用于治疗病理性血管生成和血管通透性的组合物和方法

专利名称：：用于治疗病理性血管生成和血管通透性的组合物和方法用于治疗病理性血管生成和血管通透性的组合物和方法关于联邦资助研究的声明本发明在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)资助的政府支持下做出，批予号为1R01HL77671-01。政府在本发明中具有确定的权利。
背景技术：
：尽管任何脊椎动物器官系统的脉管系统的形成是一个复杂的过程，由一群生长因子和导向信号精心安排(Jain等，2003)，但最近的研究已经极大地增加了我们对调控血管生成的信号传导级联的理解。例如，越来越清楚，指导轴突路径和神经网络形成的分子程序，在产生成熟血管网络的高度立体模式中，具有重要的作用(Carmeliet等，2005;Urness等，2004;以及Jones等2007)。在哺乳动物中被称为血管发生(vasculogenesis)的血管发育起始阶段中，内皮细胞分化、迁移并接合，形成中央轴向管、背主动脉和主静脉。第二个阶段被称为血管生成(angiogenesis)，其特征为从初生丛萌发新血管，形成成熟的循环系统。VEGF(或VPF)对于这前两个阶段都是关键的血管发生过程中内皮细胞的分化和存活，以及血管生成过程中的增殖和通透性。在该血管生成重构之后，内皮分泌血小板衍生生长因子(PDGF)，诱导血管平滑肌细胞的召集和分化。然后，血管平滑肌细胞分泌血管生成素，它确保内皮细胞和血管平滑肌细胞之间适当的相互作用。最后，血管平滑肌细胞沉积基质蛋白，例如弹性蛋白，它抑制血管平滑肌细胞的增值和分化，从而稳定了成熟的血管。因此，为了建立和维持成熟的血管网络，血管的内皮和平滑肌室必须通过自分泌和旁分泌信号传导相互作用。形成血管内皮的内皮细胞之间的间隙(细胞连接)根据组织的类型和生理状态受到严格调控。例如，在成熟的血管床中，内皮细胞的行为不是彼此独立的；相反，它们形成了单层，防止蛋白、流体(flud)和细胞从内皮腔移动到周围组织中。即使在发育好之后，血管系统也持续暴露于引起受伤、局部缺血和炎症的事件、状况或病原体中，它们通常导致细胞因子和血管生成因子的释放，例如血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF最初是基于它诱导血管渗漏的能力，作为血管通透因子(VPF)而被描述、纯化和克隆的。VEGF导致内皮细胞-细胞连接去稳定，产生内皮通透性，刺激内皮增殖和迁移，和促进血管的萌发和水肿。这些功能用于使稳定的血管网络解构，产生渗漏的新血管。在许多情况下，希望响应损伤、局部缺血和炎症释放细胞因子和血管生成因子，因为这样的响应导致恢复性或愈合过程的启动。但是，过度的血管生成和血管渗漏(例如内皮高通透性)加强了几种疾病和病理状况的病理学。例如，在发达国家，视网膜或脉络膜血管床中的病理性血管生成和内皮高通透性，是灾难性视觉丧失的最常见原因。新的以及功能障碍的血管渗漏、出血或刺激纤维变性，这些又能促成水肿、出血、或危及视觉的视网膜脱落。共有这种发病机理的主要疾病包括增殖性糖尿病性视网膜病(DR)、非增殖性糖尿病性黄斑水肿(DME)和与年龄相关的黄斑变性(AMD)(Dorrell等，2007;Afzal等，2007)。有大约一千五百万年龄超过65岁的美国人患有AMD，这些患者中的10%将由于脉络膜新生血管而经历视觉丧失。此外，超过一千六百万美国人患有糖尿病，超过400,000新患者患有视网膜水肿或新生血管。鉴于接下来20年中，全世界目前数量为2亿的糖尿病患者可能会加倍，这些患者中超过8%将患有微血管并发症，将会经历糖尿病性眼病引起的视觉丧失的患者数量不幸有快速增加的趋势。尽管流行程度低于DR、DME和AMD，但早产儿视网膜病(ROP)和缺血性视网膜静脉阻塞(IRVO)也与视网膜或脉络膜血管床中的病理性血管生成和内皮高通透性有关，并且缺少有效的治疗方法。除了眼疾之外，病理性血管生成也与肿瘤的形成和生长相关。肿瘤血管生成是渗透到肿瘤的生长中、供应营养物质和氧并除去废物的血管网络的增殖。随着血管生成，肿瘤的生长不断进行，没有它，肿瘤的生长停止。肿瘤的血管生成实际上随着恶性肿瘤细胞释放将信号传送到周围正常宿主组织的分子而开始。这种信号传导激活了宿主组织中的某些基因，这些基因又制造蛋白，以促进新血管的生长。血管生成受到活化剂和抑制剂分子的调控。在正常条件下，抑制剂占优势，阻断生长。但是，在肿瘤形成和生长过程中，肿瘤细胞释放出血管生成活化剂，导致这些活化剂的数量/浓度增加。血管生成活化剂的这种增加引起血管内皮细胞的生长和分裂，最终形成新血管。有十种以上不同的蛋白以及几种较小的分子已经被鉴定为"血管生成性的"。在这些分子中，两种蛋白对于肿瘤的持续生长似乎是最重要的血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。VEGF和bFGF由许多种癌细胞和某些类型的正常细胞产生。VEGF和bFGF首先在肿瘤细胞内部合成，然后分泌到周围组织中。当它们遇到内皮细胞时，它们与位于细胞外表面上、被称为受体的特异性蛋白结合。VEGF或bFGF与其适合的受体的结合激活了一系列中继蛋白(relayproteins)，将信号传递到内皮细胞的核中。核信号最终促使一组基因制造出新的内皮细胞生长所需的产物。内皮细胞被VEGF或bFGF的活化启动了一系列朝向产生新血管的步骤。首先，活化的内皮细胞产生基质金属蛋白酶(MMPs)，这是一类特殊的降解酶。这些酶然后从内皮细胞释放到周围组织中。MMPs分解了填充在细胞之间的空间、由蛋白和多糖形成的细胞外基质支持物质。该基质的分解使得内皮细胞可以迁移。当它们迁移到周围组织中时，被激活的内皮细胞开始分裂并组织成中空的管子，逐渐演变成成熟的血管网络。以有害的血管通透性为特征的其它疾病和病症包括，例如与脑肿瘤有关的水肿、与恶性肿瘤有关的腹水、麦格综合征(Meigs'syndrome)、肺炎、肾病综合征、心包腔积液、胸膜腔积液、急性肺损伤、炎性肠病、中风中的局部缺血/再灌注损伤、心肌梗塞、以及导致细胞因子风暴(cytokinestorm)的感染性和非感染性疾病。尽管细胞因子风暴是健康和强有力的免疫系统的全身性表现，但它是通过快速增殖和高度活化的T细胞或自然杀伤(NK)细胞引起的过度增大的免疫应答，导致了超过150种炎性介质(细胞因子，氧自由基以及凝血因子)的释放。血清中的促炎细胞因子(例如肿瘤坏死因子-a，白介素-l和白介素-6)和抗炎性细胞因子(例如白介素-10和白介素-l受体拮抗剂)都升高了，这些细胞因子激烈的并通常是致命的相互作用被称为"细胞因子风暴"。细胞因子风暴可以在许多感染性和非感染性疾病中发生，包括例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血病、禽流感、天花、以及全身性炎性反应综合征(SIRS)。在没有及时干预的情况下，细胞因子风暴可以导致永久性肺损伤，在许多情况下导致死亡。许多患者将发生ARDS，其特征为与容积过载(voumeoverload)无关的肺水肿，或左心室功能减退。促成细胞因子风暴的疾病的末期症状可能包括下面的一种或多种高血压，心动过速，呼吸困难，发烧，局部缺血或组织灌注不足，无法控制的出血，严重代谢失调，以及多系统器官衰竭。促成细胞因子风暴的感染造成的死亡通常可归因于由细胞因子风暴造成的症状，因此，不是直接由相关的病原体引起。例如，在严重流感感染例如禽流感或"鸟流感"中的死亡，典型情况下是ARDS的结果，它由病毒感染引发的细胞因子风暴所致。由于与血管生成和血管通透性有关，血管内皮生长因子(VEGF)上集中了许多关注。能够降低VEGF介导的血管生成和血管水肿的产品目前已有销售，并可用于患者。例如，抗VEGF抗体Ranibizumab(Lucentis)，Bevacizumab的抗体片段(Avastin)，其本身为VEGF抗体(Rosenfeld等，2006;Brown等，2006)，是可商购的，用于AMD的治疗。这种产品的开发和成功，激发了对于治疗与病理性血管生成或内皮高通透性有关的疾病和病症的替代策略的巨大商业兴趣。用于抑制VEGF信号传导的其它方法包括，例如，抗VEGF适配体、可溶性VEGF受体胞外结构域、受体酪氨酸激酶抑制剂、以及针对VEGF或其受体的siRNA。对于AMD来说，这样的策略已经显示出有前景。然而，对于治疗与病理性血管生成和血管渗漏有关的其它疾病的类似方法，仍然存在着巨大的兴趣。此外，因为VEGF仅仅是对血管生成和血管通透性有贡献的许多血管生成、通透性和炎性因子中的一个，所以影响VEGF功能性以及其它血管生成、通透性和炎性因子功能性的鉴定途径以及开发方法，一直具有价值。发明概述总的来说，本文描述了用于抑制血管通透和病理性血管生成的化合物、组合物和方法。本文还描述了用于生产和筛选能够抑制血管通透和病理性血管生成的化合物和组合物的方法。药物组合物包括在本文描述的组合物中。本文描述的组合物可用于例如抑制血管通透和病理性血管生成的方法，包括抑制由特定的血管生成、通透性和炎性因子例如VEGF、bFGF和凝血酶诱导的血管通透和病理性血管生成的方法。本文还提供了用于治疗特定疾病和病症的方法。通过参考具体说明，包括实施例和材料与方法，权利要求书，附图包括附图简述，本文提供的说明的其它方面将变得明了。附图简述结合在本说明书中并构成了本说明书的一部分的附图，说明了所公开的方法和组合物的几个实施方案，并与说明书结合在一起，用于解释本公开的方法和组合物的原理。本文中使用的术语"模拟物"是指不含活性Slit蛋白的假制备物。图1显示了Robo4介导的血管导向需要受体的胞质尾区。显示了48hpfTG(fli:egfp)yl胚胎的共聚焦显微镜结果，(A)未注射的，(B)注射了robo4吗啉代，(C)robo4吗啉代和野生型鼠robo4RNA，以及(D)robo4吗啉代和robo4AtailRNA。定量显示在图7中。图1E显示了在robo4morphant胚胎中血管导向缺陷的模型。在左侧和右侧图组中分别显示了5X和20X图像。DLAV-背部纵向吻合血管。PAV二脊索旁血管。DA^背主动脉。PCV:后主静脉。图2显示了Robo4依赖性的趋触性抑制需要胞质尾区的氨基末端半部。图2A显示了在趋触性迁移分析中使用的cDNA构建体的示意图。TM代表跨膜结构域。CC0和CC2是在Robo家族成员中发现的保守细胞质信号转导基序。HA^血凝素表位。图2B和图2C显示了HEK293细胞用GFP和指定的构建体共转染，并在36小时后在用5pg/ml纤连蛋白与模拟制备物或Slit2包被的膜上进行趋触性迁移。Robo4构建体的表达通过Western印迹进行证实(小插图)。结果表示成平均值士SE。图3显示了在HEK293细胞中，Robo4与Hic-5和桩蛋白的相互作用。图3A显示了HEK293细胞用Robo4胞质尾区-HA和Hic-5-V5、或空载体(pcDNA3)和Hic-5-V5共转染。Robo4用HA抗体免疫沉淀，Hic-5使用V5抗体通过western印迹进行检测。图3B显示了用针对Hic-5和桩蛋白的抗体来探测来自Cho-Kl、HEK293和NIH3T3细胞的全细胞裂解液。图3C显示了HEK293细胞用桩蛋白-V5和Robo4胞质尾区-HA或空载体(pcDNA3)进行共转染。Robo4从细胞裂解液中用HA抗体免疫沉淀，桩蛋白使用V5抗体通过western印迹进行检观!J。图3D显示了HEK293细胞用全长的Robo4-HA和桩蛋白-V5转染，并用Slit2刺激5分钟。Robo4从细胞裂解液中用HA抗体免疫沉淀，桩蛋白使用V5抗体通过western印迹进行检测。图4显示了桩蛋白与Robo4通过Robo4依赖性的趋触性抑制所需的新基序发生相互作用。图4A显示了在B图块中显示的pulldown分析中使用的GST-Robo4融合蛋白的示意图。图4B显示了从大肠杆菌(E.coli)中纯化GST-Robo4融合蛋白，并与重组纯化的桩蛋白温育。桩蛋白使用桩蛋白特异性单克隆抗体通过western印迹进行检测。图4C显示了在图D中描述的pulldown分析中使用的GST-Robo4融合蛋白的示意图。图4D显示了从大肠杆菌中纯化GST-Robo4融合蛋白，并与重组纯化的桩蛋白温育。桩蛋白使用桩蛋白特异性单克隆抗体通过western印迹进行检测。图4E显示了从大肠杆菌中纯化GST-Robo4野生型或GST-Robo4APIM，并与重组纯化的桩蛋白或体外转录/翻译的Mena-V5温育。桩蛋白和Mena分别使用桩蛋白特异性单克隆抗体和V5抗体进行检测。图4F显示了HEK293细胞用GFP和指定的构建体转染，并在36小时后在用5|ig/ml纤连蛋白与模拟制备物或Slit2包被的膜上进行趋触性迁移。Robo4构建体的表达通过Western印迹进行证实(小插图)。结果表示成平均值土SE。图5显示了Robo4通过使Rac失活来抑制细胞铺展。图5A、图5D和图5G显示了HEK293细胞用GFP和指定的构建体转染，并在36小时后在用5吗/ml纤连蛋白与模拟制备物或Slit2包被的盖玻片上进行细胞铺展分析。结果表示成平均值士SE。图5B和图5E显示了HEK293细胞用指定的构建体转染，并在36小时后铺在用5吗/ml纤连蛋白与模拟制备物或Slit2包被的皿上。在温育5分钟后，将细胞裂解，用GST-PBD沉淀GTP墨Rac。Rac使用Rac特异性单克隆抗体通过western印迹进行检测。图5H显示了将HUVEC与Slit2温育60分钟，用25ng/mlVEGF刺激5分钟，裂解，并用GST-PBD沉淀GTP-Rac。Rac使用Rac特异性单克隆抗体通过western印迹进行检测。(C)和(F)粘附诱导的以及(I)VEGF诱导的Rac活化的Sm2依赖性抑制，通过密度计量法进行定量。结果表示成平均值iSE。图6显示了桩蛋白ALim4突变体不与Robo4相互作用，或不支持Slit2-Robo4介导的抑制细胞铺展。图6A显示了用于B、C和D图块中的桩蛋白构建体的示意图。图6B显示了将HEK293细胞用Robo4胞质尾区-HA和桩蛋白-V5、或空载体(pcDNA3)和桩蛋白-V5进行共转染。使用HA抗体将Robo4从细胞裂解液中免疫沉淀，桩蛋白使用V5抗体通过western印迹进行检测。图6C显示了将HEK293细胞用Robo4胞质尾区-HA与野生型桩蛋白-V5或桩蛋白ALim4-V5进行共转染。Robo4用HA抗体进行免疫沉淀，桩蛋白使用V5抗体通过western印迹进行检测。图6D显示了在HEK293细胞中使用siRNA将内源桩蛋白敲除，并用野生型鸡桩蛋白或鸡桩蛋白ALim4进行重构。敲除和重构使用桩蛋白抗体通过western印迹进行可视化，并通过密度计量法进行定量。测得桩蛋白的表达为野生型水平的35%。图6E显示了进行过敲除/重构的HEK293细胞，在用5i!g/ml纤连蛋白与模拟制备物或Slit2包被的盖玻片上进行铺展分析。结果表示成平均值iSE。图7显示了桩蛋白相互作用基序是排斥性血管导向所需要的。图7A显示了在未注射的(n=66)、注射了robo4吗啉代(n=56)、robo4吗啉代和野生型鼠robo4RNA(n=60)、robo4吗啉代和robo4AtailRNA(n=17)、以及robo4吗啉代禾口robo4APIMRNA(n-45)的TG(fli:egfp)yl胚胎中，定量血管模式形成的缺陷。代表性图像显示在图l中。图7B显示了抑制细胞迁移、铺展和Rac活化的Slit2-Robo4信号传导轴的模型。图8显示了在斑马鱼胚胎中剪接阻断性吗啉代抑制了robo4的表达。图8A显示了斑马鱼(Daniorerio)中robo4基因座和编码的Robo4蛋白的示意图。剪接阻断性吗啉代靶向的外显子被标明，用于扩增robo4cDNA的引物的位置也被标明。图8B显示了从未注射的胚胎和用robo4剪接阻断性吗啉代注射的胚胎分离的RNA，并用于反转录cDNA。然后将cDNA用于扩增robo4，得到的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并用溴化乙锭染色进行可视化。图9显示了Hic-5是一种Robo4相互作用蛋白。图9A显示了全长Hic-5和从酵母双杂交筛选回收的cDNA克隆的示意图。图9B显示了将酿酒酵母(s.cerevisiae)菌株PJ694-A用指定的质粒进行转化，并铺于不含亮氨酸和色氨酸、或不含亮氨酸、色氨酸、组氨酸和丙氨酸的合成培养基上。将能够在营养缺陷培养基上生长的菌落点在同样培养基上，复制平板培养，并照相或用于(3-半乳糖苷酶分析。图10显示了桩蛋白相互作用基序位于Robo4胞质尾区中CC0和CC2之间。鼠Robo4蛋白的示意图以及包含桩蛋白相互作用基序的氨基酸的鉴定。图11显示了Robo4胞质尾区不抑制Cdc42的活化，也不与srGAPl相互'作用。图11A显示了将表达Robo4的HEK293细胞铺于包被有5!ig/ml纤连蛋白与模拟制备物或Slit2的细菌培养皿上。在5分钟温育后，将细胞裂解，用GST-PBD沉淀GTP-Cdc42。Cdc42用Cdc42特异性单克隆抗体通过western印迹进行检测。图11B显示了将HEK293细胞用指定的质粒转化，然后用HA抗体对Robol/Robo4进行免疫沉淀。srGAPl使用FlagM2抗体通过western印迹进行检测。图12显示出slit减少了早产儿视网膜病，它是影响糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病和与衰老相关的黄斑变性的因子的FDA标准。图12A显示了接受模拟制备物的野生型小鼠与接受Slit蛋白的小鼠相比，视网膜的新生血管百分数。与野生型小鼠相比，在用Slit处理的小鼠中，新生血管减少了63%。N=6，P<0.003。图12B显示了接受模拟制备物的野生型小鼠与接受盐水对照的小鼠相比，视网膜的新生血管百分数。N=5，P<0.85。图12C显示了基因敲除小鼠与Slit处理的小鼠相比，视网膜的新生血管百分数。N=l。图13显示了slit和导向因子(netrin)能够降低VEGF诱导的皮肤通透性。图14显示了slit能够降低VEGF介导的视网膜通透性。图15显示了脑信号蛋白样的VEGF增加皮肤通透性。图16显示出Robo4通过抑制Arf6阻断了Rac依赖性的突出活性。稳定表达allb或alIb-Robo4胞质尾区的CHO-K1细胞被铺于包被有纤连蛋白或纤连蛋白和纤维蛋白原的皿上，裂解，并使用GST-GGA3沉淀GTP-Arf6。Arf6使用Arf6特异性单克隆抗体通过western印迹进行检测(参见图16A)。将稳定表达allb或alIb-Robo4胞质尾区的CHO-K1细胞用GFP与空载体或GIT1-PBS共转染，并在包被有纤连蛋白或纤连蛋白和纤维蛋白原的载玻片上进行铺展分析。GFP阳性细胞的区域使用ImageJ测定，误差线表示SEM(参见图16B)。将HEK293细胞用GFP和指定的构建体进行共转染，36小时后在纤连蛋白与模拟制备物或Slit2蛋白上进行铺展分析(参见图16C)。在所有的图块中，误差线表示平均值土SE。Robo4和ARNO的表达通过western印迹进行证实(数据未显示)。将HEK293细胞用GFP和指定的构建体进行共转染，36小时后铺于用纤连蛋白与模拟制备物或Slit2蛋白包被的皿上。将GTP-Rac用GST-PBD沉淀，Rac用Racl特异性单克隆抗体进行检测(参见图16D)。图17显示了免疫沉淀反应的结果，证实了Robo4受体与Slit配体的结合。图17A显示了来自未转染的人类胚胎肾细胞(HEK)、用带有myc表位标签的Slit(Slit-myc)转染的HEK细胞、用带有HA表位标签的Robo4(Robo4-HA)转染的HEK细胞、以及用对照载体转染的HEK细胞(对照-HEK)的细胞裂解液的免疫沉淀结果。Slit-myc细胞裂解液的Western印迹分析用作对照，证明了Slit蛋白的质量为大约210kD，与以前的报道一样(第l道)。在将Slit-myc和Robo4-HA细胞裂解液混合后并用抗HA抗体免疫沉淀后，也用抗myc抗体通过Western印迹分析来检测Slit-myc蛋白(第6道)。该相互作用的特异性通过使用裂解液的所有其它组合时不能检测到Slit蛋白所证实。在每个实验中使用了同样量的裂解液。在第2-6道中较下的条带对应于免疫球蛋白重链。图17B显示了来自未转染的HEK细胞(HEKCM)、用带有myc表位标签的Slit转染的HEK细胞(Slit-mycCM)、用带有HA表位标签的Robo4的N端可溶性胞外结构域转染的HEK细胞(NRobo4-HACM)、以及用对照载体转染的HEK细胞(对照-HEKCM)的条件培养基的免疫沉淀结果。在Slit-mycCM中通过抗myc抗体检测到了全长Slit-myc蛋白(210KD)及其C-末端蛋白水解片段(70KD)(第1道)。与图17A中相同，在将Slit-myc和Robo4-HA条件培养基混合后并用抗HA抗体免疫沉淀后，也通过Western印迹检测到了Slit-myc蛋白(第6道)。该相互作用的特异性由使用条件培养基的所有其它组合时没有Slit蛋白所证实。如图17C-图17F所示，Slit蛋白与表达Robo4的细胞的质膜结合。Slit-myc蛋白的结合使用抗myc抗体和Alexa594结合的抗小鼠抗体来检测。在Robo4-HEK细胞的表面(图17F)而不是对照-HEK细胞的表面(图17D)上检测到了结合。图18显示了Robo4表达是内皮细胞特异性的和以柄细胞为中心的。图18A显示了从P5Robo4+/AP小鼠制备的视网膜辅片(flatmounts)，并对内皮粘蛋白(内皮细胞)、NG2(周细胞)和碱性磷酸酶(AP;Robo4)进行染色。在左上图中指向右边的最顶部箭头指示了顶端细胞，其余的箭头表明周细胞(NG2阳性)。"T"也表示顶端细胞。图18B显示了从成年Robo4+^小鼠制备的视网膜辅片，并对NG2(周细胞)和AP(Robo4)进行了染色，在图18B中包含的箭头指示周细胞(NG2阳性)。图18C显示了使用特异性针对PECAM、Robol和Robo4的引物，在指定的样品上进行的定量RT-PCR(qPCR)的结果。当用于图18C时"HAEC"表示人类主动脉内皮细胞；"HMVEC"表示人类微血管内皮细胞；"HASMC"表示人类主动脉平滑肌细胞。图18D显示了使用针对Robo4、VE-钙粘着蛋白、平滑肌肌动蛋白和ERK1/2的抗体，探测来自HMVEC和HASMC的全细胞裂解液的结果。图19显示出Robo4信号传导抑制了VEGF-A诱导的迁移、管形成、通透性和Src家族激酶(SFK)的活化。从Robo4+"和Robo4AP/AP小鼠分离到的肺内皮细胞(ECs)被用于内皮细胞迁移(图19A)、管形成(图19B)、体外通透性(图19C)、Miles分析(图19D)和视网膜通透性分析(图19E)。将人类微血管内皮细胞在存在模拟制备物或Slit2蛋白的情况下，用VEGF-A刺激5分钟，裂解，并使用磷酸-VEGFR2抗体进行western印迹(图19F)，使用磷酸-Src抗体进行western印迹(图19G)，以及Rac活化分析(图19H)。在所有图中，*代表p0.05，"代表p〈0.005，"M戈表p〈0.0005，NS表示"不显著"，误差线表示SEM。图20显示出Robo4信号传导在氧诱导的视网膜病("OIR")的动物模型中和在脉络膜新生血管("CNV")的动物模型中抑制病理性血管生成。对新生的Robo4+"和Robo4AP/AP小鼠进行氧诱导的视网膜病，并用荧光素异硫氰酸酯(FITC)-葡聚糖(绿色)进行灌注。对于每种情况制备视网膜辅片，通过荧光显微镜进行分析。箭头表示病理性血管生成的区域(图20A到图20D)。对在图20A到图20D中观察到的病理性血管生成的定量提供在图20E中。在CNV模型中，对2-3月龄的Robo4+"和Robo4AWAP小鼠进行激光诱导的脉络膜新生血管化。制备脉络膜辅片，用同工凝集素染色，通过共聚焦显微镜分析(图20F到图201)。对在图20F到图20I中观察到的病理性血管生成的定量提供在图20J中。在所有图中，*代表卩<0.05，"代表p〈0.005，***代表p<0.0005，NS表示"不显著"，误差线表示SEM。图21显示出Robo4信号传导抑制了bFGF诱导的血管生成和凝血酶刺激的内皮通透性过高。在执行提供了图21A中显示的结果的实验中，在存在bFGF与模拟制备物或Slit2蛋白的情况下，在基质胶上对鼠的肺内皮细胞进行管形成分析。在执行提供了图21B中显示的结果的实验中，在纤连蛋白包被的Transwells上进行了凝血酶诱导的通透性分析。图22显示出Robo4信号传导在急性肺损伤模型中降低了损伤和炎症。将小鼠暴露于气管内LPS,并用Slit蛋白或模拟制备物处理。在支气管肺泡灌洗液(BAL)中炎性细胞和蛋白的浓度明显通过Slit蛋白处理被降低了。图23显示了Slit蛋白的不同构建体，并显示出小到Slit2-Dl(40kD)的重组Slit肽也具有活性。在图23A中，描述了Slit蛋白的不同构建体。标出了四个富含亮氨酸的结构域(LRR)、表皮生长因子同源区域(EGF)和C末端标签(MYC/HIS)。在图23B中显示了不同Slit构建体(2nM)对VEGF介导的内皮细胞迁移的抑制。图24显示了按照禽流感的小鼠模型，施用Slit蛋白对感染了禽流感病毒的小鼠的存活率的影响。图25显示了在实施例14中描述的敲除小鼠的基因组性状。发明的具体说明公开了可用于本公开的方法和组合物、可以与它们一起使用、可用于制备它们、或是它们的产物的材料、组合物和成分。这些以及其它的材料被公开在本文中，并应该理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、分组等被公开时，尽管可能没有明确地公开这些化合物的各种个体和集合性组合和排列中每一个的特定意义，但每一个都被具体考虑到了并描述在本文中。例如，如果公开并讨论了多肽，并且讨论了可以对包含该多肽的许多分子进行的许多修饰，那么该多肽和修饰的每种和所有的可能组合和排列都被具体地考虑到了，除非明确表示不是这样。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并且公开了组合的分子的一个例子A-D，那么即使没有对每个都进行单独的叙述，但每个都被从个体上和集合上考虑到了。因此，在这个例子中，每种组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F都被具体考虑到了，并且应该被认为是从A、B和C;D、E和F;以及示例的组合A-D的公开内容中被公开了。同样地，它们的任何子集或组合也被具体地考虑到并公开了。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组被具体地考虑到了，并且应该被认为从A、B和C;D、E和F;以及示例的组合A-D的公开内容中被公开了。这种概念被应用于本申请的所有方面，包括但不限于在制造和使用本公开组合物的方法中的步骤。因此，如果存在多种可以执行的其它步骤，那么应该理解，这些其它步骤中的每一个可以用本公开方法的任何具体实施方案或实施方案的组合执行，并且每种这样的组合被具体地考虑到了，应该被认为是被公开了。本
技术领域：
的专业人员将会认识到、或者使用不逾越常规的实验就能够确定出本文描述的方法和组合物的具体实施方案的许多等效体。这样的等效体旨在被所附的权利要求所包含。应该理解，所公开的方法和组合物不限于描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应该理解，在本文中使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，不打算对本发明的范围进行限制，本发明的范围仅仅受到所附的权利要求书的限制。除非另有定义，在本文使用的所有技术和科学术语都具有本说明书背景中
技术领域：
的专业人员所通常理解的意义。必须指出，在本文和所附权利要求书中使用的没有量词指示的名词包含该词的复数形式，除非上下文明确表示不是。因此，例如指称"多肽"包含多个这样的多肽，指称"该多肽"是指一个或多个多肽及其本
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的专业人员已知的等价物，等等。"可选的"或"可选地"是指随后描述的事件、情况或材料可以发生或存在或可以不发生或存在，该描述包含了事件、情况或材料发生或存在的情形，和它不发生或不存在的情形。在本文中，范围可以表示为从"大约"一个特定值和/或到"大约"另一个特定值。当表述这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。同样地，当通过在前面使用"大约"将值表示成约略值时，应该理解为特定值形成了另一个实施方案。还应该理解，每个范围的终点显然既与另一个终点相关，又独立于另一个终点。还应该理解，在本文中公开了许多值，本文中的每个值，除了该值本身之外，也被公开成"大约"该特定值。例如，如果公开了值"io"，那么"大约10"也被公开了。还应该理解，当公开值时，"小于或等于"该值、"大于或等于该值"以及值之间的可能范围，也被公开了，这是专业技术人员所应当了解的。例如，如果公开了值"10"，那么"少于或等于10"以及"大于或等于10"也被公开了。还应该理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，该数据代表了终点和起始点，以及数据点的任何组合范围。例如，如果公开了具体数据点"10"和具体数据点15，则应该理解大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15，以及10到15之间，被认为是公开了。还应该理解，两个具体单位之间的每个单位也被公开了。例如，如果10和15被公开了，那么11、12、13和14也被公开了。本文使用的术语"对象"是指任何给药的靶。对象可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，对象可以是人类。术语没有指定具体的年龄或性别。因此，成年和新生对象以及胎儿，不论是雄性还是雌性，都打算被涵盖。患者是指患有疾病或病症的对象。术语"患者"包括人类和兽医对象。"抑制"是指活性、反应、病症、疾病或其它生物学参数的降低。这可以包括但不限于完全消除活性、反应、病症或疾病。这也可以包括例如与天然或对照水平相比，使活性、反应、病症或疾病降低了10%。因此，降低可以是与天然或对照水平相比，10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100%或具体陈述的百分率之间的任何降低量。"促进"是指活性、反应、病症、疾病或其它生物学参数的增加。这可以包括但不限于活性、反应、病症或疾病的起始。这也可以包括例如与天然的或对照水平相比，使活性、反应、病症或疾病增加10%。因此，活性、反应、病症、疾病或其它生物学参数的增加，可以是与天然或对照水平相比，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%或以上，包括具体陈述的百分率之间的任何增加量。术语"治疗有效的"是指使用的组合物的量是缓解疾病或病症的一种或多种病因或症状的充分量。这种缓解只要求降低或改变，而不必需是消除。术语"载体"是指化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合时，出于其打算的应用或目标，帮助或促进这些化合物或组合物的制备、储存、施用、投送、有效性、选择性或任何其它特征。例如，可以选择载体以最小化活性成分在对象中的任何降解，并最小化在对象中的任何不良副作用。术语"调控序列"是指通常在基因座编码区的100-1000千碱基(kb)内、影响基因表达的序列，但是它们也可以离编码区更远。这种对表达的调控包括基因的转录，以及信使RNA的翻译、剪接和稳定性。术语"可操作地连接"是指毗邻位置，在所述位置中所描述的成分处于允许它们以目的方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列是可操作地连接的。术语"可操作地连接"可以是指核酸表达控制序列(例如启动子、增强子、或转录因子结合位点的排列)与第二个核酸序列之间的功能性联系，其中表达控制序列指导第二个序列的相应核酸的转录。"分离的"，当用于描述本文公开的生物分子时，是指例如已经从其天然环境的成分中被鉴定和分离和/或回收的肽、蛋白或核酸。其天然环境的污染成分是通常将干扰被分离的分子的诊断或治疗应用的物质，可以包括酶、激素以及其它蛋白质或非蛋白质物质。分离和纯化本文描述的生物分子的方法在本
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中是已知的和可用的，本
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的普通专业人员可以根据需要被分离或纯化的物质，确定适合的分离和纯化方法。尽管分离的生物分子通常将使用至少一个纯化步骤来制备，但在本文中使用时，"分离的"也可以是指例如在重组细胞中原位的肽、蛋白、抗体或核酸物质，即使是表达在同源的细胞类型中。此外，当使用术语"分离的"、"基本上纯的"和"基本上均质的"来描述单体蛋白时，它们在本文中可以互换使用。当至少大约60%到75%的样品表现出单一的多肽序列时，单体蛋白基本上是纯的。通常，基本上纯的蛋白可以占蛋白样品的大约60-90%W/W，需要时，基本上纯的蛋白可以大于大约90%、大约95%或大约99%纯。蛋白的纯度或同质性可以由本
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众所周知的多种方法来显示，例如蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在凝胶染色后使单一的多肽条带可视化。出于某些目的，可以使用HPLC或本
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众所周知的其它用于纯化的方法来提供更高的分辨率。在通篇本说明书的说明和权利要求中，单词"包含(comprise)"，是指"包括但不限于"，并不打算排除例如其它的添加物、成分、整数或步骤。本文中使用的"血管通透性"是指小分子(例如离子、水、营养物质)、大分子(例如蛋白和核酸)或甚至整个细胞(淋巴细胞在它们通向炎症位点的路上)通过血管壁的能力。术语"病原性"或"病原性状态"是指与健康、正常或有效状态的任何偏离，这可以是疾病、病症、事件或受伤的结果。蛋白和肽在本文中使用的术语"蛋白"和"肽"，单纯是指广义的多肽分子，不用于指任何特定大小、长度或分子量的多肽分子。蛋白变异体和衍生物对于本
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的专业人员来说是非常了解的，并可以包括氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列的修饰通常属于三种类型中的一种或多种取代、插入或缺失变异体。插入包括氨基和/或羧基末端的融合以及序列内插入单个或多个氨基酸残基。插入一般是比氨基或羧基末端融合更小的插入，例如，一到四个残基左右。免疫原性融合蛋白衍生物，例如在实施例中描述的那些，是通过体外交联将大得足以赋予免疫原性的多肽与靶序列融合、或通过用编码融合蛋白的DNA转化重组细胞培养物来制造的。缺失的特征为从蛋白序列中除去一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内任何一个位点上缺失不超过大约2到6个残基。这些变异体的制备一般是通过编码蛋白的DNA中的核苷酸的位点特异性诱变，从而产生编码变异体的DNA，然后将在重组细胞培养物中表达DNA。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点上制造取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代一般为单个残基，但是也可以一次发生在许多不同位置上；插入通常在大约1到IO个氨基酸残基左右；缺失在大约1到30个残基的范围内。缺失或插入优选在邻近的对上进行，即缺失两个残基或插入两个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以被组合，以获得最终的构建体。突变绝不可以将序列放置到阅读框之外，并且优选不产生能产生mRNA二级结构的互补区域。取代变异体是其中至少一个残基被除去、并且在其位置中插入了不同残基的变异体。这样的取代一般按照下面的表1来做出，被称为保守取代。表1:氨基酸取代，原始残基示例的保守取代甚窗在率,
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中已矢口。AlaSerArgLys;GinAsnGn;HisAspGluCysSerAsn，LysAspProAsn;GlnLeu;Vallie;ValArg;GinLeu;lieMet;Leu;TyrThrSerTyrTrp;Phelie;Leu_功能或免疫学特征的显著改变通过选择比表i中的取代保守性低的取代来产生，即选择在维持下面特性的作用方面差异更明显的残基:(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构象，(b)靶位点上分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。一般来说，预计对蛋白的性质产生最大改变的取代，将是下面的取代，其中(a)亲水性残基，例如丝氨酸或苏氨酸残基，取代了(或被取代成)疏水性残基，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸残基；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代了(或被取代成)任何其它的残基；(c)具有正电侧链的残基，例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基，取代了(或被取代成)具有负电的残基，例如谷氨酸或天冬氨酸残基；或(d)具有大体积侧链的残基，例如苯丙氨酸，取代了(或被取代成)不具有侧链的残基，例如甘氨酸，在这种情况下，(e)通过增加硫化和/或糖基化的位点的数量。例如，将一个氨基酸残基用另一个生物学和/或化学上类似的残基代替，被本
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的专业人员称为保守取代。例如，保守取代将是用一个疏水残基替代另一个疏水残基，或用一个极性残基替代另一个极性残基。取代包括组合，例如Gly，Ala;Val，Ile，Leu;Asp，Glu;Asn，Gln;Ser，Thr;Lys，Arg;禾卩Phe，Tyr。每个明确公开的序列的这种保守取代变异体，包含在本文提供的嵌合多肽中。取代或缺失诱变可用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。也可希望缺失半胱氨酸或其它有可能的残基。缺失或取代可能的蛋白水解位点例如Arg，可以通过例如缺失碱性残基中的一个或用谷氨酰胺或组氨酸残基取代一个来实现。某些翻译后衍生作用是重组宿主细胞作用于被表达的多肽的结果。谷氨酰胺和天冬酰胺残基在翻译后经常被脱酰胺形成相应的谷氨酸和天冬氨酸残基。或者，这些残基在轻度酸性条件下被脱酰胺。其它的翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸或苏氨酸残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的邻-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:StructureandMolecularProperties(蛋白结构与分子性质)，W.H.Freeman&Co.,SanFranciscopp79-86[1983])，N-末端胺的乙酰化，以及在某些情况下，C-末端羧基的酰胺化。应该理解，确定本文公开的蛋白和肽的变异体和衍生物的一种方式，是通过根据与特定已知序列的同源性/同一性来确定变异体和衍生物。具体公开的是与所述序列具有至少70%或75%或80%或85%或90%或95%同源性的本文公开的这些以及其它蛋白的变异体。本
技术领域：
的专业人员容易了解如何确定两个蛋白的同源性。例如，可以在将两个序列进行比对使得同源性在最高水平后计算同源性。计算同源性的另一种方法可以通过已发表的算法来进行。用于比较的最佳序列比对可以通过Smith禾PWaterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))的局部同源性算法、Needl函n和Wunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))的同源性比对算法、Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988))的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实施(威斯康辛遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,WI)，或通过目观!j检查来进行。对于核酸来说，可以获得同样类型的同源性，例如通过在Zuker，M.Science244:48-52,1989;Jaeger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:7706-7710,1989;Jaeger等，MethodsEnzymol.183:281-306，1989中公开的算法，在此至少以其与核酸比对有关的材料引为参考。应该理解，对保守突变和同源性的描述可以以任何组合方式组合在一起，例如与特定序列具有至少70%同源性的实施方案，其中变异体是保守突变。因为本说明书讨论了各种不同的蛋白和蛋白序列，应该理解，能够编码那些蛋白序列的核酸也被公开了。这将包括所有与特定蛋白序列有关的简并序列，即所有其序列编码一种特定蛋白序列的核酸，以及所有编码蛋白序列的公开变异体和衍生物的核酸，包括简并核酸。因此，尽管每个具体的核酸序列可能没有在本文中写出，但应该理解，事实上通过公开的蛋白序列，每个和所有的序列都在本文中公开和描述了。应该理解，有众多氨基酸和肽的类似物可以掺入到公开的组合物中。例如，存在众多的D型氨基酸或与表1中显示的氨基酸具有不同功能性取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体以及肽类似物的立体异构体。通过为tRNA分子装载选择的氨基酸，以及将利用例如琥珀密码子的遗传构建体工程化，以将类似氨基酸以位点特异性方式插入到肽链中，这些氨基酸能够容易地被掺入到多肽链中(Thorson等，MethodsinMolec.Biol.77:43-73(1991);Zoller，CurrentOpinioninBiotechnology,3:348-354(1992);Ibba,Biotechnology&GeneticEnginerringReviews13:197-216(1995);Cahill等，TIBS，14(10):400-403(1989);Benner，TIBTech,12:158-163(1994);Ibba禾口Hennecke，Bio/technology,12:678-682(1994),所有上述文献至少以其与氨基酸类似物相关的材料在此引为参考)。可以生产类似于肽、但是不能通过天然的肽键连接的分子。例如，用于氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括CH2NH-、—CH2S-、—CH2—CH2—、—CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2--、—CH(OH)CH2—和—CHH2SO—(这些以及其它键可以在下面的文献中发现Spatola,A.F.inChemistryandBiochemistryofAminoAcids，Peptides,andProteins,(氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学生化)B.Weinstein主编，MarcelDekker,NewYork,p.267(1983);Spatola，A.F.,VegaData(March1983):Vol.1,Issue3,PeptideBackboneModifications(generalreview)(月太骨架修饰)(综述)；Morley,TrendsPharmSci(1980)pp.463-468;Hudson,D.等，IntJPeptProtRes14:177-185(1979)(—CH2NH—、CH2CH2—);Spatola等，LifeSci38:1243-1249(1986)(--CHH2—S);HarmJ.Chem.SocPerkinTrans.I307-314(1982)(—CH—CH—，顺式和反式)；Almquist等，J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(—COCH2—););Jennings-White等，TetrahedronLett23:2533(1982)(--COCH2—);Szelke等，EuropeanAppln,EP45665CA(1982):97:39405(1982)(—CH(OH)CH2—);Holladay等，Tetrahedron.Lett24:4401-4404(1983)(—C(OH)CH2—);以及HrubyLifeSci31:189-199(1982)(—CH2—S—);每个文献在此引为参考。特别优选的非肽键是-CH2NH--。应该理解，肽类似物在成键原子之间可以具有一个以上的原子，例如P-丙氨酸、？氨基丁酸等。氨基酸类似物和类似物和肽类似物通常具有增强的或所需的性质，例如更经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药学性质(半衰期、吸收、效力、功效等)、改变的特异性(例如广谱的生物活性)、降低的抗原性，等等。D-氨基酸可用于产生更稳定的肽，因为D-氨基酸本身不被肽酶识别。将保守序列的一个或多个氨基酸用同样类型的D-氨基酸系统取代(例如用D-赖氨酸代替L-赖氨酸)，可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于环化或将两个或多个肽连接到一起。这对于将肽限制为特定的构象是有益的。(Rizo禾口GieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992)，在此引为参考)。核酸本文公开了多种基于核酸的分子。公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物构成。这些以及其它分子的非限制性例子在本文中进行了讨论。应该理解，例如，当载体在细胞中表达时，表达的mRNA通常将由A、C、G和U构成。同样应该理解，例如，如果通过例如外源投送将反义分子引入细胞或细胞环境中，反义分子由降低反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物构成，将是有利的。核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可以通过它们的磷酸部分和糖部分产生核苷间键而连接在一起。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌吟-9-基(A)、胞嘧啶-l-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-l-基(U)和胸腺嘧啶-l-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价的磷酸。核苷酸的非限制性例子是3'-AMP(3'-腺苷一磷酸)或5'-GMP(5'-鸟苷一磷酸)。核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸部分的某些类型修饰的核苷酸。对碱基部分的修饰包括对A、C、G和T/U以及不同的嘌呤或嘧啶碱基的天然和合成的修饰，例如尿嘧啶-5-基(.psi.)、次黄嘌呤-9-基(I)和2-氨基腺嘌吟-9-基。修饰的碱基包括但不限于5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它垸基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它垸基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫羟、8-硫垸基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。其它的碱基修饰可以在例如美国专利No.3,687,808;Englisch等，AngewandteChemie(应用化学)，InternationalEdition,1991,30,613禾卩Sanghvi,Y.S.,Chapter15,AntisenseResearchandApplications,pages289-302(《反义研究和应用》，第15章，289-302页)，Crooke，S.T.和Lebleu，B.主编，CRCPress,1993中找到。某些核苷酸类似物，例如5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶，可以增加双链体形成的稳定性。很多时候，碱基的修饰可以与例如糖的修饰例如2'-0-甲氧基乙基相组合，以获得独特的性质，例如增加双链体稳定性。有众多的美国专利例如4，845，205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5，367，066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617和5,681,941，它们详细地描述了碱基修饰的范围。这些专利每个都在此引为参考。核苷酸类似物也可以包括糖部分的修饰。对糖部分的修饰包括对核糖和脱氧核糖的天然修饰以及合成修饰。糖的修饰包括但不限于在2'位置的下列修饰OH，F，O-，S-或N-垸基；O-、S-或N-烯基；O-，S-或N-炔基；或O-垸基-O-垸基，其中垸基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C,到C,o垸基或C2到Cu)烯基和炔基。2'糖修饰也包括但不限于-0[(CH2)nO]mCH3、-0(CH2)nOCH3、-0(CH2)nNH2、-0(CH2)nCH3、-0(CH2)n-ONH^P-0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m从1到大约10。其它在2'位置上的修饰包括但不限于Q到d。低级烷基、取代的低级垸基、垸芳基、芳垸基、O-垸芳基或O-芳垸基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅垸基、RNA裂解基团、报道基团、嵌入剂、改进寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或改进寡核苷酸的药效动力学性质的基团，以及其它具有类似性质的取代基。类似的修饰也可以在糖的其它位置上进行，特别是3'末端核苷酸上或2'-5'连接的寡核苷酸中糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置上。修饰的糖也包括那些在桥接性环的氧上含有修饰例如CH2和S的糖。核苷酸糖类似物也可以具有糖模拟物例如环丁基部分来代替呋喃戊糖。有许多美国专利讲述了这些修饰的糖结构的制备，例如4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5，591，722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，每个专利在此以其全文引为参考。核苷酸类似物也能够在磷酸部分上被修饰。修饰的磷酸部分包括但不限于可以被修饰、使得两个核苷酸之间的键含有下列成分的修饰磷酸基团硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基垸基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基垸基膦酸酯、硫羰基垸基磷酸三酯和硼垸磷酸酯。应该理解，两个核苷酸之间的这些磷酸或修饰磷酸的键可以通过3'-5'连接或2'-5'连接，键可含有颠倒的极性例如3'-5'变为5'-3'或2'-5'变为5'-2'。各种盐、混合盐和游离酸的形式也包括在内。大量的美国专利讲述了如何制造和使用含有修饰的磷酸的核苷酸，并且包括但不限于3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，每个专利在此引为参考。应该理解，核苷酸类似物只需要含有单个修饰，但是也可以在一个部分内或不同部分之间含有多个修饰。核苷酸取代物是具有与核苷酸类似的功能性质，但是不含有磷酸部分的分子，例如肽核酸(PNA)。核苷酸取代物是以沃森-克里克(Watson-Crick)或Hoogsteen方式识别核酸，但却通过磷酸部分之外的部分连接到一起的分子。核苷酸取代物当与适当的靶核酸相互作用时，能够形成符合双螺旋类型的结构。核苷酸取代物是磷酸部分和/或糖部分已经被替代的核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸取代物不含有标准的磷原子。磷酸的取代物可以是，例如，短链烷基或环垸基核苷间键、混合的杂原子和垸基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括了具有下列成分的取代物吗啉代键(一部分从核苷的糖部分形成)，硅氧垸骨架，硫化物、亚砜和砜骨架，甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架，亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架，含有烯烃的骨架，氨基磺酸骨架，亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架，磺酸酯和磺酰胺骨架，酰胺骨架，以及其它具有混合的N、O、S和CH2成分的部分。许多美国专利公开了如何制备和使用这些类型的磷酸替代物，包括但不限于5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，每个专利在此引为参考。还应该理解，在核苷酸取代物中，核苷酸的糖和磷酸部分都可以被替代，例如被酰胺类型键(氨基乙基甘氨酸)(PNA)替代。美国专利5,539,082、5,714,331和5,719,262讲述了如何制造和使用PNA分子，每个专利在此引为参考。(也参见Nielsen等，Science,1991,254,1497-1500)。将其它类型的分子(结合物)连接到核苷酸或核苷酸类似物上以增强例如细胞摄取，也是可能的。结合物可以被化学连接到核苷酸或核苷酸类似物上。这样的结合物包括但不限于脂部分例如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.,1994，4，1053-1060)、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660306-309;Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let"1993，3,2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、月旨肪链例如十二垸二醇或H"^—垸残基(Saison-Behmoaras等，EMBOJ.,1991,10，1111-1118;Kabanov等，FEBSLett"1990,259,327-330;Svi薩huk等，Biochimie,1993,75，49-54)、磷脂例如二-十六烷基-消旋甘油或三乙铵1,2-二-0-十六烷基-消旋甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995，36,3651-3654;Shea等，Nucl.AcidsRes"19卯，18,3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995，14,969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、或十八胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996,277,923-937)。许多美国专利讲述了这样的结合物的制备，包括但不限于美国专利Nos.4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5，112，963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，每个专利在此引为参考。沃森-克里克相互作用是核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的沃森-克里克面上的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的沃森-克里克面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的C2、N1和C6位置，以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物的C2、N3、C4位置。Hoogsteen相互作用是发生在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上的相互作用，该面暴露在双链DNA的大沟中。Hoogsteen面包括嘌呤核苷酸的N7位置和C6位置上的反应性基团(NH2或0)。i.核酸序列本文提供了各种各样的序列，这些序列一部分可以从www.pubmed.gov的Genbank获得。本
技术领域：
的专业人员了解如何分辨序列的差异和不同，以及如何调整与特定序列相关的组成和方法以适应其它相关的序列。针对给出了本文公开信息以及本
技术领域：
已知的任何序列，可以设计引物和/或探针。ii.杂交/选择性杂交术语杂交一般是指至少两个核酸分子、例如引物或探针与基因之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用是指在两种核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间、以核苷酸特异性方式发生的相互作用。例如，G与C的相互作用或A与T的相互作用是序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用发生在核苷酸的沃森-克里克面或Hoogsteen面上。两个核酸的杂交受到许多本
技术领域：
专业人员已知的条件和参数的影响。例如，盐浓度、pH和反应的温度都影响两种核酸分子是否将杂交。两个核酸分子之间选择性杂交的参数对于本
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的专业人员来说是熟知的。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件可以被定义为严紧的杂交条件。例如，杂交的严紧性受到杂交和清洗步骤中任何一个或二者的温度和盐浓度的控制。例如，获得选择性杂交的杂交条件可以包括在高离子强度溶液中(6XSSC或6XSSPE)、在比Tm(一半的分子与它们的杂交配偶体解离时的解链温度)低大约12-25°C的温度下杂交，然后在选择的温度和盐浓度的组合下进行清洗，使得清洗温度比Tm低大约5°C到大约20°C。温度和盐条件可以容易地在预实验中通过经验确定，在预实验中固定在滤膜上的参比DNA样品与标记的目标核酸杂交，然后在不同严紧性的条件下清洗。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交来说，杂交温度一般较高。可以使用上面描述的或按照本
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已知的条件来获得严紧性。(Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，《分子克隆实验指南》(第二版)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1989;Kunkel等，MethodsEnzymol.1987:154:367，1987，在此至少以其与核酸杂交有关的材料引为参考)。DNA:DNA杂交的优选严紧杂交条件可以是在6XSSC或6XSSPE中在大约68。C(在水性溶液中)杂交，然后在大约68。C下清洗。如果需要，杂交和清洗的严紧性可以根据所需的互补程度的降低而相应降低，此外，还取决于在其中搜索可变性的任何区域中G-C或A-T的丰度。同样地，如果需要，杂交和清洗的严紧性也可根据所需同源性的增加而相应增加，此外，还取决于其中需要高同源性的任何区域中G-C或A-T的丰度，这都是本
技术领域：
中已知的。确定选择性杂交的另一种方法是检査一种核酸与另一种核酸结合的量(百分率)。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件将是受限核酸的至少大约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%与未受限核酸结合时的条件。通常，未受限的引物将过量例如10或100或1000倍。这种类型的分析可以在受限的和未受限的引物都比它们的Kd低例如10倍或100倍或1000倍、或只有一种核酸分子是10倍或100倍或1000倍、或一种或两种核酸分子均高于它们的Kd的条件下进行。确定选择性杂交的另一种方法是通过在需要杂交来促进所需的酶法操作的条件下，检查实现酶法操作的引物的百分率。例如，在某些实施方案中，选择性杂交条件是在促进酶法操作的条件下，至少大约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物被酶法操作时的条件，例如，如果酶法操作是DNA延伸，那么选择性杂交条件将是至少大约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%的引物分子被延伸时的条件。优选的条件还包括制造商建议的条件、或本
技术领域：
中指定为适合酶执行操作的条件。正如同源性一样，要理解，本文中公开了各种用于确定两种核酸分子之间的杂交水平的方法。应该理解，这些方法和条件在两种核酸分子之间可提供不同的杂交百分率，但是除非另有指明，满足任何方法的参数就足够了。例如，如果需要80%的杂交，只要杂交发生在这些方法中任何一个要求的参数中，就被认为在本文中公开了。应该理解，本
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的专业人员了解，如果组成或方法合起来或单独地满足了这些用于确定杂交的标准中的任何一个，它就是本文公开的组成或方法。iii.功能性核酸功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，例如结合靶分子或催化特定的反应。功能性核酸分子被分成下面的类别，这并不意味着限制。例如，功能性核酸包括反义分子、适配体、核酶、三链体形成分子、RNAi和外部引导序列。功能性核酸分子可以用作靶分子具有的特定活性的影响剂、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可以不依赖于任何其它的分子而具有新的活性。功能性核酸分子能够与任何大分子相互作用，例如DNA、RNA、多肽或烃链。因此，功能性核酸可以与本文公开的任何导向信号或其受体的mRNA、基因组DNA或多肽相互作用。功能性核酸通常被设计成基于耙分子与功能性核酸分子之间的序列同源性而与其它核酸相互作用。在其它情况下，功能性核酸分子和靶分子之间的特异性识别不是基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。反义分子被设计成通过正规或非正规的碱基配对与耙核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用被设计成通过例如RNAseH介导的RNA-DNA杂交体的降解来促进靶分子的降解。或者，反义分子被设计成破坏正常情况下将在靶分子上发生的加工功能，例如转录或复制。反义分子可以根据靶分子的序列来设计。关于通过发现靶分子的最易接近区域来优化反义功效，存在着众多的方法。示例性的方法是体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选，反义分子与靶分子结合的解离常数(kd)小于或等于10—6、10—8、10-1()或10—12。有助于设计和使用反义分子的方法和技术的代表性样本可以在下面非限制性列举的美国专利中找到5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5，856，103、5,919,772、5,955,590、5,9卯,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6,017,898、6,018,042、6，025,198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319禾口6,057,437。适配体(aptamer)是优选以特定方式与耙分子相互作用的分子。典型的适配体是长度为15-50碱基的小核酸，折叠成确定的二级和三级结构，例如茎环结构或G-四集体。适配体可以结合小分子例如ATP(美国专利5,631,146)和茶碱(美国专利5,580,737)，以及大分子例如反转录酶1(美国专利5,786,462)和凝血酶(美国专利5,543,293)。适配体可以与靶分子非常紧密地结合，具有小于10'12的kd。优选适配体与靶分子结合的kd小于10—6、10—8、10—1()或10'12。适配体可以以非常高度的特异性与靶分子结合。例如，己经分离到这样的适配体，其对于靶分子和只在分子的单个位置上有差别的另一种分子之间的结合亲和性上，差异超过10000倍(美国专利5,543,293)。优选，适配体与靶分子的kd比与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10,000或IOO，OOO倍。优选当对例如多肽进行比较时，背景分子是不同的多肽。如何制造和使用适配体以结合各种不同的靶分子的代表性例子，可以在下面非限制性列举的美国专利中找到5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5,795,721、5,846,713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6，001，988、6，011，020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776禾P6,051，698。核酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。因此，核酶是催化性核酸。优选，核酶催化分子间反应。基于在天然系统中发现的核酶，有许多不同类型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶类型的反应，例如锤头核酶(例如但不限于下面的美国专利5,334,711、5,436,330、5,616,466、5，633，133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5,861,288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5,989,908、5,998,193、5，998，203，Ludwig和Sproat的WO9858058，Ludwig禾卩Sproat的WO9858057，以及Ludwig禾卩Sproat的WO9718312)，发夹核酶(例如但不限于下列美国专利5,631,115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)，以及四膜虫核酶(例如但不限于下列美国专利5,595,873和5，652，107)。还存在许多不是在天然系统中发现的核酶，但其己经被工程化以重新催化特定的反应(例如但不限于下列美国专利5,580,967、5,688,670、5,807,718禾口5,910,408)。优选的核酶裂解RNA或DNA底物，但更优选裂解RNA底物。核酶通常通过识别并结合靶底物、随后进行裂解，来裂解核酸底物。这种识别往往主要是基于正规或非正规的碱基对相互作用。这种性质使得核酶成为靶特异性裂解核酸的特别好的候选物，因为靶底物的识别是基于靶底物的序列。如何制造和使用核酶以催化各种不同反应的代表性例子可以在下面非限制性列举的美国专利中找到5,646,042、5,693,535、5,731,295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906禾Q6,017,756。形成三链体的功能性核酸分子是能够与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，形成了被称为三链体的结构，其中三条DNA链依赖于沃森-克里克和Hoogsteen碱基配对形成复合体。三链体分子是优选的，因为它们能够以高亲和性和特异性与靶区域结合。优选三链体形成分子与靶分子结合的kd小于l(T6、l(T8、10—1()或10—12。如何制造和使用三链体形成分子以结合各种不同靶分子的代表性例子，可以在下面非限制性列举的美国专利中找到5,176,996、5,645,985、5,650,316、5,683,874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。外部引导序列(EGSs)是与靶核酸分子结合、形成复合体的分子，该复合体被RNaseP识别，该酶裂解靶分子。EGSs能够被设计成特异性耙向选择的RNA分子。RNAseP在细胞内帮助加工转运RNA(tRNA)。通过使用EGS导致靶RNA:EGS复合体模拟天然tRNA底物，能够召集细菌RNAseP，来事实上裂解任何RNA序列。(Yale的WO92/03566，以及Forster和Altaian,Science238:407-409(19卯))。同样地，可以利用真核EGS/RNAseP指导的RNA裂解，来裂解真核细胞内的所需靶。(Yuan等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA89:8006-8010(1992);Yale的WO93/22434;Yale的WO95/24489;Yuan和Altaian,EMBOJ14:159-168(1995);以及Carrara等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)92:2627-2631(1995))。如何制造和使用EGS分子以促进各种不同耙分子的裂解的代表性例子可以在下面非限制性列举的美国专利中找到5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。通过RNA干扰(RNAi)也可以以高度特异性的方式有效地使基因表达沉默。这种沉默最初是随着加入双链RNA(dsRNA)而观察到的(Fire，A.等，(1998)Nature,391，806811)(Napoli，C等，(1990)PlantCell2,279289)(Hannon，GJ.(2002)Nature,418,244251)。一旦dsRNA进入细胞后，它被类RNaseIII的酶Dicer裂解成双链小干扰RNAs(siRNA)，它们的长度为21-23个核苷酸，在3'末端含有2个核苷酸的突出端(Elbashir,S.M.等,(2001)GenesDev.,15:188-200)(Bernstein,E.等，(2001)Nature,409,363366)(Hammond,S.M.等，(2000)Nature,404:293-296)。在ATP依赖性步骤中，siRNAs整合到多亚基蛋白复合体中，该复合体通常被称为RNAi诱导的沉默复合体(RISC)，其将siRNAs导向革巴RNA序列(Nykanen,A.等，(2001)Cell,107:309321)。siRNA双链体在某些点解开，并且看来反义链保持与RISC结合，并通过内切和外切核酸酶的组合指导互补mRNA序列的降解(Martinez,J.等，(2002)Cell,110:563-574)。但是，siRNA的作用或siRNA或其应用不限于任何类型的机制。还公开了可用于RNAi或RNA干扰的核酸。据认为，RNAi涉及RNA干扰(RNAi)的两步机制起始步骤和效应剂步骤。例如，在第一个步骤中，输入的双链(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，例如21-23个核苷酸的"引导序列"。RNA复制似乎能够发生在整个动物中。然后，通常，引导RNAs可以整合到能够降解RNA的蛋白RNA复合体——核酸酶复合体中，该复合体已经被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)。在第二个效应剂步骤中，该RISC复合体的作用是破坏由引导RNA通过碱基配对相互作用识别的mRNAs。RNAi包括通过任何方式将双链RNA导入到细胞中，从而触发了引起耙RNA降解的事件。RNAi是一种转录后基因沉默的形式。公开了能够在RNAi中起作用的RNA发夹。对于制造和使用RNAi分子的描述，参见例如Hammond等，NatureRevGen2:110-119(2001);Sharp,GenesDev15:485-490(2001);Waterhouse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(23):13959-13964(1998)，它们均在此以其全文和至少与RNAi分子的投送和制造有关的材料引为参考。RNAi己经被显示在多种细胞包括哺乳动物细胞中发挥作用。为了在哺乳动物细胞中发挥作用，优选将要在RISC复合体内用作靶向序列的RNA分子较短。例如，长度小于或等于50或40或30或29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。这些RNA分子在相对于将被裂解的靶RNA的3'或5'末端上也可以具有突出端。这些突出端的长度可以是至少或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个核苷酸。RNAi在哺乳动物干细胞例如小鼠ES细胞中起作用。短干扰RNA(siRNA)是能够诱导序列特异性转录后基因沉默、从而降低或甚至抑制基因表达的双链RNA。在一个例子中，在siRNA和耙RNA二者之间序列相同的区域中，siRNA触发了同源RNA分子、例如mRNAs的特异性降解。例如，WO02/44321公开了当与3'突出末端碱基配对时，siRNAs能够序列特异性降解靶mRNAs，该专利在此以其制造这些siRNAs的方法引为参考。在哺乳动物细胞中，序列特异性基因沉默可以使用模拟酶切丁酶(dicer)产生的siRNAs的合成、短双链RNAs来实现(Elbashir,S.M.等，(2001)Nature,411:494-498)(Ui-Tei，K.等，(2000)FEBSLett479:79-82)。siRNA可以是化学或体外合成的，或者可以是短双链发夹状RNAs(shRNAs)在细胞内被加工成siRNAs的结果。合成的siRNAs—般使用算法和常规的DNA/RNA合成仪来设计。供应商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、GlenResearch(Sterling,Virginia)、MWBBiotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colorado)禾卩Qiagen(Vento,TheNetherlands)。siRNA也可以在体外使用试剂盒来合成，例如Ambion的SILENCERsiRNA构建试剂盒。本文公开了根据本文公开的炎性介质的序列，按照上面的描述设计的任何siRNA。从载体生产siRNA更常见是通过shRNA的转录来进行的。用于生产含有shRNA的载体的试剂盒是现成的，例如Imgenex的GeneSuppressor构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-iT可诱导RNAi质粒和慢病毒载体。本文公开了根据本文公开的炎性介质的序列，按照上面的描述设计的任何shRNA。iv.载体转化载体可以是用于将基因投送到细胞中的任何核苷酸构建体(例如质粒)，或作为投送基因的总策略的一部分，例如作为重组反转录病毒或腺病毒的一部分(Ram等，CancerRes.53:83-88,(1993))。本文中使用的质粒或病毒载体，是将公开的核酸、例如编码scFvs的核酸不受降解地运输到细胞中的试剂，并包含启动子，所述启动子在它被投送进去的细胞中产生基因表达。病毒载体是例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养性病毒、辛德毕斯病毒(Sindbis)和其它RNA病毒，包括具有HIV骨架的这些病毒。还优选的是与这些病毒具有共同的性质、使得它们适合于用作载体的任何病毒家族。反转录病毒包括莫洛尼鼠白血病病毒MMLV，以及表现出MMLV作为载体的所需性质的反转录病毒。反转录病毒载体能够比其它病毒载体携带更大的遗传载荷，即转入基因或标记基因，因此是普遍使用的载体。但是，它们在非增殖性细胞中不是同样有用。腺病毒载体相对稳定并容易操作，具有高的滴度，和能够以气溶胶制剂投送，并可以感染非分裂性细胞。痘病毒载体很大，具有几个用于插入基因的基因座，它们是热稳定的，能够在室温下储存。优选的实施方案是已经被工程化、从而抑制了由病毒抗原引发的宿主生物体免疫应答的病毒载体。优选的这种类型载体将携带白介素8或10的编码区。病毒载体可以具有比将基因导入细胞的化学或物理方法更高的处理能力(导入基因的能力)。通常，病毒载体包含非结构早期基因、结构晚期基因、RNA聚合酶III转录本、复制和包壳所必需的反向末端重复序列，以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当被工程化成载体时，病毒通常被除去了一个或多个早期基因，并将基因或基因/启动子盒插入到病毒基因组中代替除去的病毒DNA。这种类型的构建体可以携带多达大约8kb的外源遗传物质。除去的早期基因的必要功能通常由细胞系提供，所述细胞系已经被工程化以反式表达早期基因的基因产物。v.反转录病毒载体反转录病毒是属于反转录病毒科的动物病毒，包括任何类型、亚科、属或趋向性。反转录病毒载体总体被Verma，I.M.描述在《微生物学-1985》中的"用于基因转化的反转录病毒载体"中(Retroviralvectorsforgenetransfer.InMicrobiology-1985，AmericanSocietyforMicrobiology,pp.229-232,Washington,(1985))，在此引为参考。使用反转录病毒进行基因治疗的方法的例子描述在美国专利Nos.4,868,116和4,980,286，PCT申i青WO90/02806和WO89/07136，以及Mulligan,(Science260:926-932(1993))中，其讲述的内容在此引为参考。反转录病毒基本上是其中包装有核酸货物的包裹。伴随核酸货物携带有包装信号，它确保被复制的子代分子将有效包装到包装外壳中。除了包装信号，还需要许多顺式分子用于复制，并包装复制的病毒。通常，反转录病毒基因组含有gag、pol和env基因，它们参与了蛋白衣壳的制造。一般来说，正是gag、pol和env基因被将要被转移到靶细胞中的外源DNA代替。反转录病毒一般含有用于整合到包装衣壳中的包装信号，为gag转录单元的启动提供信号的序列，反转录所必需的元件包括与反转录的tRNA引物结合的引物结合位点，在DNA合成过程中指导RNA链切换的末端重复序列，用作DNA合成中第二条链合成的引发位点的富嘌呤5'到3'LTR序列，以及靠近LTRs末端、能够使反转录病毒的DNA状态插入片段插入到宿主基因组中的特定序列。除去gag、pol和env基因允许大约8kb的外源序列插入到病毒基因组中，变成被反转录，并经复制被包装到新的反转录病毒粒子中。根据每个转录本的大小，核酸的量足够用于投送一个到多个基因。优选，在插入片段中，与其它基因一起包含有正或负的选择性标记。因为在大多数反转录病毒载体中复制机制和包装蛋白已经被除去(gag、pol和env)，载体一般通过将它们放置在包装细胞系中来产生。包装细胞系是已经用含有复制和包装机制、但缺少任何包装信号的反转录病毒转染或转化的细胞系。当携带有选择的DNA的载体被转染到这些细胞系中时，通过辅助细胞顺式提供的机制，含有目标基因的载体被复制并包装到新的反转录病毒粒子中。所述机制的基因组不被包装，因为它们缺少必要的信号。vi.腺病毒载体复制缺陷型腺病毒的构建已有描述(Berkner等，J.Virology61:1213-1220(1987);Massie等，Mol.Cell.Biol.6:2872-2883(1986);Haj-Ahmad等，J.Virology57:267-274(1986);Davidson等，J.Virology61:1226-1239(1987);Zhang"Generationandidentificationofrecombinantadenovirusbyliposome-mediatedtransfectionandPCRanalysis"(通过脂质体介导的转染和PCR分析产生和鉴定重组腺病毒)，BioTechniques15:868-872(1993))。使用这些病毒作为载体的好处是，它们能够扩散到其它细胞类型的程度受到限制，因为它们可以在最初被感染的细胞中复制，但是不能形成新的感染性病毒粒子。已经显示，重组腺病毒在直接地体内投送到气管上皮、肝细胞、血管内皮、CNS实质和许多其它组织位点后，获得了高效率的基因转移(Morsy,J.Clin.Invest.92:1580-1586(1993);Kirshenbaum,J.Clin.Invest.92:381-387(1993);Roessler，J.Clin.Invest.92:1085-1092(1993);Moullier，NatureGenetics4:154-159(1993);LaSalle，Science259:988-990(1993);Gomez-Foix，J.Biol.Chem.267:25129-25134(1992);Rich,HumanGeneTherapy4:461-476(1993);Zabner，NatureGenetics6:75-83(1994);Guzman,CirculationResearch73:1201-1207(1993);Bout,HumanGeneTherapy5:3-10(1994);Zabner,Cell75:207-216(1993);Caillaud，Eur.J.Neuroscience5:1287-1291(1993);和Ragot,J.Gen.Virology74:501-507(1993))。重组腺病毒通过与特定细胞表面受体结合，然后病毒以与野生型或复制缺陷型腺病毒相同的方式，通过受体介导的胞吞作用被内化，从而实现了基因转导(Chardo麵t和Dales,Virology40:462-477(1970);Brown禾口Burlingham:J.Virology12:386-396(1973);Svensson禾口Persson,J.Virology55:442-449(1985);Seth等，J.Virol.51:650-655(1984);Seth等，Mol.Cell.Biol.4:1528-1533(1984);Varga等，J.Virology65:6061-6070(1991);Wickham等，Cell73:309-319(1993))。病毒载体可以是基于腺病毒的载体，其中E1基因已经被除去，这些病毒粒子在细胞系例如人类293细胞系中产生。在另一个优选实施方案中，E1和E3基因都从腺病毒基因组中被除去。vii.腺相关病毒载体另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是优选的载体，因为它能够感染许多细胞类型，并且对于人类没有致病性。AAV类型的载体可以运输大约4到5kb,并且已知野生型AAV稳定地插入到19号染色体中。腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的成员，该病毒科的特征为单链线性DNA基因组，以及二十面体形状的小衣壳，直径测量为大约20nm。AAV首先被描述为培养一种猿猴腺病毒——猿猴病毒15的组织培养物的污染物，并被发现依赖于腺病毒才能获得可测量的复制。这导致了它的名称，腺相关病毒，以及它被分类在依赖病毒(Dependovirus)属中(综述在Hoggan，M.D.ProgMedVirol12(1970)211-39中)。AAV是腺病毒样品的常见污染物，并已经从人类病毒样品(AAV2、AAV3、AAV5)、猿猴病毒15感染的细胞样品(AAV1、AAV4)、以及禽(AAAV)(Bossis,I.和Chiorini,J.A.JVirol77(2003)6799-810)、牛、犬和羊腺病毒的原种与实验室腺病毒5型的原种(AAV6)中分离到。从恒河猴的心脏组织通过PCR扩增了跨越AAV7和AAV8的整个rep-capORFs的DNA(Gao,G.P.等，ProcNatlAcadSciUSA99(2002)11854-9)。除了AAVs1和6之夕卜，所有克隆到的AAV分离株表现出血清学上的差异。已经克隆了9个分离株，并从每个分离到的病毒产生了重组病毒原种。AAV2是表征得最好的腺相关病毒，并将根据AAV原型进行讨论。AAV2的基因组由4780个核苷酸的线性单链DNA构成。DNA的两极以相等的效率被AAV包裹。AAV2基因组含有2个开放阅读框架(ORF)，名为rep和cap。repORF编码非结构性蛋白，该蛋白对于病毒DNA复制、包装和AAV整合来说是必需的。capORF编码病毒衣壳蛋白。repORF从位于图单位P5和P19的启动子转录。rep转录本在接近repORF的3'末端含有内含子，能够被更替剪接。因此，repORF被表达为4个部分重叠的蛋白，按照它们的分子量被称为Rep78、68、52和40。c叩ORF从位于P40的单一启动子表达。通过更替的剪接和使用更替的ACG起始密码子，cap被表达成衣壳蛋白VP1-3，它们的大小从65-86kDa。VP3是最丰富的衣壳蛋白，占AAV2衣壳的80。/。。所有的病毒转录本在图单位96的polyA信号处终止。在生产型AAV2感染期间，从p5启动子开始、编码Rep78的未剪接mRNAs是第一个可检测到的病毒转录本。在感染过程中，从P5、P19和P40的表达分别增加到1:3:18。剪接的转录本的水平对于P5、P19产物来说增加到50%，对于P40表达的RNA来说增加到90%(Mouw，M.B.禾口Pintel,DJ.JVirol74(2000)9878-88)。AAV2基因组在两侧以145个核苷酸(nt)的反向末端重复序列(ITRs)结束。ITR的125个nt构成了回文序列，其中含有2个各为21个nt的内部回文序列。ITR可以自身折回以产生仅有7个未配对碱基的T-型发夹。ITR的茎含有Rep结合位点(RBS)，以及被Rep进行位点和链特异性裂解的序列——末端解离位点(TRS)。ITR对于AAV2基因组的复制、整合是必需的，并含有包装信号。单链AAV2基因组被包装到直径为大约20-25nm的无外膜的二十面体形状的衣壳中。病毒粒子由26。/。DNA和74%蛋白构成，密度为1.41g/cm3。AAV2粒子极其稳定，能够耐受在60°C加热1小时、极端的pH和用有机溶剂抽提。Rep蛋白参与了AAV2复制的几乎每个步骤，包括AAV2基因组复制、整合和包装。Rep78和Rep68具有ATPase、3'-5'解旋酶、连接酶和切割活性，并与DNA特异性结合。Rep52和Rep40表现出参与包裹过程，并编码ATPase和3'-5'解旋酶活性。突变分析表明了Rep78的结构域结构。N-末端的225个氨基酸参与DNA结合、DNA切割和连接。Rep78和Rep68以相似的效率识别ITR和ITR的线性截短形式中的GCTC重复基序(Chiorini，J,A.等，JVirol68(1994)7448-57)。Rep78和Rep68具有序列和链特异性的内切核酸酶活性，在末端解离位点(TRS)处裂解ITR)。Rep的内切核酸酶活性依赖于核苷三磷酸的水解和金属阳离子的存在。Rep78和68也能够以不依赖NTP的方式结合和裂解单链DNA。此外，Rep78催化源于AAV2复制起点的单链DNA底物一一即含有rep结合和末端解离元件的序列一一的重新连接。AAV2Rep78的中心区域，代表了Rep52和Rep40的N-末端，含有ATPase和3'-5'解旋酶活性以及核定位信号。解旋酶活性解开DNA-DNA禾PDNA-RNA双链体，但是不能解开RNA-RNA。ATPase活性是组成性的，不依赖于DNA底物。Rep78的C-末端含有可能的锌指结构域，能够通过假底物抑制作用来抑制PKA及其同源物PRKX的细胞丝氨酸/苏氨酸激酶活性。Rep68从剪接mRNA的翻译而产生，所述剪接mRNA编码Rep78的N-末端529个氨基酸，其与Rep68独有的7个氨基酸(aa)融合，Rep68不抑制PKA或PRKX。除了这些生化活性之外，Rep可通过蛋白-蛋白相互作用影响细胞内条件。Rep78与各种不同的细胞蛋白结合，包括转录因子如SP-1、高迁移率族非组蛋白的蛋白1(HMG-1)和抑癌蛋白p53。Rep的过表达导致多效性作用。Rep78破坏细胞周期进程，抑制细胞和病毒癌基因的转化。在易感细胞系中，Rep的过表达导致凋亡和细胞死亡。几种Rep78的活性对细胞毒性有贡献，包括其组成性ATPase活性，干扰细胞基因表达和蛋白相互作用。AAV感染的第一步是与细胞表面结合。AAV2的受体和共同受体包括硫酸乙酰肝素蛋白多糖、成纤维细胞生长因子受体-1和avp5整合素，但是对于AAV5的结合和转导来说需要N-连接的2,3-连接的唾液酸(Walters,R.W.等，JBiolChem276(2001)20610-6)。在HeLa细胞中，荧光标记的AAV2粒子显示出在网格蛋白包被的小窝中通过受体介导的胞吞作用进入细胞。在感染后IO分钟内，超过60%被结合的病毒被内化。观察到标记的AAV粒子已经从内体逃逸，通过细胞质运往细胞核，并在可能通过核孔复合体(NPC)进入细胞核之前，在细胞核周围聚集。已经在细胞核中检测到了AAV2粒子，表明脱壳发生在核内(Bartlett等，JVirol74(2000)2777-85;Sanlioglu等，JVirol74(2000)9184-96)。AAV5在HeLa细胞中主要通过网格蛋白包被的小泡被内化，但是也有少部分在未包被的小窝中。AAV粒子也在细胞间通过高尔基体运输(Bantel-Schaal,U.等，JVirol76(2002)2340-9)。表明在进入细胞核之前，发生了至少一部分AAV5的脱壳，因为在核中不能检测到完整的AAV5粒子(Bantel-Schaal等，2002)。脱壳后，单链基因组或者通过前导链合成、或者通过相反极性的输入DNA退火，被转变成双链体DNA。AAV的复制发生在细胞核内。在与辅助病毒例如腺病毒、单纯性疱疹病毒或细胞肥大病毒共感染期间，AAV能够进行有效的生产性复制。由腺病毒提供的辅助病毒功能已经被很详细研究。在组成性表达腺病毒E1A和E1B基因的人类胚胎肾细胞293细胞中，发现了足以允许重组AAV复制的E2A、E4和VA的早期腺病毒基因产物。Allen等报道了在仅仅用E4orf6表达质粒转染的293细胞中，有效生产rAAV是可能的(Alien,J.M.等，MolTher1(2000)88-95)。E1A刺激了S期的进入，并通过与pRB家族的蛋白相互作用导致E2F的释放，来失活Gl/S边界的pRB限制点，从而诱导了期外DNA合成(综述在Ben-Israel,H.和Kleinberger,T.FrontBiosci7(2002)Dl369-95中)。这导致诱导或活化了参与核苷酸合成和DNA复制的酶。因为期外DNA合成是强凋亡信号，因此需要抗凋亡功能。ElB-19k是Bcl-2的同系物，ElB-55k是p53的拮抗剂。这两种蛋白都具有抗凋亡功能。E4orf6与ElB-55k形成复合体，导致p53的降解。它也被报道引起了S期停止(Ben-Israel和Kleinberger,2002)。E2A编码单链DNA结合蛋白，这似乎对于DNA复制来说不是必需的，但是影响基因表达(Chang和Shenk，JVirol64(1990)2103-9)。VA转录单元影响AAV2RNA的稳定性和翻译(Janik等，Virology168(1989)320-9)。E1A对于AAV2基因表达具有更直接的效应。细胞转录因子YY-1结合并抑制病毒P5启动子。E1A解除了这种转录阻断。还没有发现晚期Ad基因产物对于AAV2的复制是必需的。辅助病毒的主要功能似乎是产生一种细胞环境，其具有活跃的DNA复制机制和阻断的促凋亡功能，以允许高水平的AAV复制，而不是直接参与AAV复制。viii.大有效载荷的病毒载体使用大的人类疱疹病毒进行的分子遗传学实验提供了一种方法，通过该方法，大的异源DNA片段可以被克隆、繁殖和建立在允许用疱疹病毒感染的细胞中(Sun等，Naturegenetics8:33-41，1994;Cotter禾口Robertson,.CurrOpinMolTher5:633-644，1999)。这些大的DNA病毒(单纯性疱疹病毒(HSV)和Epstein-Barr病毒(EBV))，具有将"50kb的人类异源DNA片段投送到特定细胞中的潜力。EBV重组体能够将大段DNA维持在被感染的B细胞中作为附加体DNA。携带有高达330kb的人类基因组插入片段的单个克隆，表现出遗传稳定性。这些附加体的维持需要特定的EBV核蛋白，EBNA1，其是在用EBV感染的过程中组成性表达的。此外，这些载体可用于转染，其中大量的蛋白可以在体外短时产生。疱疹病毒的扩增子系统也被用于包装>220kb的DNA片段，并用于感染能够将DNA稳定维持为附加体的细胞。其它有用的系统包括，例如，复制型和宿主限制性的非复制型痘苗病毒载体。ix.不基于核酸的系统公开的组合物可以以各种方式投送到靶细胞。例如，组合物可以通过电穿孔、或通过脂转染、或通过磷酸钙沉淀来投送。投送机制的选择部分取决于靶细胞类型以及投送是例如发生在体内还是体外。因此，例如，组合物可以包含脂类，例如脂质体，例如阳离子脂质体(例如DOTMA、DOPE、DC-胆固醇)或阴离子脂质体。如果需要，脂质体还可以包含蛋白，以便于靶向特定的细胞。施用含有化合物和阳离子脂质体的组合物，可以施用于流入靶器官的血液，或吸入到呼吸道中以到达呼吸道中的耙细胞。对于脂质体来说，参见例如Brigham等，Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.1:95-100(1989);Feigner等，Proc.Natl.Acad.SciUSA84:7413-7417(1987);美国专利No.4，897,355。此外，化合物可以作为能够耙向特定细胞类型例如巨噬细胞的微胶囊的成分来施用，或其中微胶囊中化合物的扩散或化合物的投送被设计成特定的速度或剂量。在包括将外源DNA施用和摄取到对象细胞中的上述方法(即基因转导或转染)中，将组合物投送到细胞可以通过各种不同的机制。例如，投送可以通过脂质体，使用可商购的脂质体制备物例如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL,Inc.,Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden,Germany)和TRANSFECTAM(PromegaBiotec,Inc.,Madison,WI)，以及其它按照本
技术领域：
的标准程序开发的脂质体。此外，公开的核酸或载体可以通过电穿孔投送到体内，该技术可以从Genetronics,Inc.(SanDiego,CA)获得，以及通过利用SONOPORATION机器(ImaRxPharmaceuticalCorp.,Tucson,AZ)。材料可以在溶液、悬浮液中(例如掺入到微粒、脂质体或细胞中)。它们可以通过抗体、受体或受体配体耙向特定的细胞类型。下面的参考文献是使用该技术将特定蛋白靶向肿瘤组织的例子(Senter等，BioconjugateChem.,2:447-451,(1991);Bagshawe,K.D.，Br.J.Cancer,60:275-281,(1989);Bagshawe等，Br.J.Cancer,58:700-703，(1988);Senter等，BioconjugateChem.,4:3-9，(1993);Battelli，等，CancerImmunol.Immunother.，35:421-425，(1992);Pietersz禾卩McKenzie,Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992);以及Roffler等，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。这些技术可用于各种其它的特定细胞类型。介质例如"stealth"和其它抗体偶联的脂质体(包括靶向结肠癌的脂类介导药物)，受体介导的通过细胞特异性配体的DNA定向，淋巴细胞指导的肿瘤定向，以及高度特异性的治疗性反转录病毒在体内耙向鼠神经胶质瘤细胞。下面的参考文献是使用该技术将特定蛋白革巴向肿瘤组织的例子(Hughes等，CancerResearch,49:6214-6220，(1989);以及Litzinger禾口Huang，BiochimicaetBiophysicaActa,1104:179-187,(1992))。一般来说，受体组成性地或配体诱导地参与胞吞途径。网格蛋白包被的小窝中的这些受体簇，通过网格蛋白包被的小泡进入细胞，通过受体在其中被分类的酸化内体，然后或者重新循环到细胞表面成为细胞内储存，或者在溶酶体中降解。内化途径起到各种功能，例如营养摄取、除去活化的蛋白、清除大分子、病毒和毒素的机会进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节。许多受体参加一种以上的细胞内途径，这依赖于细胞类型、受体浓度、配体的类型、配体价以及配体的浓度。受体介导的胞吞作用的分子和细胞机理已经被综述(Brown和Greene,DNAandCellBiology10:6,399-409(簡))。被投送到细胞并整合在宿主细胞基因组中的核酸，通常含有整合序列。这些序列往往是病毒相关的序列，特别是在使用基于病毒的系统时。这些病毒整合系统，也可以整合到将要使用不基于核酸的投送系统例如脂质体投送的核酸中，以便包含在投送系统中的核酸可以整合到宿主基因组中。其它用于整合到宿主基因组中的通用技术包括，例如，被设计用于促进与宿主基因组的同源重组的系统。通常，这些系统依赖于将要表达的核酸侧翼的序列与宿主细胞基因组中的耙序列具有足够的同源性，使得载体核酸和靶核酸之间的重组得以发生，从而导致被投送的核酸整合到宿主基因组中。这些促进同源重组所必需的系统和方法对于本
技术领域：
的专业人员来说是已知的。x.体内/离体(ExVivo)如上所述，组合物可以在可药用的载体中施用，并可以通过本
技术领域：
众所周知的各种机制体内和/或离体投送到对象的细胞中(例如摄入裸露的DNA，脂质体融合，通过基因枪肌肉内注射DNA，胞吞作用等)。如果使用离体的方法，可以按照本
技术领域：
熟知的标准方案将细胞或组织取出并维持在体外。通过任何基因转移机制、例如磷酸钙介导的基因投送、电穿孔、微注射或蛋白脂质体，可以将组合物导入到细胞中。然后可以将转导的细胞按照细胞或组织类型的标准方法进行输注(例如在可药用载体中)，或等位移植回对象。用于将各种细胞移植或输注到对象中的标准方法是已知的。xi.表达系统被投送到细胞中的核酸通常含有表达控制系统。例如，插入到病毒和反转录病毒系统中的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。启动子一般是在位于转录起始位点相对固定的位置上发挥作用的DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子发生基本相互作用所需的核心元件，并且可以含有上游元件和响应元件。a.病毒启动子和增强子控制载体在哺乳动物宿主细胞中转录的优选启动子可以从各种来源获得，例如病毒的基因组，例如多形瘤病毒，猿猴病毒40(SV40)，腺病毒、反转录病毒，乙肝病毒和最优选的巨细胞病毒，或来自异源哺乳动物的启动子，例如(3-肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40的限制性片段方便易得，所述片段还含有SV40的病毒复制原点(Fiers等，Nature,273:113(1978))。人类巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIIIE限制性片段方便易得(Greenway,P丄等，Gene18:355-360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本文中。增强子一般是指不是在转录起始位点的固定距离发挥功能、而是可以在转录单位的5'(Laimins,L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3'方向(Lusky，M丄.等，Mol.CellBio.3:1108(1983))的DNA序列。此外，增强子可以在内含子内部(Banerji，J丄.等，Cell33:729(1983))，以及在编码序列本身中(Osborne,T.F.等，Mol.CellBio.4:1293(1984))。它们的长度通常在10到300bp之间，它们以顺式发挥作用。增强子的作用是增强从邻近的启动子的转录。增强子通常也含有介导转录调控的响应元件。启动子也可以含有介导转录调控的响应元件。增强子通常决定基因表达的调控。尽管目前已经知道许多来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列，但人们通常将使用来自真核细胞病毒的增强子进行通用表达。优选的例子是在复制原点晚期侧(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制原点晚期侧的多形瘤病毒增强子、以及腺病毒增强子。启动子和/或增强子可以通过光或触发它们功能的特定化学事件来特异性激活。系统可以用试剂例如四环素和地塞米松进行调控。还存在通过暴露于辐照例如Y辐照、或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达的途经。在某些实施方案中，启动子和/或增强子区可以用作组成性启动子和/或增强子，以最大化将被转录的转录单元区域的表达。在某些构建体中，启动子和/或增强子区在所有真核细胞类型中都是有活性的，即使它仅仅在特定细胞类型中的特定时间下表达。这种类型的优选启动子是CMV启动子(650个碱基)。其它优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和反转录病毒载体LTR。已经显示，所有特异性调控元件均能够被克隆并用于构建表达载体，以在特定细胞类型例如黑素瘤细胞中进行选择性表达。神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已经被用于在神经胶质来源的细胞中选择性表达基因。在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类或有核细胞)中使用的表达载体也可以含有终止可影响mRNA表达的转录所必需的序列。这些区域被转录成编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多聚腺苷化区段。3'非翻译区也包含转录终止位点。优选，转录单元也含有多聚腺苷化区域。该区域的一个好处是它增加了被转录的单元将会像mRNA—样被加工和运输的可能性。多聚腺苷化信号在表达构建体中的鉴定和使用已经建立起来。优选在转基因构建体中使用同源多聚腺苷化信号。在某些转录单元中，多聚腺苷化区域源于SV40早期多聚腺苷化信号，并由大约400个碱基组成。还优选被转录的单位含有单独或与上述序列组合的其它标准序列，以增加从构建体的表达或构建体的稳定性。b.标记病毒载体可以含有编码标记产物的核酸序列。该标记产物被用于确定基因是否被投送到细胞中，以及一旦投送后是否正在表达。优选的标记基因是编码p-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ基因，以及绿色荧光蛋白。在某些实施方案中，标记可以是选择性标记。适合用于哺乳动物细胞的选择性标记的例子是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸腺嘧啶激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当这样的选择性标记被成功转入哺乳动物宿主细胞时，转化的哺乳动物宿主细胞如果置于选择压力下，将可以存活。有两种广泛使用的不同类别的选择性方案。第一类是基于细胞的代谢和使用缺乏不依赖于补加培养基而生长的能力的突变细胞系。两个例子是CHODHFR—细胞和小鼠LTK—细胞。这些细胞在不添加营养物质例如胸腺嘧啶或次黄嘌呤的情况下缺乏生长能力。因为这些细胞缺乏完整的核苷酸合成途径所必需的某些基因，除非在补加培养基中提供缺少的核苷酸，否则它们不能存活。补加培养基的替代方案是将完整的DHFR或TK基因引入到缺乏相应基因的细胞中，从而改变它们的生长需求。没有用DHFR或TK基因转化的个体细胞将不能在未补加的培养基中存活。第二类是显性筛选，是指在任何类型的细胞中使用、并且不需要使用突变的细胞系的筛选方案。这些方案通常使用药物来停止宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞将表现出蛋白所赋予的药物抗性，从而在选择中存活。这样的显性筛选的例子使用了药物新霉素(SouthernP.和Berg,P.，J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982))、霉酚酸(Mulligan,R.C.禾口Berg,P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden,B.等，Mol.Cell.Biol.5:410-413(1985))。这三个例子使用了在真核细胞控制下的细菌基因，以分别赋予对适当的药物G418或新霉素(geneticin)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素)的抗性。其它包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。导向信号细胞迁移参与了多样的形态发生过程，包括血管和神经网络的成型(Lauffenburger和Horwitz,1996,Ridley等，2003)。为了执行这些发育程序，迁移细胞必需对细胞外环境中存在的正和负导向信号作出反应，重新组织其肌动蛋白细胞骨架。这些信号对细胞迁移的影响受到细胞表面上的跨膜受体的补体、以及由特定信号激活的多样的细胞内信号传导级联的指令。神经和血管网络的形成具有共同的分子信号，这使伸出长距离的复杂任务降为基于细胞外环境中的这些特定信号导航一系列短区段的较简单的任务。导向信号分为四种吸引剂和排斥剂，它们可以起短程(是细胞或基质相关的)或长程(是可扩散的)作用。中间的靶通常是诱引轴突的长程吸引性信号、或排斥已经进入靶的轴突或防止它们全都进入的短程或长程排斥信号的来源。在中间靶之间，轴突和血管往往通过细胞沿着组织通道制造的吸引性信号和通过防止它们进入周围组织的排斥信号来引导通过组织通道。本文中使用的"导向信号"是可以作用以吸引或排斥神经元或血管的导航或形成的分子。导向信号，例如轴突导向信号，通常被分类成"吸引性"或"排斥性"。但是，这是一种简单化，因为不同的轴突对于给定的信号有不同的反应。此外，同样的轴突生长锥可以根据时机、与同样的或其它的信号的已有经历、以及发现信号的环境，对给定的信号改变其反应。因此，一方面中，导向信号对于特定的细胞可以是吸引性导向信号。另一方面中，导向信号对于特定的细胞可以是排斥性导向信号。本文公开的"导向信号"可以是在细胞外作用于细胞受体的蛋白。但是，也公开了能够在细胞外或细胞内作用、以吸引或排斥神经元或血管导航的分子，包括核酸和小分子。因此，例如，当在本文中公开了导向信号受体的配体时，能够调节所述受体的活性或表达的分子也被公开了。因此，例如，公开了能够改变本文公开的导向信号的受体或其信号传导分子的基因表达的组合物，例如功能性核酸。一方面中，这些分影响子与本文公开的传统蛋白引导分子相同的细胞受体和细胞内信号传导途径。另一方面，这些分子可以通过本文公开的筛选方法来鉴定。导向信号可以根据引导轴突的能力来鉴定。生长中的轴突在被称为生长锥的生长尖端具有高度能动的结构，能够"嗅出"细胞外环境中指示轴突向哪条路生长的信号。这些信号，被称为导向信号，可以固定在一个位置，或者是可扩散的；它们可以吸引或排斥轴突。对于轴突来说，生长锥含有识别这些导向信号并将信号解释成趋化性反应的受体。普遍的理论框架是，当生长锥"感应"到导向信号时，受体激活生长锥中的各种信号传导分子，最终影响细胞骨架。如果轴突的生长锥感应到了导向信号的梯度，生长锥中的细胞内信号传导不对称地发生，使得细胞骨架的变化不对称地发生，生长锥转为朝向或远离导向信号。遗传和生化方法的组合导致发现了几种重要类别的引导分子和它们的受体。导向因子及其受体DCC和UNC5，是能够作用于吸引或排斥轴突的分泌分子。Slits是分泌蛋白，通常通过与Robo(Roundabout)类受体结合，排斥神经生长锥。肝配蛋白(Ephrins)是细胞表面受体，活化其它细胞表面上的Eph受体。这种相互作用可以是吸引性的或排斥性的。在某些情况下，肝配蛋白也可以用作受体，将信号传导到表达的细胞中，而Ephs作为配体。信号传导到带有肝配蛋白和Eph的细胞中，被称为"双向信号传导"。许多类型的脑信号蛋白主要是轴突排斥物，并激活被称为丛蛋白(Plexins)和神经毡蛋白(Neuropilins)的细胞表面受体的复合体。此外，许多其它类型的细胞外分子被生长锥用于适当地导航，包括发育性形态发生素，例如BMPs、Wnts、Hedgehogs以及FGFs;细胞外基质和粘附分子例如NCAM、Ll和层粘连蛋白(laminin);生长因子例如NGF，以及神经递质和调节物例如GABA。因此，如本文所公开，排斥性信号可以是例如roundabout受体的配体或导向因子受体的配体。xii.Unc5和导向因子导向因子被鉴定为化学吸引剂，通过与DCC(在结肠直肠癌中缺失)家族的受体结合，将轴突导向中线。导向因子也与轴突排斥有牵涉，这是由Unc5家族的受体单独作用或与DCC受体一起作用而介导的效应。此外，DCC-Unc5异二聚体可以在与单独的Unc5受体相比更长的范围内介导排斥。导向因子1与四种哺乳动物Unc5受体之一的Unc5b，也调控血管的导向。Unc5b在内皮顶细胞中表达。在小鼠中，丧失Unc5b导致顶细胞丝状假足的异常延伸和许多血管的过度分支。在体内用导向因子1处理培养的内皮细胞或生长中的血管，诱导了丝状假足的回縮。Unc5b在介导内皮细胞排斥中的作用通过在斑马鱼胚胎中分析发育中的节间血管(ISV)得到了证实。导向因子构成了与细胞外基质分子层粘连蛋白相关的、在系统发生上保守的导向信号家族。在脊椎动物中已经鉴定了四种分泌导向因子鸡、小鼠、斑马鱼和人类中的导向因子-l;鸡中的导向因子-2;小鼠和人类中的导向因子-3;以及小鼠和人类中的导向因子-4。所有的导向因子在结构上都与层粘连蛋白的短臂相关，并含有层粘连蛋白VI和V结构域。所有的导向因子也含有带正电荷的C-末端结构域，被称为NTR模块。导向因子-1、-2和-3与层粘连蛋白的7链更紧密相关。相反，导向因子-4与层粘连蛋白的(3链更紧密相关。已经鉴定到两种导向因子受体家族，它们指示迁移的方向。这两个家族都属于受体的免疫球蛋白(Ig)超家族。在脊椎动物中，在结肠癌中缺失(DCC)的家族它们含有6个细胞外纤连蛋白III型重复序列，以及4个Ig结构域和3个细胞内同源性区域(P1、P2和P3)，它们介导与其它受体例如UNC5b(Pl)禾卩Robol(P3)的相互作用。UNC5家族有4个成员，UNC5a(UNC5H1)、UNC5b(UNC5H2)、UNC5c(UNC5H3)，含有细胞外的两个Ig和两个血小板反应蛋白I型(Tspl)结构域，以及细胞内的ZU-5、DCC结合和C-末端死亡结构域。在功能上，DCC家族介导了对导向因子-1的吸引，而UNC5家族通过与DCC形成导向因子-1依赖性复合体而介导排斥。两个家族的成员都显示出作为依赖性受体起作用，并在缺乏和不存在配体的情况下诱导凋亡。xiii.脑信号蛋白和神经毡蛋白/丛蛋白正如本文公开的，某些脑信号蛋白可以通过丛蛋白起作用而增加血管通透性。因此，在公开的组合物和方法的某些情况下，排斥性导向信号不是脑信号蛋白。在公开的组合物和方法的某些情况下，排斥性导向信号不是丛蛋白或神经毡蛋白的配体。但是，正如本文公开的，脑信号蛋白3E通过丛蛋白Dl起作用，抑制血管的通透性。因此，在某些情况下，排斥性导向信号可以是脑信号蛋白3E。在某些情况下，排斥性导向信号可以是丛蛋白Dl的配体。脑信号蛋白是被分泌的导向信号，能够长程扩散(3类)，但是在某些情况下具有受限的扩散，或者是膜结合的并作为短程导向信号起作用。脑信号蛋白最广为人知的是作为排斥剂，但是依赖于细胞内的环核苷酸水平，脑信号蛋白3A(Sema3A)也可以起化学吸引剂的作用。脑信号蛋白通过下述多聚体受体复合体传导信号膜结合的脑信号蛋白与丛蛋白结合，但是分泌的3类脑信号蛋白与神经毡蛋白结合，它与丛蛋白作为非信号传导的共同受体发挥作用。这种规律的例外是分泌的Sema3E，它与丛蛋白Dl(Plxndl)直接结合。此外，膜锚定的Sema7A通过活化整合素刺激轴突延伸。脑信号蛋白及其受体也调节血管的导向和分支。内皮细胞表达各种神经毡蛋白和丛蛋白受体。Sema3A抑制内皮片状伪足和血管的形成。神经毡蛋白2在静脉和淋巴管中表达，而神经毡蛋白1广泛表达在发育中的血管系统中。神经毡蛋白也牵涉在血管成型中，但是这可能反映了它们在调节VEGF中而不是在脑信号蛋白信号传导中的作用，因为神经毡蛋白也是特定VEGF同工型(VEGF165)的受体，并调节VEGF受体的活性。此外，VEGF165与Sema3A竞争与神经毡蛋白的结合。正如本文公开的，脑信号蛋白3E通过丛蛋白Dl起作用，抑制血管的通透性。因此，在某些情况下，排斥性导向信号可以是脑信号蛋白3E。在某些情况下，排斥性导向信号可以是丛蛋白Dl的配体。xiv.肝配蛋白和Ephs另一类重要的短程轴突导向分子是Eph受体酪氨酸激酶及其肝配蛋白配体。哺乳动物中的13种Eph受体被分类成A(EphAl-8)和B(EphBl-4禾t!EphB6)亚家族。8种肝配蛋白受体包括肝配蛋白Al-5，它们通过糖基-磷脂酰肌醇锚束缚到膜上，以及肝配蛋白Bll-3，它们含有跨膜和细胞质区域。肝配蛋白A配体与EphA受体结合，肝配蛋白B配体与EphB受体结合；在家族之间仅观察到中等程度的交叉反应；例如，EphA4与某些B类的肝配蛋白结合。Eph受体和肝配蛋白在表达Eph受体(正向信号传导)或肝配蛋白B配体(反向信号传导)的细胞中发动双方向信号传导。通过视网膜地形学投影(topogr叩hicretinotectalprojection)研究，肝配蛋白首先被鉴定为排斥性轴突导向分子，随后被暗示在其它布线过程(wiringprocesses)中作为负性和正性信号。Eph-肝配蛋白信号也控制血管的发育。这些导向分子中的一些属于首先发现在动脉或静脉中选择性表达的因子。在历史上，据推测，血液动力学压力差调控了高压血管分化成动脉和低压血管分化成静脉。但是，在小鼠中进行的表达分析和功能缺失研究表明，EphB4和肝配蛋白B2分别在发育的静脉和动脉中表达，对于它们的维持是关键的。这些研究表明，排斥性的肝配蛋白B2-EphB4信号传导——正向的和反向的一一都可以防止静脉和动脉内皮细胞的混合，确保了"类似"内皮细胞的组装，并为动脉-静脉边界划分界限。排斥性的肝配蛋白-Eph信号为血管导航通过组织边界航行提供短程导向信号。例如，肝配蛋白B2排斥表达EphB3/EphB4的ISVs进入体节。但是，肝配蛋白-Eph相互作用在其它情况下也可以提供吸引性信号并诱导毛细血管萌发。例如，肝配蛋白B配体和EphBs在相同血管中邻近的内皮细胞或平滑肌细胞上的近分泌表达，可以为建立接触依赖性通讯提供双方向信号，并促进血管的装配、萌发和成熟。例如，肝配蛋白A配体也可以起血管形态发生的正调控剂的作用。EphA2/肝配蛋白Al信号传导已经被显示出抑制了VEGF诱导的视网膜血管通透性，并且已经牵涉在糖尿病型视网膜病中治疗新生血管和血管通透性异常(Ojima等，2006)。因此，在公开的用于抑制血管通透性的组合物和方法的某些情况下，排斥性信号不是Eph或肝配蛋白受体的配体。在其它情况下，公开的组合物除了Eph或肝配蛋白受体的配体之外，包含至少一种导向信号。xv.Slits禾口Roundabouts排斥性导向信号的著名例子是Slit家族的细胞外基质蛋白。Slit最初是在轴突导向缺陷的遗传筛选中，在果蝇胚胎的中线上鉴定的(Seeger等，1993;Kidd等，1998;Battye等，1999;Kidd等，1999)。随后，在脊椎动物中克隆到了三个进化上保守的Slit基因，它们编码的蛋白排斥轴突(Brose等，1999;Li等，1999)，并促进感觉性轴突的树枝状分枝(Wang等，1999)。遗传和生化研究已经证实，Robo家族的跨膜蛋白起到Slit蛋白的受体的作用。与slit类似，robo也是在果蝇的轴突导向缺陷的遗传筛选中发现的(Seeger等，1993)。在脊椎动物中己经鉴定了4种Robos，其中Robo1-3主要在神经系统中表达(Marillat等，2002)。相反，Robo4，也被称为MagicRoundabout,专门表达在胚胎小鼠的血管系统(Park等，2003)、胎盘动脉(Huminiecki等，2002)以及各种人类恶性肿瘤的肿瘤内皮中(Huminiecki等，2002;Seth等，2005)。Robo4与Robo1-3的进一步区别在于它的不同序列神经元Robos的胞外结构域含有5个免疫球蛋白(Ig)结构域和3个纤连蛋白m型(FNin)重复序列，而Robo4含有两个Ig结构域和两个FNIII重复序歹"Huminiecki等，2002;Park等，2003)。此外，Robo1-3具有4个保守的细胞质(CC)基序，CC0、CC1、CC2禾nCC3(Kidd等，1998;Zallen等，1998)，其中Robo4中只存在CC0和CC2(Huminiecki等，2002;Park等，2003)。Robo在神经系统中促进导向决定的能力依赖于Slit刺激的受体下游的特定生化程序的激活。在果蝇、线虫(C.elegans)和哺乳动物中对Slit依赖性排斥的分析己经鉴定到了在神经系统中Robo信号传导的关键介导物。在果蝇中，Abelson(Abl)酪氨酸激酶和肌动蛋白结合蛋白Enabled(Ena)参与了调控Robo的排斥活性(Bashaw等，2000)。其它在果蝇中的研究鉴定到了RacGTPase活化蛋白(GAP)，它参与了Robo介导的气管细胞和轴突的排斥(Lundstrom等，2004;Hu等，2005)。在线虫中，从遗传分析中已经显露出Ena在调节Slit信号传导中的直接功能(Yu等，2002)。在哺乳动物神经元中，Robol相互作用蛋白srGAPl对于Slit依赖性排斥前体细胞从室管膜前下区迁移是必需的(Wong等，2001)。这些机制性的研究不仅开始阐释了神经元Robos下游的信号传导途径，而且这样的研究已经为受体的排斥性活性提供了解释。与神经系统相反，关于血管系统中的Slit-Robo信号传导了解得很少，并且尽管有有分量的证据表明Slit-Robo信号传导抑制了神经元和非神经元细胞类型包括内皮细胞的迁移(Wu等，1999;Zhu等，1999;Wu等，2001;Park等，2003;Seth等，2005)，但几项最近的报告提出，Robos能够以Slit依赖性和Slit非依赖性的方式促进血管生成。例如，据报道，Robol的Slit2刺激在体外诱导了迁移和管形成，并在体内促进肿瘤的血管生成(Feng等，2004)。此外，最近的研究显示，用可溶性Robo4胞外结构域阻断Robo4的活性，在体外抑制了迁移和管形成，这与Robo4在血管生成过程中的正性作用相一致。此外，该研究报告了Slit蛋白不与Robo4结合，从而暗示了受体具有未知的配体(Suchting等，2004)。Robo4促血管生成的这种观念，也已经从最近的数据中浮现出来，这些数据显示，Robo4的过表达不依赖Slit就增加了内皮细胞的粘附和迁移(Kaur等，2006)。这些似乎不一致的观察强调了需要确定Slit-Robo信号传导在内皮细胞中的功能性意义和机制。正如本文公开的，Slit2是Robo4的配体，Slit2-Robo4信号传导对细胞的运动性进行负调控，并抑制血管通透性。具体来说，本文提供的讲述确立了Slit2在内皮细胞中通过活化Robo4引发排斥性信号，定义了一个为这种活性负责的新信号传导级联。正如本文描述的，Robo4的Slit2活化抑制了Rac活化，从而抑制了Rac启动或介导的细胞活动性和细胞铺展。本文提供的讲述还建立起Robo4和连接蛋白桩蛋白之间的Slit2依赖性联合，本文详细描述的实验数据提供了生化和细胞生物学证据，表明这种相互作用对于细胞迁移、铺展和Rac活化的Robo4依赖性抑制是关键的。具体来说，正如本文讲述的，Robo4的活化发动了桩蛋白对GIT1的活化，接着，GIT1又抑制了ARF6。Robo4的活化保护了内皮的屏障功能，阻断了VEGF受体下游的VEGF信号传导，并减少了血管渗漏和病理性血管生成。重要的是，Robo4活化不仅阻断了VEGF信号传导，而且抑制了来自多种血管生成、通透性和炎性因子包括凝血酶和bFGF的信号传导。正如也在本文中公开的，Robo4-桩蛋白信号传导对于斑马鱼中胚胎血管的适当发育来说是必需的。这些公开的与Robo4活化有关的关系和结果，允许产生如本文所述用于调节和细胞操纵的新靶。本文中使用的"调节"包括改变靶的活性，本文使用的"操纵"包括改变细胞的状态。血管通透性其特征为不利的血管通透性的疾病和紊乱包括例如与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤有关的腹水、麦格综合征(Meigs'syndrome)、肺炎、肾病综合征、心包腔积液和胸膜腔积液。因此，提供了治疗或预防这些或与血管通透性增加或水肿有关的任何其它疾病的方法。例如，抑制水肿的形成对于处于例如炎症、过敏性疾病、癌症、脑中风、心肌梗塞、心肺功能不足、肾衰竭和视网膜病等情况下的患者的总体结果来说，将是有益的。此外，因为水肿是组织缺氧的普遍后果，因此也可以推论，抑制血管渗漏代表了治疗组织缺氧的潜在方法。例如，由病理性状况(例如血栓形成)或医学干预(例如心麻痹、器官移植和血管成形术)中断的血液流动，可以使用血管渗漏抑制剂进行急性和预防性治疗。中风和心肌梗塞后的局部缺血/再灌注损伤，其特征也是血管通透性和水肿。组织灌注不足导致永久性局部缺血后血管源性的水肿，它是由于血管通透性增加而发生的。组织灌注是氧化的血液由于动脉的开放和血液在动脉中的流动而到达给定组织的度量。组织血管形成可能由于阻塞而被破坏，或者可选地，可能是由于受影响位点上游的血管渗漏或出血导致的血流损失所致。在急性心肌梗塞、脑中风、外科血管再生术和组织血管形成被破坏的其它条件期间组织灌注的不足，是造成患者病症后果的关键因素。水肿可以引起各种类型的伤害，包括血管枬塌和电功能受损，特别是在心脏中。但是，随后的再灌注在某些患者中也能造成类似的损伤，导致治疗上的矛盾。尽管疏通阻塞的血管或者修复或替换受损的血管是必要的，但随后发生的再灌注，在某些情况下，可以导致进一步的损伤。同样地，在旁路手术期间，必需使心脏停止跳动并使患者挂上心脏泵。例如，某些经历了旁路手术的患者，事实上可能经历病症的恶化("泵后综合征征")，这可能是手术期间停止心脏功能过程中局部缺血的结果。动脉阻塞可能引起血流减少，但即使是除去阻塞使开放动脉之后，如果不能发生组织再灌注，可能导致进一步的组织损伤。例如，血凝块的破坏可以触发一连串事件，导致丧失组织灌注，而不是获得灌注。以不利的血管通透性为特征的其它疾病和紊乱，包括例如可以导致细胞因子风暴的感染性和非感染性疾病。细胞因子风暴可以由多种感染性和非感染性疾病促成，包括例如移植物抗宿主疾病(GVHD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血病、禽流感、天花、以及全身性炎性反应综合征(SIRS)。病理性血管生成血管生成和血管生成相关的疾病受到细胞增殖的紧密影响。在本文中使用的术语"血管生成"是指在组织或器官中产生新的血管。在正常生理条件下，人类或动物只有在非常特定的限定情况下才经历血管生成。例如，血管生成通常在伤口愈合、胎儿和胚胎发育、以及黄体、子宫内膜和胎盘的形成中才观察到。本文中定义的术语"内皮"是指衬在桨膜腔、淋巴管和血管中的一薄层扁平细胞。这些细胞在本文中被定义为"内皮细胞"。术语"内皮抑制活性"是指分子总体抑制血管生成的能力。抑制内皮细胞增殖也导致抑制血管生成。受控的和不受控的血管生成都被认为都以同样的方式开始。被基底膜包围着的内皮细胞和周细胞形成了毛细血管。随着基底膜被内皮细胞和白细胞释放的酶侵蚀，开始血管生成。然后，衬在血管腔的内皮细胞通过基底膜突出。血管生成刺激物诱导内皮细胞通过被侵蚀的基底膜迁移。迁移中的细胞形成从亲代血管抽出的"萌芽"，其中内皮细胞经历了有丝分裂和增殖。内皮的萌芽彼此融合，形成了毛细环，产生了新的血管。新的血管也可以部分通过血管发生而形成。血管发生与血管生成的差别在于内皮细胞的来源。血管发生包括召集被称为成血管细胞的内皮祖细胞。这些成血管细胞可以来自循环或来自组织。血管发生受到与血管生成类似的信号传导途径的调控。因此，本文使用的术语"血管生成"可以与血管发生互换使用，从而调节血管生成的方法也可以调节血管发生。可以以永久性失调或不受调节的血管生成为特征的病理性血管生成，在多种疾病状态、肿瘤转移和内皮细胞的异常生长中发生，并支持在这些情况下中观察到的病理性损伤。其中存在病理性血管生成的多种疾病状态已经在一起分组为血管生成依赖性的、血管生成相伴的、血管生成相关的疾病。这些疾病是异常或不利的细胞增殖、特别是内皮细胞增殖的结果。由异常或不需要的内皮细胞增殖介导的疾病和过程，包括但不限于血管瘤、实体肿瘤、白血病、肿瘤转移、毛细血管扩张性牛皮癣硬皮病、化脓性肉芽肿、心肌血管生成、斑块新生血管化、冠状动脉侧枝、缺血性肢体血管生成、角膜病、虹膜发红、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病(DR)、晶体后纤维膜增生症、非增殖性糖尿病型黄斑水肿(DME)、关节炎、糖尿病性新生血管化、衰老相关的黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)、缺血性视网膜静脉阻塞(IRVO)、伤口愈合、消化性溃疡、骨折、瘢痕瘤、血管发生、造血、排卵、月经和胎盘形成。组合物本文提供了用于在组织中抑制血管通透性和病理性血管生成的组合物。在一个实施方案中，这样的组合物含有Unc5或在结肠直肠癌中缺失(DCC)的受体的配体。在一个这样的实施方案中，Unc5或DCC的配体可以是能够通过Unc5或DCC受体起作用以抑制Rac被VEGF活化的任何组合物或分子。在本文中使用的术语"通过受体起作用"是指组合物与受体的结合促进了受体的活性。例如，组合物可以含有Unc5或DCC的配体，它们通过Unc5或DCC受体起作用，激活Gitl对ARF6的抑制。在另一个实施例中，组合物可以含有Unc5或DCC的配体，它们通过Unc5或DCC受体起作用，激活桩蛋白对Gitl的活化。在另一个实施例中，本文描述的组合物可以含有模拟Unc5或DCC受体激活桩蛋白对Gitl的活化的组合物或分子。在一个实施方案中，本文描述的组合物包含Unc5的配体，其中配体是导向因子，例如人类导向因子l、导向因子2、导向因子4、导向因子Gl或导向因子G2和啮齿动物(例如小鼠或大鼠)导向因子l、导向因子3、导向因子4、导向因子Gl或导向因子G2，或其片段或变异体，它们结合并活化Unc5b以抑制ARF6。例如导向因子配体可以含有选自SEQIDNO:17、SEQIDN0:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25的氨基酸序列，或这些氨基酸序列结合Unc5b的变异体或片段。这样的氨基酸序列片段的长度至少大约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。在另一个实施方案中，Unc5b的导向因子配体可以含有与选自SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25的氨基酸序列或其与Unc5b结合的片段具有至少大约70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%或至少大约100%的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文描述的组合物可以含有Eph的配体。在一个这样的实施方案中，组合物含有能够通过Eph受体起作用以抑制Rac被VEGF活化的Eph的配体。在另一个这样的实施方案中，组合物含有能够通过Eph受体起作用以活化Gitl对ARF6的抑制的Eph的配体。在另一个实施方案中，本说明的组合物可以含有能够通过Eph受体起作用以激活Eph对Gitl的活化的任何组合物或分子。在另一个实施方案中，本文描述的组合物可以含有模拟Eph受体以激活桩蛋白对Gitl的活化的任何组合物或分子。在另一个实施方案中，本文提供的组合物含有Robo4受体的配体。在一个这样的实施方案中，Robo4的配体可以是能够通过Robo4起作用对细胞运动进行负调控的任何组合物或分子。在另一个这样的实施方案中，Robo4的配体可以是能够通过Robo4起作用以抑制血管通透性的任何组合物或分子。在另一个这样的实施方案中，Robo4的配体可以是能够通过Robo4起作用以抑制Rac被VEGF活化的任何组合物或分子。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包含Robo4受体的配体，其中配体能够通过Robo4起作用以启动桩蛋白对GITl的活化。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包括Robo4受体的配体，其中配体能够通过Robo4起作用以活化Gitl对ARF6的抑制。在另一个实施方案中，本文描述的组合物包含Robo4受体的配体，其中配体通过Robo4起作用的方式导致下列效应中的一种或多种保护内皮屏障功能，阻断VEGF受体下游的VEGF信号传导，抑制血管渗漏，抑制病理性血管生成，多种血管生成、通透性和炎性因子的信号抑制。当本发明的组合物包含Robo4的配体时，配体是结合Robo4的细胞外结构域的任何组合物或分子。或者，Robo4的配体能够是通过Robo4受体起作用以抑制Rac被VEGF活化的任何组合物或分子。此外，Robo4的配体能够是通过Robo4受体起作用以活化Gitl对ARF6的抑制的任何组合物或分子。此外，Robo4的配体能够是通过Robo4受体起作用以激活桩蛋白对Gitl的活化的任何组合物或分子。在另一种情况下，Robo4的配体能够是模拟Robo4受体以激活桩蛋白对Gitl的活化的任何组合物或分子。在一个实施方案中，本说明的组合物中包含的Robo4的配体含有长度为大约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400个氨基酸的分离的多肽。当本文描述的组合物包含Robo4的配体时，这样的配体可以是Slit，例如Slit2、或其结合并活化Robo4的片段或变异体。在具体的实施方案中，Slit配体或其片段或变异体，结合并活化Robo4的方式，导致了下列一种或多种效应抑制ARF6;保护内皮屏障功能；阻断VEGF受体下游的VEGF信号传导；抑制血管渗漏；抑制病理性血管生成；以及多种血管生成、通透性和炎性因子的信号抑制。例如，Robo4的配体可以包含选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、以及SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一个的氨基酸序列或其结合Robo4的片段。例如，这样的氨基酸序列的片段的长度至少大约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。Robo4的配体可以含有与选自SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、以及SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一个的氨基酸序列或其结合Robo4的片段具有至少大约70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%或至少大约100%的序列同一性的氨基酸序列。Slit的片段可以含有Slit的N-末端区域。例如，Robo4的配体可以含有Slitl的1-1132位氨基酸(SEQIDNO:36)、Slit2的1-1121位氨基酸(SEQIDNO:37)、Slit3的1-1118位氨基酸(SEQIDNO:38)或在图23中图示的并在SEQIDNO:39到SEQIDNO:47中详细描述的N-末端片段中的任何一个。在具体的实施方案中，Robo4的配体可以含有基本上由选自SEQIDNO:36到SEQIDNO:47任何一个中的氨基酸序列构成的多肽。在某些实施方案中，正如在SEQIDNO:39到SEQIDNO:47的氨基酸序列中反映的那样，包含在本发明组合物中的Slit片段不包含最N-末端的氨基酸。例如，氨基酸序列可以缺少天然Slit的大约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或ioo个N-末端氨基酸。在其它实施方案中，sm片段可以不包含天然Slit最C-末端的大约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氮基酸。例如，Robo4的配体可以含有基本上由Slit1的281-511位氨基酸(SEQIDNO:15)或Slit2的271-504位氨基酸(SEQIDNO:16)构成的多肽。因此，Robo4的配体可以包含SEQIDNO:15或SEQIDNO:16或其结合Robo4的片段。Robo4的配体可以含有与SEQIDNO:15或SEQIDNO:16或其结合Robo4的片段具有至少大约70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约90%、至少大约95%或至少大约100%的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的组合物可以含有Robo4的能够激活桩蛋白活化Gitl的片段。因此，本文提供了含有Robo4的桩蛋白结合序列的分离的多肽，其中多肽不含全长Robo4。在一个这样的实施方案中，桩蛋白结合序列可以含有氨基酸序列SEQIDNO:27或其结合桩蛋白的片段或变异体。例如，片段的长度可以是至少大约5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。氨基酸序列SEQIDNO:27的片段或变异体可以含有与SEQIDNO:27或其结合桩蛋白的片段具有至少大约70%、至少大约75%、至少大约80%、至少大约85%、至少大约卯％、至少大约95%或至少大约100%的序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本文描述的组合物含有的分离的多肽包含Robo4的桩蛋白结合序列(PBS)，其中所述多肽由下式定义R、PBS-R2其中W和W独立是H、酰基、NH2、氨基酸或肽，其中多肽不包含全长Robo4。PBS可以由与SEQIDNO:27或其长度为至少10个残基的片段具有至少80%序列同源性的氨基酸序列组成。本文还提供了编码本文公开的任何多肽的分离的核酸。因此，提供了编码含有Robo4的桩蛋白结合序列的多肽的分离的核酸，其中多肽不含有全长Robo4。还提供了含有SEQIDNO:2或其长度为至少30个残基的片段的分离的核酸，其中所述核酸不编码全长的Robo4。药物组合物本文描述的组合物，例如本文公开的配体、蛋白和肽，可以配制在药物组合物中。例如，这样的组合物可以与可药用的载体混合，以提供适合治疗施用的剂型。在本文中使用的"可药用的"是指不是生物学上或其它方面不利的物质，即所述物质可以与所述组合物(例如所需的配体、蛋白、肽、核酸、小分子治疗药等)一起给对象施用，而不会引起任何不想要的生物学效应、或以有害的方式与包含它的药物组合物中的任何其它成分发生相互作用。载体自然应该选择成使活性成分在对象中的任何降解最小化，并使在对象中的任何不利的副作用最小化，这是本
技术领域：
的专业人员熟知的。物质可以在溶液、悬浮液中(例如，惨入到微粒、脂质体、或细胞中)。它们可以通过抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。下面的参考文献是使用这种技术将特定蛋白靶向肿瘤组织的例子(Senter等，BioconjugateChem.,2:447-451，(1991);Bagshawe,K.D.,Br.J.Cancer,60:275-281,(1989);Bagshawe等，Br.J.Cancer,58:700-703,(1988);Senter等，BioconjugateChem.，4:3-9,(1993);Battelli,等，CancerImmunol.Immunother.，35:421-425,(1992);Pietersz禾口McKenzie,Immunolog.Reviews,129:57-80,(1992);以及Roffler等，Biochem.Pharmacol,42:2062-2065,(1991))。介质例如"stealth"和其它抗体偶联的脂质体(包括耙向结肠癌的脂类介导药物)，受体介导的通过细胞特异性配体的DNA定向，淋巴细胞指导的肿瘤定向，以及高度特异性的治疗性反转录病毒在体内靶向鼠神经胶质瘤细胞。下面的参考文献是使用该技术将特定蛋白靶向肿瘤组织的例子(Hughes等，CancerResearch,49:6214-6220,(1989);以及Litzinger和Huang,BiochimicaetBiophysicaActa,1104:179-187,(1992))。一般来说，受体组成性地或受配体诱导地参与胞吞途径。网格蛋白包被的小窝中的这些受体簇，通过网格蛋白包被的小泡进入细胞，通过酸化的内体，受体在其中被分类，然后或者重新循环到细胞表面，成为储存在细胞内，或者在溶酶体中降解。内化途径具有各种不同的功能，例如营养摄取、除去活化的蛋白、清除大分子、病毒和毒素的机会进入、配体的解离和降解、以及受体水平的调节。许多受体参加一种以上的细胞内途径，这依赖于细胞类型、受体浓度、配体的类型、配体价以及配体浓度。受体介导的胞吞作用的分子和细胞机理已经被综述(Brown和Greene,DNAandCellBiology10:6，399-409(1991))。适合的载体和它们的配制描述在A.R.Gennaro编著的《Remington:药物科学与实践》第19版中(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(19thed.)，MackPublishingCompany,Easton,PA1995)。通常，在配方中使用适当量的可药用盐以赋予制剂等渗性。可药用载体的例子包括但不限于盐水、林格(Ringer's)液和葡聚糖溶液。溶液的pH优选从大约5到大约8，更优选从大约7到大约7.5。其它的载体包括持续释放制剂例如含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中基质是造型制品的形式，例如薄膜、脂质体或微粒。对于本
技术领域：
的专业人员来说，显然根据例如给药途径和所施用的组合物的浓度，某些载体可能是更优选的。药物载体对于本
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的专业人员来说是已知的。这些最典型是存在用于给人类用药的标准载体，包括溶液例如无菌水、盐水、以及生理pH下的缓冲溶液。组合物可以肌内或皮下给药。其它化合物将按照本
技术领域：
的专业人员使用的标准程序进行给药。药物组合物除了选择的分子之外，还可以包含载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物也可以包含一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。用于肠胃外给药的制剂包含无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、乙醇/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液或不挥发性油。静脉内介质包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂(例如基于林格葡萄糖溶液的那些)等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。用于局部给药的制剂可以包括油膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油状基质、增稠剂等，可以是必要的或适宜的。用于口服给药的组合物包括粉末或颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、袋剂或片剂。增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。某些组合物可能可以作为可药用的酸或碱加成盐施用，酸或碱加成盐的形成是通过与无机酸例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸和磷酸以及有机酸例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸进行反应，或与无机碱例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾和有机碱例如单、二和三垸基和酰基胺和取代的乙醇胺进行反应。方法本文提供了筛选或评估抑制血管通透性或病理性血管生成的药剂的方法。在一个实施方案中，方法包括确定所述药剂影响Robo4介导的Gitl活化的能力。例如Robo4介导的Gitl活化可以通过下面的步骤来测定，所述步骤包括将表达Robo4的第一种细胞与候选药剂相接触，将基本上与第一种细胞相同但是基本上缺乏Robo4的第二种细胞与候选药剂相接触，并在第一种和第二种细胞中分析Gitl的活化，其中在第一种细胞中检测到的Gitl活化与第二种细胞相比更高，表明了所述药剂的Robo4介导的Gitl活化。正如本文公开的，Robo4介导的Gitl活化导致ARF6失活。ARF6参与VEGF介导的Rac活化，Rac活化Pak，Pak活化MEK，MEK活化ERK，ERK促进血管通透性。因此，正如本文公开的，可以通过检测信号传导途径中的任何成分被激活还是失活，来分析Gitl的活化。因此，可以通过检测ARF6失活、Rac失活、Pak失活、MEK失活或ERK失活来分析Robo4介导的Gitl活化。应该理解，任何其它已知的或新发现的监控这种信号传导途径的方法可以用于公开的方法中。还提供了筛选或评估能够抑制血管通透性的药剂的方法，包括确定所述药剂抑制ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK的能力。例如，Robo4介导的ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK的抑制通过下面的步骤来确定，包括将表达Robo4的第一种细胞与候选药剂相接触，将基本上与第一种细胞相同但是基本上缺乏Robo4的第二种细胞与候选药剂相接触，并在第一种和第二种细胞中分析ARF6、Rac、Pak、MEK、ERK或其组合的抑制，其中在第一种细胞中检测到的ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK的活化与第二种细胞相比更低，表明所述药剂的Robo4介导的ARF6、Rac、Pak、MEK或ERK抑制。信号传导蛋白例如Rac、Pak、MEK、ERK的活化能够通过检测所述蛋白的磷酸化来分析。用于检测蛋白磷酸化的基于细胞的和无细胞的分析方法在本
技术领域：
中是众所周知的，包括使用抗体，所述抗体包括例如抗磷酸丝氨酸(ChemiconAB1603)(Chemicon,Temecula,CA)、抗磷酸苏氨酸(ChemiconAB1607)和抗磷酸酪氨酸(ChemiconAB1599)。也可以产生特异性针对磷酸化形式DDX-3的位点特异性抗体。产生和使用所述抗体的方法在本
技术领域：
中是众所周知的。本文公开的分析方法可以在基本上不存在VEGF、TNF、凝血酶或组胺的情况下进行。或者，公开的分析方法可以在存在生物活性量的VEGF、TNF、凝血酶或组胺的情况下进行。蛋白的"活性"包括例如转录、翻译、细胞内易位、分泌、被激酶磷酸化、被蛋白酶裂解、与其它蛋白的嗜同性和嗜异性结合、泛素化作用。在一个实施方案中，本文描述的筛选方法是筛选分析，例如高通量筛选分析。因此，接触步骤可以是基于细胞的或无细胞的分析。例如，可以将血管内皮细胞与候选药剂在体内、离体或体外接触。细胞可以在单层培养物中，但是优选组成上皮。细胞可以在体外或原位进行分析，或可以在体外对所述细胞的蛋白提取物进行分析，以检测活化的(例如磷酸化的)Rac、Pak、MEK、ERX。内皮细胞也可以被工程化以表达报道基因构建体，其中将细胞与候选药剂接触，并评估报道基因的表达。本文中也考虑了使用其它这类基于细胞的和无细胞的分析。例如，小分子、氨基酸或核酸模拟物对血管通透性或病理性血管生成的影响，可以在表达Robo4的内皮细胞中进行评估，并与缺少Robo4的内皮细胞进行比较。一般来说，可以从天然产物或合成的(或半合成的)提取物或化学文库中，按照本
技术领域：
已知的方法来鉴定候选药剂。药物发现和开发领域的专业人员将会理解，待测提取物或化合物的准确来源对于本发明的筛选程序来说不是关键的。因此，事实上任何数量的化学提取物或化合物都可以使用本文描述的示例性方法进行筛选。这样的提取物或化合物的例子包括但不限于基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物、发酵液和合成的化合物，以及现有化合物的修饰。现有大量的方法可用于产生任何数量的化学化合物的随机或定向的合成(例如半合成或全合成)，这些化合物包括但不限于基于糖类、脂类、肽、多肽和核酸的化合物。合成的化合物文库是可商购的，例如从BrandonAssociates(Merrimack,NH)禾口AldrichChemical(Milwaukee,WI)。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库，可以从许多来源商购，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、HarborBranchOceangraphicsInstitute(Ft.Pierce,Fla.)禾口PharmaMar，U.S.A.(Cambridge,Mass.)。此外，如果需要，可以按照本
技术领域：
己知的方法，例如通过标准的提取和分级方法，来产生天然的和合成生产的文库。此外，如果需要，任何文库或化合物都容易使用标准的化学、物理或生物化学方法进行修饰。此外，药物发现和开发领域的专业人员容易理解，只要有可能，用于去复制(dereplication)(例如分类学去复制、生物学去复制和化学去复制，或其任何组合)或消除其效应已知的物质的复制体或重复体的方法，应该被使用。当发现粗提物具有所需的活性时，必需对阳性前导提取物进行进一步的分级，以分离引起观察到的效应的化学组分。因此，提取、分级和纯化过程的目标是在粗提物中仔细表征和鉴定具有刺激或抑制血管通透性活性的化学实体。本文描述的用于在化合物的混合物中检测活性的同样分析可用于纯化活性成分并测试其衍生物。对这类异源提取物进行分级和纯化的方法在本
技术领域：
中是已知的。如果需要，已显示出是治疗有用的药剂的化合物，可以按照本
技术领域：
已知的方法进行化学修饰。被鉴定为具有治疗价值的化合物，然后可以使用动物模型针对希望调节血管通透性的疾病或病症进行分析。本文还提供了用于在对象中抑制血管通透性的方法。正如本文中详细描述的，Robo4的活化抑制了血管通透性、抑制了Rac被VEGF的活化、保护了内皮细胞屏障功能、阻断了VEGF受体下游的VEGF信号传导、抑制了血管渗漏、并抑制了多种血管生成、通透性和炎性因子。正如本文确定的，Robo4信号传导的活化，通过起动桩蛋白对GIT1的活化，这接着又导致GIT1对ARF6的抑制，来实现这样的效应。因此，在一个实施方案中，本文提供的抑制血管通透性的方法包括施用治疗有效量的Robo4的配体，其中这样的配体导致GITl对ARF6的抑制。在另一个实施方案中，施用的配体是本文描述的Slit蛋白。在特定的实施方案中，对象所经历的和通过施用治疗有效量的Robo4配体治疗的血管通透性，与选自可以导致细胞因子风暴的感染性和非感染性疾病的疾病状态有关，这些疾病包括，例如，移植物抗宿主疾病(GVHD)、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血病、禽流感、天花、和全身性炎性反应综合征(SIRS)、中风和心肌梗塞后的局部缺血/再灌注损伤、与脑肿瘤有关的水肿、与恶性肿瘤有关的腹水、麦格综合征、肺炎、肾病综合征、心包腔积液和胸膜腔积液、炎症、过敏性疾病、癌症、脑中风、心肌梗塞、心肺功能不足、肾衰竭和视网膜病。本文提供了在对象中抑制病理性血管生成的方法。正如本文中详细描述的，Robo4的活化抑制了多种炎性、通透性和血管生成因子的效应。还是如本文确定的，Robo4信号传导的活化，起动了桩蛋白对GIT1的活化，这接着又导致了GIT1对ARF6的抑制。因此，在一个实施方案中，本文提供的抑制病理性血管生成的方法包括施用治疗有效量的Robo4的配体，其中这样的配体导致了GIT1对ARF6的抑制。在另一个实施方案中，施用的配体是本文描述的Slit蛋白。在具体的实施方案中，对象所经历的和通过施用治疗有效量的Robo4配体治疗的病理性血管生成，与选自下列的疾病状态有关血管瘤、实体肿瘤、白血病、肿瘤转移、毛细血管扩张性牛皮癣硬皮病、化脓性肉芽肿、心肌血管生成、斑块新生血管化、冠状动脉侧枝、缺血性肢体血管生成、角膜病、虹膜发红、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病(DR)、晶体后纤维膜增生症、非增殖性糖尿病型黄斑水肿(DME)、关节炎、糖尿病性新生血管化、衰老相关的黄斑变性(AMD)、早产儿视网膜病变(ROP)、缺血性视网膜静脉阻塞(IRVO)、伤口愈合、消化性溃疡、骨折、瘢痕瘤、血管发生、造血、排卵、月经和胎盘形成。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防禽流感的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述禽流感或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述ARDS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防全身性炎性反应综合征(SIRS)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述SIRS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防移植物抗宿主病(GVHD)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述RDS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防肿瘤形成或生长的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述肿瘤形成或生长或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防呼吸窘迫综合征(RDS)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述RDS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的缺血性视网膜静脉阻塞(IRVO)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述IRVO或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的非增殖性糖尿病型黄斑水肿(DME)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述DME或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防早产儿视网膜病变(ROP)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述ROP或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的糖尿病性视网膜病(DR)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述DR或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的湿型黄斑变性(AMD)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述AMD或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的局部缺血的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述局部缺血或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的出血性中风的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述出血性中风或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的再灌注损伤例如在心肌梗塞和中风中观察到的再灌注损伤的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述再灌注损伤或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的皮肤血管缺陷或畸形的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述缺陷或处于罹患风险的对象，以及给对象的皮肤施用治疗有效量的roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防禽流感的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述禽流感或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防成人呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述ARDS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的酉己《本。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防全身性炎性反应综合征(SIRS)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述SIRS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防移植物抗宿主病(GVHD)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述GVHD或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号、例如roundabout-4(Robo4)受亍本的酉己〈本。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防肿瘤形成或生长的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述肿瘤形成或生长或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防呼吸窘迫综合征(RDS)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述RDS或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的缺血性视网膜静脉阻塞(IRVO)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述IRVO或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的非增殖性糖尿病型黄斑水肿(DME)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述DME或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roimdabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防早产儿视网膜病变(ROP)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述ROP或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受<本的配{本。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的糖尿病性视网膜病(DR)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述DR或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的湿型黄斑变性(AMD)的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述AMD或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的局部缺血的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述局部缺血或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的出血性中风的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述出血性中风或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的再灌注损伤例如在心肌梗塞和中风中观察到的再灌注损伤的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述再灌注损伤或处于罹患风险的对象，以及给对象施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。在另一个实施方案中，提供了治疗或预防对象的皮肤血管缺陷或畸形的方法，其中所述方法包括鉴定患有所述斑点或处于罹患风险的对象，以及给对象的皮肤施用治疗有效量的排斥性导向信号，例如roundabout-4(Robo4)受体的配体。适合于与本文描述的方法结合使用的配体包括，例如，本文描述的配体。例如，在具体的实施方案中，本文描述的与Robo受体包括Robo4受体相关的组合物，以及与Unc5或结肠直肠癌中缺失的(DCC)受体相关的组合物，可以在本发明的方法中用作配体。更具体来说，例如，本文描述的slit化合物可用作配体，用于激活Robo4并实现本文描述的方法的治疗效益。在某些情况下，对象通过医学诊断来鉴定。例如，患有糖尿病型视网膜病和黄斑变性的对象，可以通过观察眼睛中的过量血管来鉴定。急性肺损伤可以通过在不存在充血性心力衰竭情况下的肺水肿来诊断。缺血性中风可以通过神经图像和成像(MRI禾nCT)来诊断。其它已知的或新发现的医学测定可用于鉴定对象以用于本公开的方法。此外，对象可以通过遗传易感性来鉴定。例如，使患者对衰老相关的黄斑变性易感的基因已经被鉴定(KleinRJ等，2005;YangZ等，2006;DewanA等，2006)。同样地，使患者对脑中血管畸形易感的遗传突变已经被鉴定(PlummerNW等，2005)。其它已知的或新发现的遗传测定可用于鉴定对象以用于本公开的方法中。本文公开的核酸和多肽分子、以及任何执行本公开的方法所必需的组合物，除非另有特别指示，可以使用本
技术领域：
的专业人员已知的、用于该特定试剂或化合物的任何方法来制备。例如，核酸例如要用作引物的寡核苷酸，可以使用标准的化学合成方法来制备，或者可以使用酶法或任何其它已知的方法来生产。这样的方法范围可以从标准的酶法消化然后进行核苷酸片段分离(参见例如，Sambrook等，《分子克隆实验室指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual),第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)第5,6章)，到纯粹的合成方法，例如使用Milligen或Beckman系统lPlusDNA合成仪(例如，Milligen-Biosearch,Burlington,MA的8700型自动化合成仪或ABI380B型)通过氰乙基亚磷酰胺方法。可用于制备寡核苷酸的合成方法也被Ikuta等，Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)(磷酸三酯和亚磷酸三酯方法)和Narang等，MethodsEnzymol.，65:610-620(1980)(磷酸三酯方法)描述。蛋白核酸分子可以使用已知的方法来制备，例如由Nielsen等，Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)描述的方法。一种生产本文描述的公开蛋白的方法是通过蛋白质化学技术，将两个或多个肽或多肽连接在一起。例如，可以使用现有的实验室设备，应用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学法，化学合成肽或多肽(AppliedBiosystems，Inc.,FosterCity,CA)。本
技术领域：
的专业人员可以容易地认识到，例如，对应于本公开蛋白的肽或多肽，可以通过标准的化学反应来合成。例如，可以合成肽或多肽，并且不将其从合成树脂上裂解下来，但是可以合成肽或蛋白的另一个片段，然后从树脂上裂解下来，从而暴露出另一个片段上被功能性阻断的端基。通过肽縮合反应，这两个片段可以通过肽键分别在它们的羧基和氨基末端共价连接，以形成抗体或其片段(GrantGA(1992)《合成的肽用户指南》(SyntheticPeptides:AUserGuide)，W.H.FreemanandCo.，N.Y.(1992);BodanskyM和TrostB.，主编(1993)《肽合成原理》(PrinciplesofPeptideSynthesis)，Springer-VerlagInc.,NY(在此至少以其与肽合成有关的材料引为参考)。或者，肽或多肽按照本文的描述在体内独立地合成。一旦分离后，这些独立的肽或多肽可以被连接，通过类似的肽縮合反应形成肽或其片段。例如，克隆的或合成的肽段的酶法连接允许将相对短的肽片段连接起来，产生较大的肽片段、多肽或全蛋白结构域(AbrahmsenL等，Biochemistry,30:4151(1991))。或者，合成的肽的天然化学连接，可用于从较短的肽片段合成性地构建大的肽或多肽。该方法由两步骤化学反应构成(Dawson等，通过天然化学连接合成蛋白(SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation)，Science,266:776-779(1994))。第一步是未保护的合成肽-硫酯与氨基末端含有Cys残基的另一种未保护的肽片段进行化学选择性反应，给出了硫酯连接的中间体作为最初的共价产物。不需要改变反应条件，该中间体经历了自发的、快速的分子内反应，在连接位点处形成了天然的肽键(BaggioliniM等，(1992)FEBSLett.307:97-101;Clark-LewisI等，J.Biol.Chem.，269:16075(1994);Clark-LewisI等，Biochemistry,30:3128(1991);RajarathnamK等，Biochemistry33:6623-30(1994))。或者，将未保护的肽片段化学连接，由于化学连接在肽片段之间形成的键是非天然的(非肽)键(Schnolzer,M等，Science,256:221(1992))。这种技术已经被用于合成蛋白结构域的类似物，以及大量相对纯的具有完全生物学活性的蛋白(deLisleMiltonRC等，《蛋白质化学中的技术》(IV)(TechniquesinProteinChemistryIV)，AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))。公开了用于制造本文公开的核酸以及用于制造可用于表达本文描述的蛋白和肽分子的核酸的方法。有各种各样的方法可用于制造这些组合物，例如合成化学方法和标准的分子生物学方法。应该理解，制造这些以及其它公开的组合物的方法已具体公开。公开了通过下面的方法生产的核酸分子，该方法包括以可操作的方式，将含有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28中显示的序列的核酸，与控制所述核酸表达的序列连接起来。还公开了通过下面的方法生产的核酸分子，该方法包括以可操作的方式，将含有与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28中显示的序列具有80%同一性的序列的核酸分子，与控制所述核酸表达的序列连接起来。公开了通过下面的方法生产的核酸分子，该方法包括以可操作的方式，将所含的序列在严紧杂交条件下与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26或SEQIDNO:28中显示的序列杂交的核酸分子，与控制所述核酸表达的序列连接起来。公开了通过下面的方法生产的核酸分子，该方法包括以可操作的方式，将所含的序列编码SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一个中显示的肽的核酸分子，与控制所述核酸分子表达的序列连接起来。公开了通过下面的方法生产的核酸分子，该方法包括以可操作的方式，将所含的序列编码的肽与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一个中显示的肽具有80%同一性的核酸分子，与控制所述核酸分子表达的序列连接起来。公开了通过下面的方法生产的核酸分子，该方法包括以可操作的方式，将所含的序列编码的肽SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、或SEQIDNO:36到SEQIDNO:47中任何一个中显示的肽具有80%同一性、并且其中任何变化都是保守变化的核酸分子，与控制核酸分子表达的序列连接起来。治疗用药本文公开的组合物，包括药物组合物，可根据所需的是局部还是全身性治疗、以及依要治疗的区域，以多种方式给药。例如，公开的组合物可以静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、透皮、口服、肠胃外(例如静脉内)、气管内、眼、阴道、直肠、鼻内、局部等给药，包括鼻内局部给药或吸入给药。组合物的肠胃外给药，如果采用的话，一般特征是注射。注射剂可以制备成常规的形式，为液体溶液或悬浮液、适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或为乳液。用于肠胃外给药的修改方法包括使用缓释或持续释放的系统，以维持恒定的剂量。参见例如美国专利No.3,610,795，在此引为参考。本文公开的组合物可以向处于血管通透性或病理性血管生成风险下的患者或对象预防性给药。因此，方法还能包括在施用本文公开的组合物之前，鉴定处于血管通透性或病理性血管生成风险下的个体。所需组合物的准确量将根据对象的物种、年龄、体重和总体情况、被治疗的过敏性疾病的严重性、使用的具体核酸或载体、其给药模式等，在对象与对象之间不同。因此，不可能为每种组合物指定准确的量。例如，施用组合物的有效剂量和时间计划可以通过经验确定，做出这样的决定在本
技术领域：
的技术范围内。所施用组合物的剂量范围要大到足以产生影响症状疾病的所需效应。剂量不应该大到以至于引起不利的副作用，例如不想要的交叉反应、过敏反应等。一般来说，剂量将随着患者的年龄、状况、性别、患病程度、给药途经、或者治疗方案中是否包含其它药物而变化，可以由本
技术领域：
的专业人员来确定。在任何禁忌症的事件下，剂量由个体医生进行调整。剂量可以变化，可以每天施用一剂或多剂，为期一天或几天。在文献中可以找到对于给定类型的药物产品的适合剂量的指导。例如，选择抗体的适合剂量的指导可以在关于抗体的治疗性应用的文献中找到，例如《单克隆抗体手册》(HandbookofMonoclonalAntibodies),Ferrone等主编，NogesPublications,ParkRidge,NJ.，(1985)第22章禾口303-357页;Smith等，《人类诊断和治疗中的抗体》(AntibodiesinHumanDiagnosisandTherapy),Haber等主编，RavenPress,NewYork(1977)pp.365-389。单独使用肽或蛋白治疗药剂的典型每日剂量可在每天大约1pg/kg到最多100mg/kg体重的范围内，这取决于上面提到的因素。例如，本文公开的配体、蛋白、肽和导向信号的浓度在对象体内可以在大约lpM到lOO^M的范围内，包括大约lpM、2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、大约10pM、大约20nM、大约30nM、大约40nM、大约50nM、大约60nM、大约70nM、大约80nM、大约90nM、或大约100nM、大约l(iM、2)iM、3pM、4pM、5pM、6fiM、7|iM、8pM、869pM、大约10pM、大约20^M、大约30|iM、大约40pM、大约50pM、大约60nM、大约70(iM、大约80pM、大约90pM、或大约100pM。实施例下面提供的实施例仅仅是出于说明的目的，不打算以任何方式对本文描述的组合物和方法的范围进行限制。在每种情况下，除非另有指明，标准的材料和方法被用于执行在所提供的实施例中描述的工作。所有在本说明书中引用的专利和文献参考在此以其全文引为参考。除非另有指明，本发明的实践运用了化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学、免疫学、细胞生物学、细胞培养和转基因生物学的常规技术，它们都在本
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的技术范围之内(参见例如Maniatis，T.等，(1982)《分子克隆实验室指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Sambrook,J.等(1989)，《分子克隆实验室指南》(第二版)(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Ausubel,F.M.，等(1992)，《分子生物学现代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),(J.WileyandSons,NY);Glover，D.(1985)《DNA克隆》(I和II)(DNACloning,IandII)(OxfordPress);Anand,R.(1992)《复杂基因组的分析技术》)TechniquesfortheAnalysisofComplexGenomes)，(AcademicPress);Guthrie,G.和Fink，G.R.(1991)《酵母遗传学和分子生物学指导》(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology)(AcademicPress);Harlow和Lane(1988)《抗体实验室指南》(Antibodies:ALaboratoryManual)(ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.);Jakoby,W.B.禾口Pastan,I.H.(主编)(1979)《细胞培养.酶学方法》，第58巻(CellCulture.MethodsinEnzymology，Vol.58)(AcademicPress,Inc.,HarcourtBraceJovanovich(NY);《核酸杂交》(NucleicAcidHybridization)(B.D.Hames&S.J.Higgins主编，1984);《转录和翻译》(TranscriptionAndTranslation)(B.D.Hames&S.J.Higgins主编，1984);《动物细胞的培养》(CultureOfAnimalCells)(R.I.Freshney，AlanR.Liss,Inc.,1987);《固定细胞和酶》(ImmobilizedCellsAndEnzymes)(IRLPress,1986);B.Perbal，《分子克隆实践指导》(APracticalGuideToMolecularCloning)(1984);《专论，酶学方法》(thetreatise,MethodsInEnzymology)(AcademicPress,Inc.,N.Y.);《用于哺乳动物细胞的基因转移载体》(GeneTransferVectorsForMammalianCells)(J.H.Miller禾口M.P.Calos主编，1987,ColdSpringHarborLaboratory);酶学方法(MethodsInEnzymology),154和155巻(Wu等主编)；《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》(ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology)(Mayer禾口Walker主编，AcademicPress,London,1987);《实验免疫学手册》(HandbookOfExperimentalImmunology),I-IV巻(D.M.Weir和C.C.Blackwell主编，1986);Hogan等主编(1994)，《小鼠胚胎操作.实验室指南》(第二版)，(ManipulatingtheMouseEmbryo.ALaboratoryManual,2ndEdition)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.。用于人类基因作图、包括人类1号染色体作图的技术和材料的总体讨论，提供在例如White和Lalouel(1988)Ann.Rev.Genet.22:259-279中。除非另外指明，本发明的实践运用了化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学和免疫学的常规技术。(参见例如Maniatis等，1982;Sambrook等，1989;Ausubel等，1992;Glover,1985;A腿d,1992;Guthrie和Fink,1991)。在本文中没有任何东西将被解释为承认本发明没有权利利用现有的发明使本公开内容得以提前。没有承认任何参考文献构成了现有技术。对参考文献的讨论陈述了它们作者的主张，申请人保留挑战所引用文件的准确性和相关性的权利。应该清楚地理解，尽管在本文中引用了大量出版物，但这些引用并不构成承认任何这些文献形成了本
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的通用知识的部分。实施例1Robo4为体内血管导向所需在过去十年间，斑马鱼成为分析血管发育的有吸引力的模型(Weinstein，2002)，被选来研究Robo4在体内的生物学重要性。为了抑制Robo4基因表达，使用了以前描述的靶向Robo4前mRNA外显子10-内含子10边界的阻断剪接的吗啉代(Bedell等，2005)。为了证实Robo4吗啉代的功效，从未注射和注射了吗啉代的胚胎分离了RNA，使用位于靶外显子侧翼的引物通过RT-PCR进行了分析(图8A)。注射Robo4吗啉代与未注射的对照相比，导致野生型RNA的完全丢失，表明了吗啉型(morphant)斑马鱼无Robo4功能(图8B)。TG(flil:egfp,斑马鱼胚胎在内皮特异性flil启动子控制下表达绿色荧光蛋白，并允许在体内详细地观察发育中的内皮，被利用来评估吗啉代介导的Robo4敲除对血管发育的后果(图1A;Lawson和Weinstein，2002)。在48hpf时，注射了Robo4MO的胚胎表现出原始轴管(背主动脉和后主静脉)的野生型形成，以及分别表明血管发生和血管生成的背部纵向吻合血管和脊索旁血管，没有受到Robo4水平降低的影响(图1B，右图)。但是，在Robo4吗啉型中观察到了节间血管体系结构中的显著程度的异常。在野生型胚胎中，节间血管起于背主动脉，并朝向胚胎的背部表面生长，紧挨着体节边界。正是这种体节间的精确轨迹决定了节间血管的特征性人字形形状(图1A，右图)。Robo4吗啉型胚胎的节间血管没有采取这种典型的型式，而是向错误的方向生长(图1B，右图白色箭头表示异常的血管)。在48hpf时，60%注射了RoboMO的胚胎表现出这种缺陷，相比较而言在野生型胚胎中只有5%。重要的是，通过相位显微镜，不能将Robo4吗啉型与对照胚胎区分开，表明观察到的血管成型缺陷不是总的形态学扰乱的结果。这些数据合在一起，证明了在斑马鱼血管发育过程中需要Robo4，并表明该受体的功能性结果引发了排斥性导向信号。实施例2Robo4的胞质尾区为体内血管导向所需接下来确定了在Robo4吗啉型中观察到的血管缺陷是否能够通过重构robo4来抑制。将robo4MO和耐受吗啉代的野生型鼠Robo4RNA注射到TG(flil:egfp)yl胚胎中，在48hpf时分析血管的成型。在大约60%的吗啉型胚胎中，Robo4RNA恢复了主干血管的典型型式，证实了基因敲除的特异性(图1B和C，右图)。robo4调控血管发育的能力可能是它传递细胞质信号的能力的结果。为了证实这种想法，将Robo4MO和缺少了受体与细胞质成分相互作用的部分的鼠Robo4突变体形式(robo4Atail)进行共同注射，在48hpf时评估血管的体系结构。与野生型Robo4RNA不同，robo4Atail不能挽救吗啉型胚胎中的成型缺陷(图1B和D，右图)。这些数据证明，在Robo4的胞质尾区中包含的信息对于斑马鱼胚胎发生过程中的血管导向是关键的。合在一起，这些体内分析表明，Robo4活性是脊椎动物血管发育过程中精确确定节间血管的轨迹所需要的。实施例3Robo4胞质尾区为抑制趋触性所需Slit2-Robo4信号传导抑制了初级内皮细胞朝向VEGF梯度迁移，以及异位表达Robo4的HEK293细胞朝向血清的迁移(Park等，2003;Seth等，2005)。除了可溶性生长因子之外，固定的细胞外基质蛋白例如纤连蛋白在细胞的活动性中发挥了重要作用(Ridley等，2003)，并且纤连蛋白的梯度可以在称为趋触性的过程中指导迁移。事实上，最近显示，在早期斑马鱼胚胎中，纤连蛋白位于迁移的内皮细胞附近(Jin等，2005)。Robo4为体内内皮细胞正确迁移所需的观察结果(图1)，表明了Slit2-Robo4信号传导调节纤连蛋白诱导的趋触性的能力。将HEK293细胞用Robo4或Robo4Atail转染(图2A)，在用纤连蛋白和Slit2的混合物包被的膜上进行趋触性迁移分析。Slit2抑制了表达Robo4而不是Robo4Atail的细胞的纤连蛋白诱导的迁移，证实了Robo4胞质尾区对于受体的排斥性活性是关键的(图2B)。接下来确定了Robo4胞质尾区中抑制细胞迁移所需的区域。将HEK293细胞用Robo4缺失构建体转染(图2A)，并进行趋触性迁移分析。表达Robo4-NH2、而不是表达Robo4-COOH的细胞的纤连蛋白依赖性迁移被Slit2抑制(图2C)，证明了Robo4胞质尾区的N-端一半对于调节细胞活动性来说是必需的和足够的。实施例4桩蛋白家族成员是Robo4相互作用蛋白Robo4胞质尾区中赋予功能性活性的区域的鉴定，允许对可以调控Robo4信号传导的细胞质成分进行搜索。使用Robo4尾区的N-末端一半作为诱佴，对人类主动脉cDNA文库进行酵母双杂交筛选，鉴定了桩蛋白接头蛋白家族的一个成员Hic-5，作为可能的Robo4相互作用蛋白(图8)。为了证实这种相互作用，分离Hic-5质粒，并将其与Robo4或空载体重新转化到酵母中。只有共表达Robo4和Hic-5的菌株才能够生长在营养缺陷培养基上，并诱导强有力的p-半乳糖苷酶活性(图8B)。为了进一步证实这种相互作用，使用以Hic-5和Robo4胞质尾区共转染的哺乳动物细胞进行了免疫共沉淀实验。在表达Robo4和Hic-5的HEK293细胞的抗Robo4免疫沉淀物中发现了Hic-5，但是在只表达Hic-5的细胞中没有发现(图3A)。合在一起，这些数据证明了在酵母和哺乳动物细胞中，Hic-5与Robo4细胞质尾部特异性相互作用。Hic-5及其旁系同源物桩蛋白，可以表现出细胞类型特异性的表达(Turner,2000;Yuminamochi等，2003)。因此，确定了这些蛋白中的哪些在用于趋触性迁移分析的细胞系HEK293细胞中表达。将CHO-Kl、HEK293禾t]NIH3T3细胞的细胞裂解物与针对Hic-5或桩蛋白的抗体进行Western印迹分析，在所有细胞系中检测到了桩蛋白，但是只在CHO-K1和NIH3T3细胞中发现了Hic-5(图3B)。这不仅表明Hic-5和桩蛋白能够与Robo4相互作用以调节细胞的迁移，而且表明桩蛋白可能是HEK293细胞中的结合配偶体。从后一种想法着眼，使用表达桩蛋白和Robo4胞质尾区的哺乳动物细胞进行了免疫共沉淀实验。正像用Hic-5观察到的，在表达桩蛋白和Robo4的HEK293细胞的抗Robo4免疫沉淀物中鉴定到了桩蛋白，当在仅表达桩蛋白的细胞中没有(图3C)。因为Slit2是Robo4的生理配体(Park等，2003;Hohenester等，2006)，因此确定了Slit2刺激是否调控了Robo4和桩蛋白之间的相互作用。将表达Robo4的HEK293细胞在存在和不存在Slit2的情况下温育。在存在Slit2的情况下，在Robo4免疫沉淀物中检测到了内源桩蛋白。与此形成鲜明对照的是，在不存在Slit2的情况下，在免疫沉淀物中没有检测到桩蛋白(图3E)。因此，Robo4与Slit2的接合刺激了它与桩蛋白的结合。实施例5鉴定Robo4的桩蛋白相互作用基序为了精确地确定Robo4中与桩蛋白相互作用所需的区域，产生了一系列跨越胞质尾区的整个长度的GST-Robo4融合蛋白(图4A)。用纯化的重组桩蛋白进行的体外结合分析证明，Robo4尾区的氨基端一半(494-731)对于与桩蛋白的直接相互作用是必需的和充分的(图4B)。然后产生了含有胞质尾区的氨基端一半的大约70个氨基酸片段的4种其它的GST-Robo4融合蛋白(图4C)。体外结合分析表明，桩蛋白选择性地与Robo4尾区的位于CC0和CC2基序之间的片段(604-674;图4D)相互作用。为了确定该Robo4区域是否是与桩蛋白相互作用所必需的，从胞质尾区中删除了604-674位氨基酸，并对该突变体GST-Robo4融合蛋白进行了体外结合分析。尽管与桩蛋白的相互作用减弱了，但与已知的Robo4结合蛋白Mena的结合也减弱了，这表明消除604-674位氨基酸影响了Robo4尾区的构象。为了避免这个问题，在该70个氨基酸的一段序列内产生了较小的缺失，并进行了另外的体外结合分析。用这种方法，鉴定到了缺少36个氨基酸(604-639;图9)的突变GST-Robo4融合蛋白，它丧失了与桩蛋白的结合，但是保留了与Mena的结合(图4E)。至此，该Robo4区域被称为桩蛋白相互作用基序(PIM)。实施例6桩蛋白相互作用基序是Robo4依赖性的趋触性抑制所需的接下来确定了Robo4的桩蛋白相互作用基序对于受体的功能活性是否是重要的。通过位点定向诱变产生了全长Robo4的缺少604-639位氨基酸的突变形式(Robo4APIM)，并用于趋触性迁移分析中。Robo4APIM不能介导Slit2指导的抑制朝向纤连蛋白梯度的迁移(图4F)，证明了Robo4尾区的桩蛋白结合所必需的区域，对于Robo4依赖性抑制细胞迁移来说，同样是需要的。实施例7Slit2-Robo4信号传导抑制了细胞铺展和粘附依赖性的Rac活化固定的Slit2抑制表达Robo4的细胞在纤连蛋白上迁移的能力，可能来自于对该ECM蛋白上粘附和/或铺展的负调控。为了确定Slit2-Robo4信号传导是否影响了这些过程，将HEK293细胞用Robo4或空载体(pcDNA3)进行转染，并在纤连蛋白上进行粘附和铺展分析。尽管表达Robo4的细胞正常粘附于包被了纤连蛋白和Slit2的盖玻片，但是与用pcDNA3转染的细胞相比，它们的铺展显著减少(图5A)。这些数据表明，Slit2-Robo4信号传导调节了细胞内控制细胞铺展的途径。细胞在ECM蛋白例如纤连蛋白上铺展的能力，受到Rho家族的小GTPases活化的调控，其中包括Rho、Cdc42和Rac迁移(Nobes和Hall，1995;Nobes和Hall,1998)。在这些蛋白中，Rac在促进导致细胞铺展和迁移的肌动蛋白聚合中发挥了基本的作用(Nobes和Hall，1995;Nobes和Hall，1998)。这种在Rac和细胞铺展之间建立的关系表明，Slit2-Robo4信号传导可能抑制了Rac的粘附依赖性活化。为了评估这种可能性，将HEK293细胞用Robo4或pcDNA3进行转染，铺板在用纤连蛋白和Slit2包被的皿上，用GST-PBDpulldown分析来分析Rac-GTP的水平。表达Robo4的细胞与用pcDNA3转染的细胞相比，表现出了粘附剌激的Rac活化显著较低(图5B和C)。为了证实这种93效应的特异性，在表达Robo4的细胞中也检测了Cdc42的活化，它们同样暴露于Slit2(图11A)。该结果得到了Robo4不与Robo1结合蛋白srGAPl----种已知的Cdc42的GTPase活化蛋白——相互作用的观察结果的支持(图11B)。总之，这些数据证明了Slit2-Robo4信号传导特异性抑制粘附诱导的Rac活化。实施例8桩蛋白相互作用基序是Robo4依赖性抑制细胞铺展和Rac活化所需的接下来，评估了Robo4APIM是否能够抑制纤连蛋白诱导的细胞铺展和Rac活化。用Robo4APIM转染HEK293细胞，铺在纤连蛋白和Slit2包被的表面上，进行铺展或Rac分析。该突变形式的受体不能抑制细胞铺展和粘附依赖性的Rac活化(图5D、E和F)，证明了桩蛋白相互作用基序对于Robo4的体外功能活性来说是必需的。为了证实细胞铺展的Robo4依赖性抑制主要是由于抑制Rac活化，将HEK293细胞用Robo4和显性活性形式的Rac——Rac(G12V)进行共转染，并进行铺展分析。表达Rac(G12V)的细胞耐受了Robo4依赖性抑制细胞铺展(图5G)，证明了Slit2-Robo4信号传导通过抑制Rac活性而阻断铺展。实施例9Slit2在初级人类内皮细胞中抑制VEGF诱导的Rac活化Slit2抑制了几种初级人类内皮细胞系的VEGF刺激的迁移(Park等，2003)，并且Rac在VEGF诱导的细胞运动中扮演了基本的角色(Soga等，2001a;Soga等，2001b)。因此，确定了Slit2-Robo4信号传导在内源背景下是否能够抑制Rac的活化。在存在和不存在Slit2的情况下，用VEGF刺激人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并用GST-PBDpulldown分析来分析GTP-Rac水平。Slit2处理完全抑制了VEGF刺激的Rac活化(图5H和I)，证明了内源Slit2-Robo4信号传导调节了Rac的活化。实施例10桩蛋白的Lim4是与Robo4相互作用和Robo4依赖性抑制细胞铺展所需的尽管Robo4APIM维持了它与Mena的相互作用(图4E)，但是有可能这种突变干扰了Robo4与桩蛋白之外的蛋白的相互作用。为了专门解决这个问题，产生了与Robo4的结合被破坏的桩蛋白突变体。桩蛋白是调节蛋白，由N-末端的亮氨酸/天冬氨酸(LD)重复序列和C-末端的Lim结构域构成(图6A)。对从酵母双杂交筛选回收的克隆的分析(参见图9A)表明，Lim结构域，特别是Lim3和Lim4，对于与Robo4的相互作用是重要的。为了证实这种想法，用Robo4尾区与桩蛋白-LD或桩蛋白-Lim共转染的HEK293细胞进行了免疫共沉淀实验。在Robo4免疫共沉淀物中发现了桩蛋白-Lim，但是没发现桩蛋白-LD(图6B)，证实了桩蛋白的Lim结构域对于与Robo4的相互作用来说是必需的和充分的。为了阐明哪个Lim结构域是与Robo4结合所需，从桩蛋白的羧基末端制造了系列缺失，与Robo4尾区共转染到HEK293细胞中，并进行免疫共沉淀实验。桩蛋白的Lim4结构域缺失完全废止了与Robo4的结合(图6C)，证明桩蛋白的该区域对于其与Robo4相互作用的能力是关键的。描绘桩蛋白上的Robo4结合位点，允许对桩蛋白在Robo4依赖性抑制细胞铺展中的作用进行直接评估。在HEK293细胞中使用siRNA将内源性桩蛋白敲除，并用野生型鸡桩蛋白(Ch-桩蛋白)或Ch-桩蛋白ALim4进行重构(图6D)。然后将这些细胞在纤连蛋白和Slit2包被的盖玻片上进行铺展分析。表达Ch-桩蛋白ALim4的细胞耐受Robo4依赖性抑制细胞铺展，而表达Ch-桩蛋白的细胞表现出特征性的细胞面积减少(图6E)。这些数据证实了桩蛋白与Robo4的相互作用能够使Slit2-Robo4信号传导抑制细胞铺展。实施例11桩蛋白相互作用基序是体内血管导向所需的评估斑马鱼血管发育期间，对Robo4的桩蛋白相互作用基序的需求。正如前面描述的，95将robo4MO注射到TG(flil:egfp,胚胎中引起了节间血管的紊乱(参见图IB)。共注射robo4APIMRNA加深了robo4MO引起的缺陷，而野生型robo4RNA抑制了这些缺陷(图7A)。robo4Atail和robo4APIMRNA都不能挽救吗啉型(morphant)胚胎中的血管成型缺陷，证实该36个氨基酸的桩蛋白相互作用基序是Robo4胞质尾区中的关键信号传导模块。此外，这些数据表明，桩蛋白与Robo4之间的相互作用对于斑马鱼血管系统的适当成型是必需的。实施例12我们测定到Robo4与桩蛋白相互作用和抑制突出活性，这促使我们确定Robo4是否影响了Arf6途径。将表达alIb-Robo4:(33的细胞铺于单独的纤连蛋白、或纤连蛋白和纤维蛋白原上，并用GST-GGA3亲和沉淀技术分析Arf6-GTP的水平。尽管纤连蛋白刺激了Arf6的活化，但纤维蛋白原降低了表达alIb-Robo4:(33的细胞中的Arf6-GTP水平(图16A)。该结果证实了Robo4信号传导抑制了Arf6的活化，并表明Robo4阻断Rac活性的能力来自于它对Arf6的调控。接下来，我们分析了在Robo4依赖性抑制突出活性中对桩蛋白-GIT1复合体的需要。在蛋白的羧基末端上发现了GIT1上的桩蛋白结合序列(PBS)，并已经显示出阻止了GITl和桩蛋白的相互作用(Uemura等，2006)。将细胞用alIb-Robo4:(33与空载体或GIT1-PBS转染，在纤连蛋白、或纤连蛋白和纤维蛋白原上进行铺展分析。正如前面描述的，表达alIb-Robo4:f33的细胞当铺于纤维蛋白原上时显示出细胞面积降低，但是在用GIT1-PBS转染的细胞中面积这种现象消失了(图16B)。我们在铺于纤连蛋白或纤连蛋白和Slit2上的表达全长Robo4的细胞中重复了这个实验，与嵌合受体实验相似，GIT1-PBS阻止了Slit2依赖性减少细胞面积(图16C)。这些数据证实了功能性桩蛋白复合体是Slit2-Robo4信号传导所需的。为了确定Slit2-Robo4信号传导是否通过失活Arf6抑制突出活性，我们将Arf6鸟嘌呤核苷交换因子ARNP与Robo4共转染，并进行了铺展分析。ARNO的过表达阻断了Slit2降低细胞面积的能力，表明Slit2-Robo4信号传导的主要作用是防止Arf6的GTP负载(图16C)。如果ARNO恢复了表达Robo4的细胞在Slit2上铺展的能力，我们推论它将同样重建Rac响应纤连蛋白的活化。事实上，ARNO的过表达在铺于纤连蛋白和Slit2上的细胞中导致了正常水平的GTP-Rac(图16D)。这些实验合在一起，证明了Slit2-Robo4信号传导使Arf6失活，导致了Rac活化的局部阻断，并随后抑制了细胞铺展和迁移所必需的膜突出。实施例13免疫沉淀证实了Slit配体和Robo4受体之间的相互作用未感染的人类胚胎肾细胞(HEK)、用带有myc表位标签的Slit转染的HEK细胞(Slit-myc)、用带有HA表位标签的Robo4转染的HEK细胞(Robo4-HA)以及用对照载体转染的HEK细胞(对照-HEK)的细胞裂解液，进行免疫沉淀。在将Slit-myc和Robo4-HA细胞裂解液混合并用抗HA抗体免疫沉淀后，用抗myc抗体通过Western印迹检测Slit-myc蛋白(图17A，第6道)。该相互作用的特异性通过使用所有其它的裂解液组合时不能检测到Slit蛋白所证实(图17A，第2-5道)。在每个实验中使用了同样量的裂解液。Slit-myc细胞裂解液的Western印迹分析被用作对照，证明了Slit蛋白与以前的报道相一致，具有大约210kD的分子量(图17A，第l道)。图17A第2-6道中显示的较低条带对应于免疫球蛋白重链。对来自未转染的HEK细胞(HEKCM)、用带有myc表位标签的Slit转染的HEK细胞(Slit-mycCM)、用带有HA表位标签的Robo4的N-端可溶性胞外结构域转染的HEK细胞(NRobo4-HACM)、以及用对照载体转染的HEK细胞(对照-HEKCM)的条件培养基，也进行了免疫沉淀。在Slit-mycCM中通过抗myc抗体检测到了全长Slit-myc蛋白(210KD)及其C-端蛋白水解片段(70KD)(图17B，第1道)。在将Slit-myc和Robo4-HA条件培养基混合并用抗HA抗体免疫沉淀后，也通过Western印迹检测到了Slit-myc蛋白(图17B，第6道)。该相互作用的特异性由使用所有其它的条件培养基的组合时不能检测到Slit蛋白所证实。如图17C-图17F所示，Slit蛋白与表达Robo4的细胞的质膜结合。Slit-myc蛋白的结合可以使用抗myc抗体和Alexa594结合的抗小鼠抗体来检测。正如可以在图17D和图17F中看到的，在Robo4-HEK细胞的表面(图17F)而不是对照-HEK细胞的表面(图17D)上检测到了么±a实施例14Robo4敲除小鼠为了确定Robo4在体内的功能意义，用标准技术产生了敲除小鼠。为了生产敲除小鼠，运用同源重组，将表达Robo4的基因的外显子1到5用碱性磷酸酶(AP)报告基因代替。该等位基因Robo4AP，缺少编码Robo4胞外结构域的免疫球蛋白(IgG)重复序列的外显子，这些外显子据预测是与Slit蛋白相互作用所需要的。将Robo4WAP动物互交，以产生靶等位基因纯合的小鼠。关于小鼠的基因组结构的图示提供在图25中。Robo4APZAP动物是有生活力和生育力的，表现出血管系统的正常成型。这些数据表明，在发育的小鼠中，Robo4对于萌发中的血管生成不是必需的，并指出了在哺乳动物内皮中存在Robo4信号传导的可替代功能。在这些动物中，检测到碱性磷酸酶活性遍布发育中的胚胎和成年小鼠的所有血管床内皮中，这证实了Robo4AP等位基因是Robo4表达的有效标记物。实施例15Robo4活化稳定了成熟血管专门含有柄细胞的鼠视网膜血管丛的中心区域，是成熟、腔化的血管的分化/稳定表现型特征的例子。因此，我们推断，Robo4在柄细胞中的表达，可能通过抑制由促血管生成因子例如VEGF-A刺激的过程而维持这种表现型。使用VEGF-A内皮细胞迁移分析和VEGF-A管形成分析，评估了Robo4信号传导对VEGF-A刺激的过程的影响。这两种分析方法都常规用于体外研究血管生成。为了进行内皮细胞迁移和管形成分析，分离了来自Robo4+z+和Robo4APZAP小鼠的肺内皮细胞，并使用免疫细胞化学和流式细胞术证实了它们的身份。然后将这些细胞用于VEGF-A依赖性内皮细胞迁移和管形成分析中。在这些分析中使用的Slit2分子是Slit2N(SEQIDNO:39)。正如图19A和图19B中所示，Slit2抑制了Robo4W+内皮细胞的迁移和管形成。但是，在Robo4AP"P内皮细胞中，Slit2的抑制活性丧失了。这些结果证实，Slit2以Robo4依赖性方式抑制了内皮细胞迁移和管形成，并表明Robo4被Slit2的活化可用于使成熟血管的血管内皮稳定化。实施例16Robo4活化保护了内皮屏障功能在成熟的血管床中，内皮细胞的行为不是彼此独立的；相反，它们形成了单层，防止蛋白、流体和细胞从内皮腔运动到周围组织中。使用Transwell分析，体外模拟了这种屏障功能，以分析辣根过氧化物酶(HRP)运输穿过从Robo4+z+和Robo4^AP小鼠肺获得的内皮细胞的铺满细胞单层。用已知的通透性诱导因子VEGF-A刺激Robo4+"和Robo4AP/AP内皮细胞，增强了HRP在Transwell室下部中的积累。但是，如图19C中所示，用Slit2蛋白(Slit2N(SEQIDNO:39))预处理细胞单层，在Robo4+"内皮细胞中阻止了这种效应，但是在Robo4AP"P内皮细胞中没有。接下来，评估了Slit2在体内对内皮屏障功能的影响。通过将伊文思蓝注射到Robo4"+和Robo4AP/AP小鼠的尾静脉中，进行了Miles分析。然后在存在和不存在Slit2蛋白(Slit2N(SEQIDNO:39))的情况下将VEGF-A注射到真皮中。与体外分析类似，在Robo4+z+小鼠中，VEGF-A刺激的伊文思蓝向真皮的渗漏能够通过同时施用Slit2蛋白来防止，但是在Robo4AP"P小鼠中则不行(显示在图19D中)。这些观察被扩展到评估Slit2抑制VEGF-A诱导的视网膜内皮通透性过高的能力中。具体来说，发现在Robo4+"小鼠中玻璃体内注射VEGF-A诱导了伊文思蓝从视网膜血管的渗漏。但是，在Robo4"+小鼠中，这样的VEGF-A诱导的伊文思蓝从视网膜血管的渗漏通过共注射Slit2蛋白Slit2N(SEQIDNO:39))被抑制(图19E)。该实验在Robo4AP/AP小鼠的视网膜中进行了重复，发现Robo4^AP对Slit2N(SEQIDNO:39)的处理具有耐受性。这些数据证实了Robo4在体外和体内介导了Slit2依赖性抑制VEGF-A诱导的内皮通透性过高。实施例17Robo4阻断VEGF受体下游的VEGF信号传导VEGF-A促进血管生成和通透性的能力依赖于VEGFR2的活化，这是通过配体结合后的自身磷酸化而发生的。随后，许多非受体酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶和小GTPases以空间和时间特异性方式被激活，执行VEGF-A信号传导。为了确定Slit2-Robo4信号传导与VEGF-A-VEGFR2途径交叉，使用Slit2N(SEQIDNO:39)分析了VEGF-A禾PISlit2刺激后VEGFR2的磷酸化。Slit2N(SEQIDNO:39)对VEGF-A-诱导的VEGFR2磷酸化没有影响(图19F)，表明Slit2-Robo4途径一定在受体的下游与VEGF-A信号传导相交。然后将注意力集中于Src家族的非受体酪氨酸激酶FynYes和Src上，因为它们在介导VEGF-A诱导的血管生成和通透性中有被明确记录的功能(Eliceiri等，2002;Eliceiri等，1999)。用Slit2N(SEQIDNO:39)处理内皮细胞降低了VEGF-A刺激的c-Src磷酸化(图19G)。最近，几份报告显示出，Src依赖性Rho家族小GTPase——Rac1的活化，对于VEGF-A诱导的内皮细胞迁移和通透性是必要的(Gavard等，2006;Garrett等，2007)。用Slit2N(SEQIDNO:39)处理内皮细胞单层，防止了VEGF-A依赖性的Racl活化(图19H)。这些生物化学实验表明，Slit2-Robo4途径通过抑制Src-Racl信号传导轴，抑制了VEGF-A诱导的内皮细胞迁移和通透性过高。实施例18Robo4的活化在CNV和OIR模型中减少了血管渗漏和病理性血管生成氧诱导的视网膜病(OIR)的鼠模型，其模拟在糖尿病型视网膜病和早产儿视网膜病中观察到的局部缺血诱导的血管生成，被用于研究Robo4信号传导对视网膜血管病的影响。在该模型中，将P7小鼠在75%氧环境中维持5天，然后返回到25%氧中维持另外5天。感知氧缺乏起动了视网膜中VEGF-A表达的快速增加，导致病理性血管生成(Ozaki等，2000;Werdich等，2004)。使用该模型对Robo4+"小鼠和Robo4AP/AP小鼠进行了评估。在Robo4+/"j、鼠中，玻璃体内施用Slit2N(SEQIDNO:39)明显降低了血管生成，但是在Robo4AP/AP小鼠中没有(图20A-图20E，其中箭头表示病理性血管生成的区域)。此外，在暴露于高氧条件之后，Robo4AP"P小鼠与Robo4"+小鼠相比，显示出了更具侵略性的血管生成(参见例如图20A和20C)。除了描述的OIR模型之外，激光诱导的脉络膜新生血管化模拟与衰老相关的黄斑变性，通常被用于在小鼠中研究病理性血管生成(Lima等，2005)。在该模型中，用激光破坏Bruch膜，这使得下方的脉络膜血管系统穿入视网膜下色素上皮。为了辨别Robo4信号传导对这种病理性过程的影响，对8-12周龄的Robo4+"和Robo4AP^P小鼠进行激光诱导的脉络膜新生血管化，然后在玻璃体内注射Slit2N(SEQIDNO:39)。与在氧诱导的视网膜病的小鼠模型中获得的结果类似，玻璃体内施用Slit2N在Robo4"+小鼠中减少了血管生成，但是在Robo4AP/AP小鼠中没有(参见图20F-图20J)。合在一起，氧诱导的视网膜病和脉络膜新生血管化模型表明，具有不同特征的两种血管床，一种是紧密的血脑屏障，另一种是有孔的内皮，通过Slit2-Robo4信号传导的活化得到保护，免受病理性损伤。实施例19Robo4抑制了来自多种使成熟血管去稳定化的因子的信号传导评估了Robo4被Slit2分子的活化对bFGF、血管生成因子和凝血酶活性以及内皮通透性因子的影响。如图21所示，Slit2N(SEQIDNO:39)阻断了bFGF诱导的内皮管形成和凝血酶诱导的通透性。这些研究证明了Slit-Robo4信号传导能够抑制由多种血管生成和通透性因子诱导的信号传导，并支持了Slit-Robo4途径保护成熟的血管床免于多种血管生成、通透性因子和细胞因子影响的概念。为了加强Robo4信号传导保护血管系统免于多种血管生成、通透性因子和细胞因子影响的了解，在急性肺损伤的小鼠模型中评估了Slit2N(SEQIDNO:39)对Robo4活化的影响。在该模型中，通过气管内给药给小鼠施用细菌内毒素LPS。暴露于细菌内毒素导致了细胞因子风暴，引起肺血管床的灾难性去稳定作用和产生非心源性肺水肿(Matthay等，2005)。在气管内施用LPS后，将小鼠用Slit2N(SEQIDNO:39)或模拟制备物处理，后者是用作对照的假蛋白提取物。如图22中所示，来自用Slit2N(SEQIDNO:39)处理的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)中的炎性细胞和蛋白的浓度，与用模拟制备物处理的小鼠中相比，明显较低。这些结果证实，在这些环境下，活化性Robo4提供了有力的血管稳定作用，并表明Slit2-Robo4是强有力的血管稳定作用途径，其功能是保护成熟内皮的完整性，并抗拒极端形式的细胞因子风暴维持血管的稳态。实施例20施用Slit2蛋白在小鼠禽流感模型中降低了死亡率在下面的实施例中，分析了Slit蛋白对禽流感病毒感染的小鼠存活率的影响。共120只雌性BALB/c小鼠鼻内接种了50|il1:400稀释的禽流感病毒株H5N1/Duck/Mn/1525/81。本实施例中使用的小鼠从CharlesRiver获得，平均体重在18-20克的范围内。参考表2，将小鼠随机分成六笼，每笼20只小鼠，对每组每天进行治疗，共5天。在治疗期间和之后，观察存活(死亡)和体重。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>简单来说，如表2所示，第l组用生理盐水溶液(PSS)阴性对照进行处理。2组和3组用模拟制备物处理。4组和5组用不同浓度的Slit蛋白(Slit2N(SEQIDNO:39))处理。作为阳性对照，6组的20只小鼠腹膜内用利巴韦林75mg/kg/天进行处理，用PSS调整到总体积0.1ml。分析的结果显示在图24中，并详述在表3中。在23天后，在4组和5组中用Slit蛋白处理的小鼠与1组、2组和3组中没有接受Slit蛋白的小鼠相比，具有较低的死亡率。4组的小鼠，用每剂12.5pgSlit处理，具有25。/。的存活率。5组的小鼠，用每剂1.25pgSlit处理，具有50%的存活率。与4组和5组的存活性相反，在1组中用PSS处理的阴性对照小鼠中，只有5%(1/20)存活过23天。表3显示了接种后14天，1组、2组和3组的存活者的平均体重明显低于4组和5组中Slit处理的存活者。此外，在Slit处理浓度较低的5组的10/20个小鼠，在21天时存活，体重平均为17.6克，几乎与17.7克的起始平均体重一样高。因此，那些用Slit蛋白处理的感染小鼠，能够比未处理的小鼠更好地维持它们的体重。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>表3(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>实施例21Slit蛋白的片段起活化Robo4的作用图23显示了Slit2蛋白的各种构建体。正如本文已经描述的那样，150kD蛋白Slit2N(SEQIDNO:39)已经被发现在体外和体内模型中是有效的，包括Miles分析、视网膜通透性分析、管形成和内皮细胞迁移、以及在眼疾病的OIR和CNV模型中。此外，正如在图23中所示，(40kD)蛋白SlitDl(SEQIDNO:42)禾BSlit2N(SEQIDNO:39)构建体在VEGF诱导的内皮细胞迁移分析中显示出与全长Slit2(SEQIDNO:40)相似的活性。材料和方法试剂HEK293和COS-7细胞以及所有IMAGE克隆来自ATCC。SP6和T7MessageMachine试剂盒来自Ambion。HUVEC、EBM-2和bullet试剂盒来自Cambrex。酵母双杂交质粒和试剂来自Clontech。FBS来自Hyclone。抗HA亲和基质、Fugene6和蛋白酶抑制剂混合物来自Roche。山羊抗小鼠HRP和山羊抗兔HRP第二抗体来自JacksonImmunoResearch。抗V5抗体、DAPI、DMEM、Lipofectamine2000、青霉素-链霉素、SuperscriptIII试剂盒、Trizol禾tlTrypLEExpress来自Invitrogen。抗FlagM2、磷酸化酶抑制剂混合物、大豆胰蛋白酶抑制剂和无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)来自Sigma。人类纤连蛋白来自BiomedicalTechnologies禾口Invitrogen。CostarTranswells禾口AmiconUltra-15浓縮柱来自Fisher。Rosetta2大肠杆菌来自Novagen。谷胱甘肽-Sepharose4B、亲本pGEX-4Tl禾BECLPLUS来自Amersham-Pharmacia。考马斯蓝禾QPVDF来自BioRad。Quickchange位点定向诱变试剂盒来自Stratagene。正常大鼠IgG琼脂糖结合物来自SantaCmz。Robo4吗啉代来自GeneTools。用于PCR的寡核苷酸来自UniversityofUtahCoreFacility。Alexa564-鬼笔环肽、抗GFP和山羊抗兔Alex488来自MolecularProbes。低熔点琼脂糖来自NuSieve。T7体外转录/翻译试剂盒来自Promega。分子生物学Robo4-HA、Slit2-Myc-His和鸡桩蛋白质粒以前已有描述(Park等，2003;Nishiya等，2005)。Robo4-NH2从Robo4誦HA扩增并克隆到pcDNA3-HA的EcoRV/Notl中。Robo4-COOH从Robo4-HA通过重叠延伸PCR扩增，并克隆至ljpcDNA3-HA的EcoRV/Notl中。人类Robo4胞质尾区的氨基端一半(AA465-723)通过PCR扩增并克隆到pGBKT7的(EcoRI/BamHI)中。鼠Robo4片段通过PCR扩增并克隆到pGEX-4Tl的BamHI/EcoRI中。鼠Hic-5、Mena和桩蛋白(包含缺失)从IMAGE克隆通过PCR扩增，并克隆到pcDNA3-V5的EcoRV/Notl中。GST-Robo4APIM和全长Robo4APIM通过使用QuickChange,对相关的野生型构建体进行位点定向诱变来产生。所有构建体的完整性通过在UniversityofUtahCoreFacility进行测序来证实。胚胎培养和斑马鱼原种斑马鱼，Daniorerio，按照标准方法进行维持(Westerfield，2000)。发育阶段使用在28.5°C孵产生的胚胎标准形态学特征来进行(Kimmel等，1995)。在本研究中使用的Tg(fli:EGFP)yl转基因斑马鱼系描述在Lawson和Weinstein，2002中。成像的胚胎在24hpf后用0.2mMl-苯基-2-硫脲(PTU)处理以防止色素形成。robo4的反义缺失将针对robo4的外显子10/内含子10剪接位点的反义吗啉代寡核苷酸(MO)(5'-tttttagcgtacctatgagcagtt-3'，SEQIDNO:28)分别溶解在1XDanieau's缓冲液中，浓度为5ng/nl。注射前，将吗啉代在65。C加热5分钟，短时冷却，与可忽略量的染料混合以监测注射的效率，将大约lnl注射到l-2细胞阶段的胚胎的流动卵黄中。反转录(RT)PCR:从20个未注射和20个注射了robo4MO的胚胎中使用Trizol试剂提取RNA，随后的cDNA合成使用SuperscriptIII进行，由随机六聚体和寡聚dT引物的混合物引发。通过PCR从cDNA扩增robo4，在夕卜显子8中使用正向引物(5'陽caacaccagacacttacgagtgcc-3'，SEQIDNO:29)和在外显子12中使用反向弓l物(5'-ttcgaaggccagaattctcctggc-3'，SEQIDNO:30)，采用的参数如下(94。C4分钟，94。C30秒，58。C30秒，68。C45秒，68。Cl分钟)。为了鉴定PCR反应的线性范围，对cDNA进行了23、25、27和30个循环的扩增。从所有样品使用正向引物(5'-cccaaggccaacagggaaaa，SEQIDNO:31)和反向引物(5'-ggtgcccatctcctgctcaa陽3'，SEQIDNO:32)扩增了(3-肌动蛋白，以控制cDNA的输入量。全胚胎间接免疫荧光简单来说，将年龄匹配的24和48hpf的胚胎脱绒毛膜，并在4%PFA/4。/。蔗糖/PBS中在4°C固定过夜。然后将胚胎在PBS/0.1%Tween-20中清洗，用无水甲醇脱水，在PBS-Tween20中重新水化，在PBS/1%Triton-X中进一步通透化，在PBS/1%Triton-X/2%BSA中漂洗，在室温下在PBS/1%Triton-X/2%BSA/10%绵羊血清/1%DMSO中阻断，然后在含有IgG纯化的抗GFP(1:400稀释)的阻断溶液中在4°C温育过夜。第二天，将胚胎在PBS/1%Tdton-X/2%BSA中大力清洗，然后在含有山羊抗兔Alexa488结合的第二抗体(l:200稀释)的阻断溶液中在4。C温育过夜。下一天，将胚胎在PBS/1%Triton-X/2%BSA中彻底清洗，然后包埋在含有1%低熔点琼脂糖的PBS中，在Leica共焦显微镜下照相，使用AdobePhotoshop软件进行处理。细胞培养HEK293和COS-7细胞培养在添加有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养在添加有10%FBS的EGM-2中。按照常规，使用传代2-5代之间的HUVEC。转染HEK293禾卩COS-7细胞用Fugene6或Lipofectamine2000按照制造商提供的方案进行转染。制备浓縮的Slit2蛋白将COS-7细胞用空pSECTAG2或pSECTAG2::hSlit2瞬时转染。48小时后，将细胞用PBS清洗两次，与6ml盐萃取缓冲液(10mMHEPES，pH7.5，1MNaCl禾PIX蛋白酶抑制剂)在25°C温育15分钟。重复进行盐萃取，将样品以10，000rpm离心20分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液加样到AmiconUltra-15浓縮柱/截止值100kDa，并离心直到12ml盐萃取液减少到大约500^1。浓縮的蛋白制备物通过考马斯蓝染色进行分析，并在4。C储存最多一周。使用这种方案，通常获得的Slit2的浓度为20-50|ig/ml。除了从用Slit2质粒转染的细胞制备浓縮的蛋白之外，对于用空载体(pSECTAG2)转染的细胞液执行了同样的方案。得到的制备物被称为"模拟"制备物，它在所有分析Slit2作用的实验中被用作对照。趋触性迁移分析将转染的HEK293细胞用TrypLEExpress从组织培养皿中取出，用含有0.1%胰蛋白酶抑制剂、0.2。/。无脂肪酸BSA的108DMEM或EBM-2清洗一次，并用含有0.2%BSA的相关培养基清洗两次。对洗过的细胞计数，并重新悬浮成0.3x1()S个细胞/ml。将1.5x105个细胞装入下表面用5pg/ml纤连蛋白预包被的12|imCostartranswells的室上部中。通过用0.5pg/mlSlit2或等量的模拟制备物进行共同包被，来分析Slit2对趋触性的影响。允许细胞迁移进行6小时，然后用棉拭子除去transwell上表面上的细胞。将下表面上的细胞用4%甲醛固定5分钟，用PBS清洗三次。对于HEK293细胞来说，通过在倒置荧光显微镜下计数6个IOX的视野，对下表面上GFP阳性细胞(HEK293)的数量进行计数。对于数据显示和随后的统计学分析来说，在纤连蛋白/模拟物包被的膜上迁移细胞的数量被视为100%。进行了至少两次重复进行的独立实验。酵母双杂交分析将pGBKT7::hRobo4465-723转化到酵母菌株PJ694A中，产生了PJ694A-Robo4。将人类主动脉cDNA文库克隆到捕获质粒pACT2中，然后转化到PJ694A-Robo4中。将共转化的酵母菌株铺于SD-Leu-Trp(-LT)上以分析转化效率，铺于SD-Leu-Trp-His-Ade(-LTHA)上以鉴定推测的相互作用蛋白。然后通过滤纸提升分析(filterliftassay)测试在SD-LTHA上能够生长的酵母菌株的卩-半乳糖苷酶表达。从能够在SD-LTHA上生长并表达P-半乳糖苷酶的酵母菌株分离捕获质粒，在UniversityofUtahCoreFacility进行测序。免疫沉淀在50mMpH7.4的Tris-Cl、50mMNaCl、ImMDTT、0.5%TritonX-IOO、磷酸酶和蛋白酶抑制剂中制备细胞裂解物，以14K离心20分钟以沉淀不溶性物质，用与琼脂糖珠子结合的正常IgG进行60分钟的澄清，并在4。C下与琼脂糖珠子结合的相关抗体温育2小时。将沉淀物在裂解缓冲液中彻底清洗，重新悬浮在2X样品缓冲液中(125mMpH6.8的Tris-Cl、4%SDS、20%甘油、0.04%溴酚蓝禾口1.4M2-巯基乙醇)。GSTPullDown分析带有pGEX-4Tl::mRobo4的Rosetta2大肠杆菌生长到OD600为0.6，然后用0.3mMIPTG进行诱导。在30°C、220rpm3-4小时后，通过超声将细胞裂解在20mMTris-ClpH7.4、1%TritonX-lOO、1昭/ml溶菌酶、lmMDTT和蛋白酶抑制剂中。将GST-融合蛋白捕获在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B上，用不含溶菌酶的裂解缓冲液清洗一次，然后用结合/清洗缓冲液(50mMTris-ClpH7.4、150mMNaCl、lmMDTT、1%TritonX-100、0.1%BSA和蛋白酶抑制剂)清洗两次。将GST-融合蛋白与60nM纯化的重组桩蛋白在4。C温育过夜，在结合/清洗缓冲液中彻底清洗，重新悬浮在2X样品缓冲液中。Western印迹将免疫沉淀物和GST-融合蛋白在100°C温育2分钟，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜与含有5%脱脂奶粉的PBS+0.1%Tween20(PBST)(PBST-M)在25°C温育60分钟。将阻断的膜与第一抗体(1:2000的抗FlagM2;I:IO，OOO稀释的抗HA;1:500的抗Hic-5;1:10,000的抗桩蛋白；1:1,000的抗Rac和1:500的抗Cdc42)在PBST-M中于25。C温育60分钟，或在4。C温育过夜。将膜在PBST中清洗3x10分钟，然后与第二抗体(1:10,000的山羊抗小鼠或山羊抗兔辣根过氧化物酶)在25°C温育60分钟。将膜在PBST中清洗3x10分钟，并用ECLPLUS可视化。体外转录/翻译Mena-V5用T7QuickCoupled体外转录/翻译系统按照制造商的说明书进行合成。铺展分析将转染的HEK293细胞铺于用5pg/ml纤连蛋白包被的盖玻片上。在5%C02和37°C下温育30分钟后，将细胞用冰冷的PBS清洗3次，用3.7%甲醛在室温固定IO分钟。然后将细胞用0.2%TritonX-100通透化3分钟，用PBS+0.1%Tween20(PBST)清洗3次，与10pg/ml罗丹明-鬼笔环肽在室温温育1小时。在用PBS-T清洗3次后，将盖玻片放置在Pro-LongGold中，通过共焦显微镜进行分析。使用ImageJ在三个独立的实验中测定了150个细胞的总面积。siRNA介导的桩蛋白的击倒使用LipofectAMINE2000，按照制造商的说明书，将HEK293细胞用lOOnMsiRNA双链体(5'-CCCUGACGAAAGAGAAGCCUAUU-3'，SEQIDNO:33和5'-UAGGCUUCUCUUUCGUCAGGGUU-3'，SEQIDNO:34)进行转染。转染后48小时，处理细胞，以用于生化分析或细胞铺展分析。桩蛋白的重构通过用编码鸡桩蛋白的表达载体进行转染来实现，该载体在siRNA耙位点中具有核苷酸序列5'-CCCCTACAAAAGAAAAACCAA-3'(SEQIDNO:35)。击倒和重构可以通过用桩蛋白抗体的western印迹进行观察，并通过密度计量法进行定量。Rac和Cdc42活化分析将转染的HEK293细胞从细胞培养皿上分离，在DMEM+0.2%BSA中保持悬浮1小时，铺于用5pg/ml纤连蛋白包被的细菌培养皿上5分钟。然后将细胞用冰冷的PBS清洗两次，并在50mMTrispH7.0、500mMNaCl、lmMMgCl2、lmMEGTA、lmMDTT、0.5%NP-40、1X蛋白酶抑制剂、1X磷酸酶抑制剂和20|ig/mlGST-PBD中裂解。将裂解液在14,000rpm离心5分钟，将上清液与30pl谷胱甘肽琼脂糖在4°C温育30分钟。在用裂解缓冲液清洗3次后，将结合的蛋白用2X样品缓冲液洗脱。Rac和Cdc42用特异性针对每种蛋白的抗体通过western印迹进行检测。将Rac活化水平按照总的Rac进行归一化，每个实验中的最高值被指定为值为1。Robo4AP/AP小鼠的产生和基因分型将Robo4靶向载体电穿孔(electroporated)到胚胎干(ES)细胞中。将所靶向的等位基因是杂合的ES细胞注射到胚泡中，然后转移到假孕的雌性中。通过深浅环纹颜色的存在鉴定嵌合雄性，并与C57BL/6雌性交配，以产生ES细胞衍生的后代。基因型通过尾部DNA的Southern印迹分析来证实。使用来自耳穿孔或尾巴样品的基因组DNA，在下列条件下进行PCR基因分型94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸60秒，40个循环。使用下面的两条引物对Robo4进行基因分型5'cccttcacagacagactctcgtatttcc3'(正向)禾口5'cccagacctacattaccttttgccg3'(反向)，下面两条引物用于AP:5'ggcaacttccagaccattggcttg3'(正向)禾口5'ggttaccactcccactgacttccctg3'(反向)。胚胎和表达分析胚胎的阶段确定、原位杂交、石蜡切片和全胚胎PECAM-1免疫组织化学分析按照以前的描述i进行。对于Northern印迹分析来说，在用TRIZOL分离后，每道上样20吗总RNA。使用primeItII随机引物标记试剂盒(Stratagene)，产生了34-标记的探针。肺裂解物使用裂解缓冲液制备[P/。NP-40，150mMNaCl，50mMTris-Cl(pH7.5)，1mMEDTA和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)]。来自肺裂解物的Robo4蛋白按照以前的描述使用多克隆抗Robo4抗体通过Western印迹分析来检测。碱性磷酸酶(AP)染色将胚胎或组织在含有4%多聚甲醛和2mMMgCb的PBS中于4°C震荡固定过夜。将样品在PBST(PBS，0.5%Tween20)中清洗3次，每次15分钟。将内源碱性磷酸酶在含有2mMMgCh的PBS中于65°C失活90分钟，然后在AP缓冲液U00mMTris-ClpH9.5，100mMNaCl，50mMMgCl2，0.1%Tween20，2mM左旋咪唑)中清洗两次，每次15分钟。对于胚胎来说，染色在BM紫底物(BoehringerMannheim)中进行，对于成年组织来说，在NBT/BCIP中进行。染色在含有5mMEDTA的PBS中终止。AP染色后的全胚胎免疫组织化学按照以前的描述，在固定和切片的视网膜上进行碱性磷酸酶(AP)染色。染色在EDTA-5mMPBS中终止。将视网膜在PBS中清洗两次，在4%多聚甲醛、磷酸盐缓冲盐水中在室温下后固定5分钟，然后在PBS中清洗2次。在PBlec(PBS，pH6.8，1%Triton-X100，O.lmMCaCl，O.lmMMgCl，O.lmMMnCl)中温育2小时后，将视网膜与抗体在4°C温育过夜。使用兔抗NG2抗体(1:200;Chemicon)标记周细胞，使用大鼠抗endomucin(克隆V.7C7，由DietmarVestweber友情提供；1:20稀释)标记内皮细胞。在PBS-T中(PBS,pH7.4，1%Triton-XlOO)清洗3次后，将样品与结合了合适荧光染料--AlexaFluor488或568(MolecularProbes;Invitrogen)的第二抗体在PBS中温育。在清洗和在4%PFA中短时后固定后，将视网膜使用Mowiol/DABCO(Sigma-Aldrich)展平和固定在盖玻片上。样品通过常规的光学和荧光显微镜进行分析，使用了装备有ZeissAxiocamHRc数字照相机的ZeissStereomicroscopeStemiSV11Bioquad，还通过使用ZeissLSMMeta510的激光共焦激光扫描显微镜，进行分析。AP染色用633nmHeNe激光器和反射组件加以可见化。数字照片使用Volocity(4.0Improvision)进行处理，并在AdobePhotoshopCS2中进行汇编。免疫组织化学全胚胎三重免疫荧光共焦显微术按照以前的描述3进行。简单来说，使用了针对PECAM、NP1、CX40、2H3、BFABP和aSMA的抗体来标记E15.5处Robo4+Z+或Robo4-A胚胎的四肢皮肤。构建重组Slit片段的表达载体计划的表达载体描绘在图23中。编码所有片段的DNA被克隆到pSECTAG2载体(Invitrogen)中，共有下面的特征CMV启动子，Kozak共有序列，myc/histag框内融合，以及牛生长激素的polyA序列。Fc融合通过用重组形式的人类IgGl的Fc结构域代替myc/his表位而产生，在该Fc结构域中补体活化和效应细胞相互作用结构域已经分别被IgG4和IgG2序列代替(Katoh等，2005;Armour等，1999)。重组Slit片段和Slit片段-Fc融合蛋白从瞬时转染的细胞分离。所需的构建体被稳定地转染到CHO细胞中，通过Zeocin抗性进行筛选。表达Robo4的HEK细胞上Robo4激动剂的结合和活性将表达Robo4-HA(Robo4-HEK)或只有pcDNA3载体(对照-HEK)的稳定细胞系接种到用100pg/ml聚L-赖氨酸预先包被的6孔培养皿中。将细胞与HEKCM或Slit-mycCM在37°C温育。在与条件培养基温育1小时后，接着在PBS中清洗3次，将细胞在4%多聚甲醛中固定20分钟。然后将细胞在PBS中清洗3次，与小鼠抗myc抗体(SantaCruzBiotech)和抗小鼠Alexa594结合的第二抗体(MolecularProbes)温育。那些激动剂与Robo4结合以抑制迁移的能力，按照ParkKW,MorrisonCM,SorensenLK等，"Robo4isavascular-specificreceptorthatinhibitsendothelialmigration,"(Robo4是抑制内皮细胞迁移的血管特异性受体)DevBiol2003;261(l):251-67中的描述进行。鼠肺内皮细胞的分离鼠内皮细胞的分离已经在以前4描述。将绵羊抗大鼠IgGDynal珠子(DynalBiotech)与抗PECAM-1或抗ICAM-2单克隆抗体(BDPharmingen)以每lOOjtiL珠子5抗体结合。珠子被预先包被并储存在4。C(4xl()8个珠子/mL含有0.1%BSA的PBS)，最多2周。肺从三只成年小鼠获得。将肺叶与可见的支气管和纵隔结缔组织切开。将肺在50mL冷的分离培养基(20%FBS-DMEM)中清洗以除去红细胞，用剪刀剪碎，在25mL预温热的胶原酶(2mg/mL，Worthington)中在37°C下消化45分钟，同时轻轻摇动。通过用连接有14号金属套管的60cc注射器抽吸12次，将消化的组织解离，然后通过无菌的70pm—次性细胞过滤器(Falcon)进行过滤。将悬浮液在4°C以400xg离心10分钟。将细胞沉淀重新悬浮在2ml冷PBS中，然后与PECAM-1包被的珠子(15pL/mL细胞)在室温温育10分钟。使用磁性分离器回收珠子结合的细胞，将其在分离培养基中清洗，然后重新悬浮在完全培养基中(EGM-2MV,Lonza)。将细胞铺于单用纤连蛋白包被的75-cm^且织培养瓶中，在温育过夜后除去未粘附的细胞。将粘附的细胞用PBS清洗，并加入15ml完全培养基。隔日用完全培养基给培养的细胞补料。当培养物达到70%到80%铺满时，将它们用胰蛋白酶-EDTA分开，重新悬浮在2mlPBS中，并使用ICAM-2结合的珠子(15^L/mL细胞)进行第二次分拣。按前述清洗细胞和铺板。第2到5代被用于功能分析。细胞培养将人类表皮微血管内皮细胞(HMVEC，Cambrex)生长在EGM-2MV中，使用第3和6次之间。免疫细胞化学在细胞铺板之前，将8孔室载片(Lab-Tek)用1.5pg/cm2的纤连蛋白包被2小时。将鼠肺内皮细胞铺于完全培养基EGM-2MV中，37°C过夜(100,000个细胞/孔)。然后将细胞在PBS中清洗3次，在室温下在4%多聚甲醛中固定IO分钟。在PBS中另外清洗3次后，将细胞在含有1%TritonX-100的PBS中室温下清洗15分钟，然后在PBST中(含有0.1%TritonX-100的PBS)清洗3次。然后将细胞在含有2。/。BSA的PBS中室温下阻断20分钟，并与第一抗体在2%BSA中室温下温育1小时，第一抗体是大鼠抗PECAM-1(Pharaiigen)，兔抗VonWillebrand因子(vWF)(DAKO)。在与第一抗体温育后，将细胞在PBST中清洗，并与第二抗体在2。/。BSA中于室温温育1小时，第二抗体是AlexaFluor488驴抗大鼠IgG和AlexaFluor594驴抗兔IgG(MolecularProbes)。将细胞在PBST中清洗一次，在PBS中清洗一次，固定在Vectashield固定培养基中(VectorLaboratories)，通过共焦显微镜照相。荧光激活的细胞分拣(FACS):通过在37°C短时胰蛋白酶处理(不超过2分钟)，将鼠肺内皮细胞从培养皿分开。通过加入含有在EBM-2+0.1°/。BSA中的胰蛋白酶抑制剂，使蛋白裂解终止。将细胞在FACS缓冲液中(不含Ca2+和Mg2+的PBS+0.1。/。BSA)清洗两次，然后重新悬浮在lmLFACS缓冲液中。细胞表面标记物的表达分析以两步免疫荧光染色来进行。将细胞与纯化的单克隆抗体大鼠抗PECAM-1、兔抗vWF在4°C温育30分钟。然后将细胞在FACS缓冲液中清洗两次，并重悬浮在lmLFACS缓冲液中。然后将细胞与荧光第二抗体AlexaFluor488驴抗大鼠IgG和AlexaFluor594驴抗兔IgG(MolecularProbes)在4°C温育30分钟。将细胞再次清洗两次，重悬浮在lmLFACS缓冲液中，用FACS进行分析。细胞迁移分析将细胞用CellTrackerGreenCMFDA(MolecularProbes)标记1小时，清洗，然后在添加了0.1%BSA的EBM-2中饥饿过夜。将细胞用胰蛋白酶处理，清洗，并重新悬浮到300,000个细胞/mL。将100pL细胞悬浮液(30，000个细胞)上样到已经在两面用5吗/mL人类纤连蛋白包被的8卞mHTSFluoroBlock滤膜(BDFalcon)上。将测试因子在EBM-2/0.1%BSA中稀释，并放置在室下部中。在37°C温育3小时后，在倒置荧光显微镜(Axiovert200)上对每个孔的两个5X视野进行照相。通过对荧光细胞进行计数来计算迁移细胞的数量。Robo4+z+细胞的基线迁移被设定为1。数据被表示为三次独立实验的三份平行样的平均值iS.E.。管形成分析管形成分析按照以前的描述5进行。简单来说，将从Robo4+z+和Robo4APZAP小鼠分离的肺内皮细胞铺于基质胶包被的48孔皿的孔中，在0.5%血清中饥饿过夜。然后将细胞用0.48nMVEGF-A在不存在或存在Slit2的情况下刺激3.5小时，然后进行照相。使用ImageJ软件测定平均管长度。数据被表示为三次独立实验的两份平行样的平均值iS.E.。体外通透性分析将从Robo4悟和Robo4AP"P小鼠分离的肺内皮细胞(ECs)铺于用1.5吗/cr^人类纤连蛋白预先包被的3.0pmCostartranswells上，并生长至铺满。将细胞饥饿过夜，用0.3nMSlit2预处理30-60分钟，然后用2.4nMVEGF-A刺激3.5小时。在室顶部加入辣根过氧化物酶(HRP)，终浓度为100叫/ml，在30分钟后将培养基从室下部移除。将等份试样与0.5mM愈创木酚、50mMNa2HPO^n0.6mM11202温育，通过测量在470nm的吸光度来确定邻苯二胺的形成。单层的基本通透性被设定为100%。数据被表示为三次独立实验的三份平行样的平均值iS.E.。VEGF诱导的视网膜通透性视网膜通透性按照53中的描述进行评估。简单来说，将8-10周龄的小鼠用阿佛丁(2-2-2三溴乙醇，0.4mg/g;AcrosOrganics，MorrisPlains,NJ)麻醉。对小鼠目艮内注射1.4uL35.7ug/mL的VEGF-A(R&DSystemsInc.Minneapolis,MN)禾口50ngSlit2N(SEQIDNO:39)。在对侧眼中注射等体积的模拟制备物。按照指示，施用了其它条件的1.4uL盐水、模拟制备物或slit。六小时后，经过尾静脉对小鼠静脉内注射60mg/mL的伊文思蓝50uL。两小时后，将小鼠处死，用柠檬酸缓冲的多聚甲醛进行灌注以除去静脉内的伊文思蓝。将眼睛摘除，剥离出视网膜。在0.3mL甲酰胺中在70°C将伊文思蓝染料洗脱18小时。将提取液超速离心通过5kD的滤膜2小时。测定620nm的吸光度。在740nm测定背景吸光度，并将其减掉。Robo4的腺病毒表达按照以前的描述通过腺病毒对Robo4进行表达。Miles分析将伊文思蓝注射到6-8周龄的小鼠的尾静脉中，30分钟后，将盐水、或10ngVEGF-A在不存在和存在100ngSlit2的情况下注射到真皮中。在另外30分钟后，进行穿孔活组织检查，在60°C将伊文思蓝从真皮组织中洗脱18小时到甲酰胺中。离心后，在620nm测量吸光度。在盐水注射的动物中观察到的真皮通透性的量被设定为1。数据被表示为每次处理的5只个体小鼠个体的两份平行样的平均值士S.E.(每只动物总共注射6次)。视网膜通透性视网膜通透性按照以前的描述8进行评估。简单来说，将8-10周龄的小鼠用阿佛丁(2-2-2三溴乙醇，0.4mg/g;AcrosOrganics,MorrisPlains,NJ)麻醉。对小鼠眼内注射1.4^L35.7吗/mL的VEGF誦A(R&DSystemsInc.Minneapolis,MN)和50ngSlit2。在对侧眼中注射等体积的模拟物。按照指示，施用其它条件。六小时后，经过股静脉对小鼠施用60mg/mL的伊文思蓝50pL。两小时后，将小鼠处死，用柠檬酸缓冲的甲醛进行灌注以除去静脉内的伊文思蓝。将眼睛摘除，剥离出视网膜。在0.4mL甲酰胺中在70°C将伊文思蓝染料洗脱18小时。将提取液超速离心通过5kD的滤膜2小时。测定620nm处的吸光度。在740nm测定背景吸光度，并将其减掉。数据被表示为每个基因型的5只小鼠个体的平均值iS.E.。生物化学分析将HMVEC在纤连蛋白包被的培养皿中生长至铺满，在EBM-2+0.2%BSA中饥饿过夜。第二天，将细胞用50ng/mLVEGF-A刺激5分钟，用冰冷的PBS清洗两次，在50mMTrispH7.4、150mMNaCl、10mMMgCl2、lmMDTT、10%甘油、l%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1。/。SDS、1X蛋白酶抑制剂、IX磷酸酶抑制剂中裂解。将裂解液与2X样品缓冲液混合，通过SDS-PAGE分离，并用1:1000稀释的针对磷酸化VEGFR2、磷酸化p42/44和磷酸化Src(CellSignaling)的抗体进行探测。对于Rac活化分析来说，产生粗的膜制备物9，并将GTP-Rac用20叫/mlGST-PBD沉淀。在用裂解缓冲液清洗3次后，将结合的蛋白用2X样品缓冲液洗脱。Racl使用单克隆抗体(BDBiosciences)通过western印迹进行检测。氧诱导的视网膜病变简单来说，P7幼仔和哺乳的母亲被放置在75%氧中，这通过Pro-OX氧控制器(BioSpherix,Redfield,NY)维持。在P12时将幼仔取出，眼内注射Slit2N(SEQIDNO:39)激动剂或模拟制备物，后者用作对照条件。在P17时处死小鼠，通过左心室灌注lml50mg/ml的FITC-葡聚糖(Sigma,St.Louis,MO)。将眼睛摘除，在4%多聚甲醛中固定30分钟，产生了视网膜辅片。用Axiovert200荧光显微镜(CarlZeiss，Thornwood,NY)拍照。新生血管化用AxioVision软件进行定量，该软件计算每个区域血管化的量(CarlZeiss,Thornwood，NY)。数据被表示为每个基因型的5只小鼠个体的平均值±S.E.。激光诱导的脉络膜新生血管化将2-3月龄的小鼠用阿佛丁(2-2-2三7臭乙酉享，0.4mg/g;AcrosOrganics,MorrisPlains,NJ)麻醉，用1%托吡卡胺(Alcon,FortWorth,TX)散瞳。用带有狭缝灯投送系统的IridexOcuLightGL532nm激光光凝固器(Iridex,MountainView,CA)，从距离视神经盘3个盘直径的3、6和9点钟方向产生了3个灼伤，参数如下150mW功率，75um光点大小和0.1秒的持续时间。在使用激光时产生泡，Bruch膜的破裂是获得CNV的重要因素；因此，只有产生了泡的灼伤包含在本研究中。在激光处理后立即以及3天后，对小鼠玻璃体内注射50ngSlit2N(SEQIDNO:39)。在另一只眼内通过玻璃体内注射给予相等体积的模拟制备物。激光处理1周后，将小鼠处死，产生脉络膜辅片。使用生物素结合的同工凝集素(Sigma,St.Louis，MO)和德克萨斯红结合的链亲和素(Sigma,St.Louis,MO)对CNV进行染色。辅片使用ZeissLSM510共焦显微镜(Zeiss,Thornwood,NY)进行检査，CNV使用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD)进行定量。参考文献AfzalA,ShawLC，LjubimovAV,BoultonME,SegalMS，GrantMB.Retinalandchoroidalmicroangiopathies:Therapeuticopportunities.(视网膜和脉络膜的微血管病治疗机遇)MicrovascRes2007.ArmourKL,ClarkMR,HadleyAG，WilliamsonLM.RecombinanthumanIgGmoleculeslackingFcgammareceptorIbindingandmonocytetriggeringactivities.(缺少受体I结合和单核细胞触发活性的重组人类IgG分子)，EurJImmunol1999;29(8):2613隱24.Bashaw,G.J.,Kidd,T.,Murray,D.，Pawson,T.，andGoodman,CS.(2000》Repulsiveaxonguidance:AbelsonandEnabledplayopposingrolesdownstreamoftheroundaboutreceptor.(排斥性轴突导向Abelson和Enabled在roundabout受体下游发挥相反的作用)，Cell101，703-715.Battye,R.,Stevens,A.，andJacobs,J.R.(1999).AxonrepulsionfromthemidlineoftheDrosophilaCNSrequiresslitfunction.(轴突从果蝇CNS中线的排斥需要slit功能)Development126,2475-2481,BattyeR,StevensA,PerryRL,JacobsJR.RepellentsignalingbySlitrequirestheleucine-richrepeats.(Slit的排斥性信号传导需要富含亮氨酸的重复序列)，JNeurosci2001;21(12):4290-8.Bedell,V.M.,Yeo,S.Y.,Park,K.W.,Chung.J.,Seth,P.,Shivalingappa，V.,Zhao，J.,Obara，T.，Sukhatme，V.P.,Drummond,I.A"Li，D.Y.禾卩Ramchandran，R.(2005),(roundabout4isessentialforangiogenesisinvivo.(roundabout4是体内血管生成必需的)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,6373-6378.Brooks,P.C,Clark，R.A.禾口Cheresh,D.A.(1994).Requirementofvascularintegrinalphavbeta3forangiogenesis.(血管生成需要血管整合素avp3)Science264,569-571.Brooks,P.C,Montgomery,A.M.,Rosenfeld，M.，Reisfeld，R.A.,Hu，T.,Klier,G.禾卩Cheresh,D.A.(1994).Integrinalphavbeta3antagonistspromotetumorregressionbyinducingapoptosisofangiogenicbloodvessels.(整合素avp3拮抗剂通过诱导血管生成性血管的凋亡促进了肿瘤退化)Cell30,1157-1164.Brose,K,,Bland,K.S.,Wang，K.H.,Arnott，D.,Henzel，W.,Goodman,C.S.，Tessier-Lavigne，M和Kidd,T.(1999).SlitproteinsbindRoboreceptorsandhaveanevolutionarilyconservedroleinrepulsiveaxonguidance.(Slit蛋白结合Robo受体并在排斥性轴突导向中具有进化上保守的功能)Cell19，795-806.BrownDM，KaiserPK,MichelsM,SoubraneG,HeierJS，KimRY,SyJP,SchneiderS;ANCHOR石开究组.Ranibizumabversusverteporfinforneovascularage-relatedmaculardegeneration.(Ranibizumab禾口verteporfin对于新生血管衰老相关的黄斑变性的比较)，NEnglJMed.2006355(14):1432-44.Brown,M.C禾口Turner,CE.(2004).Paxillin:adaptingtochange.(桩蛋白:适应于变化)，Physiol.Rev.84，1315-1339.Byzova，T.V.，Goldman,C.K.，Pampori,N.,Thomas,K.A.，Bett,A.，Shattil,SJ.，禾卩Plow,E.F.(2000).AmechanismformodulationofcellularresponsestoVEGF:activationoftheintegrins.(调节对VEGF的细胞应答的机制整合素的活化)，Mol.Cell6，851-860.CarmelietP,Tessier-LavigneM.Commonmechanismsofnerveandbloodvesselwiring.(神经和血管布线的共同机制)，Nature2005;436(7048):193-200.ChengHJ,NakamotoM,BergemannAD，FlanaganJG.ComplementarygradientsinexpressionandbindingofELF-1andMek4indevelopmentofthetopographicretinotectalprojectionmap.(在地形学视网膜投射图的发展中ELF-1和Mek4的表达和结合中的互补梯度)，Cell1995;82(3):371隱81.ChunDW,HeierJS，ToppingTM，DukerJS，BankertJM.Apilotstudyofmultipleintravitrealinjectionsofranibizumabinpatientswithcenter-involvingclinicallysignificantdiabeticmacularedema.(在患有涉及中央的临床显著的糖尿病型黄斑水肿的患者中多次玻璃体内注射ranibizumab的探索性研究)，Ophthalmology2006;113(10):1706-12.CrossMJ,DixeliusJ,MatsumotoT,Claesson-WelshL.VEGF-receptorsignaltransduction.(VEGF受体的信号传导)，Trendsinbiochemicalsciences2003;28(9):488-94.CulottiJG,MerzDC.DCCandnetrins.(DCC和导向因子)，CurrOpinCellBiol1998;10(5):609-13.DiabeticRetinopathyClinicalResearchNetwork(糖尿病型视网膜病临床研究网络),ScottIU，EdwardsAR，BeckRW,BresslerNM，ChanCK，ElmanMJ,FriedmanSM,GrevenCM,MaturiRK,PieramiciDJ,ShamiM，SingermanLJ,StockdaleCR.AphaseIIrandomizedclinicaltrialofintravitrealbevacizumabfordiabeticmacularedema.(玻璃体内bevacizumab对糖尿病型黄斑水肿的II期随机临床试验)，Ophthalmology.2007114(10):1860-7.DicksonBJ.Molecularmechanismsofaxonguidance.(辛由突导向的分子机制)，Science2002;298(5600):1959-64.DongQG,BernasconiS,LostaglioS,等，Ageneralstrategyforisolationofendothelialcellsfrommurinetissues.Characterizationoftwoendothelialcelllinesfromthemurinelungandsubcutaneousspongeimplants.(从鼠组织分离内皮细胞的通用策略。来自鼠肺和皮下海绵移植物的两种内皮细胞系的特征)，ArteriosclerThrombVaseBiol1997;17(8):1599-604.DorrellM,Uusitalo-JarvinenH,AguilarE，FriedlanderM.Ocularneovascularization:basicmechanismsandtherapeuticadvances.(目艮部新生血管化基本机制和治疗进展)，SurvOphthalmol.200752Suppl1:S3隱19.DrescherU,KremoserC,HandwerkerC，LoschingerJ，NodaM,BonhoefferF.InvitroguidanceofretinalganglioncellaxonsbyRAGS,a25kDtectalproteinrelatedtoligandsforEphreceptortyrosinekinases.(视网膜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于罹患风险的对象，以及(b)给对象的视网膜施用与神经元受体和内皮细胞结合的排斥性导向信号。19.在对象中使用排斥性信号或模拟物治疗对象的方法，包括(a)鉴定具有用VEGF阻断剂、TNF阻断剂、组胺阻断剂或凝血酶阻断剂治疗的适应征的对象，以及0)给对象施用与神经元受体和内皮细胞结合的排斥性导向信号。20.权利要求15、16、17、18或19的方法，其中排斥性导向信号是roundabout受体、Unc5受体、DCC受体、再生蛋白受体、DSCAM受体或ICAM-2受体的配体。21.权利要求20的方法，其中配体是Slit2。22.包含roundabout-4(Robo4)的桩蛋白结合序列的分离的多肽，其中所述多肽不包含全长Robo4。23.权利要求22的分离的多肽，其中桩蛋白结合序列由SEQIDNO:27或其长度为至少IO个残基的片段组成。24.10到400个氨基酸的分离的多肽，包含SEQIDNO:27或其长度为至少IO个残基的片段。25.10到400个氨基酸的分离的多肽，包含的氨基酸序列与SEQIDNO:27或其长度为至少IO个残基的片段具有至少80%的序列同源性。26.包含roundabout-4(Robo4)的桩蛋白结合序列(PBS)的分离的多肽，其中所述多肽由下式构成Ri-PBS-R2其中W和I^独立地是H、酰基、NH2、氨基酸或肽，其中所述多肽不包含全长Robo4。27.权利要求26的分离的多肽，其中PBS由与SEQIDNO:27或其长度为至少10个残基的片段具有至少80%的序列同源性的氨基酸序列组成。28.分离的多肽，基本上由与SEQIDNO:27或其长度为至少10个残基的片段具有至少80%序列同源性的氨基酸序列构成。29.分离的核酸，编码权利要求22、24、26或28的多肽。30.分离的核酸，编码的多肽包含roundabout-4(Robo4)的桩蛋白结合序列，其中所述多肽不包含全长Robo4。31.分离的核酸，包含SEQIDNO:2或其长度为至少30个残基的片段，其中所述核酸不编码全长roundabout-4(Robo4)。32.载体，包含权利要求29、30或31的分离的核酸。33.促进组织中血管生成的方法，包括将含有权利要求22、24、26或28的多肽的组合物投送到组织的内皮细胞中。34.促进组织中血管生成的方法，包括将含有权利要求29、30或31的核酸的组合物投送到组织的内皮细胞中。35.促进组织中血管生成的方法，包括给组织施用含有权利要求32的载体的组合物，其中所述载体转导内皮细胞。全文摘要本发明描述了用于抑制血管通透和病理性血管生成的化合物、组合物和方法。本发明还描述了用于生产和筛选能够抑制血管通透和病理性血管生成的化合物和组合物的方法。本发明描述的组合物包括药物组合物。本发明描述的组合物可用于例如抑制血管通透和病理性血管生成的方法，包括抑制由特定的血管生成、通透性和炎性因子例如VEGF、bFGF和凝血酶诱导的血管通透和病理性血管生成的方法。本发明还提供了用于治疗特定疾病和病症的方法。文档编号A61K38/16GK101600451SQ200780050885公开日2009年12月9日申请日期2007年12月11日优先权日2006年12月11日发明者克里斯托弗·琼斯,尼亚尔·隆东,迪安·李申请人:犹他大学研究基金会