专利名称：：一种植物解蛇毒有效组分的制备方法
技术领域：
：本发明属于解蛇毒有效组分的制备方法，具体涉及一种植物解蛇毒有效组分的制备方法。
背景技术：
：毒蛇咬伤是野外常见的危重急症之一，因其发病急骤、病情变化快、症状凶险复杂、并发症多、可引起多器官衰竭、病死率高。全世界每年有数十万人被毒蛇咬伤，我国每年毒蛇咬伤患者也达10万人次，由于蛇伤主要发生在野外地区，往往因为无法及时救治而出现伤亡的情况。蛇伤死亡率为5%-10%，有剧毒的眼睛王蛇的咬伤死亡率高达90%以上，蛇伤致残者占25%-30%(覃公平，中国蛇毒学.南宁广西科学技术出版社，1998,7,9,221,646-648,1998)。目前蛇毒的解毒药物主要可分为抗蛇毒血清、化学解毒剂、植物药、抗蛇毒蛋白四类(王晴川和刘广芬，国外蛇毒解毒药与蛇伤治疗研究进展.蛇志，2001,13(4):64-72),虽然注射抗蛇毒血清能起到较好的治疗效果，但其价格昂贵、保藏条件要求高，适应范围狭窄，在应用上受到较大的局限(李章雄，自制蛇药配合西药治疗蛇伤432例报告.蛇志，2004，16(1):32-33;李金荣和蓝海，中西医结合治疗毒蛇咬伤的新进展.蛇志，2006，18(2):130-134)，因此开发新型高效、广谱、价廉的蛇毒解毒剂意义重大。植物药由于资源广泛，生产技术相对简单以及成本较低而受到各国学者的关注，并且植物药便于制作成片剂口服和随身携带，因此对野外急救意义重大。目前，有关植物解蛇毒组分的研究主要集中在国外，国外学者对含羞草、墨旱莲、槟榔、新特卡木、牛蹄豆等多种植物的提取物体内外解蛇毒作用进fi"了较多的石开究(MonimalaM，AshisKM,Neutralisationoflethality,myotoxicityandtoxicenzymesofNajakaouthiavenombyMimosapudicarootextracts.Jowr""/5y/wop/wr應co/ogy，2001，75:55-60PimolpanP,PakatipR，RapepolB.InhibitionofNajakaouthiavenomactivitiesbyplantpolyphenols.Jowra/o/投/wop/wr鹏co/ogy,2005,97:527-533;PimolpanP,SasitornL，RapepolB.Anti-venompotentialofbutanolicextractofEcliptaprostrataagainstMalayanpitvipervenom.Jowr""/o/￡//wop/anwaco/ogy,2004,90:347-352)，但上述受试材料与本发明主体明显不同，而国内在这方面的研究还未见文献报道。柿(Dw^ymyto&丄z'朋)，柿树科(Ebenaceae)，柿属(Z)'o柳rcw)植物。在梁代《名医别录》、《本草纲目》等历史药典中有详细记录，其性味甘、寒、涩、具有清热、润肺、止渴、降压、止血、解酒等功效。而其解蛇毒作用的研究仅1979年日本学者Okonogi从未成熟柿子果肉中提取粗提取物，初步研究表明其在体外(但其均是在体外将提取物与蛇毒蛋白混合后进行试验，不能证明其是否具有体内排毒的功能)对半环扁尾海蛇(丄Wicm^tow/m7^cia/a)、黄绿烙铁头(rn'附emrarwsy7avov/ncfo)蛇毒以及部分细菌毒素具有一定的解毒作用(TakashiO,Ze叩achiroH,AkiraO，SeijiM.Detoxificationbypersimmontanninofsnakevenomsandbacterialtoxins,rox/ccw,1979，17(5):524-527)，而此后关于此方面的研究国内外未见报道，特别是关于与本发明主题密切相关的文献没有检索出。
发明内容本发明的目的是找到一种植物解蛇毒有效组分的制备方法，其中特别是为了找到一种利用柿子果肉中制备所述的解蛇毒有效组分的精制方法，通过试验动物试验，确定了本发明制备的解蛇毒有效组分对在体内外对试验动物均有显著的解蛇毒作用，从而克服了现有技术的缺陷。本发明通过以下技术方案实现本发明的步骤包括以柿子为原料、经前处理、提取、有效组分的分离等处理过程。其具体步骤是(1)原料前处理新鲜柿子取肉，组织捣碎机(JJ-2,江苏省金坛科学仪器厂)制成匀浆，或采用新鲜柿肉经6(TC以下真空(DZ-2A真空干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司)干燥后粉碎至20-80目(优选地，步骤(1)原料粉碎至40-50目)，得前处理材料；(2)提取将前处理原料按重量/体积比1:9一1:15加入萃取剂(配方附后)，在50—6(TC超声循环萃取30-60min(HF-500B超声循环提取机，，西安太康生物科技有限公司，超声功率300W)，或在90-10(TC下加热回流提取40-6(kin,过滤，提取液备用。滤渣再按以上相同的操作重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇或甲醇，得浓縮液l备用；(3)有效组分的分离将步骤(2)得到的浓缩液1用蒸馏水稀释3-5倍后，上弱极性大孔树脂柱，(优选地，歩骤(3)中弱极性大孔树脂为XAD-1B、DM130、HPD-450等型号的大孔吸附树脂)，上样后保留样品0.5-lh，先用蒸馏水洗脱、至苯酚-硫酸法检测不到糖为止，然后再用甲醇洗脱，收集洗脱液，回收甲醇，得浓縮液2。将浓縮液2加蒸馏水稀释100-200倍，用截留分子量为5000-30000u的聚砜、聚醚砜或聚醚酮中空纤维超滤膜组件以8-12L/h的速率进行超滤分离(优选地，步骤(3)中超滤膜组件为截留分子量为6000-10000u的聚砜、聚醚砜中空纤维超滤膜，透过速率为10L/h)，得截留液和透过液，将截留液浓縮，采用冷冻干燥(德国MarinChrist公司，ALPHAl-4LD真空冷冻干燥机)或真空干燥(DZ-2A真空干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司)即得到解蛇毒有效组分其中步骤(2)所述的萃取剂按体积比为无水乙醇或甲醇36%盐酸=100:1配制本发明的优点在于1.找到了一种具有解蛇毒作用的植物有效组分。2.找到了这种解蛇毒有效成分的制备方法，经过体内外解蛇毒活性筛选试验，本发明找到了一种利用大孔吸附树脂与膜分离相结合制备柿子解蛇毒有效组分的制备方法。大孔树脂和超滤分离虽然常被用于植物成分的粗分离，但现有技术是单独使用，本发明的独特之处是将这两种方法相结合，且选用了型号为XAD-IB或DM130的大孔树脂和截留分子量为6000-10000u的超滤膜组件。本发明工艺简便、实用，效率高，能耗低，生产成本较低，适于工业化推广和应用、产品中无萃取剂残留，对环境无污染，所得组分解蛇毒效果明显。图l:是本发明的技术路线图；图2:是粗提物的HPLC图谱；图3:是制备所得有效组分的HPLC图谱；图4:制备所得有效组分对江浙蝮蛇毒蛋白(AhPVP)所致小鼠肌肉毒性的解毒效果(HE染色，400X);图中图4A是生理盐水组(空白对照)，图4B是AhPVP组(模型组)，图4C是制备所得有效组分低剂量处理组，图4D是制备所得有效组分中剂量处理组，图4E是制备所得有效组分高剂量处理组图5:制备所得有效组分对尖吻蝮蛇毒蛋白(AaVP)所致小鼠肌肉毒性的解毒效果(HE染色，400X);图中图5A是生理盐水组(空白对照)，图5B是AaVP组(模型组)，图5C是制备所得有效组分低剂量处理组，图5D是制备所得有效组分中剂量处理组，图5E是制备所得有效组分高剂量处理组；图6:制备所得有效组分对对江浙蝮蛇毒蛋白(AhPVP)所致皮下出血的抑制效果；图中A蛇毒组，B制备所得有效组分低剂量组，C制备所得有效组分中剂量组，D制备所得有效组分高剂量组，E生理盐水组；图7:制备所得有效组分对尖吻蝮蛇毒蛋白(AaVP)所致皮下出血的抑制效果；图中A蛇毒组，B制备所得有效组分低剂量组，C制备所得有效组分中剂量组，D制备所得有效组分髙剂量组，E生理盐水组。具体实施方式参考下列实施例将更易于理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明实施例1取新鲜成熟柿果200g打浆后按重量/体积比1:12加入萃取剂(无水乙醇，含1%盐酸，V/V),密闭，9(TC回流浸提50分钟，过滤，提取液备用。滤渣再在相同条件下提取两次，过滤，合并三次滤液，用离心机(3000r/min，湖南星科科学仪器有限公司)离心10min，取上清液，回收乙醇，得浓縮液l备用。将浓縮液1用蒸馏水稀释3倍后上XAD-1B大孔吸附树脂，上样后保留30min。先用蒸馏水以3ml/min流速洗脱，洗脱至苯酚-硫酸法检测不到糖为止，再用甲醇以2ml/min流速冲洗树脂柱，至洗脱液基本无颜色为止。收集甲醇洗脱液，在4(TC温度下真空浓缩回收甲醇，得浓縮液2。将浓縮液2加蒸馏水稀释100倍，然后采用截留分子量为6000-10000u的聚砜中空纤维超滤组件(外压式，天津天方膜分离工程公司)超滤分级，截留液浓縮采用冷冻干燥(德国MarinChrist公司，ALPHA1-4LD真空冷冻干燥机)或真空干燥(温度50°C，真空度700誦Hg,DZ-2A真空干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司)，得到解蛇毒有效组分10.6g。实施例2取未成熟青柿果肉200g打桨后按按重量/体积比1:12加入萃取剂(甲醇，含1%盐酸，V/V)，密闭，9(TC回流浸提50min，过滤，提取液备用。滤渣再在相同条件下提取两次，过滤，合并三次滤液，用离心机(3000r/min,湖南星科科学仪器有限公司)离心10min,取上清液，回收乙醇，得浓縮液l备用。将浓縮液1用蒸馏水稀释4倍后上DM130大孔吸附树脂，上样后保留40min。先用蒸馏水以3ml/min流速洗脱，洗脱至苯酚-硫酸法检测不到糖为止，再用甲醇以2ml/min流速冲洗树脂柱，至洗脱液基本无颜色为止。收集甲醇洗脱液，在4(TC温度下真空浓縮回收甲醇，得浓縮液2。将浓縮液2加蒸馏水稀释150倍，然后采用截留分子量为10000-30000u的聚砜醚中空纤维超滤组件(外压式，天津天方膜分离工程公司)超滤分级，截留液浓缩，采用冷冻干燥(德国MarinChrist公司，ALPHAl-4LD真空冷冻干燥机)或真空干燥(温度50'C,真空度700腦Hg，DZ-2A真空干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司)，得到解蛇毒有效组分11.3g。实施例3取成熟柿果肉200g打浆后按重量/体积比1:15加入萃取剂(无水乙醇，含1%盐酸，V/V)，密闭，6(TC超声循环萃取30min(300W,HF-500B超声循环提取机，西安太康生物科技有限公司)，过滤，提取液备用。滤渣再在相同条件下提取两次，过滤，合并三次滤液，用离心机(3000r/min，湖南星科科学仪器有限公司)离心lOmin，取上清液，回收乙醇，得浓縮液1备用。以下工艺同实施例l，采用与实施例1方法进行冷冻干燥或真空干燥，可得得到IO.lg解蛇毒有效组分。实施例4取经低温(<50°C)干燥的粉碎至40-50目的成熟柿果肉200g,按重量/体积比1:12加入萃取剂(甲醇，含1%盐酸，V/V)，以下工艺同实施例1，采用与实施例1方法进行冷冻干燥或真空干燥，可得到9.3g解蛇毒有效组分。实施例5对蛇毒蛋白染毒小鼠致死毒性的解毒效果动物实验法动物模型参考邓维意等介绍的方法(邓维意等.卵黄中蝮蛇蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用.广州医学院学报，2002,30(2):8-9)，以新西兰小鼠或瑞士小鼠为实验动物，采用肌肉注射或腹腔注射的方式将一定致死剂量的江浙蝮蛇蛇毒蛋白(AhPVP)、尖吻蝮蛇(AaVP)、眼镜蛇蛇毒蛋白(NnaVP)注入受试小鼠体内，然后于不同时间内以口服灌胃、腹腔注射、静脉注射三种不同给药方式，以小鼠存活时间、死亡率和小鼠死亡症状为主要考核指标，观察所制备有效组分的解蛇毒作用效果及量效关系。(见表l-表3)表l本发明制备的有效组分口服灌胃给药对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠致死毒性的解毒作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注**p<0.01,与AhPVP組.相比；"p〈0.0'与AaVP组相比；**p<0.01，与NnaVp组相比表3本发明制备的有效组分静脉注射给药对AhPVP、AaVP、NnaVP染毒小鼠致死毒性的解毒作用<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例6对蛇毒蛋白所致小鼠肌肉毒性的解毒效果动物实验法动物模型参考Melo和Ownby(MeloPA,OwnbyCL.Abilityofwedelokctone,heparin,andpara-bromophenacylbromidetoantagonizethemyotoxiceffectsoftwocrotalinevenomsandtheirPLA2myotoxins.7bx/co",1999,37:199-215)介绍的方法，以新西兰小鼠或瑞士小鼠为实验动物，釆用肌肉注射的方式将一定量的三种蛇毒蛋白(AhPVP、AaVP、NnaVP)注入受试小鼠体内，然后立即在小鼠趾长伸肌(EDL肌)上方注射不同剂量所制备解蛇毒有效组分，以小鼠血清中肌酸激酶(CK)活性和小鼠趾长伸肌(EDL肌)组织切片损伤程度为指标，观察所制备解蛇毒有效组分的作用效果及量效关系(见图4-图5)。对蛇毒蛋白所致小鼠出血毒性的解毒效果动物实验法参考Andre等(AndreLetal.,MyotoxicactivityofanacidicphospholipaseA2isolatedfrom丄acAewiwwto(Bushmaster)snakevenom.7bx/cow,2000,38:961-972)介绍的方法，以新西兰小鼠或瑞士小鼠为实验动物，以一定量的AhPVP,AaVP的溶液于小鼠背部皮下注射(s.c),作为蛇毒组，阴性对照组注射相同剂量的生理盐水。在含AhPVP，AaVP溶液中分别加入不同量的所制备解蛇毒有效组分混合均匀后迅速注射作为所制备解蛇毒有效组分治疗组。经0.5h后将小鼠用乙醚处死，将背部皮肤剪开，量取最大横径和最大直径测定皮下出血面积(cm2)，以皮下出血面积的平均值进行出血程度评价，求其抑制率。并与生理盐水组比较，进行t检验,求其差异的显著性(见图6-图7)。权利要求1、一种植物解蛇毒有效组分的制备方法，其特征在于以下步骤(1)原料前处理取鲜柿果肉，组织捣碎制成匀浆，或取新鲜柿肉并用60℃以下真空干燥后将其粉碎至20-80目，得前处理材料；(2)提取将步骤(1)的前处理材料按重量/体积比1∶9-1∶15加入萃取剂，超声循环萃取30-60min，处理温度50-60℃，功率300W；或在90-100℃下加热回流提取40-60min，过滤，滤液备用；滤渣再用上述方法重复提取两次，过滤，合并三次滤液，回收萃取剂中的乙醇或甲醇，得浓缩液1备用；(3)有效组分分离将步骤(2)得到的浓缩液1用蒸馏水稀释3-5倍后，上弱极性大孔树脂柱，上样后保留样品0.5-1h，先用蒸馏水洗脱，至苯酚-硫酸法检测不到糖为止，然后再用甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得浓缩液2；将浓缩液2加蒸馏水稀释100-200倍，用截留分子量为5000-30000u的聚砜、聚醚砜或聚醚酮中空纤维超滤膜组件以8-12L/h的速率超滤分离，得截留液和透过液，将所述的截留液浓缩，采用冷冻干燥或真空干燥即得到解蛇毒有效组分；其中步骤(2)所述的萃取剂按体积比的组分为无水乙醇或甲醇∶36％盐酸＝100∶1。2、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的真空干燥温度为40-5(TC'，将干燥后的原料粉碎至40-50目。3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，歩骤(3)精制纯化所使用的大孔树脂为对有效组分有特异性亲和力的XAD-1B或副130型弱极性大孔吸附树脂。4、根据权利要求l所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所使用的膜材料为截留分子量为6000-10000D的改性聚砜、聚醚砜或聚醚酮中空纤维超滤膜组件，其透过速率为10L/h。全文摘要本发明涉及一种植物解蛇毒有效组分的制备方法。以柿子为原料，经前处理、提取、有效组分的分离等处理过程。取新鲜柿肉匀浆，或经低温真空干燥后粉碎至20-80目的柿肉为原料，用萃取剂超声循环萃取30-60min或在90-100℃下加热回流提取40-60min，过滤，滤液回收溶剂乙醇或甲醇，得浓缩液1；将浓缩液1用水稀释后，上大孔树脂柱，上样后保留样品0.5-1h，先用蒸馏水洗脱、再用甲醇洗脱，收集甲洗脱液，回收溶剂，得浓缩液2；将浓缩液2加水稀释，用截留分子量为6000-10000u的聚砜中空纤维超滤膜组进行超滤分离，将截留液浓缩干燥即得到解蛇毒有效组分。体内动物试验表明，本发明制备的解蛇毒有效组分具有解蛇毒的效果。文档编号A61K36/44GK101327245SQ20081004801公开日2008年12月24日申请日期2008年6月13日优先权日2008年6月13日发明者徐玉娟,李春美,陈美红,顾海峰申请人:华中农业大学