专利名称：：提高牛性控精液超排受精率的方法
技术领域：
：本发明涉及胚胎工程领域，特别是涉及牛性控胚胎的产业化过程中，提高性控精液受精率的方法。技术背景牛性控胚胎产业化生产的基本原理是应用奶牛超数排卵技术和分离精液(X精子或Y精子)生产性别控制胚胎，结合胚胎移植(ET)技术快速扩繁高产奶牛(母牛)，增加高产奶牛数量。奶牛超数排卵动物的精子与卵子结合后形成动物胚胎。在母牛出生时其卵巢上有6—10万个卵母细胞，随着年龄的增长，数量进一步减少，能够发育成熟并排出的卵母细胞是极少数的。奶牛为单胎动物，一个发情周期仅排卵l枚，怀孕期间不发情排卵，在实际生产中，由于妊娠、哺乳乏情、冬季休情等因素的影响及母牛实际利用年限的限制，多数母牛一生仅排几十个卵子，不足卵巢卵母细胞数的0.1%，有99.9%的卵母细胞都没有发育成熟，没有起到应有的作用。超数排卵技术即利用生殖激素刺激卵泡生长和发育，可使奶牛排出较正常多几倍、十几倍的卵母细胞，在人工授精后形成奶牛胚胎。超数排卵和胚胎移植技术技术对于挖掘优秀母畜的繁殖潜力意义重大。性别控制决定哺乳动物的性别的基因是Y染色体上的一个核心区基因，即SRY(Sex-determiningregionoftheYChromosome)基因。对于奶牛，人们希望得到雌性奶牛，用于更快的扩繁种群和产奶。对于进行性别控制的方法，目前科学界一致认为最理想的方法是对精子进行分离，分离X-精子或Y-精子,分离的精子用于人工授精、体外受精和超数排卵结合胚胎移植获得已知性别的后代，这是一种最经济、最实用的性别控制的方法。由于着色量与DNA量成正比，因此X精子发出的荧光比Y精子强，由于光的强弱它们带有不同的电荷，X精子和Y精子通过高压的电场后便可发生偏转，分别流入不同的收集器内而得到分离的精液，分离的准确率90%以上。胚胎移植胚胎移植是将一头良种奶牛配种后的早期胚胎取出，移植到另一头同种的生理状态相同的奶牛体内，使之继续发育成为一个个体的技术。由于牛经济价值高，属单胎动物，产仔数量少，繁殖周期长，用胚胎移植技术进行纯种扩群繁殖和黄牛改良效果好，速度快。普通精液的有效精子约为1000万个，经分离处理后，性控精液的有效精子约为200万一300万个，这样就导致超数排卵所得到的未受精率较高。
发明内容针对上述领域中的不足，本发明提供一种提高牛性控精液超排受精率的方法，对荷斯坦奶牛应用超数排卵技术生产奶牛性别控制胚胎，提高了性控精液的受精率。提高牛性控精液超排受精率的方法，其特征在于对牛性控精液进行活化离心处理，所述活化离心处理是将性控精液放在含有咖啡因的mTyrode's液里离心处理。所述咖啡因的终浓度为0.3mM。所述离心处理时，离心转速1500转/分，离心时间8分钟。所述精液输入时间为牛发情后10-15小时开始第一次输精，每隔8-12小时作第二次输精。较常规的超排配种时间延后2-3h。所述第二次输精时，同时注射促排三号(PGF2a)400ug/头。所述精液输入部位为子宫角。常规的超排配种部位在子宫颈口。上述方法生产得到的胚胎可用率较常规处理高，可用率达到80—85%，每头次超数排卵所得到的可用胚胎数为4一6枚，较常规方法降低了成本，提高了效率。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例11试剂1.1新洁尔灭1.2盐酸利多卡因1.3PBS1.45%静松灵1.50.9%生理盐水1.6酒精棉球1.7青霉素(160万单位)1.8链霉素(IOO万单位)1.9PG0.2mg/2ml/支1.10FSH10mg/瓶1.11促排三号200IU/支1.12胚胎水(WaterforembryotransferSIGMAW1503)1.13咖啡因(CaffeineSIGMAC-0750)1.14氯化钠(Sodiumchloride北京化工厂)1.15氯化钾(Potassiumchloridie北京化工厂)U6氯化钙(Calciumchloride北京化工厂)1.17氯化镁(Magnesiumchloride北京化工厂)2实验器材2.1超排所需器材2.1.1冲卵管(16#)2丄2直剪18cm2.1.3弯止血钳18cm2丄4剪毛剪(18cm)2.1.5通芯2.1.6烧杯500ml2丄7滤器2丄8输液架2丄910ml注射器2丄10三通管2.1.11乳胶管2丄12夹子2丄13lml注射器2.1.14洗瓶500ml2丄15架盘天平JPF-52丄16尖头离心管10ml2.1.17载玻片7.6X2.1X0.5cm3仪器3.1液氮罐3.2胚胎移植车3.3B超仪3.4生物显微镜XSZ-G3.5离心机JAISHILIXINJI80-2B4操作步骤54.1供体母牛的选择4丄1年龄在18月龄以上，肉牛达到成熟体重的65%-70%，奶牛要在产后2个月以上。母牛营养全面平衡，膘情达到中上等为宜。4丄2发情周期正常。至少2-3个情期正常，每个发情周期18-24天之间。4丄3无生殖器官疾病，无传染性疾病，超排前2-3个月以内最好不注射各类疫苗；供体牛无对激素及其他药品的过敏史。4丄4卵巢要求有弹性、质地好、无卵泡囊肿和黄体囊肿；卵巢系膜及卵巢与腹腔无粘连现象;子宫角质地柔软、无炎症、硬肿现象；直肠要求无炎症、过肥、紧缩现象。4丄5卵巢要求在上次超数排卵后，虽有退化黄体，但要求质地柔软、有弹性；卵巢发育静止时不能做超排；高产奶牛产奶高峰时产奶量不低于25公斤不做超排。连续两次以上冲胚效果不好的牛，要査找原因，暂不用于超排，可进行配种，使其妊娠。4.2精子处理(采用市售的性控精液)解冻精液后检査活力低限为0.3。活力合格后将剩余精液推入到含8mlmTyrode's液+0.3mM咖啡因的离心管中，离心1500转/分，离心8分钟。离心后去上清液混匀装管备用。4.3配种牛发情后10-15小时开始第一次输精，每隔8-12小时作第二次。在第二次输精时可注射促排三号(PGF2a)400ug/头。4.4注意事项4.4.1激素剂量准确无误。4.4.2输精时要稳、准、避免对卵巢强烈剌激。4.4.3输精部位在子宫角。4.4.4冻精解冻后精子活力要求0.35以上。4.5冲胚方法4.5.1冲胚时间以发情当天为0天，于第7d-7.5d开始冲胚。4.5.2冲胚前准备4.5.2.1每头牛冲两侧子宫角，共需1000mlPBS。4.5.2.2凡所用器械均需事先高压灭菌消毒(金属高压、塑料制品气体灭菌)4.5.2.3将器械车放于牛的左侧，上面摆好(剪毛剪、持针钳、镊子)各一把，冲洗瓶一个，500ml烧杯一个(盖上滤器)、或集卵杯、通芯、导管、酒精棉球，输液架立于六柱栏旁挂上PBS，吊瓶连接硅胶管并与滤器相连接。4.5.2.4将供体牛牵入保定架，保定确实。4.5.3方法4.5.3.1清除粪便后将牛的肛门及附近冲洗消毒，操作者指甲剪短，手臂用清水洗净并消毒，佩带一次性塑料长臂手套，涂少量润滑油。4.5.3.2不要用力过猛，要缓慢，依肠腔向前伸入。努责和直肠扩张时，手在直肠内暂时不动。不能过度刺激肠粘膜。4.5.3.3冲胚前10分钟进行荐尾椎间隙或第一、二尾间间隙硬膜外麻醉，注射6ml2M盐酸利多卡因。4.5.3.3.1首先用手抬举尾根，用手触摸间隙部位，在荐尾椎用剪毛剪剪毛，碘酒消毒，再用酒精脱碘。4.5.3.3.2然后将利多卡因吸入10ml注射器，用9号针头呈45度左右方向刺入皮内，再刺入硬膜。4.5.3.3.3最后在针头上滴一滴利多卡因看是否下渗，若下渗即可注入。4.5.3.4用0.01%新洁尔灭消毒外阴部，用灭菌生理盐水冲洗后，吸水纸拭干。4.5.3.5冲卵管用酒精消毒后冲卵液冲洗，检査气囊是否完好。4.5.3.6将通芯插入冲卵管，一手通过直肠把握子宫颈，另一手将冲卵管通过子宫颈进入一侧子宫角大弯部。4.5.3.7根据子宫颈粗细冲入一定量气体，抽出通芯。4.5.3.8开始注入30ml左右PBS，再将子宫角提高并轻轻按摩，使PBS回流到滤器中，反复五次左右，然后每次注入量加到50ML左右，每侧冲洗总量为500mlPBS，一侧子宫角冲卵后，立既将回收液送实验室检胚。4.5.3.9冲完一侧子宫角，抽出冲卵管，用生理盐水冲洗干净。4.5.3.10按上述方法冲另一侧子宫角。4.5.3.11冲完后肌注PG0.4mg/头，青霉素(160万单位/支)链霉素(100万单位/支)每头牛各两支注入子宫。4.5.3.12冲胚结束后应将冲卵管立即泡入清水中进行清洗。4.6注意事项4.6.1插导管时要轻，防止损伤子宫颈或子宫角内膜。4.6.2注PBS时不能多、快、猛。4.6.3遇冲卵管插不进去时，不要强行，检查通芯是否穿出管外。4.6.4宫颈粘液较多时，可用粘液吸取管先将黏液清除后再进行冲胚。放栓为O天，第4天开始注射FSH，第7天撤栓。第4天早6:0070mg晚18:0070mg第5天早6:0060mg晚18:0060mg第6天早6:0040mg晚18:0040mg第7天早6:0030mg+PG0.4mg晚18:0030mg+PG0.4mg+撤栓第8天不处理(发情)第9天晚18:00AI第10天早8:00AI第17天冲胚+PG0.4mg+青霉素(160万单位/支)第24天PG0.4mg实施例2:本发明方法与常规方法对照，对照组的性控精液未经过活化离心处理，其它操作相同，结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表用t检验进行统计分析。从中可以看出，改进后方法得到的胚胎可用率明显提高，未受精率显著下降，且在统计上差异显著(P<0.05)。说明经过改进后，利用性控精液超排受精的效率显著提高，可以达到84.2%。改进后生产的胚胎与常规方法得到的胚胎移植后妊娠率与出生活后代率均没有差异(P>0.05)。权利要求1、提高牛性控精液超排受精率的方法，其特征在于精液输入前对牛性控精液进行活化离心处理，所述活化离心处理是将性控精液放在含有咖啡因的mTyrode’s液里离心处理。2、根据权利要求1所述的方法，所述咖啡因的终浓度为0.3mM。3、根据权利要求1所述的方法，所述离心处理时，离心转速1500转/分，离心时间8分钟。4、根据权利要求1所述的方法，所述精液输入时间为牛发情后10-15小时开始第一次输精，每隔8-12小时作第二次输精。5、根据权利要求4所述的方法，所述第二次输精时，同时注射PGF2a400ug/头。6、根据权利要求4所述的方法，所述精液输入部位为子宫角。全文摘要本发明涉及“提高牛性控精液超排受精率的方法”，属胚胎工程领域。采用将性控精液放在含有咖啡因的mTyrode’s液里进行超活化离心处理的方法，提高精子的活性，从而提高受精率，并确定精液在超排时的输精时间，进一步提高精子的受精率。文档编号A61K35/52GK101259042SQ20081010428公开日2008年9月10日申请日期2008年4月17日优先权日2008年4月17日发明者晶安,张家新,张红霞,刚王,月王,海王,敏郭,郭丽丽申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司