专利名称：一种新的信号芋螺p-超家族毒素及其序列和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的中国南海信号芋螺P-超家族毒素基因Lt9.1及其编码 的多肽序列lt9a，以及该种毒素在神经生物学研究，离子通道药物和镇痛药物 开发中的应用。
背景技术：
芋螺属于软体动物门腹足纲芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海 水域，少数在水深几米至200余米的深水区，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。 芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中 生代(mesozoic)时期与陆地上恐龙同时灭绝的海洋捕食性软体动物菊石的消失 客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于 中新世(Miocene)，基本上持续到现在。每个芋螺物种的形成都伴随全新的毒液 成分和有效的毒液输送装置的进化。
芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约500种芋螺，单一种属中就包括数
百种物种，这使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺是食肉动物， 靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(Piscivorous)、食螺芋螺 (molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋 螺种类的70%左右。食鱼性芋螺占芋螺总数最少，但毒性最强，报道的芋螺致死 事件基本上是该类芋螺造成的，如织锦芋螺(C ^xti7e)、地纹芋螺 (C《e。gr邵力t/5^等。
芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒 样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特异地作用于神经系统 的电压门控和配体门控离子通道的不用亚型和递质受体，因此被广泛用于神经生 物学研究。芋螺毒素通常为由7 41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含 半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒 素比较(40 80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的raRNA编码，原始的翻译 产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到 成熟肽。
二十世纪八十年代初，美国犹它大学01iveraBM学者实验室最早开展了芋螺 毒素全面系统研究工作。芋螺毒素以其分子小，结构稳定，对受体作用范围广并 且活性强的特点，已经跃居于动物神经毒素研究的首位。由于它们作用靶点广泛， 能高度特异地结合细胞膜上神经递质和激肽的受体和各种离子通道， 一方面，可 以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为 神经生物学中发现鉴定新受体,研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要 探针，并推动了离子通道的进化研究。
保守估计有50000种以上不同的芋螺毒素存在，至今已经得到分离的芋螺毒 素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、 癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研 究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan 公司进行开发的CTXM VHA (SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用 分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治
疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了ni期临床试验，正式被FDA批准上市。
而另一个衍生于CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对 N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼 痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Cormntokin-G作为NMDA受体高度选择 性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也己完成I期临床试验。芋螺毒素药用研 究的其他方向还有具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素， 可用于治疗抑郁症。以及抑制a 1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗 良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性， 降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。
另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，己经成 为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体 鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。
芋螺在我国南海海域有广泛分布，己査明的芋螺约有80余种，主要分布在台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。近年来国内也开展了芋螺 毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。中国科学院北京 药物化学研究所的陈冀胜研究员等人已自桶形芋螺(C.力""乃'/7m)、独特芋螺 (C. caracter/"We"s)、菖蒲芋螺(C. rejn'L^/z )、地纹芋螺等类芋螺中分 离鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。军事医学科学院生物工程^f究所的卢柏松、 黄培堂以及戴秋云等从我国的线纹芋螺、织锦芋螺中也发现了一些新的毒素成分 和基因序列。热带农业大学彭世清、罗素兰等己从菖蒲芋螺基因组中克隆到两个 新芋螺毒素基因(GenBank登记号AY316159， AY316160);同时还从海南产的大 理石芋螺(C历sr/ oreM)、幻芋螺(C.tk^"s)、信号芋螺(CJ/"ertos)、 勇士芋螺(C.肌7es)、独特芋螺、织锦芋螺、桶形芋螺、疵篙芋螺(C.h'w'c/M) 等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种0-超家族芋螺毒素及其基因。 虽然我国有着丰富的芋螺资源，但由于起步较晚，目前对于芋螺毒素的研究尚处 于初期阶段，有着广阔的研究空间和开发前景。
由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁 多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建信号芋螺毒管cDNA文库可以系统地 研究食虫芋螺的毒素组成、表达谱，发现新的食虫芋螺特有的毒素序列。迄今为 止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海信号芋螺是一种食虫性芋螺， 世界上尚没有关于它的毒素研究的报道。
另外，目前有关芋螺毒素的生化结构及其神经药理活性的研究都是基于天然 提取毒素的分子结构，用人工合成的毒素来研究的。虽然已克隆到很多芋螺毒素 基因，但目前鲜有芋螺毒素基因体外表达的报道。重组芋螺毒素将以其质优、价 廉的优势，代替产率低、成本昂贵的人工合成毒素。开展芋螺毒素体外表达技术 的研究，将具有非常重要的理论研究价值和应用价值。
因此，开展我国南海信号芋螺毒素的生物化学、药理学尤其是其分子生物学 和基因工程技术领域的探索研究将有助于对新毒素分子相应受体及其作用机制 的深入研究，而且可为我国芋螺海洋资源的药用开发利用提供重要理论依据
发明内容
本发明的目的在于提供一种神经毒素多肽的前体肽，以及其片段、类似物和 衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些神经毒素多肽的多核苷酸。 本发明的另一个目的是提供这些神经毒素多肽用途。
本发明的第一方面，提供一种新的神经毒素多肽的前体肽，其包括含有序列 表〈400〉2所示序列所示的氨基酸序列的多肽、或者其保守性变异多肽、或其活 性衍生物。
上述的新的神经毒素多肽的前体肽优选自以下组之一-
(a) 由序列表<400>2所示的氨基酸序列组成的多肽；
(b) 将U)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含有选自以下组之一
的核苷酸序列
(a) 编码上述多肽的多核苷酸；
(b) 与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
本发明的第三个方面提供上述神经毒素多肽的用途本发明获得的中国南海
信号芋螺神经毒素具有生物活性。小鼠热板实验证实该种多肽具有中枢镇痛作
用，从而为制备镇痛药物提供数据。分离纯化的lt9a在500 nM浓度下即可以 明显延迟TTX敏感型钠离子通道的失活，增大细胞内向钠电流。因此，本发明的 中国南海信号芋螺神经毒素lt9a作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定 或者用于工具药的研究开发，用于制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失 常、顽痛、癫痫以及中风等疾病的药物。
图1为信号芋螺粗毒的凝胶过滤色谱 凝胶过滤层析峰II含有目的蛋白lt9a
图2为凝胶过滤层析峰n的离子交换层析图谱
离子交换层析峰II含有目的蛋白lt9a
图3为离子交换层析峰n的高效液相色谱分离4为芋螺毒素lt9a的MOLDI-TOF质谱结果图
图5为芋螺毒素lt9a的Edman降解测序峰图
图6为芋螺毒素lt9a对DRG细胞TTX敏感型钠通道电流的影响
图7为芋螺毒素lt9a增加大鼠DRG细胞TTX敏感型钠电流的浓度依从性
图8为芋螺毒素lt9a作用前后钠离子通道最大开放曲线单指数拟合曲线
图9为芋螺毒素lt9a对大鼠DRG细胞钠通道电流-电压关系的影响
图10为芋螺毒素lt9a生理模型上的镇痛药效
NS :空白对照组；H : lt9a样品高剂量组；M : lt9a样品中剂量组；L : lt9a样品低剂量组
具体实施例方式
在本发明申请中，"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明 的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可 以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基) 被取代，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与 另外一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的 多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或 分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融 合蛋白)。
本发明中的多核苷酸指RNA序列、DNA序列或cDNA序列。
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何 形式限制本发明。
实施例l:信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定
总RNA的提取和cDNA合成分离中国南海信号芋螺毒管，参照Gibco BRL 公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。取1 y g信号芋螺毒管总RNA 以
SMART III 0lignuclotide(5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3')和CDSIII/3' PCR引物(5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)3。N、N-3，)进行 逆转录合成第一链，得到10"1 cDNA第一链产物。
信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定取cDNA 1. 5、1用于连接反应，反 应体系5、1，转化其中1、1，取5ul转化液分别涂板，取300ul转化液用于摇总 库菌落。隔日记数平板的单菌落数分别为800， 680和1072个。因此双链cDNA7ul 可获得的cDNA文库克隆数为(800+680+1072) *1050*7*5/3*5*1. 5=4. 170*106 (个)。随机挑取46个单克降，利用载体多克隆位点两端的T7和SP6引物PCR 扩增，结果显示，重组率超过98%(45/46)，大部分的插入片段大于500bp (41/46), 平均插入片段长度为638bp。从平板上随机挑取六板单克隆摇菌、保种、提取质 粒、T7引物单向测序，手工使用BLASTN和BLASTX在线同源比对，SEQTOOL、 ClustalX 1.83程序分析测序结果。测序结果显示信号芋螺平均插入片段长度为 544 (543.68) bp。
以上结果显示我们构建的信号芋螺毒管cDNA文库在文库重组子数、重组率 和插入片段大小等方面均符合良好文库的质量标准。
实施例2:芋螺毒素基因Lt9. 1的序列测定和分析
南海信号芋螺神经毒素基因lt9.1的质粒和序列来自实施例1，中国南海信 号芋螺毒管cDNA文库中所克隆到的7条高度同源的EST序列。利用工具软件 SEQTOOL对其碱基序列进行分析，并获得其最大读码框，长度219bp，编码73 个氨基酸残基的前体肽，该前体肽的氨基酸序列如序列表400〈2〉所示。进一步 分析确定 lt9a成熟肽序列如序列表 400<3〉所示，为 IWFCASRTCSAPADCNPCTCESGVCVDWL，分子量为3132. 59道尔顿。由于lt9a前体肽 中信号肽区和成熟肽区半胱氨酸骨架和所有已经报道的芋螺毒素P-超家族有明 显的相似性，lt9a为新的P-超家族毒素。
实施例3:信号芋螺毒素lt9a的分离纯化，质谱和Edman降解测序鉴定
将新鲜分离的中国南海信号芋螺的毒液管放置于培养皿，冰上剪碎，以萃取 缓冲液(100mmol/LNaCl， 50mmol/L Tris-HCl， pH 8. 8)萃取30min， 4° C、 12000g 离心30min收集上清，重复萃取、离心三次，合并上清，，经S印hadex-G25 Fine 分离，在280咖波长下检测可见四个吸收峰(见图1)。经S印hadex-G25 Fine分离收集的峰n样品，离子交换层析后在215mn波长下检测可见五个吸收峰(见 图2)，分别收集进一步通过反相高效液相色谱分离。
离子交换层析峰II进一步反相HPLC纯化。在215nm波长检测下所得图谱(见 图3)。图中标识的吸收峰，其保留时间为31.8 min。
对离子交换层析峰II经过高效液相色谱分离获得的保留时间为31.8 miri的 峰进行MOLDI-TOF质谱分析，表明所含组分单一，平均分子量为3133. 421 Da (见 图4)。
对离子交换层析峰II经过高效液相色谱分离获得的保留时间为31.8 min的 峰进行Edman降解测序，结果表明此蛋白的前20个氨基酸残基顺序为 IWFCASRTCSAPADCNPCTC.(见图5)
由分子量和氨基酸残基序列鉴定此峰含有的蛋白即119a 。
实施例4:信号芋螺毒素lt9a对钠离子通道的作用
为了观察此种P-超家族芋螺毒素对TTX-敏感型电压门控钠通道的影响，我
们选用大鼠的DRG细胞作为实验对象。DRG细胞形成全细胞记录模式后，在电压 钳条件下，将细胞膜电位钳制在-80 mV，然后给予持续时间为50 ms、去极化电 压为-10 mV的单脉冲刺激，可诱导出TTX敏感型钠电流。在施加毒素后，重复 给予同样的刺激，并观察毒素对内向电流的影响。
500 nM的lt9a对TTX敏感型钠电流有明显作用，能够增大细胞内向钠电流， 与对照组相比，增加了 38.86±1.31°/。 (n=3)，结果如(图6)所示。用不同浓度 的lt9a处理细胞，lt9a增大TTX敏感型钠电流具有浓度依从性，结果如(图7) 所示。
为了考察信号芋螺毒素lt9a对钠通道开放时程的影响，使用单指数拟合的方 法对毒素作用前后钠通道在最大激活电压-20mV下的最大开放曲线进行拟合，绘 制拟合曲线(见图8)。计算结果显示，毒素作用前后钠通道开放时间由 0.692±0. 035ms延长至0. 903±0. 062ms，与对照组相比延长了约30. 5% (n=3)。 由此可见，信号芋螺毒素lt9a在500nM浓度下，可以明显延迟通道的失活，从 而延长钠通道的开放时间。
在全细胞记录电压钳模式下，将细胞钳制在-80mV时，分别给予一组测试电 压，变化范围为-80mV至iJ+30raV，步阶为+10mV，持续时间为50 ms ,可在DRG细胞上得到TTX敏感型钠通道的激活电流-电压(I-V)关系曲线图，并能揭示出通 道的激活阈值、逆转电位和最大激活峰值电流电压大小。在细胞周围加入500 nM lt9a后，让毒素与细胞作用5min，再以相同的去极化脉冲诱导I-V曲线图(见 图9)。结果表明，在该浓度毒素作用下，DRG细胞钠电流与电压的依赖关系和钠 通道的激活电位没有改变，而翻转电位从+20 raV改变为+30mV
实施例5:生理模型上的中枢镇痛药效实验法 基本方案小鼠热板法
选取NIH系小鼠100只，体重20一2g，全为雌性。实验前先对小鼠进行筛选， 将小鼠放于事先加热到55。C的热板测痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出 现舔后足的时间为该鼠的痛阈值，测定2次，挑选出痛阈值不超过20s的小鼠为 合格者进行正式实验。将筛选后的小鼠随机分成4组，即空白对照组、lt9a样 品低、中、高剂量组，每组10只。实验开始时进行腹腔注射给药，其中lt9a 样品低、中、高剂量组给予剂量分别为0.07mg/kg， 0. 14mg/kg， 0.28mg/kg，空 白对照组给予等体积的生理盐水。于注射给药后0.5h、 lh、 1,5h、 2h、 3h测定 一次，如痛阈值超过60s则按60s计算(注意时间不宜太久以免烫伤小鼠足部)。 实验结束后，进行统计学处理并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率- (用药 后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)+用药前平均痛阈值乂 100%。
由实验结果可得，空白对照组小鼠给药前后的痛阈值基本稳定，提示经过筛 选后的小鼠对热刺激反应的耐受性较好。受试样品lt9a的低、中、高剂量组小 鼠给药后的痛阈值均不同程度的提高，其中给药0. 5h时，受试样品1t9a的三个 剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异 (P<0. 01, P<0. 001);给药lh和2h时，受试样品lt9a的中、高剂量组小鼠的痛 阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P〈0.01，P〈0.001);给药3h时， 受试样品的痛阈值降至最低，其中lt9a的中、高剂量组与空白对照组相比，具 有显著性差异(P〈0. 05, P〈0. 001);由此可初步认为lt9a的中、高剂量组具有一 定的镇痛作用。(见图10)<110>中山大学
<120>—种新的信号芋螺P-超家族毒素及其序列和用途
〈160〉 3
<210〉1
<211〉222
<212〉腿
〈213〉中国南海信号芋螺(Conus h'"ersr^)
<400〉1
atgactctga cgaaatcagc gctgacgtcc agcctggcct aagagcgtca ggatttggtt ccctgtacct gtgaatccgg
tgttctgatt ctggtgctac aataacaatg ggtgggggca ctgtgctagt agaacttgct cgtgtgcgtg gattggctst
tgttggcctt tgataacttt 60 gactctctaa cctgctgtcc 120 ctgcacctgc ggactgcaac 180 ga 222
<210>2
〈211〉73
〈212〉PRT
〈213〉中国南海信号芋螺(Conus力'"ersr^)
<400〉2
Met Thr Leu Thr Lys Ser Ala Val Leu lie Leu Val Leu Leu Leu 15 10 15
Ala Phe Asp Asn Phe Ala Asp Val Gin Pro Gly Uu lie Thr Met
20 25 30
Gly Gly Gly Arg Leu Ser Asn Leu Leu Ser Lys Ser Val Arg lie
35 40 45
Trp Phe Cys Ala Ser Arg Thr Cys Ser Ala Pro Ala Asp Cys Asn
50 55 60
Pro Cys Thr Cys Glu Ser Gly Val Cys Val Asp Phe Leu
65 70 73〈210〉3
<211〉29
<212〉PRT
〈213〉中国南海信号芋螺(Conus Ji"ararz^) <400〉3
lie Trp Phe Cys Ala Ser Arg Thr Cys Ser Ala Pro Ala Asp Cys 15 10 15
Asn Pro Cys Thr Cys Glu Ser Gly Val Cys Val Asp Phe Leu 16 20 25 29
权利要求
1、 从中国南海信号芋螺毒管中分离得到一种基因，其核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示。
2、 一种多肽，其含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列或其保守性变异多 肽序列或其活性衍生物。
3、 权利要求2所述的多肽，其特征在于该多肽的氨基酸序列如序列表<400>2 所示。
4、 权利要求3所述的多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表〈400〉3所示。
5、 权利要求2、 3、 4所述多肽在离子通道类型的检测，神经生物学工具药物和 镇痛药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种新的中国南海信号芋螺P-超家族毒素基因Lt9.1及其编码的多肽序列lt9a，以及该种多肽在神经生物学研究，离子通道研究和镇痛药物开发中的应用。本发明从中国南海信号芋螺的毒管中发现了一种新的P-超家族毒素基因Lt9.1，其cDNA序列如序列表中<400>1序列所示。该种基因编码的多肽(芋螺毒素lt9a)，lt9a前体肽氨基酸序列如序列表<400>2序列所示，本发明从信号芋螺粗毒中分离纯化得到lt9a的成熟肽，氨基酸序列如序列表<400>3序列所示。本发明的芋螺毒素lt9a在500nM浓度下即可以明显延迟TTX敏感型钠离子通道的失活，增大细胞内向钠电流，芋螺毒素lt9a还具有中枢镇痛作用，可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者用于工具药的研究开发和镇痛药物的制备。
文档编号A61P25/04GK101285063SQ20081002703
公开日2008年10月15日 申请日期2008年3月26日 优先权日2008年3月26日
发明者任政华, 刘君梁, 赟 吴, 周茂军, 徐安龙, 磊 王 申请人:中山大学