专利名称：病证结合动物模型的创建及评价方法
技术领域：
本发明属于中医证候研究技术领域，具体涉及病证结合动物模型的制备方 法以及评价体系的构建，是心肌缺血血瘀证及心肌缺血气虚血瘀证动物模型的 制备方法及评价体系。
背景技术：
—
目前中医证候模型研制思路主要有以下五种(1)病因造模；(2)药物 造模；(3)病理造模；(4)病因病理造模；(5)病证结合造模。现有的各种 思路均有其局限性。如病因造模只是单纯地考虑证候发生的某个或某些因素， 而忽视证候的动态性和时空性，并不能一次性地客观地成功复制出证候模型； 再如药物造模所致证型在临床实际很少见到，且存在致病因素撤除后动物易恢 复，病m加强度难控制，模型评价困难等问题；而病理因素和病因病理因素 造模的思路虽然已经开始吸取西医在造模方面的成功经验，模拟出证候模型， 但仍存在证候属性界定、评价困难及稳定性不好等问题。病证结合模型已成为 中医证候动物模型的最新趋势，病证结合模型的优势体现在制作动物模型的同 时复制出证候动态性、阶段性、个体性的特征。但现有的病证结合模型大多是 根据西医理论复制疾病模型，再根据中医理论复制证候模型，再将两者结合起 来。这种结合只是造模方法的简单叠加，忽视了 "病"与"证"之间的内在联 系。而关于心肌缺血血瘀证的模型目前几乎没有报道。
发明内容
本发明的目的是创建出一套完整的符合中医证候实质(证候是疾病某一阶 段的病理生理变化的概括)的病证结合动物模型的制备方法及评价体系，通过 中华实验小型猪及实验大鼠两种动物，构建心肌缺血血瘀证和心肌缺血气虚血 瘀证动物模型的制备方法和评价体系。
中华小型猪心肌缺血血瘀证模型是通过在冠状动脉放置Ameroid缩窄环建 立的，Ameroi(i縮窄环外层为不锈钢环，环内衬垫亲水性酪蛋白衍生物，酪蛋白 衍生物遇水向内缓慢膨胀，进而逐渐增加对套扎在其中的冠脉的压迫，使得冠 脉逐渐缩窄，乃至闭塞。术后4周縮窄率可达到90%，因此能够复制稳定的慢性 心肌缺血模型，对模型动物手术后1-8周进行动态观察、理化指标的检测、心 电图、超声心动及冠脉造影。根据实验观察，可以明确术后4周左右符合心肌 缺血血瘀证的诊断。
SD大鼠心肌缺血气虚血瘀证动物模型采用左冠状动脉结扎法制备，在术后 3天进行心电图评价，以I、 avL、 VI-V6至少出现6个异常Q波作为模型成功 标志。对模型动物术后1-30天进行动态观察，观察发现，术后7天左右符合心 肌缺血气虚血瘀证的诊断，直到30天取材前仍支持气虚血瘀证的诊断。
具体实施例方式
一、 中华实验小型猪心肌缺血模型 (一)实验方法 1构建模型1. 1术前准备
(1) 术前禁食24小时，适量饮水。
(2) 氯胺酮25mg/kg肌注诱导麻醉，并建立耳缘静脉通路维持。
(3) 行气管插管，成功后接麻醉机辅助呼吸。潮气量12ml/kg (约300ml)， 呼吸频率14次/分，吸呼比l: 2。
(4) 描记肢导及胸导心电图，并行心脏超声检查。 1.2冠脉环縮术
(1) 无菌条件下，左第三肋间开胸，切开心包，充分暴露手术野。
(2) 于左冠状动脉前降支第一间隔支起始部远端钝性分离前降支约4 6mm，穿 引导线，置放縮窄环(Research Instrument SW， USA内径2. 75mm)，确定该 环固定良好。
(3) 缝合心包，依次关胸。
(4) 术中心电监测，术后即刻描记心电图。
1. 3术后护理
(1) 动物恢复血压呼吸后，拔除气管插管，置动物于笼中。并于麻醉苏醒期进 行监控。
(2) 术后进行常规抗感染治疗，肌肉注射青霉素480万单位，日一次，共3日。
2. 模型评价
2. 1四诊信息术后1-8周观察动物的宏观体征，具体如下按照中医四诊望、 闻、问、切分别进行观察。以肉眼观察配合数码照相的方法进行观察。望神即观察动物在自然状况下的精神意识、形体动作、何对外界的反应等各 个方面。观察中尽量避免惊扰动物，通过实验人员的观察，参照表l，评定动物 的精神状态。
望色即通过观察小型猪被毛、口唇、鼻盘、眼睛、耳部等部位的色泽变化，
来了解动物模型证候的发展变化。我们所采用的观察方法为动物保持清醒， 人工保定后，肉眼观察各部位色泽的变化，同时用数码相机拍照，采用casmatch 色卡校正，并经Adobe photoshop8. 0分析得到R、 G、 B值。
望舌舌与脏腑经络有着密切的联系。舌为心之苗，通过望舌色，可以了解 气血运行情况，从而反映"心主血脉"的功能。因此，在心肌缺lftl动物模型的 四诊信息采集上，望舌是重中之重，它对证候的诊断和评价都有着举足轻重的 意义。因此，在动态观察上，笔者及其团队对舌象的观察和采集也非常重视， 尝试并摸索出了一套方法。先通过肉眼观察，参照表2进行评定。由于人为因 素干扰较大，我们又采取数码相机拍照舌象，再通过专业软件进行分析以达到
客观化。具体方法是动物在清醒状态下，人工保定，待动物稳定后， 一人用 开口器打开猪嘴，暴露舌部，另-人用数码相机拍照记录，并采用casmatch色 卡进行校正。需要注意的是拍照时尽量要统一光源，并使色卡与舌面保持在 同一平面上。得到的照片经Adobe photoshop8. 0分析得到R、 G、 B值。
2. 1. 2闻诊
在动物观察过程中，通过听动物发出的声音、嗅其发出的异常气味、排出物的 气味及所在环境的气味来诊察动物的状况。同时可以借助听诊器检査动物的心 脏情况。 .2.1.3问诊
由于动物无法与人类交流，故对动物的问诊采集是不可行的，但可以通过询问 饲养员获得动物近期的精神状况、进食、进水、二便等信息。
2.1.4.切诊 —
切脉对于脉象的研究，由于小型主动脉表面肌层丰富，难以触及，故采用心 电图的动态观察来表示脉象能提示的部分信息。
体温在中医诊断学中，体温寒热属于问诊范围，但对于动物模型上，笔者认
为应该属于切诊范围，具体测定方法为动物清醒状况下，人工保定后，将温
度计插入肛门，保留5分钟，测定肛温。
2.2描记十二导联心电图，术前及术后即刻心电图在动物麻醉情况下获得，而 动态观察中，保持动物清醒，人工固定。电极及导联放置方式同临床心电图的 使用规则。主要观察心率、心律、ST段改变、异常Q波等。每周一次。
2.3血液流变学改变每周一次。颈部前腔静脉采血5ml，置肝素抗凝管(抗 凝剂100ul/5ml全血)中抗凝，并立即送检。于采血6小时内检测包括全血黏 度1/150、全血黏度]/38、全血黏度1/10、全血黏度1/5、还原黏度1/150、还 原黏度1/38、还原黏度1/10、还原黏度1/5、血浆黏度、压积测定值、聚集指 数、聚集指数积分面积、变形指数、变形指数积分面积等血液流变学指标。
2.4其他血液理化指标第四周及第八周时，颈部前腔静脉采血3ml，采用 EDTANa厂消炎痛抗凝，4"C， 3500转./分，离心25分钟，收集上清，分装后-80 。C保存，用于检测血栓素B2 (Thromboxane B2， TXB2) 、 6-酮-前列腺素Fla (6-keto-PGR,,, 6-K-PGFla)。样品在室温复溶后，采用放免法检测。颈部前腔静脉采血3ml，采用EDTANa厂抑肽酶抗凝，4°C， 3500转/分，离心25 分钟，收集上清，分装后-8(TC保存，用于检测内皮素-1 (Endothelin-1， ET-1)、 降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene-Related P印tide， CGRP)。样品在室温 复溶后，采用放免法检测。
2.5 超声检査术后第四周及第八周，检查超声心动图。动物麻醉，左侧卧 位，探头频率1.33Hz，获取胸骨旁左室长轴，二尖瓣、乳头肌、心尖部3个水 平的胸骨旁左室短轴及心尖四腔切面。采用二维、M型及多普勒超声心动图，检 测左室舒张末内径(Left ventricular internal diameter at end-diastolic， LVIDd)，左室收縮末内径(Left ventricular internal diameter at end-systolic, LVIDs)，左室舒张末容积(End--diastolic volume, EDV)，左 室收縮末容积(End- systolic volume, ESV) ， 二尖瓣E峰，A峰等，并计算出 射血分数(Ejection fraction, EF)，短轴缩短率(Fractional shortening, FS)，每搏输出量(Stroke volume, SV) 、 E/A等以评价心脏整体的收縮及舒 张功能(EDV、 ESV、 EF值采用Si即son法测定、计算)；检测室间隔厚度，二 尖瓣、乳头肌、心尖部3个水平的左室前壁厚度，并计算收縮期室壁增厚率(△ T%)等值，结合半定量的评分方法，以评价心肌局部的结构改变以及收縮、舒 张功能。
SV二 EDV- ESV
FS= (LVIDd—LVIDs) / LVIDdX100%
T%=(收縮期室壁厚度一舒张期室壁厚度)/舒张期室壁厚度X100。/。
前壁局部收縮功能的评价通过超声动态录像回放，观察、记录二尖瓣、^L头肌、 心尖部3个节段的左室前壁运动状况。以上述三个节段得分的均值作为该动物前壁收缩功能的分数。通过以下方法将其运动分为4级，进行评价。
(1) 运动正常收縮朗心内膜向内运动幅度和室壁增厚均正常，l分；
(2) 轻度减弱受累心肌较正常运动幅度减弱，2分； -(3)运动消失受累心肌室壁运动完全消失，3分；
(4)矛盾运动受累心肌收縮期向外运动，4分；
2.6 冠脉造影术后四周及八周进行两次冠状动脉造影，计算Ameroid环放 置处冠脉狭窄程度。
(1) 动物麻醉及辅助呼吸同前所述。
(2) 左侧腹股沟备皮，消毒，铺巾。
(3) 腹股沟韧带下l 1.5cm纵行切皮，钝性分离暴露股动脉，远端结扎。
(4) 2号穿刺针穿剌股动脉插入引导钢丝，送7F鞘管，经鞘管给予肝素200U/kg 进行肝素化，ACT〉300秒。
(5) 在X线透视下置入引导导管至左冠状动脉口，与血管近端同轴。 _
(6) 注射200y g硝酸甘油后，选择LAO 60°进行冠状动脉造影。
、Ta 一 D — d
D I d 狭窄(％)=——xlOO%
(7) 计算Ameroid环放置处冠脉狭窄程度。
(8) 评价前降支血流分级
根据心肌梗死溶栓治疗试验(Th咖bolysis in Myocacardil Infarction Trial,TIMI)建议，将冠状动脉血流速度分为4级
TIMI0级无再灌注或闭塞远端无血流，l分。
TIMI I级造影剂部分通过闭塞部位，梗塞区供血冠状动脉充盈不完全，2分。
TIMI II级部分再灌注或造影剂能完全充盈冠状动脉远端，但造影剂进入和清
除的速度都较正常的冠状动脉慢，3分。
TIMI III级完全再灌注，造影剂在冠状动脉内能迅速充盈和清除，4分。
(二)实验结果
1. 疾病性质 —
心电图表现为胸部导联ST段压低；冠脉造影显示前降支狭窄90%以上；超声提 示心尖局部室壁结构改变，运动减弱，左室收縮末、舒张末内径及容积扩大， 舒张功能轻度减低。以上均支持模型动物术后4周为缺血性心脏病的诊断。
2. 证候类型
(1) 四诊信息
① 一般行为无虚证的表现；
② 舌诊是临床血瘀证诊断的主要依据，模型动物舌诊的舌色分析，见B比增大、 R比减小；
③ 动物的脉搏难以触及，用心电图反映部分信息，未见明显的心律失常。
(2) 实验室指标
①术后4周，冠造显示前降支狭窄90%以上；② 左室舒张末及收缩末内径非常显著性大于假手术组；
③ 6-K-PGF,。显著降低，6-K-PGF,。/TXB2之间的平衡破坏，动物表现为血栓形成的 倾向性。
④ 血液流变学在术后4周表现为明显的高粘、高聚及低变形性。模型动物术后4 周可诊断为血瘀证。
综上所述，该模型动物术后四周可以被诊断为心肌缺血血瘀证。 二、实验大鼠气虚血瘀证模型
(一)实验方法 1.构建模型 1. 1术前准备
(1) 麻醉称量大鼠体重，P/。戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射
(2) 备皮待大鼠麻醉后，将其背位固定在木板上，备皮范围为商界胸骨上沿， 下界为剑突左界为胸骨左缘，右界为左腋中线。
(3) 气管插管
(4) 记录术前动物的心率、呼吸频率。 1. 2冠状动脉结扎术
(1) 术区碘伏消毒，铺巾。以腋窝线为手术切口
(2) 沿手术切口依次切开皮肤、胸大肌，暴露肋骨。
(3) 连接呼吸机，呼吸频率80次/min，吸呼比1: 2，潮气量3ml/kg。(4) 以胸骨柄为第2肋标志，定位第3肋，沿第3、 4肋间打开胸膜，开胸器 将胸腺与肋骨撑开，轻轻撕开心包膜，暴露心脏，在左心耳边缘进针，肺动脉 圆锥处出针，进行结扎左冠状动脉。
(5) 结扎后即刻，心脏表面点利多卡因注射液1-2滴，腹腔注射利多卡因注射 液O. 1-0. 2ml，呋塞米O. 1-0. 2 ml。
(6) 用棉球将胸腔内液体吸净，依次缝合3、 4肋间，肌层和皮肤。 1.3术后护理
(1) 术后密切观察大鼠心率、心律和呼吸情况。
(2) 术后进行常规抗感染治疗，腹腔注射青霉素800万单位，防止感染。 2.模型评价
2.1 四诊信息在术后3、 7、 14、 21、 28天观察模型动物的体质量、体温、 舌象、毛发、爪甲、耳廓、心率、呼吸频率等；取材即日观测脏器(心、肾、 肝、肺)质量及与体重的比值。
2.1.1 —般状态术后第7、 14、 21、 28天上午，安静环境下，对模型进行观察。
2. 1.2体重术后第7、 14、 21、 28天上午，安静环境下，天平称量动物体重。
2. 1.3体温术后第7、 14、 21、 28天上午，安静环境下，将体温计放入动物 肛门内10min，取出读数，测定动物肛温。
2.1.4呼吸频率术后第7、 14、 21、 28天上午，安静环境下，待动物安静后 查胸腹起伏数，2人同时查，取平均值。2.1.5游泳力竭时间术后第8、 15、 22、 29天上午，水深50cm，水温30土1
。C大鼠负重体重6。/。的中午，计算大鼠力竭时间，以大鼠头沉入水中10s为力竭
标志o
2.1.6爪甲、耳廓的观察术后7、 14、 21、 28天上午，大鼠清醒状态，轻柔 固定大鼠爪甲、耳廓，并与标准比色卡对照拍摄。舌象舌度分析采用 photoshop6. 0软件。
2.2 描记心电图术后3、 7、 14、 21、 28天描记心电图，记录异常Q、 ST段 改变、心率等情况。上午9点，大鼠1°/。戊巴比妥钠30mg/g腹腔麻醉，背位固定， 用福田7200型12导联心电图机采集心电图，走纸速度设为50mm,/sec，检测指 标包括心率、异常Q波导联数、S异常Q波幅度及ST段变化导联数。
2.3 超声心动图检查术后30天，进行超声心动图检査。动物1%的戊巴比妥 钠30rag/g腹腔麻醉，背位固定，采用那个飞利浦HDI5000超声心动仪，探头频 率11.4MHz，获取胸骨旁左心室长轴和乳头肌水平短轴切面。检测指标包括室间 隔收縮末期厚度(IVSTs)、室间隔舒张末期厚度(IVSTd)、左室收缩末期内径
(LVEDs)、左室舒张末期内径(LVEDd)、左室射血分数(LVEF)、短轴縮窄率(FS)、 左室收縮末期后壁厚度(LVPWTs)、左室舒张末期后壁厚度(LVPWTd)。
2.4 游泳力竭时间检测术后第8、 15、 22、 29天，水深50cm，水温30士 it:，大鼠负重体重6%的重物，进行游泳实验，计算大鼠力竭时间，以大鼠头沉 入水中IO秒中为力竭标志。
2.5 病理检查取材后，心肌HE、 MASON染色；舌、肾、肺、肝HE染色。 (二)实验结果1. 疾病性质
心电图表现I、 avL、 VI-V6导联出现异常Q波。心电图表现从术后3天即可出 现，并一直持续至实验结束。大鼠超声心动图结果显示，与假手术组相比，室 间隔舒张期、收縮期厚度明显下降，左室前壁僵硬、顺应性下降、左室腔明显 增大EF和FS显著下降，左室收縮、舒张功能不全。心电图及超声心动图结果 证明模型为典型心肌缺血。
2. 证候类型
2.1 —般状态术后1-3d,模型及假手术大鼠出现毛发杂乱、活动缓慢、精神 迟钝等表现。术后4-7d假手术组动物从手术创伤中恢复，毛发整齐、活动灵活， 一般状态与正常大鼠无明显差异。而模型动物毛发杂乱、活动缓慢、精祌迟钝。 7-10d，大鼠自身恢复能力快，从宏观角度，模型动物与假手术无显著差异。
2.2游泳力竭时间同一时间点模型组与假手术组相比，游泳力竭时间显著下 降，模型组不同时点游泳力竭时间无差异。
2.3呼吸频率术后第7、 14、 21、 28d，模型组与假手术组相比呼吸频率显著 增加。
2.4舌象模型组舌质紫暗，有瘀点瘀斑，而同一时间点的假手术组舌质淡红。
数码拍摄舌象分析R、 G、 B、 L值显著下降。
综上所述，模型在术后7天可诊断为心肌缺血气虚血瘀证。
权利要求
1、一种用于心肌缺血血瘀证动物模型的制备方法及评价体系，其特征在于冠状动脉放置Ameroid缩窄环建立模型，通过多种指标判定术后4周左右符合心肌缺血血瘀证的诊断。
2、 一种用于心肌缺血气虚血瘀证动物模型的制备方法及评价—体系，其特征在 于左冠状动脉结扎法建立模型，通过多种指标判定术后7天左右符合心肌缺 血气虚血瘀证的诊断，直到30天取材前仍支持气虚血瘀证的诊断。
3、 如权利要求1或2所述的方法在用于制备及评价病证结合动物模型的用途。
全文摘要
本发明提供一种心肌缺血血瘀证及心肌缺血气虚血瘀证动物模型的制备方法及评价体系，属于中医证候研究技术领域，可用于病证结合动物模型的制备及评价；心肌缺血血瘀证模型是通过在冠状动脉放置Ameroid缩窄环建立的，对模型动物手术后1-8周进行动态观察、理化指标的检测、心电图、超声心动及冠脉造影，术后4周左右符合心肌缺血血瘀证的诊断；心肌缺血气虚血瘀证动物模型采用左冠状动脉结扎法制备，对模型动物手术后30天进行动态观察、心电图、超声心动、病理检测，发现术后7天左右符合心肌缺血气虚血瘀证的诊断，直到30天取材前仍支持气虚血瘀证的诊断。
文档编号A61B19/00GK101612063SQ20081012644
公开日2009年12月30日 申请日期2008年6月27日 优先权日2008年6月27日
发明者伟 王, 郭淑贞 申请人:王 伟;郭淑贞