专利名称：保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的能较好保持组织保护能力的长效促红细胞生成素。特 别的，本发明涉及经化学修饰的长效促红细胞生成素，所述化学修饰延长了其 在血清中的半衰期但还保持了天然蛋白在体内的组织保护功能。本发明还涉及 使用本发明所述长效促红细胞生成素来治疗贫血及其相关疾病。最后，本发明 涉及一种分析促红细胞生成素是否具有组织保护能力的检测方法。
背景技术：
自然生成的或内源性的促红细胞生成素(EPO)是一种主要由肝脏产生的 糖蛋白激素。内源性的EPO包含165个氨基酸，肝量(人类的)为大约30,000 大约到34,000道尔顿。EPO中的糖基，其由3个N-连接禾口 1个O-连接的寡糖 链构成，它占了^蛋白质分子量的大约40%。 N-连接的^链结合在24， 38 和83位的天冬翻安的氨基氮上，而0-连接的* 结合在126位上的丝氨酸残 基的氧原子上。EPO可肯巨存在3种形式a、 P和脱唾液酸形式(Asialo)。 a和 P形式具有相同的效力，生物活性，和分子量，但在糖类的组成上略有不同， 而脱唾液酸形式是除去了末端唾液酸(糖类)的a或P形式。
直到最近，内源性的EPO的主要功能是和其它生长因子一同朿微响应性骨 髓红细胞前体细胞的增殖和成熟，以及《呆持个体的血细胞比容(在含有红细胞
的全血中所占的百分率)。红细胞的产生过程称为红细胞生成，它是一种被精确 调控的生理机制，在不妨碍循环的情况下优化红细胞的数量使其满足组织氧化 的需要。例如，当红细胞输送的氧 >时，EPO #激骨髓中前体细胞吞转 运化为成熟的红细胞增加红细胞的产生，产生的红细胞随即进入循环体系中。 当循环系统中的红细胞的数量TO正常组织循环需要时，循环体系中的EPO就
^>。因此，当机体处于健康状态时，血浆中EPO的浓度是非制氐，仅足以刺 激替代由于老化而正常损失的红细胞。血浆EPO的正常范围是从O.Ol单你ml 到0.03单你mL
假定个体中大多数的EPO是由肾产生的，肾功能的损失，例如慢性肾衰竭 (CRE)，会导致EPO数量的减少并且常常会导致贫血。同样，贫血可能由其 它的慢性疾病，例如癌症，或与这些疾病相关的治疗，如化疗所引起。因此， 已经证明，给红细胞减少的个体施用重组的EPO (后面将详细叙述到)育,有 效的恢复血细胞比容的水平，所述重组的EPO与内源性EPO有基本上同样的 生物活性。
除了其在慢性症状下保持血细胞比容水平中的作用外，重组EPO己经被用 于在选择性或预定的手术之前增加红细胞水平，从而减少或取消输血的需要。 例如，施用重组EPO可以解除病AX^131输血而感染病毒或病原的顾虑，或解 决宗教上限制输血的问题。
进一步的，近来的一些证据表明，EPO作为细胞因子0^族的一员，具有 其它重要的治疗属性，iM31其与EPO受体(EPO-R)的相互作用来介导。例 如，EPO及其受体在缓减组织损伤中起着重要的作用，因为EPO和其受体相互 作用提供了改变缺氧细胞微环境的补偿性应答，以及调控由于代谢压力产生的 禾辨性细胞死亡。事实上，患有慢性肾衰竭和/或癌症的病人l柳EPO治疗后， 一般会提高康复的感觉或智力的敏锐性，这样的效果此前被归功于病人血细胞 比容的增加。但近来，如在国际申请号WO/02053580和美国专利公开号 2002/0086818和2003/0072737中所述的，这些，被归功于EPO的组织保护和 增强的活性。
最近的研究同样表明，全身性施用的EPO可以ffiil血脑屏障，因为形成血 脑屏障的毛细管也表达EPO受体。因此，这提供了从外周循环到脑部的受体介 导的胞吞作用的解剖基础。
重组EPO (epoetin a )，可以通过商业途径获得，如商品名为PROCRTT (来自Ortho Biotech Inc., Raritan， NJ)，和EPOGEN⑧(来自Amgen， Inc., Thousand Oaks， CA)，已经用于治疗由晚期肾病引起的贫血，同AZT (叠氮胸 苷)疗法一起使用来治疗感染HIV的病人，禾,于抵消化疗的影响。虽然重组 EPO的治疗作用有很多种，但至今为止重组EPO最主要的用途是缓减優性贫血。 在这一点上，在大约6到8周内重组EPO典型的初始施用剂量是50-150单^/kg 每周三次，静脉或皮下注射给药，以恢复病人体内指导性的血细胞比容范围。 当病人获得预期的血细胞比容水平，例如在约30%到约36%之间的量之后，可 以在无缺铁或并发症的情况下通过维持EPO疗法而维持所述的血细胞比容水 平。虽然剂量的要求可能根据患者个体的需求而变化，但通常维持剂量可以是 每周约给药三次(如果剂量更大的话，次数可以更少)。
重组EPO的施用剂量和次数部分取决于该分子的半衰期，当分子处于体内 时可能是很有限的。例如，据报道在患有CRF的成年及儿童病人中，静脉施用 的EPOGEN^以符合一级动力学的速率被清除，其循环半衰期在约4-13小时范 围内。因此，为了达到治疗效果考虑到重组EPO相对较短的半衰肌对施用剂 量和效率謝预整。
另外，因为重组EPOM31静脉或皮下注射，这常常就需要护士或医师来给 病人注射重组EPO。这给病人带来了更多的不便，这也就成为另外一个之所以 要考虑分子半衰期延长的原因。因此，增加重组EPO半衰期的研究在过去的十 年中受到重视，这基于如下前提，即延长的半衰期可以减少需求的剂量，同时 也提供了相同的或改进了的治疗效果。
事实上，关于人类EPO最新的实验表明，EPO中含有唾液酸的糖含量，它 的循环半衰期，和体内活性之间有着直接的关系。正如PCT公开号WO95/05465 中描述的那样，唾液酸残基加在糖链的末端并阻止了肝脏对半乳糖的识别。典 型地，每条N-连接的鎌链含有至多4个唾液酸，每条O-连接的鎌链含有至 多2个唾液酸。因此，未被修饰的EPO多肽总共可以含有最多14个唾液酸。
随着时间的推移，这些唾液酸残基可能从蛋白质上断裂，从而暴露了可以 被肝脏识别的半乳 。一旦肝脏识别到半乳糖链，蛋白质就从血液中过滤掉 了。:因此，据信逐步增加每个EPO分，含有的唾液酸，可以更好的避免半乳 糖链的暴露，也相应的逐步增加了它的生物活性(通过检测分离的相同分子量
浓度的促红细胞生成素提高正常老鼠的血细胞比容的能力方法)。由于未修饰的
EPO仅含有14个唾液酸位点，这样的结构限制了 EPO半衰期的延长。这导致 了如下假说即工程化的含有额外寡糖链的EPO类似物可能具有更强的生物学活 性。M提供额外的糖基化位点，含有末端的额外的寡糖链可以被唾液酸残基 修饰。参见PCT公开号为W091/05867， WO94/09257和WO01/81405的申请。
例如，修饰的EPO类似物可以至少喷有一个客矽卜的N-连接的,连和/或至 少一个额外的O-连接的糖链。特别是在WO01/81405中公开了在分子的30、 51 、 57、 69、 88、 89、 136禾口/或138位点的氨基酸处增加N-连接的^f连。亍針布过的 EPO肝可以在任何位置含有14个额外的糖基化位点，使得EPO分子可以增 加2-16个唾液酸残基。
虽然这些增加EPO血清半衰期的努力己经被证明是成功的并且在保持血 细胞比容水平上证明是有用的，但是却没有注意到这些额外的糖基化位点对 EPO的其它功能可能产生的影响。
因此，需要提供延长了血清半衰期(长效)并保持了内源性EPO的功能的 经修饰的EPO。特别的，本领域内需要一种长效的EPO化合物，其具有促红细 胞功能和组织保护功能，用于治疗贫血和/或相关疾病的药物组合物。另外，人 们还需要用于确定一种特定的EPO对内源性EPO的组织保护能力是否具有拮 抗性的检测方法。
发明内容
本发明涉及一种调节人类血细胞比容水平的方法，包括提供一种比重组人 类促红细胞生成素(rhuEPO)有更长血清半衰期的、具有组织保护功能的促红 细胞生成素产品的步骤和施用治疗有效量的该促红细胞生成素产品的步骤。在 一个技术方案中，提供促红细胞生成素产品的步骤还包含使用至少一种化学修 饰在至少一个N-连接的^l连或0-连接的^mt斷布重组EPO的步骤，这 里所述的化学修饰包括氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化或它们的组合。
另外，施用治疗有效量的促红细胞生成素产品的步骤，可以包含施用低于 rhuEPO摩尔量的该促红细胞生成素产品，以达到相当的血细胞比容。
在一个技术方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期长20%。 在另一个技术方案中，其血清半衰期至A、比rhuEPO的血清半衰期延40%。
本发明也涉及A^促红细胞生成素产品，其包含至少一种促红细胞生成素衍生物，其中至少一个N-连接的寡辦连或至少一个0-连接的 链上有至少一
种化学修饰所述化学修饰来源于氧化、硫化、磷酸化、PEG化或它们的组合， 这里所述的促红细胞生成素产品具有比rhuEPO更长的血清半衰期。该促红细胞 生成素产品最好具有组织保护功能。
在一个技术方案中，至少一种化学修饰包括至少一个N-连接的寡糖链或至 少一个O-连接的鎌链氧化以提供至少一个额外的酸性残基。例如，至少一种 化学修饰可以包括在至少一个N-连接的寡^或至少一个O-连接的寡糖链的 硫酸化以提供负电荷增加了的EPO产物。在另一个技术方案中,至少一种化学修 饰包括至少一个N-连接的寡糖链或至少一个0-连接的寡^l连的磷酸化以提供 负电荷增加了的EPO产物。在另一方面。至少一种化学修饰包括在至少一个 N-连接的SM或至少一个O-连接的寡糖链上增加聚乙二醇链。
本发明涉及一种制备具有延长的血清半衰期和组织保护功能的促红细胞生 成素的方法，包括如下步骤提供至少一种促红细胞生成素或促红细胞生成素 的衍生物；在所腿少一种内源性或重组的促红细胞生成素的至少一个N-连接 的寡糖连或至少一个O-连接的鎌f肚进，豫化、硫酸化、磷酸化、PEG化、 或其组合方式的修饰。
^t布的步骤还可以包括将至少一个N-连接的^l连或至少一个O-连接的 * 七的至少一4^位羟基用至少一种酸残基进行取代。在一个实施方案中， 在至少一个N-连接的寡糖链或至少一个0-连接的寡 上的至少一个邻位轻 基用至少一种酸残基进行取代的步骤还可以包括用至少多种酸残基进行取代在 至少一个N-连接的寡糖链或至少一个0-连接的 链上的至少多个邻位羟基。
在另一技术方案中，修饰的步骤还包括如下的步骤提供一种有机MU; 在溶剂中溶解促红细胞生成素或促红细胞生成素的衍生物以形成溶液；提供至 少一种縮合剂；提供至少一种硫酸盐供体；并且将至少一种缩合剂和至少一种
硫酸盐供体混合到上述的溶液中去。在另一个技术方案中，修饰的步骤还包括
如下的步骤提供一种有机溶剂；将所述促红细胞生成素或促细红胞生成素衍 生物溶解至U所有有机翻I」中的形成溶液；提供至少一种縮合剂；提供磷酸；并 且将至少一种缩合齐诉卩至少一种磷酸混合到，的溶液中去。
在另一个技术方案中，修饰的步骤还包括如下的步骤提供一种有机溶剂; 在该有机溶剂中溶解促红细胞生成素或促红细胞生成素的衍生物以形成第一溶
液；提供至少一种氧化剂；将至少一种氧化剂加至嘮一溶液中以形麟二溶液; 提供至少一种聚乙二醇链；将至少一种聚乙二醇链混合到第二溶液中去。提供 至少一种聚乙二醇链的步骤可以包括提{共在链的末端含有至少一个伯氨基团的 至少一种聚乙二醇链。
本发明也涉及一种治疗有组织损伤危险的病人的贫血的方法，其包括如下 的步骤提供一种至少一个N-连接的寡糖连或至少一个O-连接的M链上具有 至少一种化学修饰的促红细胞生成素产品，这里所述的化学修饰包括氧化、硫 酸化、磷酸化、PEG化、或其组合；施用治疗有效量的该促红细胞生成素产品，
这里所述的促红细胞生成素产品的施用摩尔量低于rhuEPO，但可以达至湘当的 目标血细胞比容，这里所述的促红细胞生成素产品具有组织保护功能。
在本发明的这一方面，该促红细胞生成素产品优选具有比rhuEPO的血清 半衰期长的半衰期。在一个实施方案中，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半 衰期长20%。另一方面，其血清半衰期至少比rhuEPO的血清半衰期长40。/。。
本发明还涉及包括如下成分的药物组合物至少一种治疗有效量的促红细 胞生成素的衍生物，其至少一个N-连接的寡^I连或至少一个O-连接的寡辦iU: 有至少一种化学修饰，所述化学1斷布来源于氧化、硫酸化、磷酸化、PEG化、 或其组合方式，这里所述的至少一种促红细胞生成素的衍生物具有比重组红细 胞生成素更长的血清半衰期并且具有组会只保护功能。在一个实施方案中，该药 物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。该至少一种药学上可接受的载 体可以包含至少一种稀释剂、佐剂、赋形剂、载体、或其组合。
在另一个实施方案中，该该药物组合物还包含至少一种润湿齐l」、乳化剂、 pH缓冲剂、或其组合。在另一个实施方案中，该该药物组，还包含至少一种 组织保护因子。
本发明进一步的特征和优点在结合下述附图进行的详细描述之后将变得更
清楚，有关的附图描述如下
图1A是不同形式的EPO对于暴露在三甲基锡中引起的细胞死亡的保护 作用有效性的比较；和
图1B是不同形式的EPO对于暴露在三甲基锡中引起的细胞死亡的保护 作用有效性的比较。
发明详述
本发明涉及具有延长了的血清半衰期(长效)的EPO分子的应用，对所述
EPO分子用糖链进行化学修饰从而得以保持内源性EPO的功能。正如在背景技 术中描述的那样，延长EPO半衰期的努力，通常集中在给EPO M增加额夕卜 的糖连以防止半乳糖连的暴露。但是据信，增加的糖链影响了EPO类似物的功 能，从而使得，例如，该功能被损害以获得较长半衰期。虽然已知的比重组EPO 具有更长半衰期的EPO类似物具有红细胞生成活性，但这些类似物没有保留最 近发现的EPO的其它治疗功能，如，组织保护活性。
例如，对应于EPO的3(M7位的17个氮基酸的片断，也被称为O' Bnen 肽，已经在体外显示具有组织保护活性，但是在体外却没有促红细胞活性。 Campana， W.M.， Msasi， R.&0， Brien， J.S.， Int丄Mol.Med， 1， 23541 (1998)。 因此，据信在0' Brien肽内具有额外的糖基化位点的1射布过的EPO肝在其 它体外i式验中不具备组织保护活性。另外，因为EPO分子的三维取向对于其功 肖巨起着重要作用，增加的糖基化位点可能影响分子的整体功能。
因此，本发明涉及长效的EPO，其具有红细胞生成活性、组织保护活性、 胞吞转运(transcytosis)能力中的至少一种或其组合。优选的，本发明所述的长 效EPO具有组织保护活性、胞吞转运作用中的至少一种以及红细胞生成活性。
在一个具体的方案中，本发明所述的长效EPO具有比重组EPO长至少约 20%的血清半衰期。在另一个实施方案中，本发明所述的长效EPO具有比重组 EPO长至少约30%的血清半衰期。在又一个实施方案中，本发明所述的长效EPO 具有比重组EPO长至少约40%的血清半衰期。
简单的说，与天然(内源性)EPO， i^与天然的人类EPO相比，本发明 所述的长效EPOs包括带有通过至少一种修饰而改变的糖链的EPO分子。在一 个实施方案中，本发明所述的长效EPOs经^,的多种修饰。
在一个实施方案中，把天然EPO糖链的邻位(vicinyl)羟基氧化成酸性残 基以制备本发明所述的长效EPO分子。在另一个实施方案中，用更稳定的酸性 残基取代EPO分子上的唾液酸残基。在又一个实施方案中，对EPO糖琏的硫 化和/或磷酸化会产生本发明所述的长效EPO。在再一个实施方案中，可以在 EPO ,加上聚乙二醇以获得本发明所述的长效EPO。前述修饰的任意组合也 )包括在本发明中。并且，正如前面提至啲那样，本发明还包含组合物，包括药
物组合物，其包含一种或几种前面提到的长效EPO分子。
本发明所述的长效EPO分子预期应用于药物组合物中，该药物组合物可以 治疗贫血及相关疾病、尤其是由包括但不限于急性肾衰竭、Wl症、HIV、化 疗等等疾病所引发的并发症。
本发明也涉及治疗贫血及相关疾病的方法，同时涉及一种用于治疗过程的 试剂盒。这里用到的术语"治疗"指药物治疗和预防或防护的措施，其目的是 为了防止或减缓(减少)靶向的病理状况或失调。那些需要治疗的对象包括
己经患有该失调(disorder)的对象，以及那些易感该失调的对象，或那些有待 于对该失调迸行预防的对象。本发明包括该长效EPO可用于慢性给药、急性治 疗、禾n/或间断性给药。为了本文的目的，"慢性给药"是指相对于急性给药模式 而言以连续的模式给药，以利于长期保t寺起始治疗效果(活性)，"间断性给药" 不是无间断i鹏续进行的，而是循环进行的。
本发明所述的长效EPO，和其用途，可以应用于任何哺乳动物。在这里，
术语"哺乳动物"是指任何分类在哺乳类的动物，包括人类、驯服的和圈养的 动物，和动物园的、比赛用的、或宠物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、 兔子等。优选的哺乳动物是人。本发明所述的长效EPO的给药包括但不限于， 口服、静脉内、鼻内、局部、腔内、吸A^非肠胃给药，后者包J織脉、动脉、 皮下、肌内、腹腔内、黏膜下层、皮内，及其组合方式。
本发明还涉及本发明所述的长效EPO的应用，其作为其它^T进入体内具 有EPO受体的区域的载体。例如，因为一些針具有低的血脑屏障穿透能力， 将这些分子与本发明所述的长效EPOs ^连接，就为这些0iaA脑部提供了 一个安全有效的转运体系。并且，随后>)每详细讨论，因为身体的其它区域表达 EPO受体，如视网膜、心脏、和肺，本发明所述的长效EPO可以为对于在这些 区域穿透力低的分子担当起转运体系的角色。
进一步，本发明涉及确定特定的EPO是否保持了内源性EPO的功能的检 测方法。例如，本发明所述的检观何以确定4針布过的EPO是否具有组织保护活 性，也就是内源性EPO的激动剂。在这里，术语"激动齐ij"用于其最宽的含义， 包括那些模拟天然EPO生物活性的分子。用同样的方式，术语"拮抗齐j"最广 义上讲包括那些部分或全部阻断、抑制、或中和天然EPO活性的分子。在一个 实施方案中，在体外分析中检测特殊EPO的存在，如P19细胞和/或老鼠运动祌
经元分析。在另一个实施方案中，本发明所述的检测包括评价特殊EPO在体内 的活性，使用各种不同的分析方法如大鼠定点局部缺血、大鼠视网膜缺血、脊 椎损伤、和荷包牡丹碱发作模型。 功能
正如在背景技术部分描述的那样，为了增加EPO半衰期的各种尝试已经成 功，因为其得到了具有较长半衰期和保持促红细胞生成活性的EPO类似物。并 且，正如描述的那样，具有较长半衰期的EPO對以物主要包括在其氨基酸序列 上增加额外MI连的EPO分子。但是可以预见到，增加的糖链可能影响EPO的 其它治疗活性，如组织保护功能和^F胞吞转运作用。不受任何特别的理论的 局限，基于O' Brien肽对组织保护功能的重要性，在O' Bnen肽上增加轔连， 可能影响其功能。另外，增加的糖链，不论是在O' Bnen肽内或之外，据信都 会影响到分子的三维取向。例如，在分子的三维构型中，增加的糖链可能阻断 分子中对其功能来说必不可少的区域。进一步的，据信糖基化的方法(或增加 糖链)可能也会影响到糖蛋白的功能。
组织保护能力
为了评价增加的糖链影响糖蛋白功能的可能性，本发明人研究了各种形式 的具有5个N-连接糖链(相比于重组EPO的3-个N-连接的糖链)的EPO类似 物。具体说来，本发明Ai柳了 EPO类似物，所述类似物在32位氨基酸处有 额外的糖基化位点，其导致了比重组EPO (epoetin a )延长了约3倍的半衰期。
虽然该EPO类似物在全身注射后在脑Wff液中出现(图1A)，但在随后的 体外P19检测(图1B)中惊奇的发现没有组织保护活性。这种组织保护活性的 缺失是意外的。另外，如果这些病人有需要组织保护能力的其它病况的话，组 织保护活性的缺失可能会在治疗贫血病人时引起并发症。侈"如，如果这些没有 组织保护活性的EPO类似物与有组织f呆护活性的内源性EPO竞争那些引发组 织保护应答的受体，由损伤产生的受伤程度可能会由于这样的EPO的作用而实 际上被加重。事实上，如果遭受中风的病人施用这样的EPO类似物，相比较于 没有{顿EPO类似物治疗的个体来说,由中风引起的麟体积实际上可能会更 大。
不受束缚于任何特殊的理论，这些发现揭示了至少一种额外的EPO受体类 型功能性地存在于神经组织中，其发出的信号不同于红细胞前体所发出的信号，
存在某种EPO类似物可能拮抗内源性EPO与这种形式的受体结合的能力的危 险。内源性EPO和这些EPO类似物的明显不同的生物活性揭示了受体是舰 相应于EPO分子不同结构域的功能差异EPO受体产生信号的。事实上，虽然 已经报道EPO受体基因蛋白质序列与红细胞前体所表达的相同，但在体外，神 经型EPO受体的结合亲和力大大低于前红细胞的EPO受体。参见，例如Masuda， S.，等，J5zb/Gtew， 268， 11208-16 (1993)。可能，这些不同是由辅助蛋白引 起的，并且可能表明其中所用到的信号传导途径不同于红细胞成熟过程中活化 的途径。有趣的是，这种亲和力上的不同不会被EPO的完全去糖基化所修饰， 如果在正常的非糖基化的EPO的AB环域出现神经活性结合的话，这就并非是 一个意外的结果。此外，由星形胶质细胞产生的EPO (可能是与其他细胞例如 神经元所产生的相同的产物)也比由肾所产生的要小。Masuda， S.， J.说oO ew， 269， 19488-93 (1994)。这种差异似乎是由糖基化程序的差异引起的。脱唾液酸 的天然配体与这些己知受体蛋白的亲和力是否有差异尚未确定，但是明显是有 关系的。
除了存在EPO受体修饰的辅助蛋白，EPO受体是一个复杂的基团，存在多 种改变形式，包括截短的可溶受体。Yamaji凡,等.^^ /说oc/^w,239,494-500; Yamaji凡，等^/c/z,m 5/。/ /^爿cto,1403,169-78(1998);Barron^C.,等， 147,263-8(1994); ChirOC.,等刀ra/h尺a Mo/Bra/" 7 ay，81,2942(2000);FujitaJM.,等, Z^tem&, llSuppl 3,444-5(1997); Westenfelder,C., BiddleJD丄.Baranowski,R&丄., /^/她m《55,808-820(1999).是否任何这样的形式都促进EPO的神经活性仍然
进一步，如在背景技术中讨论的那样，0' Brien肽在体外表现出组织保护 活性，但在体外却没有促红细胞生成活性。事实上，对在O' Brien肽内包含加 入的 的EPO类似物进行的分析表明该EPO类似物缺失组织保护功能。这 一结果暗示对O' Brien肽的某种修饰，如增加 ，影响了蛋白的功能。O' Brien肽修饰的EPO类似物可能扮演着对位于体内的内源性EPO的拮抗剂的作 用，因为其部分的或全部的阻断内源性EPO结合EPO受体的能力。因此，这 样的EPO类似物的l顿有着导致由损伤弓胞的受伤程度增加的危险。因此，在 其它体外的检测，例如大鼠运动神经元检测，以及体内检测例如大鼠定点局部 缺血检测，荷包牡丹碱发作检测，大鼠年见网膜局部缺血检测，和WH损伤检测
中，据信在O， Bnen肽上修饰过的EPO类似物将会缺失组织保护能力。
激#孕微辦运/锁
4柳上述的相同EPO對以物，也就是具有5个N-连接的糖链的EPO类似 物(相比于重组EPO的3个N-连接的糖链)，发明人研究了该對以物穿过血脑 屏障的能力。在全身注射后(图1A和1B)， EPO类似物出现在脑脊液中。不 受任何特殊理论柳艮制，据信该EPO對以物可以穿过完整血脑屏障，因为形成 血脑屏障的毛细血管也表达EPO受体，并且为M^卜周循环到脑部的由受体介导 的胞吞转运作用提供了解剖学的基础。这样，其它全身施用的EPO类似物据信 也育滩穿过血脑屏障，以及其它具有皿EPO受体的毛细血管的屏障。
总的说来，因为现有技术中的EPO类似物在牺牲内源性EPO的至少某些 功能的情况下保持促红细胞生成的活性，本领域需要一种长效的EPO，其能够 保持内源性EPO已知的全部功能。具有优势的，本发明所述的长效EPO不仅 增加了相对于重组EPO较长的血清半衰期，而且保持了内源性EPO的全部功 能，即组织保护功能和胞吞转运能力。下面的部分中提供了用于获得此类有益 蛋白质的多种修饰EPO的方法。
天然EPO的斷布
本发明所述的长效EPO可以用各种方法来制备。总的说来，长效EPO可 以舰化学修饰连接在EPO上的轔棘获得。这里，术语"辦连"是指存在于 内源性EPO上的N-连接禾卩O-连接的寡糖链，存在于EPO类似物上的增加的 N-连接和O-连接的MI连，和连接在EPO上的任何其他Mf连，尤其是糖链(Sugar chains》
在一个技术方案中，内源性或重组EPO被^t布以阻iW内源性EPO的组 织保护能力的任何干扰。另外，根据本发明，考虑了对EPO类似物进行修饰以 提供额外的糖基化位点，其并不位于Cr Bnen肽，即3(M7位的氨基辦列附 近。这里，术语"EPO类似物"是指被修饰的EPO肝，其具有至少l个增加 的的N-连接的糖链和/或至少1个增加的O-连接的糖链。在一个实施方案中， 用于修饰的EPO类似物在0' Brien肽的5个氮基酸内不含有任何增加的糖基 化位点。在另一个实施方案中，该EPO类似物在O' Brien肽的3个氨基酸内 不含有任何增加的糖基化位点。在又一个实施方案中，该EPO类似物在0'Brien 肽内不含有任何增加的糖基化位点，
EPO类似物也可以用于如本发明所述的修饰， 是应在三维空间上考虑
该类似物并且确认增加的糖链没有阻碍到0' Bnen肽或降低了组织保护能力。 另一方面，考虑了将EPO對以物用于本发明的修饰，前提是糖基化方法不会抑 制该肽的组织保护功能。在又一个方面，按照本发明提供的修饰方法修饰的EPO 类似物，在O' Brien肽有一个糖链(或更少)。例如，内源性EPO在38位氨 基酸处有一个糖链，并且在0' Brien肽内的额外的m连己被证明抑制该蛋白的 组织保护功能。因此，在0' Bnen肽上有一个或没有 的EPO對以物可以 用于修饰。在一个实施方案中，结合在38位氨基酸处的糖链可以重新连接到该 肽的其它位置。
根据本发明所述的i針布方法的非限制性实例包括(1)舰邻位羟基的氧化 作用在糖链上提供额外的酸性残基；(2)用更稳定的残基取代唾液酸残基；(3) M硫酸化和/或磷酸化增加促红细胞生成素的负电荷；禾口/或(4)用更复杂的 肝终止im连。因此，对EPO,连的修饰可以包括氧化、硫酸化、磷酸化、和 /或PEG化以及其它的步骤，它们将在后面详细的描述，并且在实施例l中进一 步的举例说明。
辦连的氧化和唾液酸残基的取代
化学修饰的本发明所述的长效EPO可以包括在EPO的糖^(銜上氧化以提 供额外的酸性残基。 一方面，可以用更稳定的酸性残基取代唾液酸残基。这种 类型的修饰相对于内源性EPO而言导致了^半衰期的增加，这是因为肝脏筛 选半乳糖链并将相关蛋白从循环系统中除去，而此时半乳糖链被保护起来使之 不被检测到。在EPO 1:更显著的修饰导致本发明所述的长效EPOs的血清 半衰期更多的延长。例如，当更多的邻〗立羟基被酸取代后，导致了血清半衰期 更多的延长。 '
尽管本领域的普通技术人员知道几种合适的用于改变促红细胞生成素的半 学L糖单元的方法， 一种合适的方纟雄括(1)将具有邻位羟基的糖分子用高碘酸 盐氧化成醛；和(2)将醛氧化成酸。适合将^l连氧化成醛的试剂对于本领域内 普通技术人员来说是熟知的，包括但不限于，高碘酸盐，如高碘酸钠，和糖氧 化酶，如半乳糖酶。另外，技术人员知道合适的试剂来转化醛，如定量本尼迪 特试剂(Kuantitative Benedict Solution)(可以从Fisher购得)。另一方面，糖分 子可以被高碘酸钠氧化，进一步用定量本尼迪特试剂(Fisher)处理将醛转化成
酸。
另一方面，EPO异构体，其具有约0-13个唾液酸残基，或EPO类似物， 其至少一条 缺失唾液酸残基，被半乳糖酶氧化。脱唾液酸形式的EPO可以 用于本发明的这一方面，即末端糖基(唾液酸)去除的a或P形式的EPO。优 选的使用脱唾液酸的促红细胞生成素。 一旦EPO被氧化，使用其他的氧化齐咖 定量本尼迪特试剂将醛转化成酸。
再一方面，四氧化钌可以用来生成糖能上的酸。由于这些斷布中涉及半乳 ，即使在转换中涉及的1^人EP0肝中被除去，该舒应该仍然會嫩 肝脏的清除，因为肝脏所筛查的成分半乳糖链将不会被暴露。
增加负电荷
本发明的另一方面，本发明所述的长效EPO可以M在EPO M上添加 硫麟和/或磷,来制备，它将会增加舒的负电荷，从而增加肝的半衰期。 也就是说，EPO分子的负电荷可以通过硫酸化来增加，其涉及了从硫酸盐供体 包括蛋白质，糖脂，葡糖胺聚糖和类固醇来转移磺基。并且，还可以通过将磷 酸基团弓l入到糖中来增加负电荷。
一种合适的用于硫酸化胰岛素的方法描述在S.Pongor等，Preparation of High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diab改es， Vol.32， No.l2， December 1983。例如，胰岛素的硫酸化可以在有机 竊」中，如二甲基甲翻安(DMF)，在縮合齐瞎在的情况下，如N， N' -二环己 基二亚胺(DCC)，和硫酸盐供体进行。硫酸化的程度可以通过改变縮合齐啲量 来控制在8倍范围内。尽管传统制备的硫酸化的胰岛素导致其丧失了胰岛素的 主要生物活性，使用Ponger程序制备的硫酸化胰岛素的生物活性在未被修饰胰 岛素的78%到87%之间。
类似的步骤用于EPO，本领域的普通技术人员可以控希臓酸化的量从而控 制化学修饰的EPO的血清半衰期。例如，可以衝i将EPO或EPO类似物溶解 在至少一种水溶性碳二亚胺优选为DCC之中，温度约为4。C，而^^酸加入到 蛋白质中，从而增加EPO的负电荷。DCC是^^的硫驢供体，本领域的技术 人员易知其它的用于本发明合适的硫KM共体。
相似的步骤可用于控制EPO的磷酸化，使用磷酸(H3P04)作为磷酸供体。 还有，虽然4她磷酸，但技术人员育滩容易的选择其它的磷酸供体舰EPO磷酸化。
PEGs终止
EPO的^f连也可以舰增加至少一种聚乙二醇(PEG)来修饰，其具有悠 久的安全的临床历史，分子式如下
PEG也可以是甲氧基化PEG (mPEG)，具有如下的舒式:
在一个实施方案中，PEG是氨基PEG，优选在甲基化PEG的末端具有伯 氨基团(mPEG-NH2)。末端具剤白氨基团的PEG链是非常有用的功能化多聚物。 mPEG-NH2氨基端的基团比一般PEGs的羟基更倾向于发生酰化反应，并且它们 也容易发生氨基还原反应(reductive amination reactions )。在另一个实施方案中， PEG是亲电子活化的PEG，如mPEG-琥珀酸丙酯(mPEG-SPA)或mPEG-琥珀 酸丁酯(mPEG-SBA)，它们都可以从NektarTher叩eutics of Birmingham, Alabama 公司购得。在又一个实歸案中，PEG是甲氧基化的PEG"^t!井。
另一方面，可以通过高碘酸盐(Jd述讨论的)的氧化作用，随后4顿氰基 硼氢化物和氨基PEG来增加至少一个PEG。例如，溶液中的EPO首先用高碘 麟氧化，如高碘勝内，在室温下反应 舰设定的一段时间，在 上产生醛。 一种合适的高碘酸盐是间高碘勝内，可以从Sigma公司购得。高碘酸盐然后被 缓冲交换去除，与此同时，EPO的N-连接的^li上的氧化的唾液酸基团可在 氰基硼氢化物存在的情况下至少与一个氨基PEG接触。可用的适合的PEG包 括但不限于，甲氧基化PEG-鹏井，其可以从NektarTherapeuticsofBirmingham， Alabama公司购得。 另一方面，在用半乳糖酶氧化后，可以M;将PEG基团连接到末端的半乳
糖残基来增加至少一个PEG。例如，缓冲液中的脱唾液,式的EPO (暴露了 末端的半乳糖残基)首先与半乳糖氧化酶(从S!gma公司购得)接触以在糖连 中产生醛。然后通过缓冲交换去除缓冲液，同时，在有氰基硼氢化物存在的情 况下将氧化的半乳糖残基与至少一种氨基PEG接触。
上面所述的方法并不是限制性的，其它的方法也可以用于制备本发明的化 合物。例如，技术人员可以认识至何以将这些化学修饰用于制造其它EPO衍生 物的长效形式如在国际公开号WO/02053580和美国专利公开号2002/0086816 和2003/0072737中公开的组织保护细胞因子，在此整体引入本发明作为参考。
制备EPO分子
各种宿主表达载体系统可以用于生产本发明所述的长效EPO和EPO相关 好。此类宿主駄载体《樣了一类载体(vehicle), M这些载体，感兴趣的 长效EPO得以生产出来并随后被纯化；也4樣了一类细胞，当所述细胞被适当 的核苷酸编码序列转化或转染时，可以原位表达经修饰的促红细胞生成素基因 产物。这些包括但不限于，细菌，昆虫，植物，哺乳动物宿主系统，例如但不 限于，用含有编码长效EPO产物的序列的重组病毒表达载体(如,病毒)感 染的昆虫细胞体系；用含有编码促红细胞生成素相关分子的序列的重组质粒表 达载体(如，Ti质粒)转化或重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV; 烟草花叶病毒，TMV)转染的植物细胞系统；或哺乳动物细胞体系，包括人类 细胞体系，如HT1080， COS, CHO， BHK， 293， 3T3，其中含有重组表达构 建体，所述构建体中含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子，如金属硫蛋白 启动子，或来源于哺乳动物病毒的启动子，如腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5K 启动子。
另外，选择的宿主细胞株可以调控插入序列的表达，或以期望的特有方式 修饰和加工基因产物。蛋白产物的这样的修饰和加工，对于蛋白的功能而言可 能是非常重要的。本领域的技术人员知道不同的宿主细胞具有特定的蛋白禾瞎 因产物翻译后加工和修饰的机制。可以选择合适的细胞系或宿主体系以保证对 表达的外源蛋白进行正确的加工和修饰。在这一点上，具有用于初级转录产物 的正确加工，基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞可以使用。 这样的哺乳动物宿主细胞包括人类宿主细胞，其包括但不限于HT1080， CHO，
VERO， BHK， HeLa， COS, MDCK， 293 ， 3T3，和WD8。
为了长期、高产量的产生重组蛋白，j皿稳定的表达体系。例如，可以工 程化稳定表达重组的组织保护细胞因子相关分子的基因产物的细胞系。不使用 含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用被合适的表达调控元件所控制， 如启动子，增强子，序列，转录终止子，多聚腺苷酸位点等的DNA，以及选择 性标记转化。引入外源DNA之后，工程化的细胞可以在营养丰富的的培养基中 生长1到2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标记使之具 有选择抗性，并且允许将质粒稳定的整合到细胞的染色体中，并生长成点(foci)， 其随后可被克隆被扩增到细胞系中。这禾巾方法可有利地被用于工程化表达EPO 突变蛋白相关分子的基因产物的细胞系。这样的工程化细胞系在筛选和评价那 些影响EPO相关分子基因产物的内源性活性的化合物中可能是特另陏用的。
或者，细胞系或微生物中内源性EPO突变蛋白基因的表达特征可以M在 稳定细胞系或克隆微生物基因组中插入异源DNA调控单元以至于插入的调控 单元有效的连接在内源性促红细胞生成素突变蛋白的基因上而被修饰。例如， 内源性EPO突变蛋白基因其通常是"转录沉默的"，即通常不表达EPO基因， 或在细胞系中表达的水平非制氐，其可以通过在所述细胞系或微生物中插入能 够促进基因产物表达的调控序列。或者，可以通过插入能在多种细胞类型中起 作用的混合调控单元来^^活转录沉默的内源性EPO基因。
异源调控单元可以插入到稳定的细胞系或克隆微生物中，使之育^多有效的 连接到内源性促红细胞生成素蛋白的基因上，使用的技术，如靶向同源重组， 对本领域技术人员来说是熟知的，并且在法国专利号2646438，美国专利号 4,215，051和5,578,461 ，和国际公开号WO93/09222和WO91/06667中有描述， 其公开的内Wii此整体引入。
药物组合物
本发明也涉及包含本发明所述的长效EPO的药物组合物。因为本发明所述 的长效EPOs有禾啲具有促红细胞生成活性以及组织保护能力和胞吞转运能力， 预期它们可以治疗同时也有各种组织损^伤的危险如中风和心急梗塞的个体的贫 血及相关疾病。另外，预期本发明所述的长效EPOs可用于治疗同对也经历了精 神系统恶化如老年性痴呆、帕金森等疾病的个体的贫血和相关疾病。进一步的，
本发明所述的长效EPOS可以用来治疗遭受了由正常老化过程产生的病况(如导 致跌倒的平衡问题、容易挫伤等)的个体的贫血。还有，本发明涉及本发明所
述的长效EPOs作为其它分子载体的应用，其中所述^T难于穿透具有EPO受
体的毛细血管的屏障。
例如，前述任何的长效EPOs可以被包含在本发明所述的药物组合物中。 另外，各种形式的EPO类似物可以被包含在本发明所述的药物组合物中，并与 至少一种组织保护性细胞因子混合，后者将在后面详细的讨论。
本发明所述的药物组合物含有治疗有效量的经修饰的EPO，优选为以纯化 的形式存在。制剂应当与给药模式相适应。制成便于施用的形式。换句话说， 本发明所述的药物组合物包含一定量的本发明所述的经修饰的EPO，从而使得 在使用了正确的齐糧和策略的情况下，其靶向的病况可以被治疗。并且，后面 将详细讨论，药物组合应当以非毒性剂量施用。
本发明所述的药物组合物可以含有治疗有效量的长效EPO化合物和合适 量的药学上可接受的载体，以便提供能句多正确向病人给药的形式。在一个具体 实施方式中，术语"药学上可接受的"是指经联邦或州政府的管理机构批准或 列在美国药典或其它公认的用于哺乳动物，尤其是人的外国药典上的。术语"载 体"是指与治疗剂一同施用的稀释剂，佐剂，赋形剂或药载体。这样的药物载 体可以是无菌液体，如水和油的盐溶液，包括石油，动物，植物或合成的来源 的，如花生油，大豆油，矿物油，芝麻袖等。当药物组合物静脉施用时，盐溶 液是优选的载体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也可以作为液体载体，特别 是作为注射用溶液。合适的药物赋形齐抱括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，；赚， 麦芽，大米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油，滑石，氯化钠， 干粉脱脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙酉享等。
本发明所述的药物组合物也可以含有少量的润滑剂或乳化剂，或pH缓冲 剂。这些组合物可以制成溶液，悬浮液，乳化液，片剂，丸剂，胶囊，粉剂， 缓释剂等形式。
本发明所述的组合物可以制成中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括那 些与自由氨基形成的盐，如来源于盐酸，磷酸，乙酸，草酸，酒石酸等的盐， 以及那些与自由羧基生成的盐，如那些来源于钠，钾，铵，钙，氢氧化铁，异 丙基胺，三乙基胺，2-乙胺乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的盐。含有长效EPO的组合物
如前所述，任何本发明所述的长效EPO可用于药物组合物中。在一个实施
方案中，由邻位羟基氧化而产生的长效EPO包含在本发明所述的药物组合物中。 在另一个实施方案中，本发明所述的药物组合物包含至少一种长效EPO，其是 用更稳定的残基取代唾液酸残基产生的。在又一个实施方案中，包含在药物组 合物中的长效EPO是ffiJl硫酸化和/或磷酸化增加EPO的负电荷而得到的。在 再一个实施方案中，包含在本发明所述的药物组合物中的长效EPO是通过用更 复杂的分子如PEG链终止糖链而产生的，。
另外，本发明涉及用本发明所述任何方法产生的长效EPOs的混合物在本 发明所述的药物组合物中的用途。例如，本发明所述的药物组合物可以包含至 少一种用更稳定的残基取代唾液酸而形成的长效EPO，和至少一种iffii硫酸化 和/或磷酸化增加EPO的负电荷而形成的长效EPO。
转运体系
如前所述，本发明所述的长效EPOs有利地能够,具有EPO受体的毛细 血管的屏障。因此，本发明的在另一个实施方案中是转运体系，其使用本发明 所述的长效EPOs作为一些分子的载体，这些M进入体内含有EPO受体的耙 向区域的屏障穿透能力较低。这样的转运体系优先有利地提供了一种新的安全 的跨越完整屏障的转运方法。
在一个实施方案中，转运系统包括本发明所述的长效EPOs和至少一种脑 部穿透能力劍氐的分子，提供了一种新的安全的穿越完整血脑屏障的转运方法。 即，本发明所述的长效EPOs让那些脑部穿透能力低的^T扮演了分子"特洛伊 木马"的角色，从而增强了脑部摄取小分子或大分子的诊断剂或治疗分子的能 力。
事实上，在治疗人劍茵部肿瘤中的一个重要问题来源于需要将治疗剂传送 到脑部的特定区域，将其分布在脑部肿瘤其中并且耙向作用于脑部肿瘤。在其 它情况下可能在诊断和治疗中有效的分子，或是不能以足够量穿过脑部紧邻肿 瘤的血脑屏障(BBB)，或是不能以足够量穿过血瘤屏障(BTB)。因此，需要 新的传送策略，其专门针对脑部并且能穿过脉管系统。例如，用于诊断或治疗 的抗体分子，由于它们的大小而不能以足够量穿过BTB。因此，本发明所述的 长效EPOs可以作为载体，使这些分子穿越BBB或BTO。 一个可与本发明所述
长效EPOS —起使用的分子的例子是反义寡核苷酸，其典型的用于抑制致癌基因
信号或对脑部基因的体内表iiiS行成像。另外，本发明所述的长效EPOs可以包
含在各种基因治疗剂中(病毒的或非病毒的制剂)，这些治疗剂通常太大以致于
在没有辅助的情况下不能穿过BTB 。
进一步的，本发明所述的长效EPOs可以用作各种化疗剂的载体介导的转 运者。因为表达在BBB和BTB上的药物活性流出(efflux)转运者活跃地将化 疗剂从脑部流回到血内，这些试剂在脑部的分布可能被抑制或阻止。部分地由 于这些原因，大部分传统的用来治疗位于中枢神经系统(CNS)外的癌症的化 疗分子对于脑部肿瘤的治疗不起作用。因此，使用本发明所述的长效EPO作为 这些化疗剂的载体，不仅在把试剂传送到脑部方面是有用的，而且还可用于将 试齐條持在脑部用于治疗。在另一个实施方案中，该长效EPO可以与药物一起 使用，所述药物抑制活性流出转运者，以进一步的确保吸收这些通常从脑部回 流到血液的化疗剂。
另外，本发明也包括傲布过的EPO作为一些肝的载体的应用，这些好 在体内表达EPO受体的其它区域具剤氐的穿透性。此类细胞的非限制性的例子 包括视网膜、肌肉、心脏、肺、肝、肾、小肠、肾上腺皮质、肾上腺髓质、内 皮毛细血管、睾丸、卵巢、胰腺、骨、皮肤和子宫内膜细胞。特别的，应答细 胞包括但不限于，神经元细胞；视网膜细胞光受体细胞(视杆细胞和视锥细
胞)；神经结，双极细胞，水平细胞，无长突细胞和MUdler细胞；肌肉细胞； 心脏细胞心肌细胞，搏起点细胞，窦房结细胞，结细胞，和交织组织(心房 结与his束)细胞；月市细胞；肝脏细胞肝细胞，星型细胞，和Kupffer细胞； 肾脏细胞肾小球，肾上皮细胞，和管状间质细胞；小肠细胞杯形细胞，肠 腺(腺窝)和肠内分泌细胞；肾上腺皮M细胞肾小球细胞，束状细胞，和网 状细胞；肾上腺髓质细胞嗜铬细胞；毛细血管细胞外膜细胞；睾丸细胞 Leydig细胞，Sertoli细胞，和精子细MS其前体细胞；卵巢细胞Graffian囊和 原始卵泡细胞；胰腺细胞Langerhans胰岛细胞，a-细胞，趴细胞，y-细胞， 和F-细胞；骨细胞骨原细胞，破骨细胞，和造骨细胞；皮肤细胞；子宫内膜 细胞内膜基质和内膜细胞；和存在于上述器官中的干细胞和内皮细胞。 混合了 EPO类似物和组织保护细胞因子的组合物
如前所述，本发明所属的药物组合物可以包含具有至少一个增加的N-连接 的 和/或至少一个0-连接的 的EPO类似物(表现出延长的血清半衰期 但缺失组织保护活性)与至少一种组织保护细胞因子的混合。例如，具有至少2
个增加的N-连接的職连的EPO對以物，其中一条糖链位于O' Bnen肽上，与 组织保护细胞因子一起，可以形成本发明所述的组合物。在另一个实施方案中， 本发明所述的药物组合物可以包含至少一种组织保护细胞因子和至少一种含有 额夕卜織连的EPO，其中ffiil在三维空间中考虑该类似物，已知所述MI连阻断了 0' Brien肽。在又一个实施方案中，本发明所述的药物组合物包含至少一种组 织保护细胞因子和至少一种EPO类似物，所述EPO类似物由于采用了向蛋白 质中增加额外糖链的方法而导致其不具有组织保护功能。
具有重新定位的糖基化位点的EPO类似物预期可以用在本发明所述的药 物组合物中。不受限于任何特别的理论，据信如果在38位氨基酸处天然生成的 糖基化位点被重定位于EPO类似物3047位氨基酸片断之外的其它位点，夷|5么 EPO类似物的组织保护能力相比于在38位具有糖基化位点的EPO类似物将会 增强。因此，本发明所述的药物组合物可以包含将38位氨基酸处的糖基化位点 重定位在分子其它位点的EPO类似物。重定位的糖基化位点可肯拨生在51 ， 57 ， 69， 88， 89， 136或138位上，如在PCT公开号WO01/81405中指出的那样。 在一个实施方案中，0' Bnen肽含有1个或更少的糖链。在另一个实施方案中， 0' Brien肽含有2个或更多的糖链。
用于本发明这方面的合适的组织保护细胞因子 那些缺失对骨髓的作用 但保持内源性组织保护作用的细胞因子，但是任何具有组织保护能力的细胞因 子也可以用于本发明。例如，合适的组织保护细胞因子包含由胍化作用，脒化 作用，氨基甲酰化(甲氨酰化)作用，苦味酸化作用，酰化作用(乙酰化或琥 珀酰化)，硝化作用，或其组合方式进纟于化学修饰而生成的EPOs。另外，至少 一个精氨酸，赖氨酸，酪氮酸，色氨酸，半胱氨酸残基^^基基团被修饰的EPO 分子预期也可用作根据本发明该方面的组织保护细胞因子。
还有，另夕卜用于本发明的另外的组织保护细胞因子可以通过有限的蛋白水 解、去卩錄基和域以分子生物学技术引入突变取代精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、 色氨酸或半胱氨酸残基而获得，所述分子生物学技术在Satake等，1990， 5呼fe.爿ctol038: 125-9中公开，在此整体引入。例如，合适的组织保护细胞因 子包括至少一个或多个突变的EPO，所述EPO在C7S， RIOI， V11S， L12A，
E13A， R14A， R14B， R14E， R14Q， Y15A， Y15F， Y15I, K20A， K20E， E21A， C29S， C29Y， C33S， C33Y， P42N， T44I, K45A， K45D， V46A， N47A， F48A， F48I, Y49A， Y49S， W51F， W51N， Q59N， E62T， L67S， L70A， D96R， S100R， S100E， S100A， S100T， G101A， GIOII， L102A， R103A， S104A， S104I, L105A， T106A， T106I, T107A， T107L， L108K， L108A， S126A， F142I, R143A， S146A， N147K， N147A， F148Y， L149A， R150A， G151A， K152A， L153A， L155A， A160S， 16A， C7入B13A， N24K， A30N， H32T， N38K， N83K， P42A， D43A, K52A， K97A， K116入T132A， 1133A， T134A， K140A， F148A， R150B， G151A， K152W， K154A， G158A， C161A，禾1V或R162A上有点突变。上面所提到的修 饰的实例在共同未决的美国专利公幵号2003/0104998， 2002/00861816和 2003/0072737中进行了描述，在此全文引入作为参考。在本文使用的突变蛋白 命名法中，被改变的氨基酸采用如下方式描述首先是天然氨基酸的单字母代 码，紧跟的是它在EPO肝中的位置，随后是替换氨基酸的单字母代码。例如， S100E是指在人类EPO分子中，将100位处的丝氨酸替换为谷氨酸。
在另一个实施方案中，组织保护细胞因子可以包含一个或多个，点突变， Itr^是所述点突变不包括I6A， C7入K20A P42A D43A K45D, K45A^ F48入 Y49入K52A K49A S訓B, R103入K116入T132A 1133A^ K140入N147K, N147八R150入R150E, G151入K152八K154入G158A C161A或R162A.
在又一个实施方案中，组织保护细胞因子可以包含点突变的组合，如K45D/ S100E, A30N/H32T， K45D/R150E， R103E/L108S， K140A/K52A， K140A/ K52A/K45A， K97A/K152A， K97A/K152A/K45A， K97A/K152A/K45A/K52A， K97A/ K152A/ K45A/ K52A/ K140A， K97A/ K152A/ K45A/ K52A/ Kl衡 K154A， N24K/N38K/N83K，和N24K/ Y15A。在再一个实施方案中,组织保护 细胞因子不包括任一上述组合。在另一个实施方案中，组织保护细胞因子可以 包含上述点突变的任何一种，前提是戶万述点突变不包括任何下述突变组合 N24K/N38K/N83K禾口/或A30N/H32T。
某些修饰或修饰组合可以影响突变蛋白与其受体如EPO受体或第二受体 结合能力的灵活性。此类修饰或修饰组合的例子包括但不限于，K152W， R14A/Y15A， 16A， C7A， D43A， P42A， F48A， Y49A， T132A， 1133A， T134A， N147A， F148A， R150A， G151A， G158A， C161A，和R162A。对人类生长激 素有害的相关突变对本领域的技术人员来说是熟知的。因此，在一个实施方案 中，组织保护细胞因子不包含那些可能影响突变蛋白与其受体结合能力的灵活 性的一种或多种修饰或修饰组合。对这样的组织保护细胞因子的进一步的讨论
包含在共同未决的专利申请公开号为2004-0122216，律师案巻号为 10165-022-999，申请日为2003年7月1日，名称为"Recombinant Tissue Protective Cytokines and Encoding Nucleic Acid Thereof for Protection, Restoration, and Enhancement of Responsive Cells, Tissues, and Organs"的美国专禾ll申请，其全 部公开的内容引入这里作为参考。
最后，具有组织保护能力的任何细胞因子超家族都可以使用，只要其不影 响长效EPO的促红细胞生成活性或血清半衰肌实例包括但不限于，白介素-3 (EL-3)，白介素-5 (EL-5)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，色素上 皮衍生因子(PEDF)，血管内皮生长因子(VEGF)。
本发明的在另一个方面中，本发明所述的药物组合物包含具有至少一个增 加的N-连接的糖链和减至少一个增加的O-连接的糖链的EPO类似物(具有延 长的血清半衰期但缺乏组织保护活性)与至少一种具有组织保护功能的小分子 的混合。统的小肝包括但不限于，类固醇(例如拉扎碱类和糖皮质激素)， 抗氧化剂(例如辅酶Qio， a硫辛酸，和NADH)，抗，军酶(anticatabolicenzyme) (例如谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，合成催化净化剂， 和模仿剂)，吲哚衍生物(例如吲哚胺，咔唑，和咔啉)，硝酸中和剂，腺苷/腺 苷激动剂，植物化学剂(黄烷类)，草药提取物(解杏和姜黄)，维生素(维生 素A， E禾nc)，氧化酶电子受体抑制剂(例如氧杂蒽氧化酶电子受体抑制剂)， 矿物(例如铜，锌，和镁)，NSAIDS (例如乙酰7K杨酸，甲氧萘丙酸,和异丁苯 丙酸)，和它们的组合。另外，本发明所述的药物组合物含有EPO對以物、组 织保护细胞因子、和具有组织保护活性的小分子。
存在于本发明所述的药物组合物中的组织保护细胞因子和/或小分子的量 ^^足够保持或超过由内源性EPO在神经或其它应答细胞系统中产生的活性。 在一个实施方案中，组织保护细胞因子和/或小分子的ft^以增强个体的组织保 护能力，这是通过保护，维持，或增强促红细胞生成应答细胞的存活力和功能 实现的。例如，本发明该方面中所述的药物组合物 含有有效、非毒性量的 组织保护细胞因子，例如约lng或更多。在一个实^"案中，存在于本发明所
述的药物组合物中的组织保护细胞因子的量大约是5mg或更少。在另一个实施 方案中，存在于本发明所述的药物组合物中组织保护细胞因子的量大约是500ng 到5mg。在又一个实施方案中，药物组合物含有约1 P g到5mg的组织保护细 胞因子，t^含有约500iig到5mg。在另一个实施方案中，存在于本发明所述 的药物组合物中的组织保护细胞因子的量更大，约为lmg到5mg。本领域的技 术人员熟知，给病AM用的药物组合物的剂量取决于以下因素，但不限于，病 人的身体状况和服药的频率。关刊艮药的剂量将在后面详细的讨论。 治疗和给药方法
前面提到的长效EPOs和含有长效EPOs的药物组合物，预期可以用于贫血、 涉及贫血或贫血症状的人类疾病、或导致贫血的疾病或治疗方法的治疗性或预 防性处理。通常，在不危害病人从其它组织损伤中康复的能力的情况下，本发 明所述的长效EPOs可以允许频率更低的给药或使用更少剂量的促红细胞生成 素来治疗，的疾病。
本发明预期该长效EPOs可以用于全身或侵性施用，急性治疗和/或间断性 施用。在一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可以慢性的施用以保护或 增强耙细胞、组织或器官。在另一个实施方案中，本发明所述的药物组合物可 以急性的施用，即在损伤期间的单一治疗。在另一个实施方案中，本发明所述 的药物组合物可以循环的方式施用。
该组合物的施用可以是非肠胃的，例如，通过静脉注射，腹腔注射，动脉 内，肌内，皮内，^下施用；ffl31吸入；跨粘膜，例如，口服，鼻腔，；EMi， 阴道内，舌下，粘膜下层，和经皮；或其组合方式施用。优选的，本发明所述 的药物组合物的施用方式是非肠胃的。这样的施用方式的剂量约为O.Olpg到约 5mg，优选约lpg到约5mg。在另一个实施方案中，剂量约为500pg到约5mg。 在又一个实施方案中，剂量约为500ng到约5mg。在再一个实施方案中，剂量 约为1 U g到约5mg。例如，剂量可以为约500 u g到约5mg。在另一个实施方 案中，剂量可以是约1 mg到约5mg。
适用于非肠胃给药的本发明所述的药物组合物含有水性或非水性无菌注射 溶液或悬浮液，其可以包含抗氧化剂，缓冲剂，细菌抑制剂和溶质，所述溶质 使该组合物基本与受试体的血液等渗。在本发明的这方面，该药物组合物也可 以含有水、乙醇、多羟基化合物、甘油、植物油、及其混合物。适用于非肠胃
给药的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如，密封的安瓿 和小瓶，并且可以冻干(冷冻干燥)保存，在这种情况下只需在马上就要使用 之前加入无菌液体载体，例如注射用的无菌盐溶液。临时用注射液和悬浮液可 以配制成无菌粉末，颗粒和片剂。在一个实施方案中，含有本发明所述的长效 EPOS注射液的自动注射器，可以用在救护车、应急室和战场的情况下紧急使用。 在一个实施方案中，本发明所述的组合物可以根据常规的步骤制成适合给 人静脉施用的药物组合物。例如，该药物组合物可以作成无菌等渗水性缓冲溶
液。如果需要，该药物组合物也可以含有增自诉tv或局部麻醉剂如利多卡因，
用于减轻注射位点处产生的疼痛。所述成分可以制虫或混合在一起以单位剂量 形式提供，如以冻干粉或无水浓縮物的形式存在于密封的容器内，如标有活性 成分用量的安瓿或小药囊。当通过灌输的形式施用本发明所述的药物组合物时， 含有无菌药物级的水或盐水溶液的f俞液并瓦可以用来分散药物。并且，当以注射 的形式施用本发明所述的药物组合物时，在施用前可以用含有无菌盐溶液的安 瓿来混合各成分。
适用于口服的药物组合物可以以如下形式提供胶囊或片剂；粉剂，粒
剂；溶液、糖浆或悬浮液(含水或不含水的液体)；可食用的泡沫(foams或
Whips);乳化剂；或其组合。口服帝跻lj可以包含重量百分比约10%到约95%的
活性成分。在一个实施方案中，口服制剂中活性成分的重量百分比是约20%到 约80%。在另一个实施方案中，口服制剂中活性成分的重量百分比是约25%到 约75%。
片剂或硬质明胶胶囊可以含有乳糖、淀粉及其衍生物、硬脂酸镁、糖機内、 纤维素、碳酸镁、硬脂礙其盐。软质明胶胶囊含有蔬菜油、蜡、脂肪、半固 体、液体多元醇、或其混合物。溶液和糖浆含有7K、多元S享、糖、或其混合物。
此外，用于口服的活性剂可以用推迟活性剂在胃肠道内崩解和/或吸收的材 料进行包衣或混合。例如，用单硬脂酸甘油、双硬脂酸甘油、或其组合与活性 齐嗨合或进行包衣。因此，活性齐啲持续释放可以维樹艮多个小时，如果需要， 可以阻止活性剂在胃内的糊早。口服的药物组合物可以根据特殊的pH或酶劍牛 进行配制，以助于在胃肠道的特定部位释放活性剂。
适合于经皮给药的药物组合物可以以不连续片(discrete patch)的方式提供， 其可保持与受试者表皮紧密接触较长时间。另外，适合于局部给药的药物组合
物可以以如下形式提供油膏剂、乳膏剂、悬浮剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊 剂、？赚剂、喷雾剂、气雾剂、油抓滴眼剂、,定、软锭剂、和漱口剂及其 组合。当局部给药用于皮肤、口腔、眼睛、或其它的外部组织时，优选使用局 部油膏剂或乳膏剂。并且，当存在于油膏剂中时，活性成分，即长效EPO，可 以与蜡或易与水混溶的油膏基质一起使用。或者，使用水包油或油包水的基质 将活性成分制备为乳膏剂。当局部给药采用滴眼剂形式时，本发明所述的药物 组合物优选含有溶解或悬浮在合适的载体例如水性溶剂中的活性剂。
适用于鼻腔和肺部给药的药物组合物可以含有固体载体，如粉末(优，
粒大小在约20到约500微米内的)。粉末可以M从,鼻子的含有粉末的容 器中快速吸入鼻腔的方式来施用。在另一个实施方案中，本发明所述的用于鼻 腔施用的药物组合物含有液体载体，如喷鼻剂或滴鼻剂。 在鼻腔内直接施 用本发明所述的药物组合物。
直接的肺部吸入可以通过伸入到咽喉的口腔插管和其它的特殊设计的装置 深吸来完成，所述装置包括但不限于，压力气雾器、喷雾器、或喷洒器，其可 经专门设计以提供预定量的活性成分。优选，药物组合物通过直接深吸入咽喉 的方式施用。
适合于直肠给药的药物组合物可以以栓剂或灌肠剂的形式提供。在一个实 施方案中，本发明所述的栓齐晗有重量百分比为约0.5%到10%的活性成分。在 另一个实施方案中，该栓剂含有重量百分比为约1%到约8%的活性成分。在另 一个实施方案中，该栓齐i恰有的活性成分重量百分比为约2%到约6%。在本发 明的这一方面，本发明所述的药物组合物可以含有常用的粘合剂和载体，如甘 油三翻旨。
适于阴道给药的药物组合物可以以如下形式提供阴道栓剂、棉塞剂、乳 膏抓凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂。
本发明所述的药物组合物也可以以使用灌输液、器官注射自部给药的方
式来施用。在这些实施方式中，该药物组合物优选的含有约0.01pM到约30pM， 优选是约15pM到约30nM的本发明所述的长效EPO。在一个实施方案中，灌 输溶液是University of Wisconsin (UW)溶液(具有约7.4到约7.5的pH和约 320mOSm/1的摩尔渗3gj5浓度)，它含有约lU/ml到约25U/ml的EPO; 5%的 羟乙基淀粉(优选具有分子量约从200,000到约300,000并且基本上不含乙二醇、
2-氯乙醇、氯化钠、和丙酮)，25mM KH2P04、 3mM谷胱甘肽；5mM腺苷； 10mM葡萄糖；lOmMHEPES缓冲液；5mM葡萄糖酸镁；1.5mMCaCl2; 105rnM 葡萄糖酸钠；200,000单位的青霉素；40单位的胰岛氣16mg的i爐米松；和 12mg的酚红。UW溶液在美国专利号4， 798， 824中有详细的描述，在此全文 引入作为参考。在另一个实施方案中，UW溶液可以含有约0.01pg/ml到约 400ng/ml，优选40ng/ml到约300ng/ml的重组组织保护细胞因子。
向需要治疗的区域局部施用本发明所述的药物组合物可能是令人期待的。 这样的给药方式可以通过如下方式来实现在手术中局部灌输；局部应用，如 手术后与伤口敷料一起应用；通过注射；通过导管；通过栓剂；或通过植入的 方式，所述的植入方式可以用带孔的、无孔的、或胶质材料，包括膜，如硅胶 膜，或纤维。
另外，如前所述的关于经皮施用的方式，本发明所述的长效EPO可以由控 释体系来输送。例如，使用静脉灌输、植入渗透泵、经皮膜片、脂质体、或其 它的方式施用该肽。在一个实施方案中，可以i顿泵，如在Saudek筝1989， N.EngUMed32h 574中描述的。在另一个实施方案中，可以使用载^il送该 化合物，特别是脂质体，如在国际公开号WO91/04014和美国专利号4,704，355 中描述的那样，在此将其整体引入参考。在另一个实施方案中，聚合物材料可 以用于制备控释体系，如那些在Howard等，1989，丄Neurosurg.71: 105中描述 的材料。
这样的控释体系可以置于靠近治疗目标的地方，即靶细胞、组织或器官， 因此只需要全身剂量的一部分。参见，例如，Goodson， Medical Applications of Contolled Release, vol.2， pp.115-138, 1984。可用于本发明的其它控释体系在 Langer， Science 249: 1527-1533， 1990的综腿有描述。
基于本领域普通技术人员公知常识，本领域普通技术人员可以选择适用于 战施用方法的优选的有效和非毒性齐曖。这些因素的实例包括长效EPO的特 殊形式；该EPO的药物动力学参数，如生物禾,度、新陈代谢、半衰期等(已 提供给技术人员)；有待治疗的情况或疾病；在普通个体中所取得的疗效；病人 的体重；给药方法；给药频率，即慢性的、急性的、间断的给药；伴随药物； 和其它已知的影响所施用的药齐啲有效性的因素。这样，精确的剂量应当根据
专业人员的判断和特定病人的情况来确定。
例如，Physicians Desk Reference (PDR)表明了，依据^^EPO治疗的病 人群体，考虑不同的血细胞比容水平以避免毒性。Physicians Desk Reference, 54ftEd， 519-525和2125-2131 (2000)。事实上，对患有CRF的病人，PDR推 荐施用的EPO齐糧是达到非毒性目标血细胞比容30y。到36Q/。。相反，对于进行 化疗的癌症病人，PDR教导将齐糧调节到不同的血细胞比容水平，也就是如果 血细胞比容水平超过40%。 PDR表明，专业人员在使用EPO治疗期间监控病人 的血细胞比容，并且如果病人的血细胞比容达到或超过预定范围的上限，贝糊 整剂量和/或停止治疗以避免毒性。因而，熟练的专业人员，根据本发明的教导， 应该能够使EPO的施用剂量足以达到治疗的效果而又避免了任何的毒性并发 症。
在一个实施方案中，本发明所述的长效EPO以剂量为每次约0.1 P g/kg体 重到约100 u g/kg体重慢性或全身的施用。例如，在治疗接受化疗的癌症病人时， 以约1 u ^kg体重到约5 u g/kg体重的剂量每周施用一次。在另一个实施方案中， 该长效EPO的剂量是每次约5 g/kg体重到约50 u g/kg体重。在又一个实施方 案中，该长效EPO的剂量是约10 u g/kg体重到约30 u g/kg体重。在再一个实 施方案中，该长效EPO的施用量约为1 u g/kg体重或更少。例如，在每周给药 一次治疗CRF患者的贫血时，约0.45ug/kg体重到约0.75 "g/kg体重的长效 EPO可能是有效的。
有效的剂量iM足以获得大于约10,000mU/mJ (80ng/ml)的长效EPO的血 清水平。在一个实施方案中，有效剂量旨^I多获得约15,000mU/ml (120ng/ml)或 更高的长效EPO的血清水平。在另一个实施方案中，有效剂量能够获得约 20,000mU/ml (160ng/mJ)的长效EPO的血清水平。最好在施用后l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10小时或其组合时进行检测。本领域的普通技术人员认为需要 时，可以重复施用的剂量。例如，只要临床需要，每天都可以重复给药，或经 过一倾当的间歇后重复给药，如每1到12周，{爐每1至U 3周。
由于本发明所述的长效EPOs具有延长的半衰肌因此它们在体内的活性 也会增加。例如，当哺乳动物的病体进行癌症的全身性化疗治疗时，包括放疗， 在治疗期间施用本发明所述的长效EPO药物组合物可以减少贫血相关的症状， 其施用的频率和剂量都少于现有的重组EPO组合物。
并且，如前所述，当本发明所述的药物组合物含有本发明所述的长效EPO 或EPO类似物与组织保护细胞因子的混合形式时，该组合物可以用于治疗同时 还有组织损伤危险的患者的贫血及相关疾病。例如，患有贫血同时也是心脏病 高危的病人，可以用本发明所述的组合物代替现有的EPO类似物来治疗，以避 免因治疗而增加损害的风险。
治疗试剂盒
本发明同时也提供了一种药物试齐抱或盒，其含有用本发明所述的药物组 合物的一种或多种成分填充的一个或多个容器。在一个实施方案中，有效量的
长效EPO和药学上可接受的载体可被包装在单剂量瓶或其它容器中。
当本发明所述的药物组合物用于非肠胃给药时，例如，可在冻干的劍牛下 保藏该组合物。因此，试剂盒可以包括冻干组合物、无菌液体载体、和用于注 射的注射器。在一个实施方案中，该试剂盒包括含有足够用于几次治疗的冻干 材料的安瓿，以便施用者可以称出特定量的材料并且加入特定量的载体用于每 次治疗。在另一个实施方案中，试剂盒包括多个安瓿，每个安瓿中都含有特定 量的冻干材料，以及多个容器，每个容器中都含有特定量的载体，以便施用者 只需将一个安瓿和一个载体容器的内容物混合用于每次治疗，而不用测定或称
量。在另一个实施方案中，该试剂盒包括自动注射器，其含有本发明所述的EPO 的注射用溶液。在另一个实施方案中，该试剂盒包括至少一个含有冻干组合物 的安瓿、至少一个含有载体溶液的容器、至少一^t有局部麻醉剂的容器、和 至少一个注射器(或类似物)。安瓿和容器优选是密封的。
当以灌输的方式施用本发明所述的药物组合物时，该试剂盒tt^包括至少 一个含有该药物组合物的安瓿和至少一个含有无菌药物级的水或盐溶液的输液 瓶。
本发明所述的试剂盒也可以包括至少一个口鹏雨管或适用于直接肺部吸入 的特别装置如压力气雾器、喷雾器、或喷洒器。在本发明的这一方面，该试剂 盒可以包括用于直接肺部吸入的装置，其含有该药物组合物，或该装置和至少 一个含有本发明所述长效EPO的7K或油溶液的安瓿。
当本发明所述的长效EPO药物组合物适合于口服、经皮、直肠、阴道、或 鼻腔给药时，该试剂盒优选包括至少一个含有活性成分的安瓿和至少一种给药 辅助物。给药辅助物的例子包括但不限于，称量勺(用于口服)、无菌清洁垫(用
于经皮给药)、和鼻腔吸气器(用于鼻腔给药)。这样的试剂盒可以含有单剂量 的长效EPO (急性治疗)或多剂量的长效EPO (慢性治疗)。
另外，该试剂盒可以配备有一种或多种类型的溶液。例如，本发明所述的
长效EPO药物组合物可以被制备在白蛋白溶液和聚山梨醇酯溶液中。如果试剂
盒含有聚山梨醇酯溶液，"不含白蛋白"的字样优选出现在容器的标签上和试剂 盒的主面板上。
另外，该试剂盒还包括管理药物或生物产品的生产、使用或销售的M机 构所规定的形式的声明，该声明反映了上述机构已经批准用于人体的生产、使 用或销售。
EPO检测it验
本发明也涉及用于确定本发明所述的长效EPOs以及用在本发明所述的几 种药物组合物中的EPO类似物的促红细胞生成能力和组织保护能力的检测方 法。例如，长效EPOs的促红细胞生成活性可以j顿TF-l分析来检测，这将在 实施例2中更详细的描述。EPO化合物的组织保护活性可以使用体外和体内分 析来检测，这将在后面更详细的讨论。另外，预期本发明也包括不仅能用于确 定特定的EPO化合物是否具有组织保护活性，而且也能用于确定该EPO化合 物是否作为内源性EPO的拮抗物的检测方法。
本发明所述的检测方法 设计成在短时间内使用最少量的EPO混合物 来完成。还有，这里提供的检观仿法是非限制的,因为本领域的普通技术人员 育滩理解到其它的用于检测EPO化合物的促红细胞生成活性和组织保护活性的 方法。
促红细胞生成活性检测
特定EPO化合物的促红细胞生成特性，即控制血细胞比容水平的能力，可 以S31多种检观仿法确定。在一个实施方案中，TF1细胞系可以用于确定EPO 化合物是否具有促红细胞生成活性。该细胞可以被沉淀、冲洗、和重悬在浓度 为1毫升105个细胞的培养液中，添加有一定浓度的重组EPO和感兴趣的EPO 化合物。个别培养物可以被维持24小时，同时使用forni扁反应物(CelJTiter; Promega， Madison， WI)来测定细胞的数目。
感兴趣的EPO化合物的活性可以首先通过使用雌性BALA/c小鼠，观察其 对血红蛋白浓度的影响^ia行体内评价。给动物皮下施用500U/kg-bw的EPO、
感兴趣的EPO化合物、或等体积的载体，每周三次给药总共三周(足以观察到 红细胞生成反应的时间间隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血红蛋白的 浓度，就确定它具有促红细胞生成活性。
对活性的进一步评价可以使用TF1红白血病细胞而体外获得。如果TF1细 胞的相对数目超过了对照组，那么感兴趣的EPO化合物就具有促红细胞生成活 性。另外，本领域的普通技术人员知道其它检测促红细胞生成活性的检测方法 也可以使用。例如，欧洲I药典记载了至少两种用于检测EPO化合物的促红细胞 生成活性的方法，其包括组织缺氧小鼠试验及网状细胞逸验.
基于EPO受体的组织保护能力检测
在一个实施方案中，本发明所述的组织保护能力检测是基于EPO的组织保 护性受体。 一旦分离了组织保护性受体的序列，就可以使用各种检测方法来确 定特定EPO化合物的组织保护能力。正如本领域内的普通技术人员已知的那样， 所用的检测的类型主要取决于EPO化合物的重量。
例如，检观仿法可以是竞争性检观蜮三明治检测或空间位阻检测。竞争性 检测^#、于示踪齐跌似物与检观孵本分析物竞争性的结合有限个位于结合配体 上的结合位点。这里，术语"分析物"是指有待于检测其组织保护活性的感兴 趣的EPO化合物。术语"结合配体"是指结合分析物(特别是EPO受体)的 任何蛋白。"示踪剂"是指被标记过的试剂，例如标记的分析物类似物、固定的 分析物类似物、标记过的结合配体、固定的结合配体和空间偶联物。这里的示 踪剂可以具有任何不影响分析物与其结合配体的结合的可被检测到的功能。非 限制的例子包括可被直接检测到的部分(mdety)，如荧光染料、化学发光剂、 和放射性标记物，以及必须被反应或衍生化才能被检测到的部分，如酶。合适 的示踪剂可以是放射性同位素P32、 C4、 I125、 H3、.1131、及其混合物；荧光团， 如稀土螯合物、荧光素、荧光素衍生物、若丹明、若丹明衍生物、丹磺酰氯、 伞形酮萤光素酶(萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利号4,737,456))、 荧光素、2,3-dihydrophthalazinediones、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、
半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、麟化酶(葡萄糖氧化酶、半学L糖氧 化酶、禾噶萄糖-6-磷酸脱氢酶)、与禾,过氧化氢氧化染料前体如HRP、乳过 氧化物酶、微过氧化物酶和其混合物偶联的杂环氧化酶(尿酸酶和黄嘌呤氧化 酶)；生物素/抗生物素蛋白自旋标记物；噬菌体标记；稳定的游离自由基；和 其组合。在一个实施方案中，示踪齐伪辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶中的至少 一种。
本领域技术人员知邀每示踪齐U与蛋白或多肽偶联的方法。例如，偶联剂如 二醛、碳二亚胺、二顺丁烯二酰亚胺、二咪唑、二重氮化对二氨基联苯等可以 用于与上面提到的荧光剂、化学发光剂、和酶标记，行标记，其中一些己在
美国专利号3,940,475和3,645,090中描述，在此全文弓l入作为参考。
在三明治检测方法中，需要进行反应物的固定，也就是将结合配体与游离 在溶液中的任何分析物分离，其可以通过在检测步骤之前沉淀结合配体或分析 物类似物来完成，如同通过共价偶联，如戊二醛交联吸附到不溶于水的基质或 <表面(美国专利号3,720,760)，或在检测步骤之后，通过如免疫沉淀法将配体或 类似物固定。
因此，在竞争性反应之前或之后可以将结合配鄉淀出来(insolubil您)， 并且与结合配体相结合的示踪剂或分析物从没有结合的示踪剂和分析物中分离 出来。分离可以使用倾析(这里结合配体是提前沉淀的)或离心(这里结合配 体是在竞争性反应后沉淀的)。试样分析物的量反比于由标记物质的量所观啶出 来的结合示踪剂的量。可以绘制已知量分析物的齐糧反应曲线，并与试验结果 相比较，以定量确定试样中分析物的量。当使用酶作为示踪剂时，检测方法通 常是指ELISA系统。
在连续三明治检测中，例如，被固定的结合配体用于吸附试验样品分析物， 冲洗去除试验样品，结合的分析物用于吸附标记过的结合配体，然后将残留的 示踪剂与结合的物质分离。结合示踪剂的量正比于试验样品的分析物。在"同 时"三明治检测中，加入标记过的结合配体之前，不需要分离试验样品。
竞争性和三明治检测方法使用相分离步骤作为检测方法的必要部分，但空 间位阻检观仿法在单个反应混合物中进行。另一种竞争性检测方法，称为"同 源"检测，其不需要相分离。在这样的检观仿法中，制备和使用酶与分析物的 偶联物，从而使得当抗分析物连接到分析物上时，抗分析物的存在影响了该酶 的活性。用双功能的有机桥将组织保护受体与酶如过氧化物斷禺联。对与EPO 一起使用的偶ra进行选择，从而使得EPO的结合抑制或增强了标记酶的活性。 这种 的检测方法通常被称为EMT。
空间偶自用于同源检观啲空间位阻方法中。这些偶联物可以M在小分
析物上共价连接一个小分子量的半抗原来合成，从而使得抗半抗原抗体基本不 能与抗分析物同时结合到偶联物上。存在于试验样品中的分析物将结合抗分析 物，从而允许抗半抗原结合到偶rai上，导致了偶联半抗原的特性改变，例如， 当半抗原是荧光团时，荧光性发生变化。
关于组织保护能力的检测的更多信息描述于共同未决的美国专利申请号为
10/188,905，申请日为2002年7月3日的专利以及申请序列号为60/456,891，申 请日为2002年4月25日的专利申请，在此全文引入作为参考。 功能检测
在缺失组织保护受体序列的情况下，EPO的组织保护功能可以由体内和体 外的功能检测来确定。优选地，本领域的普通技术人员进行单独的体外或体内 检测就可以确定EPO化合物的组织保护活性，但在某些情况下需要两者都进行 以确保化合物在体内和体外都表现出相同的组织保护活性。
实践中，本领域的普通技术人员肯^^OT本发明公开的检测方法的组合来 确定具有至少一个增加的^[-连接的 和/或至少一个增加的O-连接的糖链的 EPO类似物是否具有组织保护活性。首先，体外实验如P19细胞和大鼠运动神 经元检测可以用于确定感兴趣的EPO是否具有组织保护活性。然后，体内的检 测如大鼠定点局部缺血模型、荷包牡丹碱抽搐模型、或脊髓损伤模型能够用于 验证体外试验的结果。
本发明的体外模型包含但不限于，那些用来确定，过糖基化的促红细胞 生成素组织保护活性的缺失的模型P19细胞检测、大鼠运动神经元检测、和 cDNA微列阵，其将在后面和实施例2中更加详细的讨论。这些例子是非限制 性的，因为本领域的技术人员己知道其它的适合体外检观啲模型，用于确定EPO 化合物的组织保护活性。总的说来，如果与对照相比，EPO化合物保持或增强 了细胞的存活力，则EPO化合物将被认为是有组织保护活性的。如果与对照相 比，该促红细胞生成素严重影响了检测中细胞的存活力，则其将被认为是拮抗 性的。
A基于P19细胞系的体外检测
在一个实施方案中，体外组织保护活性的检观提基于P19细胞系的。例如， P19细胞可以在添加了 2mM匸谷胱苷月太、100 U/ml的青霉素G、 100 u gtel的 硫酸化链霉素(Gibco)和10%的胎牛血清(Hyclone Laboratories)的DMEM中
保持不分化，其中含有1.2g/lNaHC03lOmM的hepes缓冲液。除了以5ug/ml 的胰岛素、100ug/ml的转移剂(transfernng)、 20nM的黄体酮、100 uM的腐 胺禾口 30nM的Na2Se03 (Sigma)来代替胎牛血清以外，不含血清的培养液中可 以含有上述培养液同样的成分。
将与50。/。的融合剂(confluency )反应的细胞用重组EPO和/或感兴趣的EPO 化合物处理过夜，用胰蛋白酶解离，在不含血清的培养液中冲洗并且置于25cm2 的组织培养瓶中，达到在不含血清的培养液中(或含有预处理添加物)的最终 密度为W细鹏cm2。细胞的存活力M台盼蓝排斥反应来检测。
正如本领域技术人员所熟知的，在未分化的神经元样P19细胞中去除血清 后,加入重组EPO可以阻止细胞的死亡。例如，如果使用的浓度为0.1U/ml到 100U/ml，重组EPO挽救了至多50%的神经元样细胞使之免于死亡。因此，想 要确定感兴趣的EPO化合物具有组织保护活性，其必须相比于对照组挽救更多 的P19细胞使之免于死亡，优选必须挽救约25%到约50%的细胞，最优选为约 40%到约50%的细胞。
B.体外大鼠运动神经元分析
在另一个实施方案中，大鼠运动神经元分析用于体外检测感兴趣的EPO化 合物的组织保护活性。例如，初级运动神经元可以从15天大的SpraugeDawley 大鼠的胚胎的Wli中获得并使用免疫淘选纯化。细胞 以低密度(20000细胞 / cm2)接种在24 mm孔板的盖玻片上，所述24 mm孔板用聚-DL-鸟氨酸 (onnthme)和N-三甲基赖氨酸内盐预先包被，并且含有完全培养液 (Neurobasal、 B27 (2%)、 0.5mML-谷氨醐安、2%的马血清、25uM2-巯基乙 醇、25 uM谷氨酸、1%的青霉素和链霉素，lng/ml的BDNF)。经过一段时间 后，优选约6天，EPO (10U/ml)和感兴趣的EPO化合物(10U/ml)或赋形剂 可以加到培养液中(最々刊t选是在检测存活的神经元细胞密度前约5天)。然后 去除培养液，细胞与含有4%多聚甲醛的PBS混合40分钟，用0.2%的Triton X-100渗透，用含10。/。的小牛血清的PBS封闭，与抗非磷酸化的神经丝(SMI-32; 1: 9000)的抗体温育过夜，并利用二氨基联苯胺ilil抗生物素蛋白-生物素方法 来显影。运动神经元的存活力可以通过SM-32阳性细胞的计数^ia行形态上的 评价。
运动神经元的混合初级培养物在维持培养条件下特征性地经历程序性死 亡。已经表明，在检测细胞数目的5天前向培养液中添加重组EPO (10U/ml)， 在第5天明显的增加了初级运动神经元的数目。因此，被认为具有组织保护活 性，与对照组相比，感兴趣的EPO化合物i^至少挽救了相同数目的运动神经 元。在一个实施方案中，在维持培养割牛下，如果与对照组相比感兴趣的EPO 化合物挽救了更多的运动神经元，那么就认为其具有组织保护活性。
C. 基于cDNA微列阵的体外检观ij
另一种检测感兴趣的EPO化合物的组织保护活性的方法是cDNA微列阵。 这种检测方法可以用于确定EPO和感兴趣的EPO化合物对P19细胞的基因表 达的影响是否不同。A妹分化的P19细胞中分离的mRNA可以显示出不同的基 因调控模式，这是由小鼠1200 cDNA微列阵确定的，其取决于暴露至EPOs的 程度。例如，在P19细胞中1,200基因的表达可以通过使用来自Clontech (Atlasmouse1.2)的尼龙膜列阵来检测。细胞(107/样品)可以用盐水、重组 EPO、感兴趣的EPO化合物(lmU/ml)、或其混合物处理过夜。然后溶解细胞 用于提取RNA或用3小时去除血清(总是存在在预处理时加入的同样的细胞因 子)。ffiil柱层析进行标准总RNA提取之后，j顿柱上DNase处理层析柱，可 以将polyA+RNA纯化出来。随后在[P"]-ATP存在的情况下构建探针。该标记 的探针，优选具有两千万个计数或更多，可以在68"C的条件下杂交到cDNA尼 龙膜丄冲洗该膜并曝光到x光胶片上。放射性信号的强度可以用Phosphor Imager来检测并用Atlas Image 2.0计##1程序(Clontech)来分析。
本发明的体内检测包括但不限于，用于评价EPO化合物的组织保护活性的 检测方法，如定点局部缺血模型和海马(intra-hippoeampal)内荷包牡丹^lt莫型。 另外，用于评价组织保护活性的体内模型包括Wli损伤检测。进一步的，公开 在国际公开号WO/02053580和美国专利公开号2002/0086816和2003/0072737 中的各种检测方法都可以用于本发明。
D. 基于局部缺血模型的体内分析
在一个实施方案中，这种用于检测t寺定EPO化合物的组织保护能力的分析 方法是基于局部缺血模型。例如，雄性Sprague-Dawley大鼠( 250g)可以用 于三血管局部缺血模型。简而言之，使用戊巴比妥(60mg/kg-bw)麻醉大鼠并 且使用水浴保持37。C的核心温度。用两条缝合线结扎右侦顿动脉并切断。■ 右眼眶的喉孔使得中部脑血管可见，这样可以麻醉鼻腔血管的末端。为了在固
定的MCA伤口周围产生半影，用钳子牵引另一侧的颈动脉使其闭塞1小时。
在可逆的颈动脉闭合发作时，可以施用盐水，重组EPO (5000U/kg-bw)或感兴 趣的EPO化合物(5000U/kg-bw)。
24小时后，取下脑部，《OT脑部手术装置(Harvard Apparatus)从，脑 部切下连续的l-mm厚的部分。每一部分然后在含有2%的氯化三苯基四唑的 154mM的NaCl中37"C孵化30射中。受伤的体积可以用计算机图像分析系统 (MCID， Imaging Reseach， St.Catharines， Ontario, Canada)来测定。在这样的 检测中，如果感兴趣的EPO化合物与重组EPO相比，对改善由于大鼠MCA局 部缺血造成的梗塞体积的程度相同或更好，那么就认为其具有神经保护活性。
E.基于海马内的荷包牡丹碱抽搐模型的体内检测
在另一个实施方案中，EPO化合物的组织保护能力可以通过体内的海马内 的荷包牡丹碱实验来检测。例如，雄性Sprangue-Dawley大鼠(250 280g)被 关在恒定温度(23 °C)和相对湿度(60%)的条件下，施用充分的食物和水， 提供固定的12小时的昼/夜循环。在立体定位引导下手术给大鼠植入套管和电 极，按照Vezzani，A.,等,J.NeuroscU9,5054-65(1999)中所述。简要的，使用 Equ他esm(％的戊巴比妥/4%的水合三氯乙醛;3m]/kg i.p.)麻醉大鼠。两个螺旋的 电极位于顶骨皮层的两边，还放入位于鼻窦下的接地线。双极镍镉铁合金线绝 缘电极(60 u m)然后可被植入至ij背面海马(隔膜电购的脑回的两侧，并且可植入 位于硬脑膜顶部单侧的套管(22-规格)用于海马内和脑室内灌输药物。植入电极 的基于前囱的位置坐标应当是(mm)前-后-3.5;两边2.4和3硬脑膜下，4顿压尺 设置在-2.5. Paxinos,G. & Waston,C.,The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates,Academic Press，New Yoik(1986)。电极可以与多孔插座连接(March Electronics,NY)取连接在注射容器上用丙烯斷齿粘合剂保护头骨。
该实验 在动物手术后的3到7天动物完全康复时进行。然后给动物腹 腔施用重组EPO或感兴趣的EPO化合物(都是5000U/kg-bw)或载体，在诱导荷 包牡丹碱发作之前24小时给药一次，诱导前30併中时再给药一次。记录EEG 和脑内药物注射的步骤已经描述在Vezzani， A.，等，J.Pharmacol Exp Ther， 239， 256-63 (1986)。简要的，在开始EEG记录(4道EEG多种波动描写器，型号 BP8， BattagliaRangoni， Bologna， ItaJy)前，动物可以放养在Plexiglass笼子中 (25X25X60)最少10射中。约15到约30併中后，用0.8画1/0.5 u 1的荷包
牡丹碱甲碘化物灌输后，进行持续120併中的EEG记录。所有的注射都是用伸
至接管下方3mm的针头(28-规格)施用于非麻醉大鼠。
可MEEG分析来检测抽搐，此前已经表明其可以提供对药物的抗惊厥活 性的灵敏检测。Vezzani， A.，等，J.Pharmacol Exp Ther， 239， 256-63 (1986)。 出于该检测的目的，抽搐由全部4项记录信息(leads of recordings)中同时发生 的至少两项下述改变组成高频和/或多峰值复合(multispike complex)禾B/或高 电压同步峰值(high voltage synchronized spike)或波浪型活动。可观察到同步峰 值与抽搐相混合。选择用于定量抽搐的参数 是第一次抽搐(抽搐发作)的 潜伏时间，癫痫反应总共消耗的时间(通过将发作事件的持续时间加在一起而 确定；抽搐持续时间)，和在EEG记录期间(抽搐反应)的峰值反应。
使用EEG反应作为读数的海马内荷包牡丹碱抽搐模型已经被证明是药物 的抗抽搐能力的灵敏和特异性的预报手段。Vezzani， A.，等，J.Pharmacol Exp Ther， 239， 256^63 (1986)。因此，要想被认为具有组织保护活性，感兴趣的 EPO化合物应该相比于重组EPO而言相同程度或更大程度地减少了抽搐的频率 和严重程度。
F.基于急性可逆青光眼大鼠模型的体内检测
在本发明的另一种体内检测中，急性可逆青光眼大鼠模型可以用于感兴趣 的特定EPO化合物的组织保护能力的检测。例如，因为视网膜细胞对局部缺血 非常敏感，因此许多这样的细胞在局部缺血胁迫下30分钟后就会死亡。因此， 为了检测外周施用的感兴趣的EPO化合物是否显示足以保护对局部缺血敏感的 细胞的组织保护活性，可以使用急性、可逆青光眼大鼠模型，其描述参见 Rosenbaum等,Vis. Res.37: 3443-51， 1997。特别的，可以注射盐水到成年雄性 大鼠的眼部前腔，并使其压力皿体动脉血压并维持60併中。然后在诱导出局 部缺血之前24小时给大鼠B复腔内施用盐水和5000U EPO/kg体重，并且作为每 日剂量连续施用额外的3天。
治疗后1周可以用视网膜电流描记器可以检测适应了黑暗的大鼠，以确定 感兴趣的EPO化合物是否具有组织保护活性。如果该EPO具有组织保护活性， 相那么比于用盐水治疗的大鼠，在视网膜电流描记中应该有很好的活性保留。
G心肌梗塞检测
心肌麟检观他可以应用于本发明，其用来检测EPO化合物在整体上或特
别在心脏内是否具有组织保护活性。例如，在麻醉大鼠并准备进行冠状动脉结
扎前24小时可以给成年雄性大鼠施用5000U/kg体重的EPO。在程序开始时可 以施用额外剂量的EPO，同时结手LS边的主冠状动脉30^I中然后松开。在处理 后每天施用同样剂量的EPO l周，同时检观伏鼠的心脏功能。接受了空白注射
(盐水)的大鼠将显示出左边末端心脏舒张压的大幅度增加，预示了扩大的、 僵硬的心脏，仅次于心肌梗塞，而对施用了感兴趣的EPO化合物的动物而言， 如果该EPO有组织保护活性的话，那么该动物应当相比于空白对照组表现出未 损伤的心脏功能(显著性差异在P 〈0.01水平)。
H. WIi损伤检测
脊髓损伤检测也可以用于本发明来评价特定的感兴趣EPO化合物的组织
保护活性。特别的，可将大鼠Wli压縮液用于本发明。tte使用体重约为180g
到约300g的W!star大鼠(雌性)。手术前，动物，在手术前绝食12小时，人 性化监禁，并腹腔内注射戊硫代巴比妥钠(40mg/kg-bw)进行麻醉。皮肤渗透 (0.25%的布比卡因)之后，在解剖用显微镜的辅助下，通过2 cm的切口进行 完全单水平(T-3)椎板切除术。创伤性Wft损伤是由硬脑膜外的临时动脉瘤夹 子M31施加在WH上0.6牛顿(65克)的闭合力1分钟而诱导的。取下夹子后， 缝合皮肤的切口，大鼠从麻醉中完全苏醒，再放回到笼子中。使用至少每天两 次的膀胱触诊来监控大鼠直到恢复自发t生的排空。
对照组的动物在缝合切口后迅速的立即施用通常的盐水(通过静脉注射)。 其余的动物静脉施用16毫^g-bw的感兴趣的EPO化合物。然后使用运动比 率值(locomotorratingscaJe)来评价大鼠的运动神经学功能。在这种数iM，动 物的得分范围从0 (没有观察至(j后肢运动)到21 (正常的步态)。由不了解动物 所受治疗的同一个检验人员在损伤后1小时、12小时、12小时、48小时、72 小时、禾口1周，分别观啶大鼠的功能缺失。如果感兴趣的EPO化合物具有组织 保护活性，施用了该EPO的大鼠应当比注射盐水的大鼠更快更好的从损伤中痊 愈。
I. 兔纖局部缺血检测
在另一个实施方案中，将兔wii局部缺血检观,于组织保护能力的检测。
例如，新西兰白兔(36， 8-12月大，雄性)重1.5kg-2.5kg可以用于该检测中。 动物禁食12小时并人性化的管理。麻醉诱导是iW 3%的三氟溴氯乙烷，其分
散在100%的氧气中，并维持于0.5-1.5%的三氟溴氯乙烷，其分散在50%的氧气 和50%的空气混合气体中。将静脉注射用导管(22-规格)插入左耳静脉。在手 术过程中以每小时4ml/kg体重(bw)的速度灌输Ringers乳,溶液。手术前， 静脉注射10 ml/kg-bw的头孢唑林(Cefa2Dline)以预防感染。动物被放置g 边卧姿，用聚乙烯吡酮碘处理皮肤，使用布比卡因(0.25%)渗透，并在平行于 脊骨的第12节处开一侧面的皮肤切口。在切开皮肤和皮下胸腰筋膜后，取出 最长腰肌和腰髂肋肌。通)1^边腹膜后方法暴露腹部动脉，移动到左边的肾动 脉下方一点。 一根PE-60管从左侧肾动脉远端绕住动脉，并且两端都穿过一个 大一点的橡胶管。M拉动PE管，非外伤性的结扎腹部动脉20射中。
在腹部动脉结扎以静脉丸剂形式施用肝素(400IU)。结扎20分钟后，去除 橡胶管和导管，缝合切口并监护动物直到痊愈，同时对动物顺序进行神经学功 能的检测。在解开腹部动脉结扎后立即给对照组动物静脉注射通常的盐水。在 重新灌注后立即给另一组动物静脉注射6.5 u ^kg-bw的感兴趣的EPO化合物 (每组的11=6)。
由不了解动物所受治疗的检测者在重新灌注后1小时、24小时、和48小 时根据Drummond和Moore的标 lia行运动功能评价。每只动物得分为0到4 ， 按如下标准打分0=下肢麻痹，没有明显的后肢运动能力；H氐的后肢运动能 力，仅有微弱的抗重力运动；2=中度的后肢运动能力并具有较强的抗重力能力 但没有从身体下面伸腿的能力；3=很好的运动能力并具有从身体下面伸腿和跳 跃的能力，但不是正常的；4=正常的运动能力。在对下肢麻痹的动物进行每天 两次的人工膀胱排空。
如果感兴趣的EPO化合物具有组织保护活性，那么施用了该EPO的动物 应该相比用盐水注射的动物应该更快更女子的从损伤中痊愈。
如前所述，好几种组织具有EPO受体，从而，可能对EPO的组织保护能 力有所应答。因此，根据感兴趣的EPO化合物的预期临床用途，技术人员旨, 认识到也可以进行涉及这些另外的应答细胞的类似体外检测，皿行涉及到相 应器官的体内检测。例如，基于血清去除的体外检测可以利用心肌、视网膜、 和Leydig细胞以类似于上述用于P19检测的方法鄉行。
体内检测也可以直接用于具体的器官。例如，为了评价EPO对于视网膜细 胞的影响，本领域内普通的技术人员可以进行上述的视网膜局部缺血检测。另
夕卜，为了评价EPO對以物对于心鹏胞的影响，本领域内普通的技术人员可以 容易地改变上述的心机| 检测。本领域的普通技术人员能够选择合适的检测
方法顯莫OT于评1射寺定的EPO对促红细胞生成应答细胞、组织或器官是否具
有组织保护活性。
具体实施方式
实施例
下面所述的实施例仅仅用于解释本发明的ttii实施例，不倉统军释为限制本 发明，本发明的范围是由附加的权禾腰求所限定的。
实施例1:化学修饰的EPO
A. 糖链的氧化
EPO的糖链部分可以使用下述的步骤转化成酸。EPO和足以提供氧化所需 量(高碘酸钠的:1M大，氧化程度越高)的高碘酸钠可以被置于100mM乙酸 钠缓冲液中。然后该溶液冰浴20併中并使用蒸馏水透析。然后从透析管中取出 产物并收集到一个干净的试管里(产物I )。
定量本尼迪特溶液(18g的硫酸铜，100g的碳勝内(无水)，200g的柠檬 酸钾，125g的硫氰勝甲，25g的氰亚铁酸钾)可以用蒸馏水溶解，最终体积为l 升。然后在定量本尼迪特溶液(Quantitative Benedict Solution)中加入几滴甲基
■ii^:。
产物i随后可以被加到该定量本尼迪特溶液中直到溶液的颜色变得澄清，
这表明溶液已完全氧化。然后可以将该溶液去盐并用离心过滤装置(U11rafree CentnfogaJ Filter Unit)浓縮。然后该样品(产物II)可以再进一步用蒸馏7夂透析。
B. 用葡萄糖氧化酶对脱唾液酸形式的EPO进行氧化 50至lj500ug的脱唾液酸形式EPO， 10ixllU/ul的葡萄糖氧化酶，禾口IOO
ul 10mM的磷,内缓冲液可以在15ml的圆锥形离心管中混合(总体积为110 W)。然后该混合物可以在37"C下温育2小时，同时可用蒸馏水充分透析。然 后可以从透析管中取出产物并收集到一个干净的试管里(产物III)。
定量本尼迪特溶液(上述的)可以用蒸馏水溶解至撮终術只为1升。然后 可以在定量本尼迪特溶液加入几滴甲基蓝。
然后产物II坷以加到该定量本尼迪特溶液中，直到溶液的颜色变得澄清， 表明溶液已完全氧化。然后将该溶液去盐并用离心过滤装置(Ultrafree CentrifiigalFilterUnit)浓缩。然后该样品(产物IV)可以再进一步用蒸馏水充皿析。
C. EPO的硫酸化
EP0可以溶解在4。C的N,N-二甲基甲,安(DMF-SA)中。然后加入溶解 在DMF中的N,N，-二环己基碳二亚胺(DCC)，将溶液在4。C的条件下震荡4小 时。可加入碎冰并用ION的NaOH调节pH到7.5。可以调整溶液的体积并在 HN-S2型离心管(DAMONIEC， NeedhamHts.， Massachusettes)中以1000xg 离心15分钟。然后可以将上清液充分透析。更多的有关硫酸化的描述参见 S.Pongor等,Preparation of High-Potency, Non-aggregating Insulins Using a Novel Sulfation Procedure, Diabetes, Vol.32， No. 12， December 1983，在此全文引入作 为参考。
D. 将PEG链连接到EPO上
可以Mil将PEG链连接至愾化的糖歡来{針布EPO，如上述在A中获得 的(产物I )。修饰的程度可以通过调节氧化作用中高碘酸盐的浓度来调控。
制备PEG-EPO偶联产物时可以首先用1 mM -10mM的间高碘酸钠 (Sigma)室温下氧化EPO (24mg/ml在50mM乙酸钠中)30分钟。然后在 100 mM， pH5.4的乙勝内中通过缓冲交换除去磷酸缓冲液。
各种分子量的甲氧基-PEG-翻井(NektarTherapeutics)随后可以以5到100 倍的摩尔过量(多聚物蛋白质)加入。然后可以通过加入15mM的氰化硼氢 化钠(Sigma),在4t:反应过夜M^中间S5tl井连接。获得的偶Ml然后可以用本 领域熟知的技术射歐纯化。
E. 连接PEG链到脱唾液酸的EPO
脱唾液酸形式的EPO可以通过在用半乳糖氧化酶氧化后，将PEG链连接 到新生成的末端半乳糖残基上而进行^t布，如那些在上述B中获得的产物(产 物III)。
重组人类EPO (rhuEPO)可以根据制造商手册用唾液酸酶(Prozyme， Inc) 进行去唾液酸化。化学修饰iM是iM;将反应产物进行SDS聚丙烯醐安 繊电 泳上来确定。染色的产物带应该表明1it布的EPO具有约31kDa的表观分子量， 而未修饰的EPO具有约34kDa的分子量。保留在EPO中的唾液酸{，少于 0.1mol/molEPO。
获得脱唾液酸形式的EPO后，新暴露的EPO (24mg/ml，在10mM的磷
勝内缓冲液中)的半 L糖残基可以用每毫升EPO溶液100单位的半乳糖氧化酶
(Sigma)(溶于PBS中)进行氧化。反应混和物然后在37。C温育2小时。 然后在pH5.4的100mM乙勝内中通过缓冲交换去除磷酸缓冲液。然后将 各种M量的甲基化-PEG-翻井(Nektar Therapeutics)以5至ij 100倍的摩尔过量 (多聚物蛋白质)加入。然后4雄Mil加入15mM的氰化硼氢化钠(Sigma) 进一步减少中间,井连接，在4。C反应过夜。然后可以用本领域熟知的技术併留 /纯化获得的偶糊。
F.连接PEG链到脱唾液酸的EPO
脱唾液酸形式的EPO可以通过在用半乳糖氧化酶氧化后，将PEG链连接 到新生成的末端半乳糖残基上而进行^t布，如那些在，B中获得的产物(产 物III)。
RhuEPO (lmg)可以用唾液酸苷酶(Seikagaku Corporation of Japan,将1U 的冻干粉溶解在100 u L的75mMNaP04 (pH6.5)中)以lmgEPO比0.05单位 唾液酸苷酶(5nL)的比例进行去唾液酸化。然后在混合物中添加5个单位(5 的半乳糖氧化酶(450uL溶角祐75mMNaPO4 (pH6.5) (Sigma)中)。
然后通过缓冲交换在pH5.4的lOOmM乙酸钠中去除磷酸缓冲液。然后向 混合物中加入PEG-NH2 (750舒量，Nektar Therapeutics)和15mM的氰化硼 氢化钠(Sigma)然后在4"C反应过夜。优选地，PEG-NH2加入量为250倍的摩 尔过量(多聚物蛋白质)(80mg的PEG-NH2)。然后用本领域熟知的技术分 馏/纯化获得的偶自。
实施例2.功能检测
A.促红细胞生成险测
一种特定的EPO化合物的促红细胞生成能力，即调控血细胞比容水平的能 力，ilil如下的检测方法确定。
TF]是一种完全依赖于生长因子(包括EPO)的人类红细胞白血病细胞。 Kitamura，等，Blood 73， 375-80。 TF1细胞系从ACTT获得并且用含有211^1^ 谷氨醐安，10mM Hepes， ImM丙酮酸钠，4.5g/L葡萄糖，1.5g/L重碳勝内，5ng/ml GM-CSF，和10。/。胎牛血清的RPM 1640—直保存到实验时。从活性生长期获 得的TF1细胞被沉淀下来，用培养液单多虫冲洗三次，并以lml培养液中含有105 个细胞的浓度重悬浮，其中可以有或没有GM-CSF，并且添加有特定浓度的EPO 或具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少一个增加的O-连接的糖链的
EPO类似物。各培养物保持24小时，{糊forai謹反应物(CellTiter; Promega，
WI)根据制造商手册来确定细胞的数目。
EPO化合物的活性通过观察它对雌性BALB/c小鼠血红蛋白浓度的影响而 首先进行体内评价。给动物皮下施用50OU/kg-bw的EPO，感兴趣的EPO化合 物，或等体积的载体，1周3次总共3周(足以观察到促红细胞生成反应的时间 间隔)。如果EPO化合物提高了小鼠的血清血红蛋白的浓度，那么就认为其具 有促红细胞，舌性。进"^的活性检测iffil在体州吏用TF1红细胞白血病细胞而 获得。石im5角认如果相对TF1细M的增力口舰了对照應，那么就认为EPO具有 鹏加胞4^性。
本领域的普通技术人员知道其它的检观仿法，如组织缺氧小鼠检观仿法和 网状细胞检测方法(欧洲药典)，也适用于本发明以确定促红细胞生成活性。 B.组织保护活性检测
具有至少一个增加的N-连接的糖链和/或至少一个增加的O-连接的糖链的
EPO對以物的组织保护功能ilii如下的方法来检测。
由18天大的大鼠胚胎的海马体构建神经元培养物。AAI囟膜中取出并分离脑 部，分离出海马体。然后细胞分散在2.5%的胰蛋白酶溶液中，在37i:下温育5 併中，然后滴定。细胞悬浮液用不含血清的、含有l%B-27的补充液(Gibco， Rockville， MD， USA)的神经基质(neurobasal)培养液稀释，并以每片盖玻片 80， 000个细胞密度放置在覆盖有多聚鸟苷酸的盖玻片上。细胞然后用EPO过 夜预处理，然后暴露在5uM TMT中24小时，有或没有l) EPO， 2)具有至 少一个增加的N一连接的,和减至少一个增加的O-连接的Hf连的EPO對以物，
或3)脱唾液酸形式的EPO。然后在体夕卜使用介于10到14天的培养物。
可以通过溴化3- (4， 5-二甲基-噻唑-2-基)-2， 5-联苯四唑(MTT)检测 来测定细胞的存活力。Denziot， F.， andLang， R. 1986. Rapid Colormetric Assay for Cell Growth and Survial. Modifications to the tetrazoHum dye procedure giving improved reliability. .//mwmo/A/e欲oA 89:271-277。简言之，将MTT四唑盐溶解 在不含血清的培养液中，至最终浓度为0.75mg/ml并在处理结束时加入到细胞 中，在37"C下3小时。然后去除培养液并用lNHCl:异丙醇(l:24)提取formazan。 在微量培养板读数器上读取560nm处的吸收值。
如在附图1A中描述的那样，具有至少一个增加的N-连接的,和/或至少
一个增加的O-连接的糖链的EPO类似物不具有组织保护功能。
这里描述和要求保护的发明的范围不被本文所公开的具体实施方案所限 制，因为这些具体实施方案仅用于解释本发明的几个方面。任何等价的实施方 案也包含在本发明的范围之内。事实上，除了那些在这里描述的发明以外，本 发明的各种修饰对本领域的普通技术人员来说，在阅读了前面的描述之后将是 显而易见的。这样的修饰也落在了所附的权利要求的范围之内。在此引用的所 有文献为各种目的全文弓i入作为参考。
权利要求
1.比rhuEPO具有更长血清半衰期并包含组织保护功能的促红细胞生成素产品在制备用于调节人类血细胞比容水平的药物中的用途。
2. AX促红细胞生成素产品包括至少一种促红细胞生成素衍生物，其中至少一条N—连接的寡糖链或至少 一条0—连接的 链具有至少一种化学修饰，所述化学修饰来源于氧化、硫 酸化、磷酸化、PEG化、或其混合，并且其中所述促红细胞生成素产品的血清 半衰期比rhuEPO长。
全文摘要
本发明涉及保持内源性促红细胞生成素组织保护活性的长效促红细胞生成素。本发明提供一种通过施用含有化学修饰的长效促红细胞生成素的药物组合物增加个体血细胞比容同时保持了内源性组织保护活性的方法。同时也公开了一种新的化学修饰的长效促红细胞生成素，制备该化学修饰的长效促红细胞生成素的方法，和含有该化学修饰的长效促红细胞生成素的组合物。
文档编号A61K38/18GK101371920SQ20081014908
公开日2009年2月25日 申请日期2003年9月9日 优先权日2002年9月9日
发明者A·切拉米, C·切拉米, J·斯马特, M·布赖恩斯 申请人:沃伦药品公司;肯尼思.S.沃伦研究院