专利名称：一种桑蚕卵的活体解剖方法
技术领域：
本发明涉及一种桑蚕卵的解剖方法，具体涉及一种桑蚕卵的活体解剖方法。
背景技术：
桑蚕(fio"i6jx L.)在我国已经被人工驯养5700多年，人们已经可
以根据生产的需要，调节桑蚕卵的外周环境，随时控制桑蚕的发育或滞育。 桑蚕卵从解除滞育到孵化一般需要11-12天的时间，在这段时间里人们每天都 要通过传统的方法解剖桑蚕卵，根据卵内胚胎的发育特征，判断胚胎的发育 进程，调节外周的环境条件，促进胚胎发育齐一。
传统的桑蚕卵解剖方法是碱法，即将浓度为20V。的NaOH或KOH煮沸后， 用铜丝网漏勺将桑蚕卵浸入碱液后，至卵面变为赤豆色后取出，经清水漂洗 碱液后，放入平面皿中，用胶头吸管冲吸，直到卵壳被冲破后，吸出已经变 性的胚胎，放显微镜下观察。由于桑蚕的品种很多，卵壳的厚薄存在差异， 在碱液中浸的时间也要求不同。浸的时间过长，整个桑蚕卵包括胚胎都被碱 溶解；浸的时间过短，则吸管冲时很难将胚胎冲出。因此，这一技术要求髙 的操作， 一般都由有经验的技术员进行操作。
另外，随着桑蚕发育生物学和分子生物学的研究的飞速发展，近年来，研 究胚胎的发生及其分子调控机制巳经成为研究热点。目前，还国内没有解剖 桑蚕卵活体胚胎的相关报道，在一定程度上制约了活体胚胎的体外培养。抽 提桑蚕卵核酸(DNA或RNA)的方法都是连同卵壳一起放入液氮后研磨，卵 壳上的附着物中会包含大量的微生物，会影响核酸(DNA或RNA)的抽提效 果。
发明内容
本发明目的是提供一种桑蚕卵的活体解剖方法，该方法可以适用于不同厚度卵壳的桑蚕卵，操作方便、经济实用；而且利用该方法得到的胚胎来确 定桑蚕卵的发育进程检验快速；并且利用该方法得到的胚胎可以用于活体胚 胎的体外培养；另外利用该方法得到的胚胎提取桑蚕卵核酸DNA或者RNA 的时候不会有污染。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是 一种桑蚕卵的活体解剖方 法，包括下列步骤
(1) 将桑蚕卵放入PBS缓冲液中浸泡后，削开桑蚕卵的一端，挤出桑蚕卵的 所有内容物
(2) 在缓冲液中冲洗桑蚕卵的内容物，分离胚胎和卵黄。 上述技术方案中，所述PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)的配方为本领域技
术人员已知的现有技术，其中各化合物的浓度为 NaCl 137mmoI/L KC1 2.7mmol/L Na2HP04 4.3mmol/L KH2P04 1.4mmol/L。
上述技术方案中涉及的解剖器材包括医用镊子、解剖刀、培养皿、胶 头吸管，载玻片。
优选的技术方案包括以下具体步骤
(1) 在超净工作台内，将经72%乙醇消毒5分钟的桑蚕卵放入盛有温度为 50t: 55X:无菌PBS缓冲液培养皿中浸泡5 8分钟，采用镊子将蚕卵两边夹 紧固定，用解剖刀削开卵的一端，镊子再轻轻挤压，挤出卵内的所有内容物；
(2) 用胶头吸管在缓冲液中轻轻冲洗内容物数次，分离胚胎和卵黄分离。 上述技术方案中，桑蚕卵的切口面积占卵面积的10~15%为宜，过大会伤
害到胚胎，过小在挤出内容物时，会使胚胎被挤碎。
本方案所得的胚胎可以应用于胚胎发育分析，以确定桑蚕卵的发育进程， 具体包括以下步骤用吸管吸出胚胎至于载玻片上，在400倍显微镜下进行观 察，根据胚胎的特征，可确定桑蚕卵的发育进程；如解剖的活体胚胎用于观 察发育进程用，则桑蚕卵的活体解剖不需要在超净工作台中操作，解剖器材 只需用无菌水清洗即可，本方案所得的胚胎可以应用于活体培养，具体包括以下步骤用吸管将 完整的胚胎吸入盛有lmL培养基(TC100)培养板中，摇匀后，再将胚胎吸 出，植入培养板中即可正常培养；如解剖活体胚胎用于活体培养DNA抽提， 所有试剂和器材需要髙压灭菌(121" 6.895X104 Pa30分钟)，并在超净台内 进行操作；如解剖活体胚胎用于RNA抽提，所有器材需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 1%。水浸泡30分钟后，髙压灭菌6.895 X104 Pa 30分钟)后， 180r灭菌4小时以上，PBS缓冲液(含1、DEPC)进行灭菌，并在超净台内进 行操作。
本方案所得的胚胎还可以应用于分子生物学分析领域，具体包括以下步 骤收集活体胚胎，加入液氮后研磨，按照常规方法可以抽提出核酸(DNA 或)RNA，用于分子生物学分析。
本发明的工作原理为在50C 55'C的PBS浸润下，可使桑蚕卵的卵壳 软化；用镊子固定好桑蚕卵后，用解剖刀削开桑蚕卵的一端后，再用镊子挤 压桑蚕卵时所有内容物均可通过切口挤到缓冲液中；在缓冲液中用吸管冲洗 所得的桑蚕卵的内容物后，即可分离出活体胚胎。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1. 由于本发明是在软化后的桑蚕卵壳的一端开口，再将桑蚕卵的内容物 挤压出，因此不需要考虑桑蚕卵卵壳的厚度，适用性强；
2. 由于50t 55'CPBS缓冲液的使用，其pH值为7.2 7.4,在这样的 环境下直接活体解剖桑蚕卵，因此本发明解剖出的胚胎为活体，胚胎特征为 实体特征，便于做体外培养和抽提核酸(DNA或RNA);
3. 本检验方法的灵敏度髙，操作方便，检验快速成本低不会排放强碱污 染环境。
附图1实施例中桑蚕卵活体解剖示意其中，1、桑蚕卵；2、胚胎及其它内容物；3、镊子；4、解剖刀；5、切
PI 。
具体实施方式
下面结合附图1及实施例对本发明作进一步描述 其中涉及的解剖器材的包括
医用镊子(12.5 cm)、解剖刀(12号)、培养皿(9 cm)、 PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L, KC1 2.7mmol/L， Na2HP04 4.3mmol/L,KH2P04 1.4mmol/L)、 胶头吸管(9 cm),载玻片(0.2 mm);
实施例一 一种桑蚕卵活体解剖方法，胚胎用于发育分析。 将桑蚕卵放入盛有温度为50"C-55'CPBS缓冲液培养皿中浸泡5-8分钟， 采用镊子将蚕卵两边夹紧固定，用解剖刀轻轻削开卵的一端，镊子再轻轻挤 压，挤出卵内的所有内容物。用胶头吸管在水中轻轻冲洗内容物数次，分离 胚胎和卵黄。
用吸管吸出胚胎在400倍显微镜下进行观察，根据胚胎的特征，可确定桑 蚕卵的发育进程。
实施例二 一种桑蚕卵活体解剖方法，胚胎用于活体培养。
将所有的器材进行髙温灭菌，在超净工作台内，将经72%乙醇消毒5分 钟的桑蚕卵放入盛有温度为5(TC-55C无菌PBS缓冲液培养皿中浸泡5-8分 钟，采用镊子将蚕卵两边夹紧固定，用解剖刀轻轻削开卵的一端，镊子再轻 轻挤压，挤出卵内的所有内容物。用胶头吸管在水中轻轻冲洗内容物数次， 即可将胚胎和卵黄分离。
用吸管将完整的胚胎吸入盛有lmL培养基(TC100)培养板中，摇匀后， 再将胚胎吸出，植入培养基中正常培养。
实施例三 一种桑蚕卵活体解剖方法，胚胎用于DNA抽提
将所有的器材进行髙温灭菌，在超净工作台内，将经72%乙醇消毒5分 钟的桑蚕卵放入盛有温度为50X:-55"无菌PBS缓冲液培养皿中浸泡5-8分 钟，采用镊子将蚕卵两边夹紧固定，用解剖刀轻轻削开卵的一端，镊子再轻 轻挤压，挤出卵内的所有内容物。用胶头吸管在水中轻轻冲洗内容物数次， 即可将胚胎和卵黄分离。
收集胚胎，放入研钵后加入液氮研磨，按照常规方法进行DNA抽提。实施例四 一种桑蚕卵活体解剖方法，胚胎用于RNA抽提 将所有的器材用1°/。DEPC水浸泡30分钟后，髙压灭菌(121X: 6.895X104 Pa30分钟)后，180匸灭菌4小时以上。在超净工作台内，将经72%乙醇消毒 5分钟的桑蚕卵放入盛有温度为50'C-55"C无菌PBS缓冲液(含"/。DEPC)培养 皿中浸泡5-8分钟，采用镊子将蚕卵两边夹紧固定，用解剖刀轻轻削开卵的一 端，镊子再轻轻挤压，挤出卵内的所有内容物。用胶头吸管在水中轻轻冲洗 内容物数次，即可将胚胎和卵黄分离。
收集胚胎，放入研钵后加入液氮研磨，按照常规方法进行抽提RNA。 采用本解剖方法，可实现经济、快速解剖出桑蚕卵活体胚胎，可用于分析 胚胎的发育进程、体外培养和抽提核酸(DNA或RNA)。本发明对于节约资 源、减少强碱对环境的污染、提髙劳动效率具有重要意义。
权利要求
1. 一种桑蚕卵的活体解剖方法，其特征在于包括下列具体步骤(1)将桑蚕卵放入PBS缓冲液中浸泡后，削开桑蚕卵的一端，挤出桑蚕卵的所有内容物；(2)在PBS缓冲液中冲洗桑蚕卵的内容物，分离胚胎和卵黄。
2. 根据权利要求1所述的桑蚕卵的活体解剖方法，其特征在于所述PBS 缓冲液为50 55"C的无菌PBS缓冲液，桑蚕卵在PBS缓冲液中浸泡时间为5 8分钟。
3. 根据权利要求1所述的桑蚕卵的活体解剖方法，其特征在于步骤(l) 和步骤(2)在超净工作台内进行。
4. 根据权利要求1所述的桑蚕卵的活体解剖方法，其特征在于解剖过 程涉及的试剂和器材经髙压灭菌，即于12ir下，6.895X104Pa的压力下，灭 菌30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种桑蚕卵活体解剖方法，用解剖刀削开桑蚕卵的一端，将卵内内容物全部挤入缓冲液中，经吸管冲吸即可分离胚胎及卵黄。其特征在于该方法解剖出来的胚胎为活体，特征明显，便于对发育进程的判断；还可用于胚胎的体外培养及抽提核酸(DNA或RNA)。本发明对于节约资源、减少强碱对环境的污染、提高劳动效率具有重要意义。
文档编号A61B16/00GK101283919SQ20081009685
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者卫正国, 兵 李, 沈卫德, 许雅香, 陈玉华 申请人:苏州大学