或其片段的蛋白 质或蛋白质片段，其在特定的实施方案中可以融合至多聚体化成分 (multimerizing component)上并结合Notch受体而不激活它们，由此阻断 内源性1)114的作用。
通过本发明方法治疗的眼病是以异常血管的存在和/或正常血管或正常 血管功能的损失为特征的眼睛血管系统病症。在特别的实施方案中，所治 疗的状况或病症包括早产儿视网膜病变、局部缺血性视网膜病变、视网膜 静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成、年龄相关 性黄斑变性、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或角膜移植。
本发明方法中使用的抗体或抗体片段可为多克隆或单克隆的，且可为人 源化的、嵌合的或全人的。优选地，抗体是全人单克隆抗体或单克隆抗体 片段。抗体片段可为单链抗体、ScFv、 Fab或F(ab，)2。
当1)114拮抗剂是蛋白质或蛋白质片段时，片段优选是D114的胞外域或 其片段或修饰的片段，并可融合至多聚体化成分。多聚体化成分优选M
5疫球蛋白结构域，例如Fc结构域，例如人Fc (SEQIDNO:5)。蛋白质可 任选地包含信号序列，该信号序列可为细胞天然的或为重组的或合成的。
在更广的方面，本发明方法可以用于治疗由血管损失和/或灌注不良所 致的血供不足引起的任何局部缺血性疾病或状况，例如，局部缺血性损伤、 脑缺血、心肌缺血、影响四肢和其它器官或组织的局部缺血状况、动静脉 畸形、创伤愈合、器官或组织移植、胎盘功能不全、动脉狭窄和闭塞、动 脉粥样硬化、和全身性高压或肺动脉高压。
在第二方面，本发明提供能够抑制D114活性的药剂在制备治疗、抑制 或改善局部缺血性或血管性病症的药物中的用途，其中该D114拮抗剂是能 够阻断1)114与Notch受体结合的抗体或抗体片段、或任选地连接至多聚体 化成分(例如Fc结构域)的DU4片段。在一个实施方案中，局部缺血性 或血管性病症是以异常血管的存在和/或正常血管或血管功能的损失为特 征的眼睛疾病或状况。所述眼睛疾病是早产儿视网膜病变、局部缺血性视 网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血 管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或 角膜移植。
在另一实施方案中，局部缺血性或血管性疾病是局部缺血性损伤、脑缺 血、心脏缺血、影响四肢或其它器官或组织的局部缺血性状况、动静脉畸 形、创伤愈合、器官或组织移植、胎盘功能不全、动脉狭窄和闭塞、动脉 粥样硬化、或全身性高压或肺动脉高压。
从随后的详述中其它目的和优点将是显而易见的。
附图简述
图1.单个D114等位基因的遗传缺失在发育中的视网膜血管系统中增加 了血管生成性芽的数目。芽的数目是在100x显微镜视野中定量的。结果在 p<().00()01水平上显著不同。
图2. D114-Fc的眼内递送在发育中的视网膜血管系统中增加了增殖的 BrdU阳性细胞的数目。在7日龄的小鼠幼畜中玻璃体内注射4.15mcg的
6ml)114-hFc或5mcg的人hFc对照蛋白质。24小时后分析视网膜血管系统。 在200x显孩t镜视野中定量BrdU阳性细胞的数目。结果在p<0.05水平上
显著不同。
图3A-B. D114-Fc或抗D114抗体的眼内递送在患有氧诱导的局部缺血性 视网膜病变(OIR)的小鼠中促进视网膜血管的再生。(A)在13日龄(出 生后第13天或P13 )的OIR幼畜中玻璃体内注射0.48 mcg的mD114-hFc 或0.5 mcg的人hFc对照蛋白质。在P17分析视网膜血管系统。(B)在 P13玻璃体内注射2.55 mcg的兔多克隆抗mDU4抗体或5mcg的人hFc对 照蛋白质。在P17分析视网膜血管系统。在视网膜铺片(flat-mounts)中测 定无血管区域。结果在p<0.0001 (A)和pO.05(B)水平上显著不同。
图4A-B. D114-Fc或抗D114抗体的眼内递送在OIR中改善病理性新生血 管的形成。(A )在P13玻璃体内注射0.48 mcg的mD114-hFc或0.5 mcg的 人hFc对照蛋白质。在P17分析视网膜血管系统。(B)在P13玻璃体内注 射2.55 mcg的兔多克隆抗ml)U4抗体或5mcg的人hFc对照蛋白质。在 P17分析视网膜血管系统。在视网膜铺片中测定异常血管区域(含有异位 血管"丛，，的区域)。结果在pO.OOOl (A)和p<0.05 (B)水平上显著不同。
图5. D114-Fc的眼内递送改善视网膜灌注。在P13玻璃体内注射0.48 mcg的mD114-hFc或0.5 mcg的人hFc对照蛋白质。在P17用标记了得克 萨斯红的番茄凝集素灌注动物并在P17分析视网膜血管系统。在视网膜铺 片中测定未灌注的血管区域。结果在p<0.0005水平上是显著的。
图6A-B. DU4-Fc或抗D114抗体的眼内递送减轻^L网膜低氧/局部缺血。 (A )在P12玻璃体内注射4.1mcg的hD114-hFc或5mcg的人hFc对照蛋 白质。处死动物之前1小时向腹膜内注射HypoxyprobeTM-l。在P17分析 视网膜血管系统。在视网膜铺片中测定Hypoxyprobe标记的区域。(B)在 P13玻璃体内注射2.55mcg的兔多克隆抗mDU4抗体或5mcg的人hFc对 照蛋白质。处死动物之前1小时向腹膜内注射HypoxyprobeTM-l。在P17 分析视网膜血管系统。在视网膜铺片中测定Hypoxyprobe标记的区域。结 果在p<0.001 (A)和p<0.05 (B)水平上显著不同。图7.单个D114等位基因的遗传缺失降低由暴露于高氧诱导的血管损 失。在P7将D114+/laeZ和同窝出生的野生型对照小鼠置于75%氧气室。在 P12时在铺片中分析视网膜血管系统。结果在pO.05水平上显著不同。
图8A-B. DI14-Fc或抗D114抗体的眼内递送降低或阻止由暴露于高氧诱 导的血管损失。(A )在P8玻璃体内注射4.1mcg的hD114-hFc或5mcg的 人hFc对照蛋白质。在P9将幼畜置于75M氧气环境中。在P10分析视网 膜血管系统。(B)在P8玻璃体内注射2.55mcg的兔多克隆抗mD114抗体 或5mcg的人hFc对照蛋白质。在P9将幼畜置于75。/。的氧气环境中。在 P10分析视网膜血管系统。结果在p0.00001 (A)和pO.OOOl (B)水平上显 著不同。
图9A-B. D114-Fc或抗D114抗体的眼内递送减轻视网膜血管闭塞。(A ) 在P8玻璃体内注射4.1mcg的hD114-hFc或5mcg的人hFc对照蛋白质。 在P9将幼畜置于75 %的氧气环境中。在P10用荧光凝集素灌注幼畜并分 析视网膜血管系统。(B )在P8玻璃体内注射2.55mcg的兔多克隆抗mD114 抗体或5mcg的人hFc对照蛋白质。在P9将幼畜置于75 %的氧气环境中。 在P10用荧光凝集素灌注幼畜并分析视网膜血管系统。结果在p<0.00001 (A)和pO.OOOl (B)上显著不同。
图10.D114-Fc的全身性递送降低或阻止视网膜血管损失。在P7玻璃体 内注射(ITV ) 4.1 mcg的hD114-hFc或5mcg的人hFc对照蛋白质，或腹 膜内以每kg体重25mg的剂量注射hD114-hFc。在P8将幼畜置于75%的 氧气环境中。在P9分析视网膜血管系统。结果在p<0.0001水平上显著不 同。
发明详述
在描述本发明的方法之前，应当理解本发明并不局限于所描述的特定方 法和实验条件，因为此类方法和条件可以改变。也应当理解，本文所用的 术语仅旨在描述特定的实施方案，并不意在构成限制，因为本发明的范围 将仅受所附权利要求的限定。
8除非另有限定，否则本文中所用的所有^t术和科学术语均具有如本发明 所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材 料相似或等价的任何方法和材料均可用于实践或检验本发明，但优选的方 法和材料是现在所描述的。
定义
短语"D114拮抗剂，，是指能够通过阻断D114与其受体相互作用而抑制 D114生物活性的药剂。D114活性的抑制可通过利用抗D114抗体或者利用结 合但不激活受体(无效性结合(no叩roductive binding))的D114类似物或片 段抑制受体活化来实现。通常的抑制剂包括但不限于抗体、可溶性受体、 寡核苷酸适体、肽或其它小分子拮抗剂及它们的衍生物，以及能够结合1)114 配体的Notch受体但不能通过此结合激活信号的修饰的D114配体。其它方 法包括干扰编码D114的基因的表达或阻断Notch受体激活，例如分别用 siRNA或y分泌酶抑制剂。
"中和性"或"封闭性"抗体，旨在指结合D114后将导致D114的生物活性 受到抑制的抗体。DU4生物活性的这种抑制可通过检测D114生物活性的一 个或多个指标来评^f介。D114生物活性的这些指标可通过本领域已知的几种 标准体外或体内测定试验中的一种或多种来评价(见下面的实施例)。优选 地，通过DU4与Notch受体(例如Notchl和Notch4)的结合所受到的抑制， 评价抗体的中和D114活性的能力。
一般描述
Notch信号通路是进化上保守的，在胚胎发育和出生后发育过程中在许 多组织的细胞命运决定和分化中起关键作用。Notch通路的主要组分表达 于血管系统中，且某些Notch通路组分(包括Notchl、 Notchl/Notch4、 Jaggedl、 DIIl、 DU4、 Heyl/Hey2或早老素)的遗传缺失会导致与血管重 塑缺陷相关的胚胎致死。尽管这些基因中的大多数表达于多种组织和细胞 类型中，但D114很大程度上局限于血管内皮，表明D114是血管系统中Notch
9受体的关键配体。
在早期胚胎发育中，甚至单个D1I4等位基因的遗传缺失也会造成严重 的血管异常，在大多数小鼠林系中导致胚胎致死。事实上，在参与血管发 生和血管生成的许多基因中，仅仅就DU4和VEGF-A才艮道过单倍体功能 不全导致重度血管缺陷和胚胎致死。早期胚胎致死妨碍了大多数实验操作， 致使难以精确地理解D114在血管发育过程中以及在病理环境中的作用。
为克服此局限性，在单倍体功能不全仅造成有限胚胎致死的ICR小鼠 林系中，研究D114基因缺失的影响。将在这些突变小鼠中观察到的血管表 型与在野生型小鼠中获得的表型进行比较，其中通过玻璃体内注射DU4的 可溶性抑制剂D114-Fc或抗DU4胞外域的中和性多克隆抗体，选择性地抑 制D114/Notch信号。对于这些实验，将视网膜选作为研究D1I4生物学的模 型系统，这是因为视网膜血管系统在出生后以高度有组织的固定不变方式 按时间和空间发育。
氧诱导的局部缺血性视网膜病变(OIR)小鼠模型是已经充分表征过的 病理性新生血管形成模型，该模型与主要的促血管生成因子VEGF的升高 表勤目关(Smith等人1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 35:101-111; Neely等 人1998 Am J. Pathol 153:665-670; Saint画Geniez等人2004 Int J Dev Biol 48:1045-1058)，并由此与和多种疾病状况相关的病理性血管发生相关联 (Ferrarra等人2005 Nature 438:967-974)。最后，视网膜血管系统容易接 受实验操作，包括玻璃体内显微注射实验药剂。
下述实验证实，在正常视网膜血管发育中，以及在OIR模型中， D114/Notch信号的药物抑制可以显著地增加血管生成性芽生和促进更密的 初级(primary)毛细血管网的形成。与此相一致的，发现在正常发育过程中 以及在OIR模型中内源性D114表达都在血管生长最活跃的区域中特别显 著。而且，D114抑制显著地抑制了异常血管系统的形成并防止了血管闭塞 和退化。
1)114拮抗剂
10D114拮抗剂包括能够阻断D114与Notch受体例如Notchl结合的抗D114 抗体及其片段；以及可融合至多聚体化成分上的包含D1I4胞外域的蛋白质 或蛋白质片段；肽和肽体(peptibodies)(见例如，美国专利公开号 2()03/022卯23 Oliner等人)。
1)114抗体,此处所用的短语"免疫球蛋白或抗体"指的是能够特异结合 并识别抗原(在本发明中为D114蛋白或其部分)的、包含来自免疫球蛋白 基因的构架区的、哺乳动物(包括人)多肽或蛋白质，或其片段。如果预 期的抗体或抗体样蛋白质将用作哺乳动物治疗剂，则免疫球蛋白结合区域 应当来自相应的哺乳动物免疫球蛋白。如果该分子旨在用于非治疗用途， 例如用于诊断和ELISAs，则免疫球蛋白结合区域可来自人或非人哺乳动 物，例如小鼠。人免疫球蛋白基因或基因片段包括k、 X、 ou y、 8、 s和ji 恒定区，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为k或X。重链分为y、 卜(x、 S或s，其依次分别定义了免疫球蛋白类型IgG、 IgM、 IgA、 IgD 和IgE。在每一IgG类型中，有不同的同种型(例如，IgG,、 IgG2等)以 及其同种异型。
一个示例性人IgG免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每一个四聚 体都由相同的两对肽链组成，每一对都具有一条轻链(大约25kD)和一条重 链(大约50-70kD)。每条链的N端定义主要负责抗原识别的、大约100-110 或更多个氨基酸的可变区。术语"可变轻链"(VO和"可变重链"(VH)分别指 这些轻链和重链。
抗体可以以完整免疫球蛋白的形式存在，或可以以多种经由各种肽酶消 化而产生的、已被充分表征过的片段形式存在。例如，胃蛋白酶在绞链区 二硫键的下面消化抗体以产生F(ab)V即，Fab的二聚体，其中Fab本身 是通过二硫键与V『CH连接的轻链。可在温和条件下还原F(ab)V断裂铰 链区中的二硫键，从而将F(ab)，2二聚体转换成Fab，单体。Fab，单体实质 上是具有部分绞链区的Fab。尽管多种抗体片段基于完整抗体的消化进行
用重组DNA方法学从头合成。因此，如此处所用的术语抗体，还包括通
ii过修饰完整抗体产生的抗体片段，或利用重组DNA方法学从头合成的抗 体片段、或通过展示文库例如噬菌体、大肠杆菌或酵母展示文库产生的抗 体片段(见，例如，McCafferty等人(19卯)Nature 348:552-554)。
1)114类似物或蛋白质片段.D114拮抗剂可为任选地与多聚体化成分连 接的1)114片段。在特定的实施方案中，D114片段可融合至多聚体化成分， 所述多聚体化成分为例如免疫球蛋白结构域、截短的免疫球蛋白结构域、 或长度为1至大约500个氨基酸的氨基酸序列，任选地包含至少一个半胱 氨酸残基。在优选的实施方案中，多聚体化成分是免疫球蛋白结构域，优 选Fc结构域，例如，人Fc (SEQIDNO:5)。蛋白质或蛋白质片段可任选 地包含信号序列，所述信号序列可以包含本领域技术人员已知的用于指导 多肽或蛋白质从细胞分泌的任何序列，包括天然的或合成的序列。通常， 将信号序列置于本发明融合蛋白的开始处或氨基端。此信号序列可为细胞 天然的、或为重组的或合成的。
D114的胞外域由Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)结构域和8个表皮生长因子 (EGF )样串联重复组成。通常，对于hD114, EGF结构域祐j人为存在于 大约218-251位(结构域1 )、 252-282位(结构域2 )、 284-322位(结构域 3)、 324-360位(结构域4 )、和362-400位(结构域5 )， DSL结构域位于 大约173-217位，而N端结构域位于大约27-172位(SEQ ID NO:2 )。在 特定的实施方案中，D114拮抗剂包含SEQ ID NO:2的大约氨基酸27-172、 27-217、 218-400、 218-360、 218-322或218-282，任选地融合至hFc (SEQ ID NO :5)。
施用方法
技术领域：
本发明提供治疗方法，包括对受试者施用有效量的本发明药剂。在一个 优选的方面，所述药剂是基本上纯的(例如，基本上不含会限制其效果或 产生不希望的副作用的物质)。受试者优选是动物，例如牛、猪、马、鸡、 猫、狗等，且优选是哺乳动物，且最优选是人。在特定的实施方案中，可 能期望将本发明的药物组合物局部施用于需要治疗的区域，这可以，例如，但不并限制，通过在外科手术中局部灌注，通过局部应用，例如通过注射、 通过导管、或通过植入物来实现。
本发明方法可以有利地通过以局部施用方式施用于需要治疗的区域来 实施，所述局部施用包括玻璃体内、眼内、眼周、结膜下、近巩膜
(juxtascleral)、目艮J求筋膜嚢下(subtenon )、或夕卜用(topical administration)。
联合治疗
在多种实施方案中，本发明的方法利用D114拮抗剂例如D114抗体与一 种或多种其它化合物或疗法或医学措施相联合来实施。例如，适宜于交替 地或同时地联合使用的治疗剂，包括能够结合和抑制血管内皮生长因子 (VEGF)的活性的融合蛋白质(见U.S. 7， 070,959和7,087,411 )、免疫抑 制剂例如皮质类固醇、地塞米^K环孢菌素A、 FK506、或抗代谢物(见 Barker, NH爭人，(2000) Clin Exp Opthal 28:357-360 )。其它适宜于与本发 明1)114拮抗剂交替地或同时地联用的治疗剂，可以包括那些能阻断其它 VEGF家族成员例如VEGF-C和VEGF-D的生物活性的药剂。
实施例
给出下列实施例旨在向本领域技术人员提供有关如何制备和使用本发 明方法和组合物的完整7>开和描述，而不意在限制本发明人所认为的其发 明的范围。尽管已经努力确保有关所用数字(例如，量、面积测定等)的 准确性，但一些实验误差和偏差仍应被考虑。
实施例1.单个D114等位基因的遗传缺失在发育的视网膜血管系统中对血 管芽生的影响
开展了研究以确定在正常发育的视网膜的血管发生过程中D114部分遗 传缺陷对血管芽生的影响。
动物.利用Velocigene 技术(Valenzuela等人(2003) Nat. Biotechnol. 21:652-9; US Patent 6,586,251 )在C57BL/6:129杂交小鼠胚胎干细胞中将
13完整的D114编码区置换为(3-半乳糖苷酶报告基因。使嵌合雄性小鼠与ICR 雌性小鼠杂交。将与ICR回交3代的D114+/lacZ小鼠(87.5% ICR)用于此研究。
组织化学和免疫染色.在P7人性化地给予小鼠幼畜安乐死。摘出眼睛 并解剖视网膜，用4%多聚甲醛固定过夜，用FITC标记的Griffonia simplicifolia ( GS )凝集素I ( Vector Laboratories, Burlingame, CA )染色， 并铺片。利用Nikon (Melville, NY)显孩i:镜才I/f象。
定量.利用Scion图像软件进行测量。每种实验条件测定至少一式三份。 利用Student T-检验和双向方差分析，评估统计学显著性。
结果.D114+/laeZ小鼠比野生型同窝出生仔畜具有密得多的外周血管丛 (Peripheral plexus)。更高放大倍率的视图显示D114+/lacZ小鼠视网膜中更密 的外周血管丛由直径更大、更为高度相互连接以及超融合(hyperfuse)的毛 细血管组成，由此在一些区域血管合生形成合胞体，而且，另外在生长前 沿(growing front)有多得多的芽(图1);此外，还以比正常频率高的频率 在血管丛的更内部观察到线状伪足(filopodia)。定量分析揭示，与野生型对 照相比，D114+/laeZ小鼠的视网膜在表面视网膜血管系统的生长前沿显示出 68%的芽数目增加(图1)，以及每单位面积毛细血管互连的数目超过两倍 的增加，从而导致血管覆盖度的显著增加。尽管有显著的形态改变，但是 在D114+^"小鼠中与在野生型小鼠中一样，除了从顶端细胞延伸出的线状 伪足外，荧光凝集素的血管内注射完全充满了发育中的表面血管丛，表明 发育中的血管系统的所有成分均具有管腔并且是功能性的。
实施例2.用DI14-Fc或抗-DU4抗体抑制D114/Notch对发育中的视网膜血 管系统的影响。
开展了研究以确定在正常发育的视网膜的血管发生过程中药物抑制 D114/Notch信号对内皮细胞增殖和血管芽生的影响。
抗体和试剂.D114-Fc包含小鼠或人D114的胞外域和人IgG的Fc部分。 在CHO细胞中表达D114-Fc并通过蛋白A层析进行亲和纯化。抗D114抗
14体通过用重组mD114-hFc免疫兔子来生产。在使用前通过蛋白A层析对抗 血清进行部分纯化。
动物.将C57/B16小鼠(Taconic)用于研究D114-Fc或中和性D1I4抗 体对发育中的视网膜血管系统的影响。
玻璃体内显孩i注射.利用装有玻璃针的Dmmmond Scientific (BroPA) 纳米注射器，在中绵线和角膜缘之间完成研究化合物的玻璃体内显微注射 (30—100 nl)。
BrdU标记.在玻璃体内注射hFc或D114-Fc之后20小时，通过施用 BrdU (1 mg/kg腹膜内)对增殖细胞进行标记。4h后收获^L网膜并用抗 BrdU (Dako North America, Inc., Carpinteria， CA)和VE-钩粘着蛋白(BD PharMingen, San Diego， CA)抗体染色。
结果.为研究非继发于未检测的全身性异常的、D114/Notch信号的局部 视网膜内缺陷的作用，将结合Notch受体但不激活它们从而阻断内源性 1)114作用的D114可溶形式(称为D114-Fc )、或特异于D114胞外域的中和性 多克隆抗体注射入野生型小鼠的玻璃体内。在眼内施用任一 D114阻断剂之 后三天，视网膜血管显示出形态改变，其与在D114"aez小鼠中发现的血管 异常非常相似，包括急剧增加的血管密度和血管尺寸。而且，这些特征性 的形态变化发生迅速，在24小时内清楚明显。
BrdU标记还显示出在D114阻断的24小时内内皮细胞增殖的增加(图 2 )。所观察到的增殖速度的~ 17%增加可在3至4个倍增时间内造成细胞^ 数目超过50%的增加。
实施例3. D114-Fc和抗D114抗体在OIR小鼠中对视网膜血管化、灌注和血 管异常的影响。
开展了研究来测定D114-Fc和抗D114抗体在氧诱导的局部缺血性视网膜 病变(OIR)中对视网膜血管的生长、血管异常的形成和视网膜灌注的影响。
为测定D114/Notch信号是否在病理性血管发生中以及在正常发育过程
15中发挥作用，使用了 OIR模型。在OIR模型中，在P7将小鼠幼畜暴露于 高氧，导致中央视网膜中毛细血管的快速消失(obliteration)。在P12回到 室内空气后，无血管区变得严重低氧，这又引起广泛的异常新生血管形成， 其特征在于血管异位生长进入玻璃体内(视网膜前血管，丛，)和异常动静 脉短路的形成；视网膜的中央部分长期在很大程度上保持无血管。
动物和OIR纟莫型.使用C57/B16小鼠(Taconic)研究D114-Fc或中和性 1)114抗体在OIR中对视网膜新生血管形成的影响。根据Smith等人(Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994， 35:101-111)发展的方法产生了 OIR。简要地， 从出生后第7天(P7)至第12天(P12)将小鼠幼畜及其母鼠置于75%的氧气 环境中，然后返回室内空气。暴露于高氧在中央视网膜中诱导迅速的血管 消失(vaso-obliteration)。当将小鼠返回室内空气(P12 )时，中央视网膜的 血管损失导致严重的低氧/局部缺血，这又刺激上述的病理性血管改变。
为标记未闭合的血管，将50ml得克萨斯红标记的番茄(Lycopersicon seculcnt躍，LE )凝集素(l mg/ml; Vector Laboratories, CA)注射入左心室 并允许循环5分钟。
结果.用D114-Fc或抗D114抗体抑制D114/Notch改善了病理性新生血管 形成(图3A-B),刺激了新血管生长(图4A-B)并改善了视网膜再灌注(图
在血管消失完全之后很久，在将动物返回室内空气之后一天，于P13 玻璃体内注射DI14-Fc或抗D114抗体或对照蛋白质(hFc )。当在P17评价 4见网膜时，D114-Fc或抗1)114抗体的施用急剧抑制了病理性新生血管丛向 玻璃体内的异位生长(图1 ),还阻止了异常动静脉短路的形成。在用D114-Fc 处理的视网膜中新生血管丛所占的面积减少了 43%,而在用抗D114抗体 处理的视网膜中减少了 85%，两者均是与hFc处理的对照视网膜相比较而 言的。
而且，发现D114-Fc和抗D114抗体可以刺激新血管更广泛地自位于无血 管区边沿的毛细血管和静脉芽生，导致血管更快速地再生进入血管系统已 经耗竭的中央视网膜中，从而减小无血管视网膜区域(图4A-B)。在用D114-Fc处理的视网膜中无血管区域减少了 43%，而在用抗D114抗体处理 的视网膜中减少了63%。特别值得注意的是，在D114-Fc处理的视网膜的 无血管区域中自静脉发出的广泛的毛细血管再生。因此，D114/Notch信号 的削弱有利于新血管芽沿视网膜表面的延伸，并抑制了视网膜前(epiretinal) 新生血管的形成，这导致表面血管丛的更快速的重形成。新形成的血管是 功能性的并展示出改善的视网膜再灌注，如D114-Fc处理的视网膜中无灌 注区域的45%减少所证实的(图5)。
实施例4. D114-Fc和抗DU4抗体对OIR模型中视网膜低氧/局部缺血的影 响。
开展了研究来测定DU4-Fc和抗D114抗体在病理性新生血管形成的OIR 模型中对视网膜低氧/局部缺血的影响。
在某些环境下过度的血管生长可干扰正常血液循环并降低组织氧合。为 测试D114/Notch抑制是否可改善组织氧合，在非侵入性试验中使用 HYPOXYPROBEtm-1 (Chemicon)检测组织低氧和确定D114-Fc处理对视 网膜低氧/局部缺血的影响。在收集视网膜用于评价之前一小时，腹膜内注 射100mg/kg的HYPOXYPROBETM-l。
结果.玻璃体内施用D114/Notch抑制剂后功能性新血管的生长有效地减 轻了组织低IU局部缺血，如通过D114-Fc或抗-D114抗体处理的视网膜中 hypoxyprobe阳性区域分别减少69%和30%所证实的(图6A-B )。
实施例5.单个D114等位基因的遗传缺失降低高氧诱导的血管消失。 开展了研究来测定D114部分遗传缺陷对高氧诱导的血管退化的影响。 ，.如上所述产生与ICR回交3代的D114+/laeZ小鼠(87.5% ICR )。由 于隐性突变(rd/rd)， ICR小鼠中视网膜感光细胞层在P12开始退化。因 此，为了排除光感受器丧失对视网膜血管系统的潜在继发效应，为了评价 视网膜发育的后期阶段以及为了所有的Om实验，将D114+紐z (87.5% ICR) 小鼠与C57BL/6回交来产生Rd/rd小鼠，其不显示光感受器退化。
17在出生后第7天(P7)至P12将小鼠幼畜《A 75%的氧气环境中。收获 视网膜并在铺片中分析视网膜血管系统。
结果.DU4+紐z小鼠的视网膜血管系统中降低的D114表达部分地阻止了 高氧诱导的视网膜血管损失(图7)。在OIR模型中，在P7将小鼠幼畜暴 露于高氧，导致中央视网膜中毛细血管的迅速消失和闭塞。为测定 D114/Notch抑制对血管是否具有保护作用，分析了 D114+/laeZ小鼠中D114部 分遗传缺陷对高氧诱导的血管消失的影响。在P12评价动物(以便评估高 氧血管消失的程度)，发现与野生型同窝出生对照动物相比，D114+/laeZ小 鼠中血管消失减少了 40 % ，表明D114抑制剂可保护现有血管免于退化。
实施例6.1)114-Fe和抗D114抗体对高氧诱导的血管消失的影响。
开展了研究来测定利用D114-Fc和抗D114抗体抑制D114/Notch对高氧诱
导的血管退化的影响。
动物.使用C57/B16小鼠(Taconic)来研究D114-Fc或中和性D114抗体对
氧诱导的视网膜血管消失的影响。在出生后第8天进行了研究化合物的玻
璃体内显微注射。在出生后第9天将幼畜置于75%的氧气环境中。24小时
后收获视网膜并在铺片中分析视网膜血管系统。
结果.D114-Fc或抗D114抗体的玻璃体内注射导致消失的血管系统的面
积急剧减少，分别减少97 %和41 % (图8A-B )。
实施例7. D114-Fc和抗D114抗体对高氧诱导的血管闭塞(occlusion)的影响。 开展了研究来测定利用D114-Fc和抗D114抗体抑制DH4/Notch对高氧诱
导的血管闭塞的影响。所有步骤均按上述进行。
D114-Fc和抗D114抗体治疗分别导致无灌注视网膜区域减少40%和29
% (图9A-B )。
实施例8. D114-Fc的全身性施用对高氧诱导的血管退化的影响。
开展了研究来测定D114-Fc的全身性治疗对高氧诱导的血管退化的影200780029497.8
响。
在P7，将4.1 mcg的hD114-hFc或5 mcg的人hFc对照蛋白质进行玻璃 体内注射(ITV )或以每kg体重25mg的剂量腹膜内注射hDU4-hFc。在 1)8将幼畜置于75%的氧气环境中并在P9分析;亂网膜血管系统。所有其它 步骤均按上述进行。
结果.D114-Fc的局部(玻璃体内)和全身(腹膜内)施用分别导致消失 的血管系统的面积减少86%和56%，表明与施用途径无关，D114抑制剂 可以有效用于保护血管免于退化(图10)。
19
权利要求
1. 能够抑制Dll4活性的药剂在制备用于治疗、抑制或改善局部缺血性或血管性病症的药物中的用途，其中该Dll4拮抗剂包含能够阻断Dll4与Notch受体结合的抗体或抗体片段，或包含Dll4的片段，该片段任选地连接于多聚体化成分。
2. 根据权利要求1的用途，其中D114抗体或抗体片段是多克隆或单克 隆的。
3. 根据权利要求2的用途，其中抗体或抗体片段是人源化的、嵌合的、 或是全人抗体或抗体片段。
4. 根据权利要求1至3中任意一项的用途，其中局部缺血性或血管性 病症是以异常血管的存在和/或正常血管或血管功能的损失为特征的眼睛 疾病或状况。
5. 根据权利要求4的用途，其中眼睛疾病是早产儿视网膜病变、局部 缺血性视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络 膜新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、新生血管性 青光眼或角膜移植。
6. 根据权利要求1至5中任意一项的用途，其中所治疗的受试者是人。
7. 根据权利要求1至3中任意一项的用途，其中局部缺血性或血管性 病症是局部缺血性损伤、脑缺血、心脏缺血、影响四肢或其它器官或组织 的局部缺血性状况、动静脉畸形、创伤愈合、器官或组织移植、胎盘功能 不全、动脉狭窄和闭塞、动脉粥样硬化、和全身性高压或肺动脉高压。
全文摘要
本发明提供通过向有需要的受试者施用能够抑制人delta样配体4(Dll4)活性的药剂，用于治疗局部缺血性或血管性病症的治疗方法。优选地，所述药剂是能够抑制Dll4与Notch受体结合的抗Dll4抗体或抗体片段。在一个实施方案中，局部缺血性或血管性病症是局部缺血性损伤、脑缺血、心脏缺血、影响四肢或其它器官或组织的局部缺血性状况、动静脉畸形、创伤愈合、器官或组织移植、胎盘功能不全、动脉狭窄或闭塞、动脉粥样硬化、和全身性或肺动脉高压。在另一个实施方案中，所治疗的疾病是眼睛疾病或状况，例如早产儿视网膜病变、局部缺血性视网膜病变、视网膜静脉或动脉闭塞、糖尿病性视网膜病变、脉络膜新生血管形成、年龄相关性黄斑变性、角膜新生血管形成、新生血管性青光眼或角膜移植。
文档编号A61P9/00GK101500605SQ200780029497
公开日2009年8月5日 申请日期2007年8月7日 优先权日2006年8月7日
发明者I·B·洛博夫, N·J·帕帕佐普洛斯, S·J·威甘德 申请人:瑞泽恩制药公司