专利名称：预防或治疗阿片剂耐受和依赖的方法
预防或治疗阿片齐鹏授和繊的方法
背景技术：
1. 发明领域本发明主要涉及医学治疗。本发明特另ij涉及^^印hrinB-EphB信号传导 阻断剂，来预防或治疗阿片齐嘛受和娜的方法。
2. 相关技术说明阿片样药物因其止痛和兴奋稱寺性，而被iM和 ，。重复使用阿片样 药物，例如吗啡来缓解慢性疼痛，可以导致阿片剂耐受和 。阿片剂耐受的 机制非常复杂，其涉及药物受体、细胞和神经网络水平相关因素。各种神经递 质和受体系统及其胞内信号传导蛋白，在急性和慢性阿片样物质作用中的角色 已被证实(Bailey& Connor, 2005; Bohn等，2000; Collier, 1980; King等， 2001; Muscoli等，2007; Pasternak等，2007Roerig等，1984; Zachariou等， 2003)。研究最多的系统是谷氨酸S/NMDA受柳0级联(Ben—Eliyahu等， 1992; Inoue等，2003; Inturrisi， 2002; Kolesnikov等，1998; Kolesnikov等， 1993; Kolesnikov等，1992; Muscoli等，2007; Pasternak, 2007; Pasternak & Kolesnikov, 2005; Trujillo & Akil, 1991)。慢性阿片祥物质暴露后的3glS性改 变，——可肖^131改变神经元的应激性和突鲥专递而成为身体臓的基fltt~~， 其包括戒断导致的cAMP 7K平和cAMP反应元件结合蛋白(CREB) (Barrot等, 2002; Nestler, 2001; Shaw-Lutchman等，2002)和MAPK (Sweatt， 2004)表 达的反弹性增加。该激动齐IJ弓胞不同^阿片^^质受体(MOR)调控事件的能 力，最近已被提出是它们诱导耐受和依赖倾向的主要决定因素(Bailey & Connor, 2005)。尽管研究了几怖，以阿片機质耐受和戒断所弓胞疼痛加剧 为基础的明确细胞和分子机制还不清楚。 一种普遍的可能性是反复或延长的 MOR激动，可能引起包括突触形成增加在内的进化事件重演的神经元改变 (Chen等，2007)。确定以耐受和身体依赖为基础的机理，以及研发出能预防、 M^，转阿片样物质耐受和1^的药物，具有临床重要性。
Eph-受体构成了酪氨酸激酶受体(RTK)的一个最大亚族，它们在外部信号向多种类型细胞内部传递中起重要作用。人类有13个Eph-受体基因，其分 为A亚类(EphAl-EphA8)和B亚^(EphBl曙EphB4， EphB6)。它们的配体， Eph受体配恢ephrins)，也分为两亚类ephrinAl"ephrinA5和ephrinBl-ephrinB3。 A类受体典型地结合大多数或全部的A类配体，B类受体结合大多数或全部的 B类配体(Kullander & Klein， 2002)。 Eph RTKs和Eph受体配晰ephrins),在 祌经系统发育过程中的组织边界形成，细胞迁移和轴突弓l导中起作用(Krull等， 1997; Wang & Andereon, 1997; Wilkinson, 2000; Wilkinson, 2001)。 EphB 受体还能ffi51与NMDA受体(NMDAR)相互作用,调节谷氨酸能突M5i接的发 生和重构，以及它们在成術申经系统中的可塑性(Chen等，2007; Dalva等， 2000; Grunwald等，2004; Grunwald等，2001; Henderson等，2001; Takasu 等，2002)。包含NR1和NR2亚基的NMDARs,在神经可塑性方面有确定作用， 并且其是表现、发展和维持，阿片剂耐受、 和戒断的基本介质(Bailey & Connor, 2005; Herman等，1995; Mao, 1999; Mao等，2002; Mayer等，1999; Noda & Nabeshima， 2004; Zhu & Banr， 2001)。阿片剂系统与NMDAR相互 作用，以致MOR激活而导致Ca2+MilNMDAR离子鹏复合^A。不同的 Ca2+,性酶，例如032+/钙调蛋白依赖性激酶(CaMK) (Fan等,1999; Hamdy 等，2004; Liang等，2004; Lou等，1999; Lu等，2000)和ERK(Ren等，2004; Schulz & Hollt， 1998)的依次激活，在阿片效应機诱导中起重要作用(Noda& Nabeshima^2004)。最近的研究已经进一步证实，周围炎症和/或神经损伤可增强 ephrinB-EphB受体信号传导(Kobayashi等，2007; Song等，2008a),而且该信 号传导可肖,在糊(SC)中与NMDAR相互作用，由此改变神经应激性和 突触传递而可引起炎症和神经性鄉(Battaglia等，2003; Song等，2008a; Song等，2008b)。几组证据表明，纖背侧角(DH)，即鹏感受伤害信息的 第一个重要的转递站，是阿片样物质依赖和戒断发生的重要位点(Jhamandas 等，1996; Mao等，2002; Marshall & Buccafiisco， 1985; Mayer等，1999; Muscoli等，2007; Rohde & Basbaum， 1998; Rohde等，1996; Rohde等,1997; Trang等，2003)。显然需要一种用以预防、自或逆转阿片齐啲耐受和依赖的有效方法。 本发明满足了这一长期存在的需要。发明,本发明证明了 EphB受体信号传导对阿片样药物身体娜的产生和擀卖 的影响，以及该受体信号传导对药物戒断后特征反应的影响。本发明进一步提 供了预防或治疗阿片齐1厕受和 ^的方法。具体地，本发明涉及M给予需要此种治疗的个体，施用药学上有效量 的ephrinB-EphB信号传导阻断抓来预防或治疗阿片齐耐受和依赖的方法。所 述的阿片齐嘛受和 ，雌是由长期吗啡治疗和戒断弓胞的。
根据下列详细说明的本发明优选实施方式并结合附图，本发明的J^和 其它优点，对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
附图简述参考下述详细说明的例证性实施方式并结合附图阅读，会更好地理解本 发明的特点、雌的实船式、进一步的主题、以及其优点，其中
图lA-lD说明了本发明EphB2-Fc，对吗啡戒断的减毒作用。
图1A说 明了 EphB2-Fc对纳洛酮鹏的吗啡戒断行为体征的影响。除了接受吗啡和纳洛 酮，不同的实验组还接受下列治疗中的一种(鞘内注射(a)):对照l (对照-l) -没有附加治疗；对照2 (对照-2)-PBS; 7EphB， EphB2-Fc g吗啡给药七次； lEphB， EphB2-Fc给药一次(2吗，最后一次4顿吗啡后5射中)；7Fc， IgG-Fc (l吗齢吗啡)给药七次。图1B说明了齡实验组的飾戒断评分。图1C说 明了EphB2-Fc (2昭)和IgG-Fc (2吗)对初次接受实验小鼠魏阈值的影响。 图lD说明了EphB2-Fc (2吗)禾口IgG-Fc (2呢)对吗啡最初止痛反应的影响。 MoH，吗啡。*,p<0.05， ，p〈0.01表明与对照l相比，有显著性差异。#,p < 0.05表明1EphB和7EphB实验组间，有显著性差异。
图2A-2B说明了本发明吗啡戒断过程中在背侧角(DH)， EphB2-Fc造 成c-Fos的表达下降。图2A给出了Fos-免疫反应神经元的实例，并且在图2B 中给出了数据总结。一,p〈0.01表明和首次实验(naive)组相比，有显著性差异。 #, p < 0.05，辦，p < 0.01表明和Mor+Nlx组相比，有显著性差异。& ， p < 0.05 表明Mor+7EphB+Nk和Mor+lEphB+Nlx组间，有显著性差异。比例尺(Scale bars): 200(jm。图3A-3B说明了在与本发明反复增加吗啡剂量和吗啡戒断相关DH中， EphB2-Fc可导致CGRP-免疫反应性变化斷氐。**, p < 0.01表明与首次实验组相比，有显著性差异。#,p<0.05，载p〈0.01表明与吗啡组(Mor)相比，有显著性 差异。&, p < 0.01表明Mor+Mx和Mor+l^)hB+Nlx组间，有显著性差异。 比例尺200mhi。图4A4G说明了按照本发明逐渐增加吗啡治疗、吗啡戒断和脊椎施用 EphB2-Fc之后，EphBl受体禾口 ephrinB蛋白在髓(SC)中的^ii变化。图4A 和图4B分别说明了继逐渐增加吗啡暴露或逐渐增加吗啡暴露与EphB受体阻断 剂重复给药相联合，EphBl受体蛋白的,实例和数据总结。图4C说明了由免 疫荧光染色指示的DH中EphBl受体蛋白分布的实例。图4D和图4E分别说明 了继逐渐增加吗啡治疗，或吗啡治疗与EphB受体阻断齐睥次或反复给药相联 合，在吗啡戒断30併中后，EphBl受体蛋白的表达实例和数据总结。图4F和 4G说明了吗啡治疗和吗啡戒断对ephrinBl、 ephrinB2禾卩PY99皿的影响。*，p <0.05， ，p〈0.01表明与首次实验组相比，有显著'瞎异。#,p<0.05， ##,p < 0.01表明与长期吗啡组(Mor)相比，有显著性差异。
图5A-5D说明了按照本发明在吗啡治疗和戒断后，EphB2-Fc对SC中 磷酸化NR2B、ERK和CREB增加的影响。图5A和5C说明了在不同治疗之后， 所检测蛋白的表达实例。图5B和5D显示了繊总结。*,p<0.05， **,p<0.01 表明与相应的首次实验组相比，有显著性差异。#,p<0.05，辦,p〈0.01表明与 相应的吗啡组(Mor)相比，有显著性差异。
发明详述本发明证明了 EphB受体信号传导对阿片药物身体繊的发生和擀卖， 以及所述药物戒断后其特征反应的影响。本发明进一步提供了预防或治疗阿片 剂耐受和 的方法。 Eph受体酪氨lt激酶及其ephrin配体，在神经突触可塑性方面扮演了 重要作用。最近有报道称，ephrinB—EphB受体信号传导的激活，对神经性疼痛 的发展至关重要。本发明研究了 ephrinB-EphB受体信号传导是否也涉及参与调 节，阿片样物质戒断后的行为表现和神经化学表现。结驗明，EphB受体拮抗 剂EphB2-Fc (2吗，在最后一次吗啡用药后)鞘内治疗(")，明显抑制了戒断症 状。对照注射PBS和人Fc，不會树戒断症状产生明显作用。此外，EphB2-Fc 以较低剂量重复治疗(lpg，鞘内注射(")，伴随吗啡的七次给药而施用七次)， 可明显抑制戒断症状，并且这种抑制比以较高剂量一次治疗产生的抑制，更加明显。结果还表明纳洛酮攻击，明显增加了背侧角内Fos样免疫反应神经元的 数量，而且EphB2-Fc治疗，可明显减少c-Fos的^ii。这些研究结，明， ephrinB-EphB受体信号传导激活，可能与WM中阿片,质身体,的,有 关，而且阻断EphB受体，能有效减少戒断体征。本发明涉及通过给予需要此种治疗的个体施用药学上有效量的 ephrinB-EphB信号传导阻断剂，来预防或治疗阿片剂耐受和 的方法。
在一个优选实施方案中，阿片剂耐受和依赖是由长期吗啡治疗和戒断
引起的。阻断剂可以是EphB受体的阻断剂，两个例子是EphBl-Fc和EphB2-Fc。 阻断剂可以以约0.5昭至约75mg， i^地，以约l吗至约15mg的剂量范围， 鞘内*好需要此种治疗的个体。阻断剂可以与吗啡齢多次给药，也可以在吗 啡给药后以单剂给药。被治疗的个体通常是哺乳^， 1M地，是人。
给出下列实施例的目的是为了说明本发明的各种实施方式，而不意味 着以任何方式限制本发明。
实施例 材料和方法
动物本研究4顿雄性CD-1小鼠(25—30g， n=237， CharlesRiver实验室， MA)。将小鼠圈养于软草垫塑料笼，并且在12小时昼/12小时夜周期下能自由 获得食物和水。所有实验方法都符合世界 研究协会伦理委员会章程，并且 得到Paricer研究中心,照厕和使用委员会批准。 阿片剂戒断以七次逐渐增加的剂量(20、 40、 60、 80、 100、 100和100mg/kg)每 隔8小时，重复给小鼠腹腔内注射吗啡(Sigma, MO)。最后一次吗N胜射2 小时后，将小鼠注射纳洛酮(Sigma, MO) (lmg/kg,皮下)，并且在纳洛酮施 用30併中后，检测戒断症状(跳动、湿狗M^抖动、向后走、爪子颤抖、颤抖、 腹泻、上睑下垂和体重减轻)。除了检测个体的戒断体征，总的阿片齐喊断评分 计算如下(向后走的步数x0.1) +(腹泻><2)+ (瑕励次数x0.1) + (爪子颤抖x0.1) + (上睑下垂)+ (颤抖)+ (%体重减轻><5 ) + (湿狗M7jC抖动的次数)(Zachariou 等人，2003)。通过体内给WM施用EphB受体阻断剂EphB2-Fc (该分子与ephrinBl-3结合；小鼠重组；Sigma, E9402),研究ephrinB-EphB信号传导在吗 啡繊和戒断鄉机制中的作用。鞘内、湖(i，t.)是如先辦艮道的那样(Hylden & Wilcox， 1980)，用带30号针头的25mlHalmiton 、湖器，腰部穿刺进行。 EphB2-Fc或者伴随七次增加的吗啡给药而施用七次(每次lpg), ^#在纳洛酮 之前30併中一次给药(2pg)。施用IgG-Fc片段(Jackson, Fc对照，每剂l)og) 和载体PBS (每次吗啡给药都施用一次)做为对照。总1^只5Ml。 疼痛阈值和吗啡镇痛i^为了检测EphB2-Fc和IgG-Fc对鄉阈值和吗啡初女織痛反应可能的 影响，将小鼠置于55'C热板體上，并测量舔爪的反应时间。设置30s的中止 时间，以防止组织损伤。小鼠在2小时或2.5小时内，每30辦巾检测一次。数 据以最大可能效果百分比(％MPE)计算，用下列公式计算如下100%x [(药 物反应时间一基本反应时间)/ (30秒一基本反应时间)]=%MPE。
前30 5H中施用吗啡(10mg/kg，s.c.)。 EphB2-Fc和IgG-Fc (2昭，i.t)在图1C中在时 间0点施用，在图1D中与吗啡^应用。 oFos、 CGRP和EDhBl受体的免疫组织化学和免疫焚光染色
用冰冷4%多聚甲醛溶液接着冷盐水，将小鼠贲门灌注并麻醉。将微 腰段剖离，并用多聚甲醛溶液在4。C后续固定4小时，接着将HistoPrep (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)包埋块在Leica CM1850鄉恒温器上切片(Leica Microsystems, Germany)。然后，将切片(10拜)解冻封固到载玻片上，并且 允许空气干燥。按照前人所皿行免疫荧光染色(Kerr等人，2000)。内源fiai 氧化物酶通过将组织切片与0.3 %过氧4^孵育30 5H中和与3 %标准山羊血清孵 育20射中，而阻断。在孵育间隔，将切片用PBS清洗三次。来自每组的切片(每 组5只小鼠)，接着分别与兔抗c-Fos多克隆抗体(1: 100)和兔抗EphBl多克 隆抗体(1: 200)，(均来自Santa Cniz Biotechnology Inc.SantaCruz， CA)，兔抗 CGRP多克隆抗辨1:1000， Millipore， Billerica, MA)孵育。兔IgG被用作同种 型对照。一抗4。C孵育过g，将组织切片清洗，并在高湿度暗箱室温下，与荧 光标记山羊抗兔IgG O: 200， Vector Laboratories, Inc., Burlingame， CA)孵 育1小时。用PBS清洗后，使用Vectashield H-1400封固介质(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)封固载玻片。在荧光显微镜(Olympus BX51WI; Olympus America Inc., Melville,NY)下，对SC免疫染色形态学细目进行研究。将图象随m^码，并转到计算 丰/LH腿1分析。Fos-免疫反应神经元，以盲数方式计数。每组DH中(I-VI 节)Fos样免疫反应神经元的数目，由20个SC切片(L4-L5)的平均计数确定。 为获得CGRP免疫荧光的定量检测，将每组^ DH所覆盖的15-20个视野定 值，并以相同曝光时间拍照，以获得原始数据。J顿MicroSuite image分析软件 (Olympus America Inc.),分析不同组的荧光强度。将^h像点的平均绿色荧光
强度，规一化至同一图象中的背景强度。 Western印迹分析 Western印迹分析用于检测SC中EphB受体，ephrinBs,以及磷酸化 NR2B、 ERK和CREB蛋白的表达。共108个小鼠用于Western印迹实验 样品由来自于4只小鼠的SC混合而成，每组由3个样品组成)。将WHIf段快 速提取，并立即在液氮中冷冻，保存于-80'C。定量蛋白水TO时变化所用方法， 与前A^f述的类似(Bundesen，等，2003)。简单地说，利用增强的化学发光(ECL) 检测法，将蛋白沉淀法与Western印迹s齢用于检测蛋白条带。将连缘沉淀法 用于，在冰预冷(4'C)裂解缓冲液中裂解的组织样品[50mMTris， PH7.5，包 括150MmNacl， 1% TritonX-IOO， 0.5X脱fLEi離，0.1%SDS, 0.2mMEDTA， lOmMNaF, 10g/ml抑肽酶，lg/ml亮抑肽酶，10g/ml胃蛋白,库,，0.4mM 4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟，和lmM正钒酸钠。使用BCA法(Pierce， IL)评
估裂解物中的蛋白浓度，并且均衡各样品的总蛋白含量。最初，分别地，使用 抗EphBl抗体(2昭，Q-20， Santa Cruz， CA)将EphBl从2mg总蛋白/ml组 织，物中免疫沉淀，使用与琼月識偶连的蛋白G-琼月識(iiwitrogen) (50jnl 50 %浆体；5mg/ml结合容量；Sigma)将ephrinBs从2mg总蛋白/ml组织l^物 中免疫沉淀。孵育过夜后，将沉淀的蛋白复，用冷(4'C),缓冲液清^H 次。在向8或10^SDS聚丙烯 胶上样分辨蛋白条带之前，ilil在样品缓冲 液中(2%SDS, 100mMDTT， 10%甘油，和0.02%溴苯酚蓝)100。C加热5分 钟，将EphBl和ephrin-B蛋白解离。对于pNR2B， i>CREB， j>ERK， GAPDH 的Western印迹分析，^ffl全部细胞蛋白提^l 物。转移至硝酸纤维素膜后， 将膜用2%牛血清白蛋白(BSA)封闭，然后与第一抗体(EphBl 1:100， Q20， 印hrinBl 1:100, H70， ephrinB2 1:100， C20， PY99 1:100，禾口 j>CREB(sed33)来 自Santa Cniz, CA;i>NR2B(Tyr 1472) 1:300来自于Chemicon， CA;
9p-ERKl/2(Thr202/Tyr204)1:500来自于Cell Signaling Technology, MA; GAPDH 1:1000来自于Sigma，MO)4"孵育过夜。然后，将膜{鲷ECL试剂(Pericinelmer， MA)和来自于Chemicon的二抗显影。使用分子图象仪(Gel DocTM XR， 170-8170)和相关定量软件One—4.6.5(Bio^Rad Laboratories, Hercules, CA)分析繊。
统计学微所检测蛋白的表达变化和各组间的反应时间差异，分别<糊单因素方 差分析和双因素方差分^ifi行检验，在Bonfeironi post hoc检验后重复检测。独 立样本t-检验用于检验，各检测组与其相应对照组之间的差辦异性假设。所有
数据以平均值土SEM表示。如果/K0.05，统计结果认为具有显著性。
驢
EphB受体阻断剂可阻止并抑制纳洛酮,的吗啡戒断的行为体征
纳洛酮鹏的吗啡的戒断，可导致特异性相彌态，包括焦虑，恶心， 失眠，发热发冷，肌肉M，出汗，和腹浑。鞘内注射(i.t.)肖辦阻断EphB受 Wr活的药齐iJ~~嵌合^ EphB2-Fc，可明显减低小鼠大部分吗啡戒断体征禾口 总戒ifi平分。如图lAa-i所示，重复共施用EphB2-Fc (在7次吗啡用药的每次 期间l吗)，可明显M^、向后走，咀嚼，腹渴，瑕歐，颤抖，湿狗甩7K抖动和体 重自，但不能减少戒断伴随的爪子颤抖和上睑下垂。在吗啡施用后，EphB2-Fc 以较大剂量(2吗，纳洛酮应用前30 5H中) 一次治疗，也可明显减少戒断相关 症状，向后走，咀嚼，蹈歐，颤抖，禾口湿狗甩7]C抖动，但不能M^、腹泻，爪子 颤抖，上睑下垂，或者体重離。与这^变化相一致，EphB2-Fc治疗小鼠的总 戒附平分，也明显陶氐(图1B)。重复共施用EphB2-Fc与单次吗啡用药后施用 阻断剂相比，在总戒断评分上产生的抑带將更大(图1B)。人IgGFc (IgG-Fc, 2吗，i.t.)不能明显影响戒断行为(图1A和1B)。 EphB2-Fc (2昭，i.t.)和Ig-Fc (2昭，i.t.)都没有改变魏阈值(图1C)或初次吗啡弓胞的痛觉缺失(图1D)。 在图1C和1D中，都〗柳PBS做为对照。这些结果表明，阻断EphB受体败活, 能减轻吗啡戒断症状,^ EphB受体可能在阿片剂，和戒断的WM机制中起 作用。
EohB受体阻断剂可抑制继吗啡治疗和戒断后DH中，c-Fos的诱导和CGRP的 堆积和耗竭
阿片剂戒断后c-Fos蛋白表达的诱导，以及长期吗啡暴露之后和戒断期 间DH中CGRP鋭的增加而接着斷氏，已被作为与这些状态相关的神经、赫 和可塑性的指征(Chieng等，1995; Jhamandas等，1998; Rohde等，1996; Rohde 等，1997; Trang等，2006; Trang等，2002; Trang等，2003)。免疫组织化学 和免疫荧光染色被用于检测c-Fos的表达和CGRP-免疫反应性。将六组小鼠(n =5每组)用于试验和检测首次实验组(Aa)不接受治疗；Mot (Ab)接受 增加的吗啡治疗；Mor+Nlx (Ac)在吗啡治疗后接，洛酮；Ad-Af，除了接 受吗啡和纳洛酮，还接受七次EphB2-Fc (l昭)给药(Mor+7EphB+Nlx) (Ad); 将EphB2-Fc(2昭)在纳洛酮前30射中进行一次治疗(Mor+lEphB+Nk)(Ae); 以及将IgG-Fc (l呢)进行重复给药(Mor+7Fc+Nk) (Af)。代表性的显微照 片及DH中Fos-样免疫反应性神经元相应数量，分别显示在图2A和图2B中。 正如所料，在吗啡戒断期间，c-Fos的表达明显增加(图2Aa^c)。有趣地是， EphB2-Fc， i.t，可阻止或明显抑制c-Fos的,增加。重，用EphB2-Fc (l吗， 7次每8小时间隔，伴随吗啡)可完全阻止c-Fos的^ii(图2Ad),而EphB2-Fc 单次给药(2昭，纳洛酮攻击前30併中)可显著陶氐c-Fos的鋭增加(图2Ae)。 IgG-Fc (l吗，i.t.)则没有明显影响c-Fos的,诱导(图2Af)。数据总结在图 2B中。长期吗啡和吗啡戒断及给药治疗相关DH中的CGRP-免疫反应性改'变， 显示在图3中。将六组小鼠(11=5每组)用于i微和检测首次实验组(Aa) 不接受治疗；Mor (Ab)接受增加的吗啡治疗；Mor+Nlx (Ac)在吗啡治疗后 接，洛酮；Mor+lEphB+Nlx (Ad)除了接受Mor+Nk以夕卜，在纳洛酮前 30併中再接受EphB2-Fc (2吗)一次治疗；Mor+7Fc+Nlx (Ae)除了接受Mor 十Nlx以外，再接受IgG-Fc (l昭)的重复治疗；Mor+7EphB (Af)接受吗啡 治疗及EphB2-Fc (l吗)的重复治疗。正如所料，重复的吗啡暴露，可显著增 加遍及SC中DH区的CGRP^ii(图3Aa/b)。重iJOTEphB2-Fc，而不是IgG-Fc (在每次吗啡给药期间每次施用ljug)，可显著抑制长期吗啡诱导的CGRP样免 疫反应活性增加(图3Ac/d)。吗啡戒断可导致CGRP免疫反应性明显陶氐(图 3Ae)。单次施用EphB2-Fc,而不是人Fc (在纳洛酮前30併中每 娜用2昭， i.t.)，可显著削弱戒断相关的CGRP免疫反应活性斷氏(图3Mg)。相应检测的 荧光强度，总结在图3B中。
iiSC中EphBl受体^jfe，被长期吗啡治疗和吗啡戒断上调
假定EphB受体撒活是诱导和/或機，纳洛S^a的吗啡戒断相关行 为和神经化学体征所必需的，那么， 一个有趣的问题是，EphB受体及其配体是 否受长期吗啡暴露和/或吗啡戒断所调节/调整。将蛋白沉淀法与Western印迹 (Bundesen等，2003)!^用于，检测EphB受体和印hrinB蛋白表达。
每组由3份样品组成，^^样品包括来自于4只小鼠的4条WliJ5要段。 首次实验组不接受治疗，7Fc接受人Fc的7次重复治疗，Mor接受增加的吗啡 治疗，Mor+7EphB接受增加的吗啡治疗和EphB受体阻断剂EphB2-Fc (l吗， 7次给药)，以及Mor+lEphB接受EphB受体阻断剂EphB2-Fc (2吗)单次给 药之后，再接受增加的吗啡治疗。在增加的吗啡治疗后，EphBl受体蛋白的表 iiM著增加(图4A和4B)。免疫组织化学荧光染feit—步表明，EphBl受体蛋 白的增加^ii^魏于DH表面层(图4C)。在接受增加的吗啡给药和重复的 EphB受体阻断剂EphB2-Fc给药(l昭，i.t.， 7次给药)的同步治疗小鼠中，大 部分EphBl受体蛋白的增加鋭都被阻止舰消了 (图4A和4B)。纳洛酮治 疗后，也发现了相似的结果(图4D和4E)。纳洛酮治疗不能明显改变，吗啡诱 导的EphBl受体蛋白的表达增加或EphB2-Fc重复给药导致的EphBl受体蛋白 的皿抑制。EphB2-Fc单次治疗(2昭，i.t,纳洛酮前30併中给药)也不能明 显斷氏吗啡诱导的EphBl受体蛋白的毅增力卩(图4E)。尽管这些结果不育凍 明，在增加的吗啡治疗或吗啡戒断后，ephrinBl或ephrinB2或磷酸酪氨酸(PY99) 的,有明显变化，但该结果可以表明EphBl受体，可被增加的吗啡治疗和吗 啡戒断所上调，以及可被受体阻断剂的^施用所抑制，其中，所述受体阻断 剂也能减少吗啡戒断的行为症状和神经化学体征(图4F和4G)。 EphB受体阻断剂可阻止或抑制，长期吗啡治疗和吗啡戒断相，酸化NR2B， ERK和CREB的增加 NMDARs在阿片齐湘关神经可塑性上，己有确定作用(Mao, 1999; Mayer等，1999; Zhu & Ban, 2001)。长期吗啡治疗可导致Ca"水平的增力口和 CaMKH(Liang等，2004; Lu等，2000), ERK(Ren等，2004; Schulz & Hollt, 1998)和CREB(Nestler， 2001)的改变。本研究要回答的一个问题是，在吗啡治疗 和戒断后，这對言号传导是否被EphB受体^T活所调节。
不同组的小鼠，接受如图4A和4C所示的相同治疗。 总结显示在图5B和5D中。该结果表明，增加的吗啡治疗可导致jvNR2B、P"ERK或p^CREB 蛋白水平的显著增加，如Western印迹所示(图5A和5B)。 EphB2-Fc与吗啡共 给,显著阻止或减少，吗啡诱导的磷酸化NR2B、 ERK和CREB的增加(图 5B)。在吗啡戒断后(纳洛酮之后30射中)，i>NR2B、 p-ERK或i>CREB水平 没有进一步的增加(图5C和5D)。重复共给药EphB2-Fc，可显著斷氏 ^ 化蛋白增加水平，而单次共给药EphB2-Fc,只育腿著抑制i>NR2B和j>CREB 的增加而不肖腿著抑制P"ERK增加(图5D)。这些数据表明EphB受体的激活， 育,调节NMDARs和与长期吗啡暴露和吗啡戒断相关的胞内信号传导。
讨论本研究提供了 SC中EphB受体信号传导，对吗啡，和戒断发^作 用的首次证据。本文主要的发现是1 )增加的吗啡治疗，可明显上调SC中EphBl 受体蛋白的敲；2)鞘内施用EphB受体阻断剂，可阻止和/或抑制与长期吗啡 治疗或吗啡戒断相关的行为症状和神经化学体征——包括c-Fos诱导,和EphBl 受体蛋白泰逸恢复所伴随DH中CGRP的积累而后耗竭；3)NMDAR的P"NR2B 亚基水平以及SC中的pERK和!^CREB，在长期吗啡治疗和戒断后会明显增 加；并且这些增加可被EphB受体阻断剂和吗啡的共给药，阻止或斷氏。这些发 现表明SC中EphB受体信号传导，可肯腿过与NMDAR的NR2B亚单位相互 作用，在阿片剂身体依赖中起重要作用。 EphB受体，除了在神经系统发育期间在组织边界形成、细te移和轴 突向导上起重要作用以外，其还能够通过与NMDA受体相互作用而调节成人神 经系统中谷氨酸能突触连接的发生以及其可塑性(Chen等，2007; Dalva等， 2000; Grunwald等，2004; Grunwald等，2001; Henderson等，2001; Takasu 等，2002)。本研究表明EphB受体兽腿过与NMDAR的NR2B亚對目互作用进 而调节DH神经元的应激性和突触可塑性，而对吗啡1^和戒断的发^作用， 尽管EphB受体介导的DH神经，l微是发生于突触后，突触前，还是突触前和 突触后都存在，以及ephrinB激活反向信号传导是否也在突触前或突触后起作 用，仍有待观察。EphB受体是在蛋白聚集时启动双向信号传导的膜蛋白 (Kullander &幻ein， 2002; Palmer & Klein, 2003)。然而，吗啡治疗后DH 中EphB受体的堆积以及EphB受体阻断剂戶顾DH中最初传Mf维内CGRP 表达的抑制其表明，EphB受体信号传导可肖^t突M^侧都比较重要，并且SC中正向和反向ephrinB-EphB信号传导,育树吗啡| 和戒断症^作用。虽 然可获得的阻断剂不能确定所再活化的特异EphB受体，但J^于1^测EphBl 的特异性抗体使该结论更加可信这，异性蛋白可在长期吗啡暴露和戒断 期间被上调。另外，最棘出版的来源于EphBl剔除(KO)小鼠的娜也表明， EphBl受体对吗啡娜的发生糊重要，艮P，纳洛酮舰的吗啡戒断的行为体 征，在EphBlKO小鼠中大大^l 了。 NMDAR在神经的可塑性和P可片齐lJ相关的改^hfe重要作用(Mao & Mayer， 2001; Nestler， 2001)。] NMDARj^&含NRl和NR2亚基的彌复合 体。它们位于兴奋性突触的突触后侧，并且是Ca"駄的重要鹏(Cull-Candy 等，2001; Prybylowski & Wenthold, 2004)。 NR1亚基广泛分布于CNS内， 而NR2B亚,布更有P艮，但其分布包括DH表层(Boyce等，1999; Nagy等， 2004)。在NR2AKO小鼠中通过电穿孔重新引AiiJ除基因至特定脑区显示， NR2A对吗啡繊和戒断比體要(Inoue等，2003)。有些证据也指出，阿片 剂诱导的NR1和NR2B蛋白水平的增加，对于扁杉淋的吗啡耐受反应有作用 (Bajo等，2006)。本研究ll^了，长期吗啡暴露和/或戒断可增加DH中j>NR2B 亚基的首次证据。而且，NR2B的这种增加，可以被EphB受体阻断剂阻止和/ 或减少(图4)。配体结合可使EphB受体聚簇和在多酪氨^^S位点上的互相 磷酸化(Grunwald等，2004)。磷酸化的酪氨酸召集包含SH2结构域的下游信 号传导蛋白，包括Src家族激酶例如Fyn(Gnmwald等，2004;Murai & Pasquale， 2004)。 Fyn与EphB受体和NMDARs都物理性相关，并且Fyn可使NR2B酪 氨酸磷酸化(Nakazawa等，200"。这可能在长期吗啡暴露和/或吗啡戒断之后， 也发生于DH神经元。阿片剂系统与NMDAR相互作用由此MOR^^活，可导 致经由NMDAR离子通道复合体Ca2+流入。各种Ca2M^t号传导途径的后 续激活(Fan等，1999; Noda & Nabeshima， 2004)，在吗啡,和戒断中起 了重要作用。CaMKH蛋白售feOT^酸化(激活)CREB,其可导致c-Fos mRNA 和oFos蛋白的表达增加(Sheng等，1991)。基因鋭被认为在许多可塑性形 式中起重要作用，包括吗啡依赖和戒断。突触后的EphB受体与突触前的ephrinB之间的跨突触相互作用，对海 马内苔状纤维突触的某些可塑性形式是必需的(Contractor等，2002)。最g 现在神经损伤后，EphB受体及其ephrinB配,DH初级传入突触处被，前和突触后上调(Song等，2008a; Song等，2008b)。本研究结果表明EphB受 体蛋白的表达，在长期吗啡暴露和戒断后也显著增加(图4A4E)。奇怪地是， 在吗啡治疗和戒断后，SC中印hrinBl和ephrinB2以及含磷酸化酪氨酸的蛋白， 其,没有发生改变(图4F和4G)。在没有ephrinB配体的相应改变情况下， 上调的EphB受^聚簇和相互磷酸化是怎样发生的？ 一种可能性是在长期吗 啡治疗和/或吗啡戒断后，EphB受体直接被如NR2B, ERK (Nateri等，2007) 和CREB信号传导(Ma等，2001; Watson & Latchman, 1995)或NO途径(Muscoli 等，2007; Pasternak, 2007)，在突触后调节。EphB受体和cAMP相互作用， 可能也对EphB受体的突触后效应起作用。例如，暴露于福司柯林后EphB2的 鋭增加，并且c層的、歸，育滩、職转录活动而增强EphB2受体基因的表 达Uassen等，2006)。长期吗啡治疗可以导致初级传入神经^^内CGRP的增加，这可解 释DH中CGRP免疫反应性有显著增加的原因(Trang等，2003)。尽管根本的 机制尚不清楚，但是CGRP的增加，可能是繊于MAPK途径的活化和CREB 的磷酸化(Ma等，2001)——该涉及CGRP基因表达的转录因子(Watson & Latchman, 1995)。目前的结果表明，DH中初级传入末端内CGRP的堆积和耗 竭，軎濑被EphB受体阻断剂所抑制。CGRP的这种抑制，可能是阻断剂抑制 CREB信号传导途，50f致(Ma等，2001; Watson & Latchman, 1995)。进行 进一步的研究以显示在长期吗啡治疗后，EphB受体其如何调节突触前初级^ 中CGRP的表达。总之，本研究为阿片齐i臓和戒断症状相关的新机制，和EphB受体信 号传导在吗啡依赖和戒断发生中的新作用，提供了证据。本研究可能也提供了
一个预防、减少或逆转吗啡依赖的潜在药物耙点，从而可,临床上阿片样药 物的使用。临床应用可以扩展到平均体重约60kg的人，该体重是本研究中所用 小鼠平均体重(30—50g)的约1500倍。临床应用的治疗有效剂量，可根据治 疗个体的体重进fiH周整。虽然本发明仅以一些方式被说明，但本领域技术人员显而易见，其并 不局限于此，而是容许在不偏离本发明的范围内有各种变化。
权利要求
1.一种预防或治疗阿片剂耐受和依赖的方法，所述方法包括给需要此种治疗的个体施用药学上有效量的ephrinB-EphB信号传导阻断剂。
2. 权利要求1的方法，其中所述柳可片剂耐受和娜是由长期吗啡治疗 和戒断引起的。
3. 权利要求1的方法，其中戶脱的阻断剂是EphB受体阻断剂。
4. 权利要求3的方法，其中戶腐的EphB受体阻断齐抱括EphBl-Fc。
5. 权利要求3的方法，其中所述的EphB受体阻断齐l泡括EphB2-Fc。
6. 权利要求1 一5任一项的方法，其中戶脱的阻断剂以约0.5飓到约75mg的量被施用。
7. 权利要求6的方法，其中所述的阻断剂以约lpg到约15mg的量被施用。
8. 权利要求l的方法，其中所述的阻断剂以鞘内施用。
9. 权利要求1的方法，其中所述的阻断剂与吗啡重缺给药，或者在吗 啡给药后以单剂给药。
10. 权利要求1的方法，其中所述个体是哺乳动物。
11. 权利要求10的方法，其中所述哺乳微是人。
全文摘要
本发明提供了通过给予需要此种治疗的个体，施用药学上有效量的ephrinB-EphB信号传导阻断剂，来预防或治疗阿片剂耐受和依赖的方法。优选地，阿片剂耐受和依赖，是由长期吗啡治疗和戒断引起的。
文档编号A61K39/395GK101574519SQ20081012770
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月6日 优先权日2008年5月6日
发明者宋学军 申请人:帕克脊椎医学院