专利名称：：对破伤风类毒素的维生素e补充的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于对生物学物质的免疫反应进行补充的组方。更具体地说，本组方由一种或多种形式的对破伤风类毒素的免疫反应提供补充的维生素E组成。
背景技术：
：目前认为维生素E是描述生育酚(tocopherols)和生育三烯酚(tocotrienols)衍生物生物活性的总称。维生素E是脂溶性的、存在于多种食物中的用于正常的繁殖、肌肉的正常发育、抵抗红血球溶血以及多种生物学功能的必需维生素。维生素E最被普遍公认的功能是其作为抗氧化剂。棕榈原油中维生素E的含量范围在600-1000ppm(partspermillion(百万分之一))之间并且是生育酚(18-22%)和生育三烯酚(78-82%)的混合物。维生素E是一类八个化合物的总称四个生育酚的异构体((x-生育酚、P-生育酚、？生育酚、S-生育酚)和四个生育三烯酚的异构体(cx-生育三烯酚、卩-生育三烯酚、Y-生育三烯酚、5-生育三烯酚)。在结构上，生育酚和生育三烯酚有一些类同之处，其由共同的苯并二氢吡喃醇(chromanol)母核和C-2位置上的侧链组成。有时生育酚和生育三烯酚被共同称作母育酚。然而，生育酚和生育三烯酚由其侧链来区分。生育酚具有饱和的植基侧链；而生育三烯酚具有不饱和的类异戊二烯侧链。已发现生育酚存在于蔬果油(vegetableoils)比如来自卡诺拉(canola)、棉籽(cottonseed)、橄榄(olive)、花生(peanut)、向日葵(sunflower)、大豆(soybean)和向日葵(sunflower)的油中，尤其是种子油中。生物三烯酚的主要来源是植物油(plantsoils)，最丰富的来源是棕榈油(palmoil)、米糠油(ricebranoil)、棕榈仁油(palmkerneloil)和椰子油(coconutoil)。在如燕麦、大麦和黑麦的粮谷中也存在生育三烯酚。随着棕榈油作为国际市场上第二大食用油的出现，科技的进步已能够使人们从目前可在市场上购得的棕榈油中提取生育三烯酚。棕榈油中的生育三烯酚作为氧化剂是生育酚效用的很多倍。生育三烯酚还可以被皮肤每周吸收，从而也适用于作为维生素E霜使用。除了他们作为抗氧化剂的功能，生育三烯酚与生育酚相比还具有独特功能特性。已经表明生育三烯酚能降低心血管疾病的血浆胆固醇水平，以及其它脂质和非脂质相关风险因素(Hood,1996)。还有报道表明生育三烯酚具有抗高胆固醇血症(anti-hypercholesterolemmic)的活性(Qureshi等，1991)。该化合物还显示具有比生育酚更好的抗肿瘤活性(Carroll等，1996)。与通常认为的相反，已观察到在生物体系中，生育三烯酚体外具有比生育酚明显更高的对抗脂质过氧化反应的抗氧化活性(Serbinova等，1991)。目前，商业上将棕榈油中大量存在的生育三烯酚提取为浓縮的生育三烯酚(Enrichedtocotrienols，ET)。生育酚和生育三烯酚其抗氧化活性已被充分地认识了，并且在许多局部用制剂尤其是化妆品中也得到了充分的应用。加入到这些局部用制剂中的生育酚和生育三烯酚的百分含量很低，通常低于0.1%。生育三烯酚和生育酚在结构上几乎相似，局部用制剂中使用生育酚(维生素E)己经有很多年了。因此，低浓度生育三烯酚的使用不会造成任何不良皮肤反应的风险。破伤风类毒素是引发人长期持久的免疫性的有效免疫原(Shnonsen等，1986)。破伤风接种疫苗对全世界范围的成人和婴儿的破伤风感染发病率产生了革命性的影响。破伤风疫苗相关免疫与中和破伤风类毒素免疫球蛋白G(IgG)抗体的生成有关(Simonsen等，1986)。这些抗体的水平可以通过使用国际标准来定量，因而为研究补充生育三烯酚后疫苗的保护活性提供了有用的模型。维生素E是一种主要为脂溶性的抗氧化剂，其可以清除生物膜中的自由基并保护细胞结构以抵抗氧化损害。一些研究表明，补充维生素E、生育酚和生育三烯酚对动物和人的免疫系统产生了有利的影响，并且还揭示其能降低一些免疫和炎症疾病的风险。在本发明中，发明人检测了小鼠模型中口服给予生育三烯酚和生育酚对免疫原性威胁下的免疫调节的影响，然后研究了补充富含生育三烯酚的组分(tocotrienolrichfraction，TRF)对免疫系统接受了加强的破伤风类毒素(TT)疫苗的正常健康志愿者的免疫调节的影响。本发明通过使用维生素E增进对破伤风免疫反应的补充从而克服了现有技术中存在的问题。本发明的目的是公开补充维生素E对哺乳动物免疫调节的影响，其中，该哺乳动物接种了破伤风类毒素疫苗。此外，本发明还涉及补充不同类型的维生素E比如富含生育三烯酚的组分、S-生育三烯酚和ct-生育酚对破伤风类毒素接种疫苗的免疫反应的影响。
发明内容因此，本发明的目的涉及用于对生物活性物质的免疫反应进行补充的组方，所述组方包含维生素E(优选富含生育三烯酚的组分(TRF))。所述组方能够用作对破伤风类毒素接种疫苗免疫反应的补充剂。除此之外，富含生育三烯酚的组分(TRF)优选选自由a-生育三烯酚、5-生育三烯酚、Y-生育三烯酚和(x-生育酚组成的群组。本发明的另一个方面涉及该组方用于制造对免疫反应进行补充的药物的用途，其中，该组方用于增强哺乳动物的免疫反应。在本发明的另一个实施例中，说明了一种用于增强人免疫反应的方法，其中，该方法包含给予所述需要增强免疫反应的人有效量的上述组方。此外，本发明还涉及包含内含能有效激活人体对破伤风类毒素接种疫苗的免疫反应的组方的包装材料以及包含标示该组方能用于增强免疫反应的标签的包装材料的制品，其中，该组方优选用作药物组合物。图1表示说明整个试验中参与者的分布和保持的流程图。图2表示每天补充维生素E的不同异构体56天的小鼠脂肪组织中总的维生素E的浓度。图3表示每天补充维生素E的不同异构体56天的小鼠脂肪组织中(X-生育酚和生育三烯酚的浓度。图4表示比较对照组和补充维生素E组小鼠之间总的免疫球蛋白抗-TT滴度的柱状图。图5表示TT-免疫的小鼠中补充维生素E对有丝分裂原(刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS))以及抗原剌激的(TT)脾细胞增殖的影响。图6表示补充维生素E对刀豆球蛋白A或破伤风类毒素剌激的脾细胞的干扰素(IFN)-Y生成的影响。图7表示补充维生素E对刀豆球蛋白A或破伤风类毒素刺激的脾细胞白细胞介素-4(IL-4)生成的影响。图8表示补充维生素E对脂多糖刺激的脾细胞肿瘤坏死因子(TNF)-a生成的影响。图9表示对照组和实验组志愿者血浆中总维生素E的浓度。图IO表示对照组和实验组志愿者血浆中总的(x-生育酚的浓度。图11表示对照组和实验组志愿者血浆中生育三烯酚的浓度。图12表示补充TRF对刀豆球蛋白A刺激的外周血单个核细胞(PBMC)干扰素-Y生成的影响。图13表示补充TRF对破伤风类毒素刺激的外周血单个核细胞干扰素-Y生成的影响。图14表示补充TRF对刀豆球蛋白A刺激的外周血单个核细胞白细胞介素-4生成的影响。图15表示补充TRF对破伤风类毒素刺激的外周血单个核细胞白细胞介素-4生成的影响。图16表示补充TRF对脂多糖刺激的外周血单个核细胞白细胞介素-6(IL國6)生成的影响。图17表示补充TRF对刀豆球蛋白A剌激的外周血单个核细胞白细胞介素-10(IL-10)生成的影响。图18表示补充TRF对破伤风类毒素剌激的外周血单个核细胞白细胞介素-10生成的影响。图19表示比较补充安慰剂和补充TRF的志愿者之间的总的免疫球蛋白(Ig)抗-TT滴度的柱状图。图20表示比较补充安慰剂和补充TRF的志愿者之间的抗-TT免疫球蛋白G(IgG)浓度的柱状图。图21表示比较补充TRF或安慰剂的健康志愿者之间总的T-淋巴细胞百分数的散点图。具体实施方式定义在详细说明本发明之前，应该理解本发明不仅限于特定的组方类型、制造方法等等，这些都可以变化。还应该理解这里使用的术语仅是为了描述特定的实施例，不用于限定。术语活性剂的"有效量"表示活性剂不产生毒性而又足以提供所需有益效果的量。更具体地说，通过"有效治疗"的量表示有益制剂不产生毒性而又足以提供所需治疗或药妆品效果的量。术语"免疫系统的激活"表示各种各样情形的改善，其中人的免疫系统应该达到更高程度的机能，包括增强所述人的免疫系统和病程的縮短。说明书和权利要求书中使用的术语"包含"表示"至少部分由…组成"。参照后面的附图和实施例，将对本发明进行详细地说明。下面提供的实施例仅供说明的目的，而并非有意限制本发明。(实施本发明的最佳方式)实施例一用于补充小鼠的维生素E富含生育三烯酚的组分(TRF)、a-生育酚(a-T)(黄金希望种植公司，马来西亚)和5-生育三烯酚(5-丁3)(Isei，日本)的浓縮物；25号管饲针(Interfocus，英国)，大豆油(马佐拉，马来西亚)。小鼠血液收集和免疫肝素化的微血球容量计毛细管(美国飞世尔科学世界公司(FisherScientificInternational)，美国)；1.5ml微量离心管(爱思进(Axygen),美国)；肝素钠(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，美国)；二乙醚(西格玛奥德里奇，美国)；吸附明矾的破伤风疫苗(alum-adsorbedtetanustoxoidvaccine)(印度尼西亚万隆生物医药公司(Biofarma));1ml结核菌素注射器(碧迪(BectonDickinson),美国新泽西)；26号无菌针(泰尔茂公司(TerumoCorp)，菲律宾)。四甲基偶氮唑蓝(MethylThiazoleTetrazolium,MTT)法MTT试剂盒(美国化工(Chemicon)，美国)；96孔平底组织培养板(Nunc,美国)；多道移液器(LabMate，美国)。志愿者的身体检査血压测量计(Spirit,台湾)；Littman⑧听诊器(3M,英国)；电子计重秤(SECA，德国汉堡)收集志愿者血液10mL和5mL无菌注射器(碧迪，新加坡)；25、23和21号无菌针(泰尔茂公司，菲律宾)；棉球；止血带；无菌酒精湿巾(碧迪，美国新泽西)；无菌弹性绷带；一次性乳胶检査手套(SE有限公司(SESdnBhd)，马来西亚)；5mL肝素管(碧迪，美国新泽西)；5mL无菌真空采血促凝管；3mL乙二胺四乙酸(EDTA)管；3mL氟化钠管(碧迪，美国新泽西)；标本袋和盒(由PATHLAB提供)。破伤风类毒素接种疫苗lmL无菌结核菌素针(碧迪，新加坡)；破伤风类毒素(TT)疫苗(印度尼西亚生物医药公司(Biofarma);批号ATT073BA2006/2007)。流式细胞测量术5mL聚苯乙烯圆底管Falcon2054(碧迪，美国新泽西)；溶血素(FACSLysingsolution)(碧迪，美国新泽西)；三色检验试剂套组(TriTESTreagents)，比如三色检验试剂CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP、三色检验试剂CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP、三色检验试剂CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP以及三色检验试剂CD3FITC/CD16+CD56PE/CD45PerCP(碧迪，美国新泽西)。淋巴细胞培养红细胞裂解液(RBCLysisBuffer)"Bioscience,美国)；15mL和50rnL聚丙烯锥形管Falcon2097(Greiner，美国)；含L-谷氨酸的RPMI1640培养基(Gibco，InvitrogenCorp,新西兰)；冻干的刀豆蛋白A(Sigma-AldrichInc，美国密苏里州)；冻干的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)(Sigma-AldrichInc，美国密苏里州)；冻干的破伤风类毒素(TT)(Calbiochem，德国)；0.4%的台盼蓝染液(Gibco,InvitrogenCorp,新西兰)；青霉素-链霉素(Gibco，InvitrogenCorp,新西兰)；10。/o的胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)(Gibco，InvitrogenCorp，新西兰)；96孔平底组织培养板(Nunc,美国)；Neubauer血细胞计数器(Dynatech，德国)；手持式计数器(高野(Togoshi)，日本)。酶联免疫吸附坝!l定(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA)96孔平底的具有Maxisorp表面的NUNC高结合力免疫板(Nunc,美国)；磷酸缓冲盐(Phosphatebufferedsaline,PBS)片(Sigma-AldrichInc,美国密苏里州)；吐温20(MPBiomedicalsInc.,美国俄亥俄州)；用于人的干扰素-Y、白介素-4、白介素-6和白介素-10的ELISA试剂盒(eBioscience，美国加利福尼亚州)；用于小鼠的干扰素卞白介素-4和干扰素-a的ELISA试剂盒(eBioscience，美国加利福尼亚州)；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG+A+M(H+L)、辣根过氧化物酶标记羊抗人igG(H+L)(Zymed-Invitrogen，美国加利福尼亚州)；3,3',5，5'-四甲基联苯胺(3,3',5，5'-tetmmethylbenzidineTMB)底物(BectonDickinson,美国新泽西)；2M硫酸(Sigma-AldrichInc，美国密苏里州)；人IgG检测试剂盒(ImmunobiologicalLaboratories,德国汉堡)。高效液相色谱(HPLC)分析己烷、乙醇、异丙醇和0.9%的氯化钠(分子生物学级别-PromegaCorp，美国威斯康星州);15ml聚丙烯锥形管Falcon2097(Greiner,美国)。方法(动物实验)维生素E富含生育三烯酚的组分(TRF)和cx-生育酚((x-T)的浓縮物得自马来西亚的黄金希望种植公司(GoldenHopePlantation)。3-生育三烯酚(3-丁3)购自日本的Isd。各异构体的纯度约为97%。TRF组合物的比例包括32%的a-生育酚、25%的a-生育三烯酚、29%的y-生育三烯酚和14%的5-生育三烯酚。然后，将该异构体的浓縮物用大豆油制备成终浓度为20mg/ml的乳液。将大豆油用作a-T、5-T3和TRF浓縮物的溶剂是因为这种油缺乏生育三烯酚并且与其它油比如向日葵、红花和玉米油相比，具有低的维生素E活性(Grela和Gunter，1995)。在本实验中，我们只能将TRF和5-T3的活性与维生素E、a-T的黄金标准(goldstandard)相比较，因为生育三烯酚的其它种纯化形式(即(x-T3和，T3)在本实验中无法得到。雌性BALB/c小鼠(6周龄)购自(马来西亚吉隆坡)医学研究院(InstituteofMedicalResearch)并在稳定的气候和饮食条件下、饲养于马来西亚棕榈油委员会(MalaysianPalmOilBoard)(Bangi，马来西亚)动物房。为了降低公知的由小鼠的年龄、性别和品系对免疫反应产生影响而引起的变化(Shaikh等，1993)，在该项动物实验中，仅使用年幼的雌性BALB/c小鼠。选择雌性的BALB/c品系的原因只是因为这些动物是动物实验中最常用的近交系小鼠(Iwata等,2007)。实验设计将20只雌性BALB/c小鼠分成四组，每组5只。每组小鼠每天喂饲50^iL(lmg)的TRF、a-T或5-T3，共两个月。在本试验中，对照组的小鼠不接受任何的补充剂，也不喂饲大豆油。基于我们初步实验的结果，短期(2个月)补充喂食大豆油动物与未补充喂食的动物相比，既没有改变免疫参数，也没有改变脂肪组织中总的维生素E累积量。这个结果可以让人信服，因为大豆油已经被研究表明其具有低的维生素E活性(Grela和Gunter,1995)，并且这些动物8周(2个月)每天仅喂养很少量的油(5(VL的大豆油)。另外有四个不接受任何补充剂或接种疫苗的空白鼠被分组为阴性对照并于0天处死，以在本实验开始前建立基线免疫参数。本实验得到国际医药大学科研伦理委员会(ResearchandEthicsCommitteesoftheInternationalMedicalUniversity)的批准。对动物的饲养和处理是严格按照国际医药大学科研伦理委员会提供的指南进行的。破伤风类毒素接种疫苗所有的动物在第14天时用lOOpL即4Lf/mL的吸附明矾的破伤风类毒素(TT)疫苗(Biofarma，印度尼西亚)免疫(见表1)。在每只小鼠的左后腿四头肌肌注TT疫苗。在28天和42天时给予加强剂量的TT疫苗。如Gileadi等所报道(2002)的动物实验标准免疫方式，所有的动物均最初在第14天时给予TT疫苗，并每隔两周给予加强共两次。在所有的免疫中，小鼠用二乙醚轻微麻醉。在0天(基线)、28天(第一次免疫后两周)和56天(第三次免疫后两周)时进行眼球后采血得血清样品。完成免疫后，在第56天处死前，所有的实验动物用补充剂再喂养两周。收集处死后动物的血液、脾和脂肪组织以供各种试验。表l小鼠的免疫方案及实验设计<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>g:收集血清样品；TT:TT接种疫苗；56天时从动物中分离脾和脂肪组织。脾细胞增殖实验将处死老鼠的脾无菌转移到含培养基(含5%(Wv)胎牛血清、30(Hig/mLL-谷氨酸和100IU/mL青霉素、100jag/mL链霉素的完全RPMI-1640)的皮氏培养皿中。通过轻微破坏脾被膜使脾细胞从脾中脱离出。接着，从脾中轻轻地挑出脾细胞。将脾的混悬液放置室温约一分钟，使团块沉到管底。然后将含单细胞的脾细胞混悬液的上清液转移到新管中。通过离心回收脾细胞(1200转/分钟，4。C离心10min)。根据制造商推荐的方案，用裂解液"Bioscience,加拿大圣地亚哥)将脾红细胞溶解。再通过离心(1200转/分钟，4。C离心10min)回收白细胞。然后将白细胞重新悬浮在RPMI-1640完全培养基中。使用细胞计数器对细胞计数。采用台盼蓝染料排除技术在计数过程中促进排除死亡细胞。接着，用培养基将脾细胞混悬液调整为每毫升含1x107个细胞。然后将该细胞混悬液分成三管。在上述管的每管中加入有丝分裂原或者特殊的抗原。用到的有丝分裂原为各lng/mL浓度的刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)，用到的特殊抗原是lOpg/mL的纯破伤风类毒素(TT)。将100微升的上述脾细胞混悬液置于96孔板中，于37°C、潮湿的、含5%C02的培养箱中培养72小时。用MTT法测定脾细胞的增殖，同时用ELISA测定这些细胞分泌的细胞因子。四甲基偶氮唑蓝(mtt)法使用MTT法测定脾细胞的增殖(Hansen等，1989)，其测定3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑变成甲瓚结晶的减少量。在本方法中，通过活细胞线粒体脱氢酶的作用，黄色的MTT溶液将变成紫色的甲瓒产物。将100微升的脾细胞液(1x107细胞/毫升)接种三份在平底96孔板中，并在含有或不含有lng/mLConA或LPS或10pg/mLTT的情况下培养。37°C、5%C02下培养72小时后，用5mg/mL的MTT试剂将细胞培养四小时。然后加入O.lmL的盐酸，将甲瓒沉淀物溶解于异丙醇中，并通过反复吸液将其彻底混匀。在570nm波长下，使用酶标仪来定量细胞增殖。细胞因子分析培养72小时后，将四孔中的脾细胞培养上清液倒入1.5mL的微量离心管中。离心(12000转/分钟，4。C离心10分钟)上述管，弃掉细胞碎片。将培养上清液转移到新的无菌微量离心管中，并在ELISA分析之前将其储存于-80。C。使用商品化的小鼠细胞因子酶联免疫试剂盒，根据厂商说明(eBiosdence,加拿大圣地亚哥)检测无细胞培养上清液中各种细胞因子(IFN-y、IL-4和TNF-a)的浓度。简言之，在无菌96孔板(Nunc，美国)的每孔加入100^iL相应的包被抗体(例如，抗-IFN-y、抗-IL-4或抗-TNF-a)。将板密封，4°C培养过夜。接着，将板中内容物弃掉，用缓冲洗液(PBS和0.05%吐温-20)将孔清洗三次。第三次清洗过后，将板倒置，置于吸水纸上，除去残留的缓冲洗液。然后，每孔加200^iL商家提供的分析稀释液封闭。将板盖住并于暗处、室温下培养一小时。培养期过后，吸出封闭缓冲液，按之前所述方法洗涤板。将储存于-80。C的脾细胞培养上清液解冻。然后将100的该培养上清液加到检测孔中作为复样。阴性对照孔每孔含100)iL的分析稀释液，阳性对照由商家提供的纯标准细胞因子的滴度组成。每套ELISA试剂盒都有已知浓度的纯细胞因子样品。使用分析稀释液将每孔100微升的相应细胞因子(IFN-Y、IL-4或TNF-a)的最高标准溶液梯度稀释。然后盖住上述板，室温下培养两小时。接着，将板中内容物弃掉，洗涤板。按厂家所推荐的，用分析稀释液将检测抗体和抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)反应物(厂家提供)稀释。然后向所有孔中加入100pL上述溶液。盖上板，暗处培养一小时。接着，吸出板中内容物，洗板七次。在最后一个洗涤周期中，在吸出缓冲液之前，洗涤液浸洗孔一分钟。然后，在所有96个孔中都加入100的TMB底物溶液。室温下培养板十分钟以使颜色发生变化，在所有96孔中都加入40的2M硫酸以终止反应。450nm波长下，使用酶标仪读取吸光度值。生成的细胞因子数量以pg/mL表示，每种细胞因子ELISA试剂盒的检测限为8pg/mL。阴性对照孔的细胞因子水平通常检测不出。实验孔的细胞因子值减去阴性对照孔的细胞因子值。血清抗-TT抗体滴度的检测通过使用ELISA的终点滴定来检测小鼠血清中的抗-TT抗体并确定其数量。简言之，在96孔ELISA板的每孔加入100nL3jag/mL的TT碳酸盐缓冲液(pH9.2)溶液，4°C培养过夜。随后，用ELISA洗涤液(含0.05%吐温-20的PBS)洗涤板三次。洗涤后，用200pL的ELISA封闭缓冲液(含1%(w/v)牛血清蛋白的PBS)在室温下将板封闭一小时。然后用洗涤液洗板五次。然后将100pL的实验样品加入该板，重复两孔。以1:200的血清开始，采用两倍梯度稀释法用封闭缓冲液对补充过维生素E的动物和对照组血清样品进行梯度稀释。0天的空白鼠血清用作本实验的阴性对照。室温下培养板两小时。两小时后，洗板五次，所有孔中加入100jiL结合有辣根过氧化物(1:4000稀释)的抗-小鼠免疫球蛋白(Ig)。37°C培养60分钟后，洗板五次，所有孔中加入100jiL的3，3',5，5'-四甲基联苯胺(TMB)底物。使颜色产生变化，通过向所有孔中加入50pL2M的硫酸来终止反应。450nm下，使用酶标仪读取吸光度值。如前所述，Ig滴度以稀释度的倒数表示，给出吸收度值^0.45(Sneath等，1987)。从小鼠脂肪组织中提取维生素E将约0.5g的小鼠脂肪组织置于15mL离心管中，与正己烷、乙醇和0.9%氯化钠(4:1:1的比率)的混合液在10000转/分钟下匀质五分钟，或者使用组织匀浆仪直到组织变为液体形式。然后在2000转/分钟下，将该组织匀浆离心10分钟。将包含油脂的上清相转移到5mL的小瓶，氮气下干燥。仅在使用前将所得样品置适量的正己烷(500至2ml)中，通过高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)进行分析。HPLC分析使用LC-10AT型HPLC系统完成HPLC分析，该系统由岛津RF-10AXL型荧光分光光度计、色谱柱室和岛津ClassVP数据采集软件。HPLC色谱柱为YMCA-012型、5pm、150mmx6mm的硅胶柱。荧光检测器的激发波长和发射波长分别为295和325nm。流动相为正己垸-异丙醇(99.5/0.5，体积/体积)，流速为2mL/min。进样体积10pL，并将a-生育酚、a-、，和5-生育三烯酚混在一起的标准溶液注入系统。将样品中组分的峰面积与标准液的峰面积进行比较，并用于定量计算。统计学分析数据用平均值士标准差(S.D.)来表示，其中，n是所使用小鼠的数量。在所有的实验中，对脾细胞单独评价(即，没有合并)。同样，每只小鼠的血清也是单独检验。使用裂区方差分析(split-plotanalysisofvariance,SPANOVA)、单因素方差分析(one-wayANOVA)、(接着是事后Tukey，s成对比较)，或是使用Student'st-检验来确定对照组和实验组动物(a-T、S-T3和TRF)之间的显著性意义，其中，将尸<0.05设置为可接受的具有显著的统计学差异的水平。方法(临床试验)实验设计临床试验得到国际医科大学科研伦理委员会的批准，并遵照马来西亚的药品临床试验管理规范(GoodClinicalPractice,GCP)指导原则。本试验是随机的双盲安慰剂对照试验。志愿者招自马来西亚普渡大学(UniversitiPutraMalaysia,UPM)工程系第^^一住宿学院。从该学校选择志愿者缘于他们理想的年龄组(18-25岁)。在动物试验中，给予所有小鼠三次剂量的破伤风类毒素免疫，因为在本试验开始之前没有观察到动物有破伤风抗原(即，非三倍剂量的TT接种疫苗)，同样地，给予他们三次剂量的TT疫苗(每隔两周一次剂量)，作为标准的接种疫苗程序的一部分。志愿者的筛选在常规的体检和病史采集后，从每个志愿者抽取7ml的血液，并将该样品送至被认可的医学实验室(PATHLAB，马来西亚)用于各种生化检验，比如空腹血糖水平、血肌酐、包括总胆固醇、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)胆固醇、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)胆固醇、甘油三酸酯(triglycerides)、总HDL比率的总脂分布、肝功能检验即血清谷草转氨酶(serumglutamicoxaloacetictransaminase，SGOT)和血清谷丙转氨酶(serumglutamicpyruvictransaminase,SGPT)以及总胆红素。在本试验的0天、28天和56天时，使用标准的静脉穿刺技术(《护理标准》，1999;http:〃www.gp國tmining.net/protocol/nurse/venepunc.html，2005)采集血液。还要采集志愿者尿样用来进行孕检。要求志愿者在采血做生化检验的前一天晚上禁食10-12小时。在试验结束(56天)时再次测定同样的生化参数，主要目的是确保所有志愿者应用补充剂后肾和肝功能是正常的。志愿者的招募经选中的志愿者被随机分组为每天服用安慰剂(对照组)或400mg的TRF补充剂(试验组)。在本试验中使用区组随机化法(blockrandomizationscheme)。所有的108名试验参与者以1:1的比率平等地配发瓶装的TRF或者安慰剂胶囊。在整个试验中使用两种标以数字1和数字2的相同的瓶子。对于每个参与者，研究者会以交替的方式挑选两种瓶子的一种(即，第一个参与者分到瓶l，第二个参与者分到瓶2，等等)并将挑选的瓶号记录在试验参与者的档案中。在本发明的实施期间，为了使志愿者卡路里的摄取一致并使饮食对维生素E的整体吸收的影响降到最小，给予志愿者标准的推荐饮食清单的一日三餐。在工作日，参与者到指定地点吃早餐并带走他们的午餐。每日的晚餐由大学餐厅提供。所有的膳食均在大学餐厅准备。在最初的一个月期间，治疗组的六名志愿组和安慰剂组的两名志愿者退出实验。所有的志愿者在基线(0天)、28天和56天采血。每次访问时，通过计算药丸数检査依从性。图1表示本发明整个过程中志愿者的分布和保持。在实验结束时，将从每位志愿者的血液样品分析中收集的数据计算到数据库(MicrosoftExcel,2003)中并使用WindowsSPSS(11.0版本，SPSS公司，伊力诺依州芝加哥)完成统计学分析。补充剂在本试验中使用的TRF补充剂是由Hovid有限公司(怡保，马来西亚)制造的TocovidSupraBio。Tocovid软胶囊的组成成分包括生育三烯酚和oi-生育酚的混合物(见表2)。混合的生育三烯酚(TRF)胶囊每粒含200mg的补充剂，而安慰剂胶囊由完全缺乏维生素E的棕榈油精(食用油)制成。表2:TRF补充剂的生育三烯酚和生育酚组成<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>补充剂的服用在本试验的0天开始，要求志愿者服用他们每日的维生素E补充剂或安慰剂，共8周。指示他们每天最好与午餐或晚餐一起服用两粒胶囊以促进依从，试验组的补充剂口服剂量是每日400mg的混合生育三烯酚。破伤风类毒素(TT)接种疫苗由注册护士将TT疫苗(Biofarma，批号ATT073BA2006/2007)肌肉注射至非优势臂的三角肌。使用的剂量为最终体积为0.5mL的20个絮凝单位(Lf)的TT疫苗。在免疫期间以及本试验过程中没有发生与疫苗相关的严重不良事件。血液样品的采集在筛选当天以及0天、28天和56天时，由注册护士或医生从健康志愿者采集血液样品。使用连接至真空管夹持器的蝶形或10mL塑料注射器做静脉穿刺。基于将要对血液样品实施的检验，将血液样品采集到不同类型的采血管，并将管充满。血液采集后，将管倒置三次以使血液与凝块激活剂或抗凝血剂适当混合。在本试验中使用的采血管类型示于表3中。所有的采血管均在产品有效期前使用。表3:血液采集所使用的管采血管的类型天筛选前02856凝块激活剂管(5ml)l管一—l管乙二胺四乙酸(EDTA)管(3ml)l管一一l管氟化钠管(3ml)l管一—l管肝素化管(5ml)-2管2管2管外周血白细胞的分离采用血红细胞(redbloodcell,RBC)裂解技术从肝素化的健康志愿者血中分离外周血白细胞(PBL)。在先前优化试验的指导下，确定1mL血的白细胞足够用于本试验将进行的增殖和细胞因子分析。约lmL肝素化的志愿者血装于标示为15mL的圆锥管。然后向含有血液样品的每个管中加入大约3mL的RBC裂解缓冲液，将管盖上盖子，倒置四次直到混合物混合均匀，室温下培养3分钟，进行RBC裂解反应。通过加入冰冷的PBS终止反应，4°C、4000转每分钟离心十分钟。离心后，弃掉上面的红色上清液，用冰冷的PBS洗涤细胞一次。重复离心步骤，将含白细胞的球团重新悬浮于5mL的含5%(体积/体积)FBS、1%的青霉素、链霉素和L-谷氨酸盐的完全RPMI-1640中。轻轻地拍打管使管底的细胞变得松散，并将管缓缓倒置以形成细胞混悬液。将上述管置于冰中并使用血球计进行细胞计数。在0、28和56天进行血白细胞培养。外周血白细胞的计数以及增殖使用血球计对所有样品分别进行存活血白细胞的计数。使用台盼蓝排除法来鉴别死细胞。在无菌的1.5mL艾本多夫管(Eppendorftubes)中，将100的细胞混悬液加到900pL的完全RPMI中，对白细胞混悬液进行十倍稀释。然后向管中加入40(iL的台盼蓝染色液(0.4%)，将管倒置几次以使溶液混合。吸取约10pL的细胞混悬液到血球计载物片的计数池，计数未染色的活细胞数目。计算活的白细胞数目，并用培养基(RPMI1640)对细胞混悬液的体积进行调整得到最终的细胞浓度为lxl(^细胞/毫升。将白细胞以lxl(^细胞/孔接种于96孔板中，分别用1pg/mL的ConA或LPS或者10jig/mL的TT剌激细胞。于37°C下、5%C02的潮湿环境中培养72小时。三天后收获外周血白细胞培养物。elisa培养72小时后，将孔中的外周血白细胞培养上清液倒入1.5mL的微量离心管中。将管离心(4T、12000转/分钟离心10分钟)除去细胞碎片。将培养上清液转移到新的无菌微量离心管中，并在ELISA之前储存于-80。C。使用商业的ELISA试剂盒(eBioscience，加拿大圣地亚哥)、根据厂家说明书完成对人外周血白细胞(PBLs)培养上清液中的IFN-y、IL-4、IL-6和IL-10评价。IFN-y和IL-6的检测灵敏限度分别8pg/mL和1pg/mL。IL-4和IL-10的检测限均为4pg/mL。0天、28天和56天采集的血桨中总的抗-TTIg滴度也使用ELISA测定。将血液样品采集在肝素化管中，并于室温、2000转每分钟下旋转十分钟。将血浆从沉淀的红细胞中分离并转移到无菌的1.5mL离心管中。血浆样品使用两倍的梯度稀释从1:400开始用分析稀释液梯度稀释。将采自作为阴性对照的无免疫志愿者的血清用作血清总的Ig滴度。将血浆样品培养两小时后，洗涤ELISA板，并以1:5000的稀释比加入结合有山羊-抗人Ig的HRP。培养60分钟后五次洗板，加入100pL的TMB底物，当完成颜色的变化时，加入2M的硫酸(50^L/孔)终止反应。在450nm波长下，使用酶标仪读取板的数值，总的Ig滴度以稀释度的倒数表示，给出吸光度值^0.45。然后使用抗破伤风人IgGELISA试剂盒(IBL，汉堡)对已知Ig滴度的血浆样品进行分析以确定样品中IgG(IU/mL)的浓度。在IgG微孔板中包被有灭活的破伤风类毒素抗原。厂家的校验仪(5-40IU/mL范围内的浓度)和阴性对照每板重复运转两次。使用校验仪的标准曲线计算样品中IgG的浓度。血液白细胞染色将分别采自O天、28天和56天的自愿者血液各约1mL采集到无菌的K3EDTA￥八0^八1顺尺@采血管中用于流式细胞术分析。根据厂家推荐的方法，使用四种不同类型的三色检验试剂(见表4)，即CD4、CD8、CD19、CD16+CD56抗体(BectonDickinson,美国新泽西)对血液样品进行染色。所有的四种抗体均含有免疫荧光试剂，具体说是异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)标识的CD3和多甲藻叶绿素蛋白(peridininchlorophyllprotein,PerCP)标识的CD45抗体。CD3抗体鉴别成熟的人T-淋巴细胞(CD3+)和T-细胞抗原受体(TCR)的复合体(Brenner等，1986)，而CD45抗体识别人白细胞抗原(HLA)(Schmidt,1989)。为每份血液样品准备四只圆底的无菌Falcon管。然后吸取不同的三色检验试剂各20微升至各个管底(见表4)。接着，吸取50pL充分混合的抗凝全血至各份血液样品的所有四管的底部。为管盖上盖子并轻轻地在底部拍打以使抗体和血细胞彻底混合。然后室温下在暗处将管培养15分钟。在室温下进行培养是为了减少据报道的当样品受冷-暖温度改变时发生的白细胞表面抗原表达的变化(ForsythandLevinsky，1990;Repo等，1995)。培养后，向各管中加入450pL的lxFACS裂解液。为管盖上盖子，在底部轻轻地拍打使其混匀。置管于暗处再培养15分钟。接着，采用流式细胞仪立即分析样品。表4:流式细胞术分析中使用的三色检验试剂(抗体)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>流式细胞术分析使用厂家提供的Multiset软件，通过流式细胞仪(型号FACSCalibur，厂牌BectonDickinson,加利福尼亚州圣何塞)获取三色检验染色抗体样品的数据。每天在每次运行前，使用厂家提供的校准荧光微球(CalibriteBeads)对流式细胞仪进行校准。使用Multiset软件测量的参数包括T-淋巴细胞、T-辅助细胞、CD8+T-淋巴细胞、B-淋巴细胞、NK-细胞的数目和百分数以及CD4:CD8T-细胞的比率。从血浆中提取维生素E以及HPLC分析将采集到肝素化管中的血液样品在室温下以2000转每分钟旋转10分钟。将血浆从沉淀的红细胞中分离出并转移到无菌的1.5mL离心管中。接着，将500的血浆加入到含0.5mL的0.5%NaCl和乙醇的管中。然后，向各管中加入400nL的正己烷。使用迷你搅拌器将混合物剧烈振摇一小时。然后在室温下以3000转每分钟的转速旋转管10分钟。离心后，将清澈的正己烷相小心转移到干净的小瓶，并在氮气下吹干。用500)iL的正己烷重新组成脂质样品部分。然后将10|iL溶液注入HPLC系统。统计学分析本试验获得的数据使用WindowsSPSS(10.0版本；SPSS公司，伊利诺州芝加哥)处理。使用裂区方差分析(SPANOVA)或单因素方差分析(One-WayANOVA)来确定对照组(安慰剂组)和实验(TRF)组在三个不同时间点即0天、28天和56天之间的显著性意义。数据以平均值士标准差来表示。结果(动物试验)小鼠脂肪组织中的维生素E水平喂食主要为a-T、TRF和S-T3的维生素E的不同异构体的实验组动物与未用补充剂的对照组小鼠比较，其脂肪组织中的总的维生素E累积量显示为显著性(P<a05)的水平(见图2)。喂食S-T3的动物的脂肪组织中总的维生素E水平最高，其次是TRF和a-T。在补充不同类型维生素E的小鼠中，a-T和(x-生育三烯酚(a-T3)异构体出现在所有动物的脂肪组织中。然而，当与其余的动物组比较时，喂食a-T的动物具有显著(i><高浓度的生育三烯酚，类似地，喂饲TRF的动物也显示出其脂肪组织中积累有非常显著(P<a^)量的a-T3(见图3)。喂食S-T3的动物的脂肪组织中S-T3的浓度是最高的，与其余组比较，具有非常显著(P<0.Wj的水平(见图3)。对照组和补充a-T的动物脂肪组织没有任何可检测量的S-T3或"T3。仅补充TRF的动物显示其脂肪组织中存在所有的四种异构体，并且该组中Y-生育三烯酚(Y-T3)的浓度与其它动物相比差异非常显著(P<0.0"。实验组喂食1mg维生素E的不同异构体即TRF、a-T或5-T3。对照组不补充维生素E的任何异构体。对照组和实验组之间的显著性差异表示为3户<0.05^AT0F4)。对于脂肪组织中的a-T浓度，以a-T喂养的小鼠与其余组之间的显著性差异表示为》<aw^^6^4>。至于脂肪组织中的5-T3浓度，以5-T3喂食的小鼠与对照组、(x-T和TRF组之间的差异表示为*<0Mr4)。补充TRF的小鼠脂肪组织中a-T3和Y-T3的积累量与对照组、a-T和S-T3组的动物相比显示出显著的差异，并分别表示为》<0.07WM叫和><0.0/0TV麵」。补充维生素E的小鼠中抗破伤风类毒素抗体的生成将BALB/c小鼠分成四组，即三个实验组，一个对照组。实验组小鼠喂词不同类型的维生素E。所有的动物均接种三次剂量抗破伤风类毒素(TT)疫苗。在0天、28天和56天，采用ELISA测定对照组和实验组血清中的TT-特异抗体滴度。如图4所示，在每日补充维生素E即S-T3、a-T或TRF后，TT免疫小鼠的抗-TTIg滴度有了显著(尸<a05卩提高。与对照组动物相比，28天第一次接种疫苗后的所有补充维生素E的组中的抗-TTIg滴度的增加具有统计学上的显著性意义CP<ao》。然而，抗-TTIg滴度的增加在第一次接种疫苗后的实验组中没有显著的差异(见图4)。在第三次接种TT疫苗后，以维生素E的不同异构体饲养56天的小鼠与非治疗小鼠比较具有更高显著性(P〈aO》的抗-TT抗体滴度(见图4)。如图4所示，补充5-丁3异构体的小鼠在第三次接种疫苗后，具有最高的抗TT抗体滴度。其次是喂食TRF和a-T的小鼠。补充5-丁3和TRF的小鼠比a-T治疗的小鼠的抗TT抗体滴度更显著(尸<a^)。此外，喂食TRF和S-T3的小鼠在第三次免疫后与第一次免疫相比，也显示出高显著^P<ft0"的抗体滴度。所有动物的血清抗TT抗体的基线(0天)滴度都很低，并且对照组和实验组的几乎相同(见图4)，这表明试验初始，动物的免疫状态是相似的。上述发现表明生育三烯酚、主要是S-T3和TRF显著地增强了TT免疫小鼠抗-TT抗体的生成。28天和56天时对照组和实验组间的显著性差异分别表示为》<aa5(5^7VO^i)和5尸<a050iMiV(9^;。56天时喂食S-T3和a-T的动物间的显著性差异表示为，<(^VC^i);而56天时补充TRF和a-T的组间差异表示为e尸<aWf^VO^i)。喂食TRF和S-T3的动物中，56天和28天之间的显著性差异表示为0i^7VO^4」。补充维生素E的TT-免疫小鼠脾细胞的增殖将BALB/c小鼠分成四组，即三个实验组和一个对照组。实验组的小鼠喂饲维生素E的不同异构体。所有的动物接种三次剂量的破伤风类毒素(TT)疫苗。56天时，分出处死动物的脾并在ConA、LPS或纯TT的存在下进行培养。图5表示补充维生素E不同异构体对对照组和补充维生素E小鼠有丝分裂原或抗原诱发的脾细胞增殖的影响。与对照组小鼠相比，补充S-T3、TRF或a-T的免疫小鼠的脾细胞显示出对ConA(1吗/mL)或TT(10pg/mL)显著高的(P<ft059增殖反应(见图5)。补充S-T3的组其细胞增殖略有增加，其次是补充TRF和a-T的组。然而，在经过ConA或TT剌激之后的维生素E治疗组之间其脾细胞增殖不具有显著性(尸〉0.05)差异。此外，与对照组相比，LPS(1pg/mL)未诱发维生素E治疗组的脾细胞显著(户>0.05)增殖。这些结果表明生育三烯酚和生育酚补充剂都能增加ConA-或TT-刺激的鼠科动物脾细胞的增殖。五个雌性小鼠组在14、28和42天时用TT疫苗(4LfteL)进行免疫。在随后一次接种疫苗后的两周(56天)处死动物。将对照组和实验组之间ConA刺激的培养物中的显著性差异表示为"<a050iVOF4;;而对照组和实验组之间TT剌激的培养物中的显著性差异表示为》<0iVOF4;。LPS刺激之后，未观察到对照组和实验组之间的脾细胞增殖有显著性的差异(^VO^i)。补充维生素E对有丝分裂原或抗原剌激的TT免疫小鼠脾细胞细胞因子生成的影响将BALB/c小鼠分成四组，即三个对照组和一个实验组。实验组的小鼠喂饲维生素E的不同异构体。所有的动物均接种三次剂量的破伤风类毒素(TT)疫苗。56天时，处死对照组和实验组小鼠。分出处死动物的脾并将其在ConA或纯TT的存在下进行培养。培养72小时后，收获培养上清液，用elisa对生成的细胞因子(ifn-y、il-4和tnf-a)量进行定量。补充维生素E对ConA或TT刺激的脾细胞IFN-Y生成的影响如图6所示，ConA-刺激的喂食维生素E不同异构体的TT接种疫苗小鼠的脾细胞IFN-Y的浓度比对照组小鼠的显著(？<O.O"高。与ct-T治疗的小鼠相比，在ConA刺激之后，补充S-T3的动物显示其细胞因子的生成有了显著的(P<a0》增加。然而，未观察到喂食a-T和TRF的小鼠间IFN-Y的水平有显著的差异。与对照组相比，所有补充维生素E的组中，TT免疫的脾细胞中的IFN-y水平有显著增加(见图6)。然而，治疗组中的细胞因子水平没有显著性的差异。此外，与对照组动物相比，ConA刺激的空白(未治疗小鼠并且没有接种疫苗)鼠的脾细胞生成的IFN-y量相对低。补充维生素E对ConA或TT刺激的脾细胞IL-4生成的影响图7表示三次剂量的TT接种疫苗后，对照组和维生素E治疗的小鼠脾细胞IL-4的生成。与对照组小鼠相比，维生素E治疗的动物显示其在ConA和TT诱发的脾细胞增殖中IL-4的生成有了显著的(P<O.O"增强。然而，未观察到IL-4的水平在补充维生素E的组之间有显著的差异。与对照组动物相比，空白动物(未治疗小鼠并且没有接种疫苗)的脾细胞生成的IL-4量相对低。补充维生素E对LPS剌激的脾细胞TNF-a生成的影响在补充不同的维生素E异构体并接种TT疫苗的小鼠中，发现LPS-诱发的TNF-a生成显著(P<a05J降低(见图8)。在所有维生素E治疗的动物中，TNF-a的生成几乎是相等的，并且未观察到这些组之间有差异性。5只雌性小鼠组成的组在14、28和42天时，以TT疫苗(4Lf/mL)免疫。56天即最后一次免疫后两周时处死小鼠。从处死小鼠的脾中制得脾细胞并将其在ConA(lpg/mL)或TT(10pg/mL)的存在下进行培养。培养72小时后获得培养上清液，采用ELISA对生成IFN-Y的量进行定量。对照组和实验组动物之间ConA剌激的脾细胞的显著性差异表示为T<(^VOM力而对照组和实验组动物之间TT剌激的脾细胞的差异表示为尸<f^VOKi)。补充S-T3和a-T的动物之间ConA刺激的脾细胞之间的差异表示为1^<a05^w&"Ar-裣验入补充TRF和a-T的动物间，对ConA剌激的脾细胞未观察到差异性。空白和对照动物间OmA剌激的脾细胞的显著性差异表示为^<0力5(5h^e"Ar-^^J^)。5只雌性小鼠组成的组在14、28和42天时，以TT疫苗(4Lf/mL)免疫。最后一次免疫后两周(56天)时处死小鼠。从处死小鼠的脾中制得脾细胞并将其在OmA(lpg/mL)或TT(10pg/mL)的存在下进行培养。结果以浓度(pg/mL)表示。培养72小时后获得培养上清液，采用ELISA对生成的IL-4进行定量。ConA刺激的脾细胞在对照组和实验组间的显著性差异表示为^<0.05MM9K力；而TT刺激的培养物在对照组和实验组之间的差异表示为》<(^VOF力。ConA刺激的脾细胞在空白组和对照组动物间的显著性差异表示为，<(S^^wAr-^^^)。5只雌性小鼠组成的组在14、28和42天时，以TT疫苗(4Lf/mL)免疫。最后一次免疫后两周(56天)时处死小鼠。从处死小鼠的脾中制得脾细胞并将其在LPS(1pg/mL)的存在下进行培养。结果以浓度(pg/mL)表示。培养72小时后获得培养上清液，用ELISA法对生成的TNF-cx进行定量。LPS刺激的脾细胞在对照组和实验组之间的显著性差异表示为T<0力5,O叫。补充TRF的志愿者血桨中的高水平维生素E利用HPLC分析志愿者的血浆样品，来定量总的生育酚和生育三烯酚的浓度。如图9所示，实验组中，补充TRF四周(28天)和8周(56天)后血浆总的维生素E(生育酚和生育三烯酚)浓度显著地(？<O.O"增高。相反，在这两个时间点，安慰剂组血浆中总的维生素E浓度保持不变(见图9)。然而，补充TRF组的血浆总的维生素E水平在28天和56天之间的差异不具有显著的统计学意义(见图9)，其可能意味着机体发挥了有效的清除过程以维持某个最佳的维生素E水平。在28天和56时健康自愿者血液中内生的cc-生育酚的数量与0天相比显著(P<a^》增加(见图10)。28天和56时，补充TRF的组中a-生育酚的浓度与安慰剂组相比显著(P<ft0"增高。接受TRF的志愿者与安慰剂组的相比，28天和56天时的平均血浆a-、，和S-生育酚浓度相比也显著(P<O.W和尸<aO"增加(见图ll)。在补充TRF的组中，28天和56天时生育三烯酚异构体的浓度中，cc-生育三烯酚是最高的，其次是？和5-生育三烯酚(见图ll)。安慰剂组中生育三烯酚的浓度在28天和56天时保持相同，与o天相比，其数量未表现出显著(？>ao》差异。一百名志愿者被随机分配在两组即对照组(接受安慰剂)或实验组(每天接受400mg的TRF)。0天、28天和56天时从两组采集血液。从血液中分离血浆用于如方法部分所述的HPLC分析。该分析中总的维生素E血浆浓度以,ug/mL报告o28天时对照组和实验组之间血浆维生素E水平的显著性差异表示为1^<a05(^VOr力。56天时对照组和实验组之间血浆维生素E水平的显著性差异表示为P户<0.05f^VOW入实验组0天和28天之间血浆维生素E水平的显著性差异表示为^<0.05(SE4ATC^力。实验组0天和56天之间血浆维生素E水平的显著性差异表示为》<(57MiVO^i)。一百名志愿者被随机分配在两组即对照组(接受安慰剂)或实验组(每天接受400mg的TRF)。0天、28天和56天时从两组采集血液。从血液中分离血桨用于如方法部分所述的HPLC分析。该分析中总的维生素E血浆浓度以吗/mL报告。28天时对照组和实验组之间血浆ct-生育酚浓度的显著性差异表示为^<0.05(^VOF4)，而56天时对照组和实验组之间的差异表示为^<0.0507VC^4)。实验组0天和28天之间血浆a-生育酚水平的显著性差异表示为Y<0力5(5TMiV(9^i),而实验组0天和56天之间的水平差异表示为P尸<图ll:对照组和实验组志愿者血浆中生育三烯酚的浓度一百名志愿者被随机分配在两组即对照组(接受安慰剂)或实验组(每天接受400mg的TRF)。0天、28天和56天时从两组采集血液。从血液中分离血浆用于如方法部分所述的HPLC分析。该分析中生育三烯酚的血浆浓度以lig/mL报告。28天时对照组和实验组之间血浆a-生育三烯酚浓度的显著性差异表示为，<0.07^iVOF4)，而56天时对照组和实验组之间的差异表示为"<(^VOF4)。实验组0天和28天之间血浆a-生育三烯酚水平的显著性差异表示为》<(5TM7VOF4)，而实验组0天和56天之间的水平差异表示为e尸<謹(5TWO叫。28天时对照组和实验组之间血浆"生育三烯酚浓度的显著性差异表示为Y<a05(^VO^i)，而56天时对照组和实验组之间的差异表示为t户<0力50iVC^力。实验组0天和28天之间血浆，生育三烯酚水平的显著性差异表示为，<0.050iMiVC)^i)，而实验组0天和56天之间的水平差异表示为V<a05(SE47VO^i)。28天时对照组和实验组之间血浆5-生育三烯酚浓度的显著性差异表示为￥尸<0力5W7VOF4;，而56天时对照组和实验组之间的差异表示为，<aa5WiVC^力。实验组0天和28天之间血浆S-生育三烯酚水平的显著性差异表示为Y<0力50iMiVOKi)，而实验组0天和56天之间的水平差异表示为众尸<,补充TRF对有丝分裂原或抗原剌激的外周血单个核细胞(PBMC)细胞因子生成的影响如方法部分所述的，在0、28和56天时采集所有自愿者的血液。如3.4.8部分所述分离外周血单个核细胞(PBMC)，在ConA、LPS或纯TT的存在下培养白细胞。培养72小时后获得培养上清液，用ELISA法对生成的细胞因子(IFN-y、IL-4、IL-6和IL-10)的数量进行定量。在本发明中，仅在28天和56天时、即Meydani等(1997)报道的给予TT疫苗之前和之后测定TT剌激下PBMC的细胞因子生成。据报道，TT刺激下志愿者细胞因子的基线(0天)水平与给予TT疫苗之前的28天时水平相似(Meydani等，1997)。然而，在ConA和LPS(非特异的有丝分裂原)刺激下的外周血单个核细胞细胞因子的生成是在0天、28天和56天时测定。补充TRT对Cona或TT剌激的外周血单个核细胞IFN-y生成的影响图12表示对照组和实验组志愿者的外周血单个核细胞IFN-y的生成。56天时即TT接种疫苗后，ConA刺激的外周血单个核细胞IFN-y的生成，与0天或28天时生成的相比显著(？<a05j提高。28天时IFN-y的水平与0天相比仅略有升高。此外，28天时观察到TRF和安慰剂组之间的差异不具有显著的统计学意义(P>a0"。56天时、即给予TT疫苗后的28天，与相应的安慰剂组相比，接受TRF补充剂的志愿者外周血单个核细胞生成的iFN-y量显著fP<aoj提高。同时也测定了由特异抗原即TT刺激的外周血单个核细胞生成的ifn-y量(见图13)。28天时、即加强tt免疫之前，大部分志愿者外周血单个核细胞均对TT的刺激有反应。这可能是由于之前在儿童免疫计划期间接触该抗原引起的。TT免疫之后的56天时，补充TRF和安慰剂的组在体外TT刺激下IFN-Y的生成均增加。然而，与安慰剂补充组相比，接受TRF补充剂的志愿者的细胞因子水平非常显著fP〈0.0"。补充TRF对ConA或TT刺激的外周血单个核细胞IL-4生成的影响如图14所示，TT接种免疫之前，与ConA剌激的培养物中的IFN-y相比，志愿者的外周血单个核细胞生成非常低水平的IL-4。TT接种免疫后一个月(56天)时，与本试验的0天和28天相比，补充TRF和安慰剂的组IL-4的水平都显著地(P<a05j提高了。然而，56天时对照组和实验组之间的IL-4浓度无显著差异(P>0.05」。在两个时间点即TT接种免疫之前四周和之后四周，分析TT刺激的外周血单个核细胞培养物中的IL-4水平。与ConA剌激的外周血单个核细胞相比，TT刺激的外周血单个核细胞生成较低量的IL-4(见图14和图15)。在TT接种免疫之前、即28天时，补充TRF和补充安慰剂的志愿者中TT刺激的人外周血单个核细胞生成的IL-4的量无显著(户>ft05)统计学差异(见图15)。相反，TT免疫之后，56天时，接受TRF的志愿者与接受安慰剂的相比，IL-4的水平显著(？<0力"增高。补充TRF对LPS剌激的外周血单个核细胞IL-6生成的影响已被广泛公认的是促炎细胞因子、比如IL-6和TNF-a由巨噬细胞生成从而在受到病原体威胁时诱导急性时相蛋白(Levi等，2003)。在本试验0天和28天时，对照组和实验组志愿者中，LPS-刺激的志愿者外周血单个核细胞都生成高水平的IL-6(见图16)。然而，56天时、即TT免疫后一个月，补充TRF的志愿者与接受安慰剂的志愿者相比较，生成的IL-6显著(P<,低(见图16)。测定从对照组和实验组外周血中分离出的ConA刺激的外周血单个核细胞生成的IFN-Y量。测定0天(基线)、28天(补充安慰剂或TRF四周以及TT接种免疫之前)和56天(补充安慰剂或TRF八周以及TT接种免疫之后四周)时生成的IFN-y量。56天时，观察到对照组和实验组的ConA刺激的外周血单个核细胞生成的IFN-Y水平具有统计学上的显著性差异。56天时对照组和实验组之间的显著性差异表示为^<M7VO^i)。对照组56天时与0天和28天时相比的显著性差异表示为，<0.050尸^VO^i)，实验组56天时与0天和28天时相比的水平差异表示为，<0.05按照方法部分所述的，测定从对照组(安慰剂治疗)和实验组志愿者外周血中分离出的TT剌激的外周血单个核细胞生成的IFN-Y量。测定28天(补充安慰剂或TRF四周以及TT接种免疫之前)和56天(补充安慰剂或TRF八周以及TT接种免疫之后四周)时生成的IFN-y量。28天时，对照组和实验组之间TT特异性IFN-Y水平的显著性差异表示为e尸<W7VOr々，而56天时对照组和实验组之间的差异表示为"<ftWf^VO^i)。对照组28天和56天之间的显著性差异表示为Y<ft05fiSiMiV0F4)，而实验组28天和56天之间的水平差异表示为V<aW测定从对照组(安慰剂治疗)和实验组志愿者外周血中分离出的ConA刺激的外周血单个核细胞生成的IL-4量。测定在0天(基线)、28天(补充安慰剂或TRF四周以及TT接种免疫之前)和56天(补充安慰剂或TRF八周以及TT接种免疫之后四周)生成的IL-4量。与0天和28天相比，56天时对照组之间的显著性差异表示为5尸<0.05(5"/MiVOK力，与0天和28天相比，56天时实验组之间的水平差异表示为&尸<0.05(5TMiVOF4)。补充TRF对ConA或TT剌激的外周血单个核细胞IL-10生成的影响白细胞介素-10(IL-10)是众所周知的免疫抑制性细胞因子，其能降低共朿lj激分子(co國stimulatorymolecules)在抗原提呈细胞(antigen-presentingcells)上的表达(Corinti等，2001)，从而抑制树突状细胞(dendriticcells,DC)的抗原提呈能力(Thomssen等，1995)。本发明中，在0、28和56天，所有的志愿者显示其ConA剌激的外周血单个核细胞有可检测水平的IL-10生成(见图17)。尽管本试验中从基线到56天生成的IL-10水平略微增加，但是该水平是无显著性意义的(P〉a0"，并且未观察到TRF和安慰剂组之间的IL-IO生成有显著f〉a0"变化(见图17)。如图18所示，在28天和56天，与安慰剂组相比，补充TRF的组其TT剌激的外周血单个核细胞在IL-10的生成上也显示出略微的增高。然而该细胞因子水平上的变化无显著性意义(P〉猪」。测定从对照组(安慰剂治疗)和实验组志愿者外周血中分离出的ConA刺激的外周血单个核细胞生成的IL-10的量。测定在0天(基线)、28天(补充安慰剂或TRF四周以及TT接种免疫之前)和56天(补充安慰剂或TRF八周以及TT接种免疫之后四周)生成的IL-10的量。在0天、28天和56天，补充TRF和安慰剂的组之间IL-10生成水平的差异无统计学意义f57^VOF4)。根据方法部分所述的，测定从对照组(安慰剂治疗)和实验组志愿者外周血中分离出的TT-刺激的外周血单个核细胞生成的IL-10的量。测定在28天(补充安慰剂或TRF四周以及TT接种免疫之前)和56天(补充安慰剂或TRF八周以及TT接种免疫之后四周)生成的IL-10的量。在28天和56天，补充TRF和安慰剂的组之间TT-特异的IL-10生成水平的差异无统计学意义(5P^VOF4)。在TRF补充和TT接种疫苗后血浆中抗破伤风抗体的水平研究了补充TRF对接种TT疫苗的人类志愿者血浆中总的Ig生成的影响。生成抗-TT抗体的量用来作为免疫响应的体液性抗体手臂(humoralarm)的标记。可检测量的抗-TT抗体的总的Ig出现在本试验的0天和28天，但是其滴度与TT接种免疫后即56天时观察到的相比相对要低(见图19)。TT接种免疫后一个月，TRF和安慰剂组的抗-TTIg滴度均显著增加(见图19)。56天时观察到两组中抗-TTIg的滴度与0天和28天相比显著<0.0"要高。56天时，补充TRF的志愿者与补充安慰剂的相比，显示出显著(P<a0》高的抗-TTIg生成。TT-接种疫苗后、即在56天时，还观察到补充TRF的组中增加的抗-TTIgG的生成(见图20)。本试验人群中TT接种疫苗之前抗-TTIgG的平均水平为0.79IU/mL，TT接种疫苗之后一个月，补充TRF和安慰剂的志愿者中的水平都显著(P<a05J升高。在56天时，安慰剂补充组和TRF补充组的平均抗-TTIgG水平分别为1.30IU/mL和1.93IU/mL，与安慰剂组相比，TRF组的水平显著(P<a0》要高(见图20)。两组中的志愿者在接种免疫之后，均达到了保护性的抗-TT反应，其被定义为S0.85IU/mL的抗破伤风抗体水平(Kilian和Nielsen,1989)。在0天、28天和56天时，采集对照(补充安慰剂的)组和实验(补充TRF)组志愿者的血液。在28天时肌肉注射(i.m.)给予加强剂量的TT疫苗。通过ELISA法测定总的Ig抗-TT血浆水平。安慰剂(对照)组56天时与0天和28天时相比，抗-TTIg滴度的显著性差异表示为e尸<0.05(S7^A^^i)，而实验(TRF)组56天时与0天和28天时相比，滴度的差异表示为Y<0.05(5TM7VOF4)。在56天时，对照组和实验组之间抗-TTIg滴度的显著性差异表示为^<"050iV(9^i)。在0天、28天和56天时，采集对照(补充安慰剂的)组和实验(补充TRF的)组志愿者的血液。在28天时肌肉注射给予加强剂量的TT疫苗。通过ELISA法测定抗-TTIgG的血浆水平。安慰剂(对照)组56天时与0天和28天时相比，IgG浓度的显著性差异表示为》<(57MA^Ei)，而实验(TRF)组56天时与0天和28天时相比，IgG水平的差异表示为W〈0.O5(57MA^r4)。在56天时，对照组和实验组之间水平的显著性差异表示为^<^iVOK々。图21:比较补充TRF或安慰剂的健康志愿者之间总的T-淋巴细胞百分数的散点图。0天(A)、28天(B)和56天(C)时采集志愿者血液。淋巴细胞用CD3抗原的抗体染色并用流式细胞仪分析。在每个时间点、即0、28和56天，TRF和安慰剂组之间总的T-细胞百分数的差异不显著f57M7V(9^i)。x轴显示TRF组中i^50，安慰剂组中n=50,总计11=100。权利要求1.一种用于对生物活性物质的免疫反应进行补充的组方，所述组方包含维生素E。2.根据权利要求1所述的组方，其特征在于，该组方能够用作破伤风类毒素接种疫苗的免疫反应的补充剂。3.根据权利要求1所述的组方，其特征在于，维生素E由富含生育三烯酚的组分(TRF)组成。4.根据权利要求3所述的组方，其特征在于，所述的富含生育三烯酚的组分选自由cc-生育三烯酚、S-生育三烯酚、Y-生育三烯酚和a-生育酚组成的群组。5.根据上述权利要求任一项所述的组方用于制造对免疫反应进行补充的药物的用途。6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于用于增强哺乳动物的免疫反应。7.—种用于增强人免疫反应的方法，其特征在于，该方法包含给予所述需要增强免疫反应的人有效量的根据权利要求1至3所述的组方。8.—种包含内含能有效激活人体对破伤风类毒素接种疫苗的免疫反应的组方的包装材料以及包含标示该组方能用于增强免疫反应的标签的包装材料的制品，其中所述的组方是根据权利要求1至4所述的药物组合物。全文摘要本发明涉及一种用于对生物学物质的免疫反应进行补充的组方。更具体地说，本组方由一种或多种形式的对破伤风类毒素的免疫反应提供补充的维生素E组成。此外，本发明还涉及补充不同类型的维生素E、比如富含生育三烯酚的组分、δ-生育三烯酚和α-生育酚对破伤风类毒素接种疫苗免疫反应的影响。文档编号A61K39/39GK101401805SQ200810161498公开日2009年4月8日申请日期2008年10月6日优先权日2007年10月2日发明者卡拉尼斯·纳萨特纳姆申请人:马来西亚棕榈油委员会