治疗性疫苗制剂的制作方法

专利名称：：治疗性疫苗制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种治疗性疫苗制剂，具体涉及增强疫苗免疫原性的疫苗佐剂及用于肿瘤治疗的疫苗制剂，属于分子生物学及免疫学领域。
背景技术：
：恶性肿瘤是一类严重威胁人民生命和健康的疾病，肿瘤的预防和治疗已成为全球性的医药卫生工作的重要任务，人类对肿瘤的治疗研究也一直在不懈的努力。肿瘤疫苗成为继手术、放疗和化疗之后的肿瘤治疗方法，肿瘤疫苗作为主动特异性免疫治疗，在临床中起到越来越重要的作用，人们开始尝试利用多种方法制备肿瘤疫苗并利用其促进机体免疫应答，从整体细胞，分子水平调控机体对肿瘤的免疫。疫苗的本质是将某一免疫原组份作用于生物体，从而激发机体对该免疫原或免疫原载体的免疫保护，肿瘤疫苗正是根据这一免疫原理将自身肿瘤细胞经物理因素的处理，改变或消除其致瘤性，保留其免疫原性。且常与佐剂联合应用，增强其免疫原性。这是以肿瘤细胞为基础的疫苗，也是第一类肿瘤疫苗。第二类肿瘤疫苗是以肿瘤相关抗原为基础的疫苗，包括肽和蛋白质疫苗、重组病毒疫苗、DNA疫苗等。第三类肿瘤疫苗是以树突状细胞为基础的疫苗，它利用了树突状细胞在体内强的抗原呈递能力，捕获免疫原，并将信息传递给T、B淋巴细胞，从而引发一系列的特异性免疫应答反应。为了增强肿瘤疫苗的免疫原性，常常与佐剂联合应用，从而引发有效的抗肿瘤免疫应答。佐剂主要可分为两种一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌(结核分枝杆菌)以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。我们熟知的弗氏佐剂是目前最常用的。在19世纪，纽约的外科医生WilliamColey注意到细菌的提取物对肿瘤具有治疗作用，后来人们发现其中的有效成分是含有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA。CpG0DN是人工合成的含有未甲基化的CpG基序的寡脱氧核苷酸，它能模拟原核生物DNA刺激机体的免疫系统，激活多种免疫细胞，产生多种细胞因子，有诱导激活抗肿瘤免疫应答的能力，可以单独应用治疗肿瘤。同时，CpGODN也是一种有效的Thl型免疫佐剂，可促进蛋白类免疫原诱发特异性CTL应答，比弗氏完全佐剂更强，因此，成为肿瘤免疫治疗研究领域的热点。乳剂是指互不相溶的两种液体混合，其中一相液体以液滴状态分散于另一相液体中形成的非均相液体分散体系。乳剂由水相、油相和乳化剂组成，根据乳化剂的种类性质及相体积比形成水包油或油包水型。根据乳滴的大小乳剂分为普通乳、亚微乳、纳米乳。乳剂中液滴的分散度很大，药物吸收和药效的发挥很快，生物利用度高。油性药物制成乳剂能保证剂量准确，而且使用方便；水包油型乳剂可以掩盖药物的不良气味，并可加入矫味剂；外用乳剂能改善对皮肤、黏膜的渗透性，减少刺激性；静脉注射乳剂注射后分布较快、药效高、有靶向性；静脉营养乳剂时高能营养输液的重要组成部分。目前，已经有多种疫苗以乳剂形式在进行临床试验，如赫利欧等人制备的HIV疫苗TAB9即为以ISA720为油相和佐剂的乳剂疫苗，目前正在进行临床研究(赫利欧托尔多等，多表位多肽联合MontanideISA720作为佐剂在非HIV-1感染志愿者中的I期临床试验.疫苗，2001年19期，4328-4336页.HerioToledoetal.AphaseIclinicaltrialofamulti-epitopepolypeptideTAB9combinedwithMontanideISA720adjuvantinnon—HIV-1infectedhumanvolunteers.Vaccine19(2001)4328-4336)。以乳剂形式上市的疫苗包括葛兰素史克公司的油包水乳剂乙肝疫苗Fendrix(2005年，欧洲上市)和Chiron公司水包油乳剂的流感亚单位疫苗(1997年欧洲上市)。美国专利US5023077、US5468494、US5607676、US5609870、US5622702、W02004004687公开了通过产生抗胃泌素抗体，用于控制患者G17和G34水平的免疫原和免疫原性组合物，这些组合物即是以肿瘤相关免疫原为基础的肽类疫苗，它们也是以乳剂的形式在进行研究。本发明治疗性疫苗涉及美国专利US5023077、US5468494、US5607676、US5609870、US5622702、W02004004687中公开的抗G17肽类疫苗，本发明治疗性疫苗还涉及中国专利CN101050236中公开的抗G17肽类疫苗以及中国专利CN100999548中公开的载体蛋白。
发明内容本发明的目的在于提供一种用于肿瘤治疗的疫苗制剂。本发明的疫苗制剂，包括一种本身具有免疫原性的免疫原物质、具有免疫增强剂活性的人用疫苗佐剂、适合于油包水乳剂的油相介质和作为水相的缓冲液。所述的具有免疫原性的免疫原物质是多肽免疫原或多肽免疫原与大分子蛋白的交联物。上述多肽免疫原或多肽免疫原与大分子蛋白的交联物可采用现有技术，例如美国专利US5023077、US5468494、US5607676、US5609870、US5622702、W02004004687、中国专利CN101050236中公开的免疫原、免疫原与蛋白的交联物。上述具有免疫增强剂活性的人用疫苗佐剂为含有至少一个非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸；该寡聚脱氧核苷酸长度为15-35个核苷酸，优选长度为20-30个核苷酸，更优选长度为20-25个核苷酸。优选的，所述寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列为下列之一5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'55'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'更优选的是，所述寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列为下列之一5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3，其中优选的，所述寡聚脱氧核苷酸是硫代修饰的。上述硫代寡聚脱氧核苷酸的制备方法是本领域技术人员所熟知的，例如可以采用固相亚磷酰胺三酯法化学合成。本发明所涉及治疗性疫苗制剂还包含其它佐剂，如ISA720(法国SEPPIC公司)、MF59(诺华公司)、氢氧化铝、磷酸铝、无定型铝或其它任何适用于人用疫苗的佐剂。本发明中所涉及的免疫原物质具体是一种具有刺激肿瘤生长活性的多肽免疫原或此多肽免疫原通过由7个氨基酸组成的间隔肽借助于双功能交联剂与载体蛋白的交联产物，该交联产物如G17CRM197、G17DT、G17BSA、G17P64K等。其中，所述的多肽免疫原的氨基酸序列如下pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu其中，所述间隔肽氨基酸序列如下Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys所述双功能交联剂为e-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS);所述载体蛋白包括白喉类毒素(DT)、破伤风毒素(TT)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)、白喉毒素突变体CRM197以及脑膜炎球菌P64K蛋白；其中优选白喉类毒素和CRM197。本发明所述的交联物优选G17CRM197以及G17DT，采用中国专利申请CN101050236(200610043442.X)和美国专利申请US5468494中所述方法制备。本发明所述的适合于油包水乳剂的油相介质选自注射用大豆油、角鲨烯、ISA720(法国SEPPIC公司)、ISA51(法国SEPPIC公司)，其中优选ISA720(法国SEPPIC公司)。优选的，本发明所述的治疗性疫苗制剂为一种油包水乳剂，每剂疫苗(250ul为一剂)含有具有免疫活性的免疫原10ug-lmg，优选50ug-0.5mg;含有寡聚脱氧核苷酸佐剂10ug-10mg，优选25ug-5mg;含有油相介质ISA720为0.05-lml，优选O.1-0.5ml。其中，上述优选的油包水乳剂中还含有缓冲液作为水相介质，这些缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等生理上可接受的水相介质。本发明所述制剂通过下述主要步骤制备(1)将一定量的免疫原与免疫佐剂加入至缓冲液中制成适宜浓度的免疫原佐剂溶液;(2)称取处方量的油相介质置适宜容器中作为油相；(3)取处方量的免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，以较低转速进行均质，再以较高转速均质，制成均一、稳定的油包水乳剂；(4)用粒度仪测定乳剂粒径。采用动物免疫试验的方法来测定所制备的乳剂刺激动物产生抗体的情况，按照常规的方法进行免疫，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测产生的抗体滴度。本发明的肿瘤治疗性疫苗制剂作为抗消化道肿瘤的药物的应用。本发明的肿瘤治疗性疫苗制剂适合于肌肉内注射或皮下注射。用所制备的乳剂免疫小鼠，定期采集抗血清。对所采集的血清进行纯化得到抗体，并将所得到的抗体进行体外药效学评价。体外实验所采用的肿瘤细胞为胃癌细胞MKN45、BGC823和大肠癌细胞L0V0、SW480。体内实验用荷瘤大鼠进行，将适量乳剂注射入大鼠体内，通过检测肿瘤的大小来评价本发明治疗性疫苗制剂对肿瘤的作用。通过体外肿瘤细胞培养及大鼠体内抑瘤实验证明本发明治疗性疫苗制剂对胃癌及大肠癌有明显的治疗作用。具体内容将在实施例中进一步详细说明。以本发明免疫原与佐剂的组合物作为治疗性疫苗的有效成分制成的乳剂可直接用于人体注射。此免疫原在人体内能够刺激免疫系统产生相应的抗胃泌素抗体，此抗体可中和消化道肿瘤患者体内过多的胃泌素，从而达到治疗肿瘤的目的。本发明中用于增强疫苗免疫效果的佐剂为人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸(简称CpG-0DN)，这种佐剂通过免疫细胞上的受体TLR9激活免疫系统，从而增强针对疫苗免疫原的特异性免疫应答。本制剂中的免疫原在所述的佐剂CpG-0DN存在的情况下与未加佐剂或加入其他佐剂的制剂相比较，能够刺激机体产生更高滴度的抗体，对体内移植瘤模型的抑制效果更加明显。另外，由于本制剂中油相介质的加入，使得用本发明所提供的方法制备的油包水型乳剂能够在体内持续不断地刺激机体产生高滴度的抗体。与现有技术相比，应用本发明疫苗制剂来免疫动物，所产生的抗体滴度远高于单独应用未加佐剂的疫苗的抗体滴度，即本发明所涉及的免疫原与佐剂的组合物具有更高的免疫原性。经动物实验证明，本发明所涉及的免疫原与佐剂的组合物相比于单独使用疫苗具有更明显的肿瘤抑制效果。图1为利用本发明所制备的治疗性疫苗制剂的动物免疫实验结果，表明以CpG为佐剂能大大增强免疫原的免疫原性。A组空白对照组，只注射磷酸盐缓冲液；B组CpG佐剂组(G17CRM197为免疫原，CpG-ODN为佐剂，ISA720为油相，磷酸盐缓冲液为水相);C组铝佐剂组(G17CRM197为免疫原，氢氧化铝为佐剂，ISA720为油相，磷酸盐缓冲液为水相)；D组无佐剂组G17CRM197为免疫原，ISA720为油相，磷酸盐缓冲液为水相)。图2为不同CpG-ODN对G17CRM197免疫原的免疫增强能力对比，表明不同CpG-0DN能够增强兔子对G17CRM197疫苗的免疫应答。具体实施例方式下面结合实施例来进一步说明本发明，但不限于实施范围。本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例l:本发明治疗性疫苗制剂的制备1.1精密称取2mg免疫原G17CRM197与lmg免疫佐剂CpG—起溶于3.3ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取6.7ml油相介质ISA720置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.2精密称取10mg免疫原G17DT与15mg免疫佐剂CpG—起溶于3.3ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取6.7ml油相介质ISA720置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.3精密称取40mg免疫原G17BSA与100mg免疫佐剂CpG—起溶于10ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取20ml油相介质ISA720置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.4精密称取2.5mg免疫原G17CRM197与0.5mg免疫佐剂MF59—起溶于3.3ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取6.7ml油相介质ISA720置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.5精密称取4rag免疫原G17CRM197与10mg免疫佐剂氢氧化铝一起溶于3.3ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取6.7ml油相介质ISA720置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.6精密称取5mg免疫原G17CRM197溶于3ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取7ml油相介质ISA720置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.7精密称取2.5mg免疫原G17CRM197与0.5mg免疫佐剂CpG—起溶于3ml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取7ml油相介质ISA51置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以lOOOOrpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。1.8精密称取2.5mg免疫原G17CRM197与0.5mg免疫佐剂CpG—起溶于lml磷酸盐缓冲的盐水中，制成免疫原佐剂溶液。精密量取9ml注射用大豆油置适宜容器中作为油相。5000rpm转速下，将免疫原佐剂溶液缓慢加入油相中，均质2分钟，再以10000rpm转速乳化3分钟，制成外观均一、稳定的油包水乳剂。实施例2:本发明治疗性疫苗制剂的家兔免疫实验本实施例中所使用免疫原为G17CRM197，也可以选择其它免疫原如G17DT、G17BSA、G17P64K、G17TT。按照专利CN101050236中所描述的方法制备G17CRM197，按照本发明实施例1.4的方法制备疫苗制剂。其中，本实施例中所使用的CpG-ODN序列如下5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'，由本领域技术人员熟悉的方法进行人工合成，并进行全链硫代修饰。8本实施例使用的免疫动物为新西兰大白兔。将兔子分为4组，每组5只。4组分别为A:空白对照组，只注射磷酸盐缓冲液；B:CpG佐剂组(G17CRM197为免疫原，CpG-0DN为佐剂，ISA720为油相，磷酸盐缓冲液为水相)；C:铝佐剂组(G17CRM197为免疫原，氢氧化铝为佐剂，ISA720为油相，磷酸盐缓冲液为水相)；D:无佐剂组G17CRM197为免疫原，ISA720为油相，磷酸盐缓冲液为水相)。动物免疫实验按照如下过程进行(1)将制备的疫苗制剂分别在0、21、42天免疫新西兰大白兔。免疫方法采用兔后腿肌肉注射，第一次注射右腿，第二次注射左腿，第三次注射右腿，注射点略高于第一次注射点。第一次免疫剂量为lmg，后两次的免疫剂量为0.5mg。(2)分别在第14、35、56天采集兔血进行抗体效价检测。其中前两次为家兔耳缘静脉采血，第三次为颈动脉采血，采集的血清室温下放置1小时，凝固后置4'C过夜，析出血清，2000rpm离心，分离血清。血清保存于-4。C，2周内备用。本发明所使用的抗血清效价检测方法为ELISA法。具体为将免疫原G17BSA用包被液(Na2C03-NaHC03，pH9.6)稀释至0.lug/ml，包被聚苯乙烯96孔板，50ul/孔，4。C培育过夜。洗板三次后用封闭液(2%BSA-PBS)封闭，50ul/孔，37°C，2小时。加抗血清，将采集的抗血清做如下倍数稀释2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000、512000，每孔50ul，37'C培育2小时。以注射生理盐水的兔血清为阴性对照，以商品抗白喉毒素抗体为阳性对照，同时与以注射G17DT的兔子产生的抗血清进行比较。洗涤三次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，1:4000稀释，37'C孵育1小时。洗板10次后加底物显色，37'C孵育40分钟后终止反应，测定A491值。实验结果如图l所示。从图中结果可以看出，在第一次动物免疫后第14天即可检测到抗G17抗体产生，第56天时抗体滴度达到最高值。同时可以看出，利用本发明所制备的疫苗制剂(B组)在三次检测中抗体滴度均大大高于C组和D组，C组抗体滴度低于B组但高于D组。这说明，本发明所制备的含有CpG佐剂的制剂不但能大大增强免疫原G17CRM197的免疫原性，而且其免疫增强能力高于其他佐剂。实施例3:不同CpG-ODN能够增强兔子对G17CRM197免疫原的免疫应答按照与实施例2相同的方法对新西兰大白兔进行免疫并检测抗G17抗体滴度，以测定不同CpG-ODN序列在兔子中对G17CRM197疫苗的免疫效果的影响，不同之处在于使用如下Cl-C6所示的CpG-ODN序列。Cl5，-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'C25'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'C35'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'C45，-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA--3，C55'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG--3'C65，-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA--3'图2所示为免疫后56天采血检测到的抗G17抗体滴度，与使用氢氧化铝佐剂的对照组相比，上述任意一种CpG-ODN均可使特异性抗体滴度大幅度增加。说明使用上述序列的CpG-ODN佐剂与其他佐剂相比能大大提高疫苗制剂的免疫原性。实施例4:本发明治疗性疫苗制剂的小鼠免疫对比实验G17CRM197疫苗制剂小鼠免疫对比实验实验动物BALB/C小鼠；普通级；年龄6-8周龄；雌雄兼用；体重20g土2g。普通环境，温度18—26匸，相对湿度40_70%。饲养笼具为塑料鼠盒，笼具每周替换2次。分组情况分为三组，每组10只小鼠。第一组以G17CRM197为免疫原，以弗氏佐剂为佐剂，以ISA720为油相，以磷酸盐缓冲液为水相；第二组以以G17CRM197为免疫原，不加佐剂，以ISA720为油相，以磷酸盐缓冲液为水相；第三组以G17CRM197为免疫原，以CpG-ODN为佐剂，以ISA720为油相，以磷酸盐缓冲液为水相。动物的免疫给药剂量G17C脂197免疫原量为50ug/只，本发明涉及的CpG-0DN佐剂为10ug/只；免疫途径为肌肉注射；免疫时间为第0、21天；免疫方法为后腿肌肉两点注射。抗血清制备以及抗体纯化按下述操作进行(1)采血时间第21、42天(免疫当天先采血后免疫)。(2)制备血清采用鼠眼眶静脉采血，约取0.25ml,将采集血液置于离心管中静止30分钟，4000转/分钟离心10min，分离血清。(3)血清的保存置于-2(TC冰箱中保存。(4)抗体的纯化采用本领域技术人员所熟悉的方法对抗血清进行纯化，如硫酸铵沉淀法、正辛酸沉淀法以及ProteinA亲和层析法。所制备的抗体经SDS-PAGE检测纯度大于97%。抗体滴度的检测根据本发明实施例2所述方法进行抗体滴度检测。ELISA检测抗体滴度结果如下表所示表1第二次免疫后21天采血检测结果第一组第二组第三组鼠12560001280002048000鼠2256000256000512000鼠31280001024000512000鼠41280001024000512000鼠5102400064000512000鼠6640001280001024000鼠764000256000512000鼠864000256000512000鼠964000512000512000鼠10128000256000512000几何平均滴度137187276495630346由上表结果可见，本发明所述疫苗制剂能刺激小鼠产生高滴度抗体。抗体滴度不但高10于无佐剂组，且远高于传统的弗氏佐剂组。证明本发明所述疫苗制剂具有更高的免疫原性。G17DT疫苗制剂小鼠免疫对比实验按照本专利实施例4.2所述的方法进行小鼠免疫对比实验。本实验采用G17DT代替实施例4.2中的G17CRM197。分组情况分为三组，每组10只小鼠。第一组以G17DT为免疫原，以弗氏佐剂为佐剂，以ISA720为油相，以磷酸盐缓冲液为水相；第二组以以G17DT为免疫原，不加佐剂，以ISA720为油相，以磷酸盐缓冲液为水相；第三组以G17DT为免疫原，以CpG-0DN为佐剂，以ISA720为油相，以磷酸盐缓冲液为水相。ELISA检测抗体滴度结果如下表所示表2第二次免疫后21天采血检测结果第一组第二组第三组鼠12560002560002048000鼠2256000256000512000鼠3128000512000512000鼠41280001024000512000鼠5102400064000256000鼠664000128000256000鼠7128000128000512000鼠8128000256000512000鼠964000256000512000鼠10128000512000512000几何平均滴度157586256000512000由上表结果同样可以看出，本发明所述疫苗制剂能刺激小鼠产生高滴度抗体。抗体滴度不但高于无佐剂组，且远高于传统的弗氏佐剂组。证明本发明所述疫苗制剂具有更高的免疫原性。实施例5本实施例旨在阐明用本发明所述的疫苗制剂免疫小鼠后所分离出的抗G17抗体在体外对肿瘤细胞的生长抑制作用。向生长良好的肿瘤细胞中加入实施例4中所制备的抗G17抗体，通过MTT法测定不同处理组(加胃泌素17组、加抗体组、空白对照组)的细胞活力，以确定抗体对肿瘤细胞的抑制作用。所选用的肿瘤细胞为胃癌细胞MKN45和大肠癌细胞SW480。肿瘤细胞株体外细胞培养，10%小牛血清RPMI1640培养液中分别加入无菌的G17和抗G17抗体，分成三组空白对照组、胃泌素17组(25ug/ml)抗体组(30ug/ml)。细胞活力的测定应用噻氮唑蓝(MTT)比色分析法测定细胞活力，取100ul含细胞的培养液(细胞浓度为105/ml)，接种于96孔培养板，细胞贴璧后吸去培养液；按上述11分组分别加入培养液、G17和抗体，各组均设8个复孔，培养66小时后每孔加MTT(5mg/ml)20ul，继续培养6小时，离心弃上清，每孔加20%SDS100ul，震荡5分钟，置室温半小时后在酶标仪上测定570nm波长处的光吸收值。各组A570值间接反映活细胞数量，结果表明不论是胃癌细胞MKN45还是大肠癌细胞SW480，胃泌素组活细胞数明显高于对照组(P〈0.01),而抗G17抗体组细胞数明显下降(P<0.01)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例6本实施例旨在阐明用本发明所述疫苗制剂免疫荷瘤小鼠后，小鼠体内肿瘤的生长情况。肿瘤动物模型的建立取含有MKN45细胞和SW480细胞的培养液70ul(细胞数107)，接种于小鼠右腋背交界处皮下层内成瘤，瘤块反复接种2次，形成肿瘤动物模型，将小鼠随机分成三组，每组六只；传代的肿瘤在放大镜下剪成大小一致的立方体状瘤块，约8mm3大小，以套管针分别接种于小鼠右前腋背交界处皮下。各组均自瘤块接前一周开始进行第一次免疫，第一次免疫后第21天进行第二次免疫。其中，对照组每只小鼠每次后腿肌肉注射PBS加油相ISA720200ul，实验组每只小鼠每次后腿肌肉注射本发明所述G17CRM197疫苗制剂200ul。第40天将小鼠处死，称重瘤块重量，计算抑瘤率，同时检测抗体滴度。对照组平均瘤重-实验组平均瘤重抑瘤率％=------------X100%对照组平均瘤重结果瘤块接种第5天后肿瘤生长明显，测量各组肿瘤面积，大小相近，无显著性差异(P>0.05)，表明肿瘤生长的均一性较好，从瘤块接种第七天开始实验组肿瘤面积较对照组縮小。特别是在第二次免疫后一周，实验组肿瘤面积明显开始小于对照组，差异有显著性(P<0.05);第40天时实验组肿瘤面积较对照组更小。根据肿瘤的重量变化计算，本发明所述治疗性疫苗制剂的抑瘤率对于两种肿瘤的抑瘤率分别达到30%左右。肿瘤重量变化情况如下表所示。表4体内肿瘤重量变化表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由此可见，本发明所述治疗性疫苗制剂具有明显的肿瘤抑制作用。序列表〈110〉齐鲁制药有限公司〈120〉治疗性疫苗制剂〈160〉14<170>PatentIn3.1〈210〉1〈211〉25〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3，〈210〉2〈211〉29〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'〈210〉3〈211〉20<212>寡聚脱氧核苷酸5，-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'〈210〉4〈211〉25〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3，<210>5<211〉21〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3，〈210〉6<211>30〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'<210〉7<211〉25〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'<210〉8〈211〉29<212>寡聚脱氧核苷酸5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'〈210〉9〈211〉20〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'〈210〉10〈211〉25〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'〈210〉11〈211〉30〈212〉寡聚脱氧核苷酸5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'〈210〉12〈211〉9<212>多肽pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu〈210〉13〈211〉7<212〉多肽Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro—Cys1权利要求1、一种治疗性疫苗制剂，包括一种本身具有免疫原性的免疫原物质、具有免疫增强剂活性的人用疫苗佐剂、适合于油包水乳剂的油相介质和作为水相的缓冲液；所述的具有免疫原性的免疫原物质是多肽免疫原或多肽免疫原与大分子蛋白的交联物。2、根据权利要求1所述的治疗性疫苗制剂，其特征在于，具有免疫增强剂活性的人用疫苗佐剂为含有至少一个非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸；该寡聚脱氧核苷酸是硫代修饰的，其长度为15-35个核苷酸，优选20-30个核苷酸。3、根据权利要求2所述的肿瘤治疗性疫苗制剂，其特征在于，所述寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列为下列之一5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3，5'-TCGTACGTACGTACGTACGTACGTACGTG-3'5，-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3，5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5;-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5，-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3，5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3'。4、根据权利要求2所述的治疗性疫苗制剂，其特征在于，所述寡聚脱氧核苷酸的核苷酸序列为下列之一5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3，5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5，-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3，5'-TCGATCGATCGATCGATCGATCGTA-3'5'-TCGTATCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGATTCGTA-3，；其中优选5'-TCGTATCGTATCGTATCGTG-3'5'-TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT-3'5'-TCGATTCGATTCGATTCGTA-3'。5.根据权利要求1所述的治疗性疫苗制剂，其特征在于，免疫原物质是一种具有刺激肿瘤生长活性的多肽免疫原或此多肽免疫原通过由7个氨基酸组成的间隔肽借助于双功能交联剂与载体蛋白的交联产物；所述的多肽免疫原氨基酸序列为pGlu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu;所述的间隔肽氨基酸序列为Ser-Ser-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys;所述的双功能交联剂为e-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。6、根据权利要求5所述的治疗性疫苗制剂，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、白喉类毒素(DT)、白喉毒素突变体CRM197、破伤风毒素、脑膜炎球菌P64K蛋白；其中优选白喉毒素突变体CRM197或白喉类毒素。7、根据权利要求l所述的治疗性疫苗制剂，其特征在于还包含其他适合于人用的疫苗佐剂，这些疫苗佐剂选自ISA720、MF59、氢氧化铝、磷酸铝、无定型铝或其它任何适用于人用疫苗的佐剂。8、根据权利要求l所述的治疗性疫苗制剂，其特征在于，适合于油包水乳剂的油相介质为可注射用油，包括大豆油、角鲨烯、ISA720、ISA51，其中优选ISA720。9、根据前述任一项权利要求所述的治疗性疫苗制剂，其特征在于每剂疫苗含有具有免疫活性的免疫原10ug-lmg，优选50ug-0.5mg;含有寡聚脱氧核苷酸佐剂lOug-10mg，优选25ug-5mg;含有油相介质ISA720为0.05-lml,优选O.1-0.5ml。10、权利要求1所述的治疗性疫苗制剂作为抗消化道肿瘤药物的应用，适于肌肉内注射或皮下注射。全文摘要本发明涉及一种治疗性疫苗制剂。该制剂包含一种具有免疫活性的免疫原，包含至少一个非甲基化CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸作为主要佐剂，另外还含有一种或多种油相介质和缓冲液作为水相介质。本发明中用于增强疫苗免疫效果的佐剂为人工合成的含有CpG二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸(简称CpG-ODN)，这种佐剂通过免疫细胞上的受体TLR9激活免疫系统，从而增强针对疫苗免疫原的特异性免疫应答。本发明的制剂为一种油包水型乳剂，动物实验结果证明其在体内能持续刺激机体免疫系统产生高滴度抗体，对胃肠道肿瘤具有较强的抑制能力。文档编号A61K9/107GK101675994SQ200810139858公开日2010年3月24日申请日期2008年9月19日优先权日2008年9月19日发明者张明会,杨清敏,王晶翼,王栋海,娥赵,玉郭申请人:齐鲁制药有限公司