灭活的乳酸菌微生态制剂及其制备方法

专利名称：：灭活的乳酸菌微生态制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及人用或饲用微生态制剂领域，尤其涉及一种灭活的乳酸菌微生态制剂及其制备方法。
背景技术：
：规模化、高密度畜禽和水产养殖的迅速发展，使养殖生态环境遭到严重冲击，致使传染性高、致死性强的疾病频发，使用传统的消毒剂和抗生素已不能有效地防止疾病发生。随着人们对食品安全和个人健康关注度提高，已意识到长期接触抗生素或在饲料中添加抗生素添加剂带来的种种弊端(1)长期使用抗生素导致抗药性菌株的出现；(2)造成人或畜禽、水产机体免疫机能下降。抗生素被机体摄入后，会随着血液循环分布到各个免疫组织器官，动物免疫能力会逐步削弱。抗生素还会导致抗原质量降低，会对疫苗的接种造成不良的影响；(3)可能引起人或畜禽、水产内源性感染和二重感染；(4)在畜禽和水产品中造成残留。微生态制剂是一种由活的有益的微生物制成，其改善人和动物肠道微生态平纟軒，预防肠道致病菌的感染，提高人和动物的免疫力等性能已得到了充分的证明和认可，是一种极具潜力的抗'生素替代品。目前微生态制剂已广泛应用于人或动物肠道疾病的预防与辅助治疗。微生态制剂的作用机制主要包括(1)竟争性粘附。通过在肠道结合位阻效应，形成生物保护膜，保护人和动物免受致病微生物的侵害。(2)抗菌效应。乳酸菌发酵产生的乳酸降低肠道pH,阻止病原菌生长，产生类细菌素能够灭杀致病菌。(3)激活免疫功能。微生态制剂菌株能影响宿主天然免疫、体液和细胞免疫系统，提高肠道抗体水平和巨噬细胞活性，增强机体免疫功能；(4)改善消化能力，提高食物或饲料消化水平。有益的微生物在人或动物肠道分泌一些酶类物质，可促进食物或饲料中营养成分的分解，更有利于人或动物对营养的消化吸收；微生态制剂菌抹可以刺激小肠绒毛的生长，增大营养吸收面积。尽管微生态制剂的功效已经被广泛证明和接受，但是，这类活菌体微生态制剂仍然存在以下几个问题(1)受环境条件(温度、水分、酸碱度等)的影响，其有效成份易失活，从而降低使用效果；(2)饲料调制和造粒的高温过程使大量的活菌致死；(3)饲料中添加的或在治疗过程使用的抗生素和化学合成抗菌剂，对微生态制剂同样具有杀灭或抑制作用；(4)不能有效抵抗人或动物消化道中的盐酸或胆汁等的作用，在肠道的定植能力差。(5)在同一生境中长期使用同一活菌制剂，导致噬菌体感染与暴发的风险增加。这些问题极大地限制了活菌类微生态制剂应用推广，是瓶颈。
发明内容本发明的目的在于克服现有活菌类微生态制剂的不足，提供了一种全新、稳定、高效的灭活乳酸菌微生态制剂，以灭活的乳酸菌细胞及其发酵代谢产物为主要有效成分。本发明的第二个目的在于提供一种灭活乳酸菌微生态制剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种灭活的乳酸菌微生态制剂，包括如下质量配比的组分灭活乳酸菌细胞及乳酸菌发酵产物10-60份，其中灭活乳酸菌细胞108-109个/克，赋形剂30-50份。所述灭活的乳酸菌微生态制剂还包括速效能量物质10-50份。所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌中的一种或一种以上。所述赋形剂是60-100目玉米芯粉和沉淀二氧化硅的混合物、玉米淀粉和沉淀二氧化硅的混合物、或者玉米芯粉、玉米淀粉和沉淀二氧化硅三者的混合物。所述速效能量物质为葡萄糖或乳糖。灭活乳酸菌微生态制剂制备方法，包括以下步骤1)选取乳酸菌发酵培养；2)发酵结束后在发酵液中加入质量分数为0.1-0.5%的保护剂；3)灭活，离心收集菌体；4)浓缩上清液，加入赋形剂，干燥，使残留水分小于15%;5)将步骤3)获得的菌体与步骤4)的产物混合。所述步骤4)中，还可以加入速效能量物质。所述速效能量物质为葡萄糖或乳糖。所述保护剂为海藻酸钠和甘油的混合物，或者脱脂牛奶。所述海藻酸钠和甘油的质量比是l:1。所述灭活方法可以是冷冻灭活、热灭活或者化学灭活。灭活乳酸菌微生态制剂在制备用于预防或辅助治疗人或动物肠道疾病的药物中的应用。本发明所述灭活的乳酸菌微生态制剂拥有与活的微生态制剂相同的功效，尽管乳酸菌发酵后经过灭活处理，灭活的乳酸菌细胞不仅能高效粘附到人和动物的肠道上皮细胞，发挥保护作用，而且还具有活的微生态制剂没有的优点灭活的乳酸菌细胞耐高温、耐胃酸和耐胆汁，可与抗生素协同作用；另外，乳酸菌发酵过程产生的代谢产物如乳酸、类细菌素等能有效地抑制或杀灭人或动物的肠道致病菌；本发明所述的灭活乳酸菌微生态制剂有效、经济地解决了目前困扰活菌类微生态制剂的问题。具体实施例方式实施例1一种灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂，其组分为每公斤灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂含有灭活的嗜酸乳杆菌及其发酵产物550克，其中灭活的乳杆菌细胞含量为1()S个/g，规格为80目的玉米芯粉和沉淀二氧化硅共450克，其中玉米芯粉和沉淀二氧化硅各225克。在一吨全价料中的用量为2公斤。此组分比例和添加量可以用于水产养殖业。实施例2实施例1所述灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂制备方法，包括如下步骤1)嗜酸乳杆菌先进行菌种制备，菌种筛选培养基是以固体MRS培养基作为基本培养基，加入0.lo/。CaC03,pH值为6.4。121。C灭菌20-30分钟，冷却至37'C，备用。2)嗜酸乳杆菌的发酵培养，发酵培养基是以液体MRS培养基作为基本培养基，pH值为6.4。121'C灭菌20-30分钟，冷却至37。C，备用。种子菌龄12-18小时，接种量为3%-5%(V/V或V/W)。发酵时间36-48小时，发酵温度37。C,pH值维持在5.5左右。3)在发酵结束后将发酵液中加入质量分数0.1-0.5%(w/v)的保护剂，所述保护剂由海藻酸钠和甘油组成，二者的比例为1:1。4)灭活冷冻灭活，发酵液3000转/分钟离心15分钟，去上清液，收集菌体并降温至l(TC左右，维持2-5个小时。5)上清液经双效真空浓缩，浓缩10倍，550克灭活的嗜酸乳杆菌及其发酵产物加入赋形剂450克，所述赋形剂是80目玉米淀粉和沉淀二氧化硅的混合物，二者比例为1:1，混合并搅拌20-30分钟，使之充分混合与吸附。6)已同赋形剂充分混合的灭活的嗜酸乳杆菌及其发酵产物于90°C-105匸千燥，使残留水分《15%。由海藻酸钠和甘油组成的保护剂，可以保护细胞的形态，保护细胞表面基团的完整性，保证其能与肠道位点结合，如果在灭活前不添加保护剂会造成80%以上细胞破裂，添加该保护剂可以保证95%以上细胞完整。另外，也可以用脱脂牛奶作为保护剂。嗜酸乳杆菌发酵产物中含有淀粉酶、乳糖酶等酶类，有助于动物消化；类细菌素，具有抑制病菌作用；乳酸、乙酸等有机酸。实施例3一种灭活的保加利亚乳杆菌微生态制剂，其各组分为每公斤灭活的保加利亚乳杆菌微生态制剂含有灭活的保加利亚乳杆菌及其发酵产物600克，其中灭活的保加利亚乳杆菌细胞含量为1()8个/g,葡萄糖100克，规格为100目的玉米芯粉和沉淀二氧化硅300克，其中玉米芯粉和沉淀二氧化石圭各150克。在一吨全1^介料的用量为17>斤，此组分比例和添加量可以用于仔猪养殖，在新奶仔乳猪养殖试验中，添加了G.1%的此微生态制剂可以使腹泻率降到2.25%,远低于对照组的11.32%。所述葡萄糖可以用乳糖替换。实施例4实施例3所述灭活的保加利亚乳杆菌微生态制剂的制备方法，包括如下步骤1)保加利亚乳杆菌先进行菌种制备，菌种筛选培养基是以固体MRS培养基作为基本培养基，加入O.l°/。CaC03,pH值为6.4。121。C灭菌20-30分钟，冷却至37。C，备用。2)保加利亚乳杆菌的发酵培养，发酵培养基是以液体MRS培养基作为基本培养基，pH值为6.4。12rC灭菌20-30分钟，冷却至3丌C，备用。种子菌龄12-18小时，接种量为3°/。-5%(V/V或V/W)。发酵时间36-48小时，发酵温度37。C,pH值维持在5.5左右。3)在发酵结束后将发酵液中加入质量分数0.1-0.5%(w/v)的保护剂，所述保护剂是脱脂牛奶。4)灭活热灭活，发酵液升温至70-80。C，维持30-60分钟，发酵液3000转/分钟离心15分钟，去上清液，收集菌体。5)上清液经双效真空浓缩，浓缩10倍，600克灭活的保加利亚乳杆菌及其发酵产物的浓缩物加入赋形剂300克和葡萄糖100克，所述赋形剂是IOO目玉米芯粉、玉米淀粉和沉淀二氧化硅的混合物，三者比例为1:1:1,混合并搅拌20-30分钟，使之充分混合与吸附。6)已同赋形剂和葡萄糖充分混合的灭活的保加利亚乳杆菌及其发酵产物于90°C-105。C干燥，使残留水分<15%。所述灭活方法还可以是化学灭活，例如添加曱酪灭活。所述葡萄糖或者乳糖作为速效能量物质，可以在应激和危急状态下，快速合成ATP,给机体提供能量。实施例5一种灭活的乳酸乳杆菌微生态制剂，其各组分为每公斤灭活的乳酸乳杆菌微生态制剂含有灭活的乳酸乳杆菌及其发酵产物400克，其中灭活的乳酸乳杆菌细胞含量为>1()8个/g,乳糖300克，规格为100目的玉米淀粉和沉淀二氧化硅共300克，其中玉米芯粉200克、沉淀二氧化硅100克。在一吨全价料的用量为1.5公斤，此组分比例和添加量可以用于家禽养殖业，在竹丝鸡的试验中，添加了0.15%的此微生态制剂可以提高竹丝鸡从出生到90日龄的平均生长性能，试验组的料肉比为3.37,成活率为93.04%，而对照组为3.60和91.77%。实施例6一种灭活的双歧杆菌微生态制剂，其各组分为每公斤灭活的双歧杆菌微生态制剂含有灭活的双歧杆菌及其发酵产物200克，其中灭活的乳杆菌细胞含量为1()8个/g，葡萄糖500克，规格为80目的沉淀二氧化硅300克。其可以应用于水产养殖。在牙鲆的饲料中加入O.1%的灭活微生态制剂，祠喂一周后发现，试验组基本上没有发生肠炎等肠道疾病，死亡率O.5%;空白对照组和加抗生素组发生了严重的肠炎，死亡率达到4%。实施例7实施例1所述灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂饲喂仔猪实验实-睑时间46天。试验组合共分三组饲料，设为A、B、C料。A料为(311料作为基础日粮)对照用料，B料为在J^4日粮上添加lkg/t实施例1所述灭活的嗜酸乳杆菌^f敫生态制剂，C料为在基础日粮添加2kg/t实施例1所述灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂。试验对象正常分娩的18头母猪所产仔猪(平均10头/窝)为实验仔猪，共三批，计54头母猪所产540头仔猪。按照母猪的分娩情况，确定好每批每组的实验仔猪数。试验设计共分三个试验组，分别为对照组、试验I组和试验II组，如下表一。表一试验分组<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按照母猪预产期顺序逐次分为一、二、三批次试验，在每批次中也按照预产期顺序逐次分为A、B、C共6个重复试验，如表二。表二每个批次的试验用料排序<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>曰常饲养管理按养猪公司制定的《猪场伺养管理手册》进行，自由采食，充分饮水，常规防疫，经常消毒。每天仔猪加料四次，每天按标准称料祠喂，第二天早上把剩余料回收称量，每天观察仔猪的下痢情况，仔猪釆食及健康状况。实验数据记录母猪的生产情况、仔猪出生重、26天龄断奶重、35天龄重；按日记录添加料量与剩余料量，记录下痢头数及各阶段各组仔猪增重，分析下痢发生率。数据总结下痢分析，从表三可以看出，每组试验仔猪中，对照组腹泻率为11.32%,试验I组为2.25%，试验II组为1.62%。在詞料中添加灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂可降低仔猪腹泻率，试验I、II组分别比对职组腹泻率降低80.12%和85.68%。并且试验组仔猪肤色红润，被毛光亮，35天成活率达到95.4%和95.3%,分别比对照组提高了1%和0.95%。平均日增重分析，从出生到35曰龄，对照组平均曰增重为191克/天/头，试验I组和试验II组分别为212克/天/头和206克/天/头，试验I组和试验11组平均日增重分別比对照组提高了10.99%和7.85%。表三试验数据统计表测试项目单位对照组试验I组试验II组实验母猪数头181818总产仔头206209207活产仔头196191192实验仔猪数头185182183#刀生始重公斤189.69292.68270.9726天断奶重公斤1266.81296.81223.335天龄重公斤1521.211643.821591.31日增重(0-35)克191212206腹泻率(0-35)%11.322.251.62耗料总量(25-35天)公斤398.8405.2430.1日耗料量(25-35天)克215.57222.64234.97饲料报酬/U31.051.1435天仔猪成活率%94.495.495.3饲料报酬分析，从第25到第35天，对照组、试验I组和试验II组的日耗料量分别为215.57克/天/头、222.64克/天/头、234.97克/天/头，料肉比分别为1.13，1.05,1.14，其中试验I組最好。结论1)在小猪料中添加灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂可维持乳猪胃内适当酸度来激化酶的活性，提高物质消化率，也能抑制致病菌在胃肠道的繁殖，从而减少腹泻，提高增重，改善饲料转化率。2)在两个试验中，B料(即试验I组)的试验效果比较好，试验仔猪生长表现良好，皮毛红亮，精神活泼，无不良反应。3)从经济效益分析，B料(即试验I组)饲料报酬低(即饲料转化率高)、生产成本较^f氐，经济效益明显。4)目前早期断奶后仔猪下痢发生率较高，大量使用抗生素药物使仔猪产生的耐药性越来越强，试验证明，灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂能有效防止下痢的发生，因此在乳猪料添加适当灭活的嗜酸乳杆菌微生态制剂是一个减少仔猪下痢的有效途径。权利要求1、一种灭活的乳酸菌微生态制剂，包括如下质量配比的组分灭活乳酸菌细胞及乳酸菌发酵产物10-60份，其中灭活乳酸菌细胞108-109个/克，赋形剂30-50份。2、根据权利要求l所述的灭活的乳酸菌微生态制剂，其特征在于还包括速效能量物质10-50份。3、根据权利要求l所述的灭活的乳酸菌微生态制剂，其特征在于所述乳酸菌选自嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、嗜热链球菌、戊糖片球菌、乳酸片球菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌中的一种或一种以上。4、根据权利要求2所述的灭活的乳酸菌微生态制剂，其特征在于所述赋形剂是60-100目玉米芯粉和沉淀二氧化硅的混合物、玉米淀粉和沉淀二氧化硅的混合物、或者玉米芯粉、玉米淀粉和沉淀二氧化硅三者的混合物。5、根据权利要求1所述的灭活的乳酸菌微生态制剂，其特征在于所述速效能量物质为葡萄糖或乳糖。6、灭活乳酸菌微生态制剂制备方法，包括以下步骤1)选取乳酸菌发酵培养；2)发酵结束后在发酵液中加入质量分数为0.1-0.5%的保护剂；3)灭活，离心收集菌体；4)浓缩上清液，加入赋形剂，干燥，使残留水分小于15%;5)将步骤3)获得的菌体与步骤4)的产物混合。7、根据权利要求6所述的灭活乳酸菌微生态制剂制备方法，其特征在于所述步骤4)中，还可以加入速效能量物质。8、根据权利要求7所述的灭活乳酸菌微生态制剂制备方法，其特征在于所述速效能量物质为葡萄糖或乳糖。9、根据权利要求6所述的灭活乳酸菌微生态制剂制备方法，其特征在于所述保护剂为海藻酸钠和甘油的混合物，或者脱脂牛奶。10、灭活乳酸菌微生态制剂在制备用于预防或辅助治疗人或动物肠道疾病的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种灭活的乳酸菌微生态制剂及制备方法，包括如下质量配比的组分灭活乳酸菌细胞及乳酸菌发酵产物10-60份，其中灭活乳酸菌细胞10⁸-10⁹个/克，赋形剂30-50份。灭活的乳酸菌细胞耐高温、耐胃酸和耐胆汁，可与抗生素协同作用；另外，乳酸菌发酵过程产生的代谢产物如乳酸、类细菌素等能有效地抑制或杀灭人或动物的肠道致病菌；淀粉酶、乳糖酶等酶类有助于动物消化。本发明所述的灭活乳酸菌微生态制剂有效、经济地解决了目前困扰活菌类微生态制剂的问题。文档编号A61K35/74GK101612169SQ200810068138公开日2009年12月30日申请日期2008年6月27日优先权日2008年6月27日发明者吴清平,曹永长,毕英佐,胡文锋,陈永泉申请人:生物源生物技术(深圳)有限公司