专利名称：：一种中药组合物在制备防治脑缺血的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药组合物的用途，具体地，涉及一种中药组合物在制备防治脑缺血的药物中的应用。
背景技术：
：2005年11月2日公告的发明专利说明书CN1225250C公开了一种防治老年痴呆的中药组合物，其主要由茯苓、白术和当归组成的原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成，或者主要由选自茯茶、白术和当归中的一种或两种原料药中的多糖、正丁醇提取物和/或挥发油有效部位组成。该中药组合物可采用超临界萃取和水提取的方法制得。上述中药组合物具有防治老年痴呆的用途。本发明发掘了该中药组合物新的医药用途。对于已知的药物，发现其还具有治疗另一种疾病的性能，从而可以治疗另一种疾病，这种第二次医药用途发明对于满足医疗临床需求与市场需求，具有重要意义。鉴于第二次医药用途的重要作用，研究和开发上述中药组合物的新用途具有重要意义。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种中药组合物的新用途，即在制备防治脑缺血的药物中的应用。本发明提供了一种中药组合物在制备防治脑缺血的药物中的应用，该中药组合物由茯苓、白术和当归三种原料药的超临界萃取物和/或水提取物，或者超临界萃取物和/或水提取物有效部位组成。为叙述方便，将本发明茯苓、白术、当归组成的中药组合物简称为FBD。茯苓简称F、白术简称B、当归简称D。本发明FBD可以采用以下方法制得将原料药粉碎成粗粉，经二氧化碳超临界萃取得到超临界萃取物，之后药渣用水提取后得到水提取物；或者原料药经超临界萃取得到超临界萃取物后，药渣用水提取后，加乙醇至含醇浓度为45-95%时沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得到正丁醇提取物；或者，所述原料药用水煎煮，水提取液浓縮后，加乙醇至含醇浓度为45-95%时沉淀，得到多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得到正丁醇提取物；多糖和正丁醇提取物是水提取物有效部位。在所述的超临界萃取物和水提取物有效部位中可加入药用载体或敷料，制成中药制剂。常用制剂辅料可选用，崩解剂如羟丙基淀粉、羟丙纤维素、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钙、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；填充剂如乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、糊精、淀粉、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、碳酸钙、环糊精、微粉纤维素等；润湿剂和粘合剂如乙醇、预胶化淀粉、聚维酮、羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素；润滑剂如滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、微粉硅胶、氢化植物油、聚乙二醇4000和6000;润湿剂如十二烷基硫酸钠、吐温80。本发明FBD的用量和疗程可根据剂型、患者的年龄、疾病的轻重程度作适当调整，但一般为每日口服3次，每次2片，以l个月为一个疗程，可连续使用l个疗程或更长时间。为了更好地理解本发明的实质，下面将用本发明FBD的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途在药效学研究中发现1、在线栓法引起大鼠局灶性脑缺血后再灌注损伤实验中，FBD组及阳性药尼莫地平(2mg/kg)对线栓法造成的局灶性脑缺血-再灌注损伤均有明显的治疗作用。结果表明FBD能有效防治中风，脑缺血。2、在小鼠断头全脑缺血模型中，尼莫地平(5mg/kg)可使小鼠断头全脑缺血模型张口呼吸时间明显的增加(p〈0.05)。FBD对呼吸时间有一定的延长作用，但与阴性组比较没有显著性差异。尼莫地平和FBD都可以显著提高SOD活力，对MDA含量无明显影响。结果表明FBD能有效防治中风，脑缺血。3、在四动脉阻断大鼠全脑缺血再灌注损伤实验中，FBD能延长模型大鼠缺血后脑电图消失时间、縮短再灌注后脑电图恢复时间和翻正反射恢复时间，效果与剂量呈正相关。结果表明FBD能有效防治中风，脑缺血。4、在FBD对麻醉犬外周及脑血流量影响的研究中，FBD对麻醉犬具有一定的降低脑部血管阻力，增加脑部血流量的作用，并且对动物的外周血压也有类似尼莫地平的作用降低外周血压，特别是舒张压；减慢心率。但作用强度和作用时间均小于尼莫地平。FBD十二指肠给药对脑部血流的改善作用在给药后30min最明显。结果表明FBD能有效防治中风，脑缺血。5、阳性药丹参注射液和FBD组可明显增加软脑膜微循环血管的网点计数(与给药前相比p〈0.05)。结果表明FBD能有效改善微循环。6、FBD可以抑制大鼠动静脉旁路血栓形成，降低血栓湿重；FBD与阳性药丹参注射液(3000mg/kg)对大鼠脑微循环障碍的血液流态有不同程度的改善，表现为血细胞聚集程度有所减轻，如血液流态由淤滞状变为粒状，或由粒状变为带状或线状，或由虚线状变为线状，使脑膜毛细血管网点计数明显增加。FBD对AA和ADP诱导的血小板聚集亦有明显的抑制作用，对胶原诱导的血小板聚集则无明显的抑制作用。结果表明FBD能有效改善血栓形成，降低血栓湿重。在作用机制的研究中发现1、在大鼠动静脉旁路血栓形成实验中，FBD对血栓形成有抑制作用，与阴性组比较有显著性差异(P〈0.05)。但其抑制率小于阳性药阿司匹林(25mg/kg)。2、在FBD对大鼠脑膜微循环障碍影响的研究中，丹参组(3000mg/kg)和FBD于给药后，可明显增加软脑膜微循环血管的网点计数(与给药前相比P〈0.05);血液流态有不同程度的改善。3、FBD对血小板聚集功能影响的研究中，FBD可有显著性地抑制ADP和AA诱导的血小板聚集，而对胶原诱导的血小板聚集无明显作用，其作用强度均低于阿司匹林(25mg/kg)。经过上述研究显示FBD对局部性和全脑缺血一再灌注损伤具有明显的治疗作用。其抗缺血性脑损伤的机制可能与抑制血栓形成、抗血小板聚集和改善微循环，增加脑部血流量有关。本发明的优点在于本发明对已知的中药组合物FBD发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。本发明FBD安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。本发明FBD制备工艺简单，并可制成各种口服剂型，如片剂、胶囊等。本发明FBD对局部性和全脑缺血一再灌注损伤具有明显的治疗作用，其抗缺血性脑损伤的机制可能与抑制血栓形成、抗血小板聚集和改善微循环，增加脑部血流量有关。这些作用有利于防治脑缺血。图1是FBD十二指肠给药对麻醉犬脑血管阻力影响的示意图；'图2是FBD十二指肠给药对麻醉犬颈内动脉流量影响的示意图；图3是FBD十二指肠给药对麻醉犬外周平均动脉压影响的示意图；图4是FBD十二指肠给药对麻醉犬心率影响的示意图。具体实施例方式以下通过试验例对本发明的有益效果作进一步的阐述试验例lFBD对动静脉旁路血栓形成的影响1.1实验目的观察受试样品对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响。1.2动物品系SD大鼠来源上海斯莱克实验动物责任有限公司性别雌雄各半体重200-240g动物合格证号SCXK(沪)2003-0003词养动物饲养于正压净化通风动物房内，室温25土2。C，自由进食与饮水。1.3药品1.3.1受试样品名称归苓片(FBD)来源上海中药制药技术有限公司性状深红色片剂批号040904规格0.48g/片1.3.2阳性对照样品名称阿司匹林来源上海信谊百路达药业有限公司规格25mg/片性状白色肠溶片批号0305031.4动物分组30只雌性、30只雄性大鼠按随机数字法各分为6组，每组10只(5只雌鼠，5只雄鼠)动物。1.5药液配制I.阿司匹林_05%两黄蓍&10mlII.FBD药液的配制FBD量l片0.5%西黄蓍胶_3.加ml_1.6实验方法第1组动物给予0.5%西黄蓍胶，其余5组动物按应给予的药液口服灌胃给药，给药体积均为0.5ml/100g，每天给药1次，连续5天。在末次给药后1小时，大鼠腹腔注射3鬼戊巴比妥钠35mg/kg麻醉，将大鼠仰卧固定，切开颈部皮肤，分离左侧颈动脉和右侧颈外静脉，以一旁路管连接，管中置一7cm长的4号手术丝线。手术结束后开放血流15分钟，取出丝线称重，减去丝线重量，即为血栓湿重。1.7结果从表1可见，与阴性组相比FBD不同剂量组能剂量依赖性地抑制大鼠动一静脉旁路血栓的形成(P〈0.05或0.01);4.60、2.30、1.15和0.56g/kg给药组对血栓形成的抑制率分别为19.95、16.77、11.62和8.17%。阳性药阿司匹林能非常显著地抑制大鼠动静脉旁路血栓的形成(P〈0.0D，抑制率达36.58%(表l)。数据以平均值士标准差(；土SD)表示，数据差异统计采用t检验，组间差异以P<0.05判断。表l.FBD对大鼠动静脉旁路血栓形成的影响组别动物数血栓湿重(mg)抑制率(只)(％)阴性组1043.71±4.32/阿司匹林1027.72±4.01**36.58FBD1034.99±8.52'19.95*P〈0.05,**P〈0.01，aP=0.05034与阴性对照组相比试验例2FBD对大鼠线栓法局灶性脑缺血-再灌注损伤的治疗作用2.1实验目的观察FBD对线栓法引起大鼠局灶性脑缺血后再灌注损伤的治疗作用。2.2动物品系Wistar大鼠性别雄性体重250350克来源上海斯莱克实验动物责任有限公司动物合格证号SCXK(沪)2003-0003饲养恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2°C。2.3药品2.3.1试验样品同1.3.12.3.2阳性对照样品名称尼莫地平来源郑州瑞康制药厂批号20030106含量101.29%性状淡黄色结晶性粉末2.4动物分组按随机数字法分组，每组10只。2.5药液配制I.尼莫地平用95%乙醇配制成20mg/ml的注射液II.FBD受试样品的的配制同1.52.6实验方法取健康雄性Wistar大鼠，体重250-350g，共50只，随机分成3组，FBD样品于缺血2小时后灌胃给药，给药体积为0.5ml/100g;阳性对照组尼莫地平给药体积为0.01ml/100g,于缺血后2小时从大鼠尾静脉注射给药。阴性对照组给同等体积的0.5%西黄蓍胶。将大鼠以12%的水合氯醛腹腔麻醉(350400mg/kg)后，仰卧固定于手术台上。室温维持在25'C左右。切开右侧颈部皮肤，分离、结扎右侧颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉(ICA)，至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，根部结扎该分支。在ICA近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入直径为0.26ram的尼龙线1720mm，栓线进入ICA、穿过大脑中动脉(MCA)起始端至大脑前动脉近端，阻断MCA的所有血流来源。扎紧备线，4小时后，拔出尼龙线，使其血流再通，结扎备线并缝合皮肤，于缺血后2小时给药，将手术大鼠分笼放回动物房。缺血24小时后，进行神经缺陷评分，评分方法为(1)提鼠尾离开地面约l尺，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面。如果有左肩内旋，左前肢内收现象发生者，评分为4分，否则为0分。(2)将动物置平滑地板上分别推左(或右)肩向对侧移动，检査抵抗推动的阻力。正常大鼠双侧阻力明显且对称。如果推右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降程度的不同，评分为1_3分。(3)将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢张力明显且对称。而发生左前肢张力下降者，根据下降程度的轻重评为0-3分。根据以上标准打分，满分10分。评分完毕，断头取脑。将大脑平均冠状分为5片，放于TTC溶液中，37t:温育1015rnin染色。梗死区不着色，正常脑组织染成红色。用生理盐水冲洗后数码照相，数码照片利用计算机测量每片梗死区截面积和全脑截面积，计算梗死面积百分比。2.7结果FBD组以及阳性对照药尼莫地平对大鼠线栓法大脑中动脉造成的局灶性脑缺血-再灌注损伤均有明显的治疗作用，与阴性对照组相比，使脑坏死百分比明显降低，动物神经学缺陷显著改善。FBD组抗局部性缺血-再灌注损伤的作用与剂量呈明显的正相关(表2)。表2.FBD对大鼠线栓法脑局部性缺血再灌注模型的影响组别n神经缺陷评分脑坏死百分比21.98±9.5010.77±9.14*1.42±1.00"试验例3FBD抗小鼠全脑缺血作用的药效学研究3.l实验目的通过小鼠断头全脑缺血模型研究FBD对全脑缺血的预防作用，以及对缺血脑耐缺氧能力的改善作用。3.2动物品系昆明种小鼠性别雌雄各半体重20_22g来源上海医药工业研究院动物房提供动物合格证号SYXK(沪)2004—0015饲养动物饲养于正压净化通风动物房内，温度25±2°〇，自由进食与饮水。3.3药品3.3.1试验样品同1.3.13.3.2对照样品同2.3.23.3.3其它试剂3,3.3.1名称总蛋白测定试剂盒来源上海申索试剂有限公司上海生物制品研究所批号200407023.3.3.2名称丙二醛(MDA)测定试剂盒来源南京建成生物工程研究所批号20041013阴性组97.9±1.9尼莫地平95.6±1.7*FBD94.2±0.4**卞〈0.05，，<0.01与阴性组比较3.3.3.3名称超氧化物歧化酶(SOD)测试盒来源南京南京建成生物工程研究所3.4实验仪器3.4.1名称3K30高速低温冷冻离心机3.4.2名称JY92-II超声细胞粉碎机3.4.3名称80—2型离心机3.4.4名称722光栅分光光度计批号20041015来源德国Sigma公司来源宁波新芝科器研究所来源上海手术器械厂来源上海第三分析仪器厂3.5动物分组将小鼠按随机数字法分组，做SOD和MDA测定的共3组，每组10只动物；头呼吸次数的，共3组，每组16只动物，均雌雄各半。3.6药液配制l断I.FBD药液的配制FBD:1片II.尼莫地平3.7实验方法5mg05%两黄蓍胶_^6.52ml05%两黄蓍龄一20ml各组均提前2天灌胃给药，给药体积0.2ml/10g体重。给药开始后第3天给予第3次实验样品，并于给药后l小时，用锋利的剪刀将小鼠的头连同小脑脑干一并剪下，并于剪下即刻开始计时，记录断头张口呼吸的时间。将断头冰浴，剥下大脑及小脑,称重，放入已预先冰浴好的离心管中。按照1.9ml冰生理盐水/100mg脑的稀释比例，用超声细胞粉碎机140W，两秒，10次制成5%的脑组织匀浆，并且在超声的同时也保持冰浴。将组织匀浆在低温离心机上以4°C，2700g离心30分钟。小心吸取上清，测定组织匀浆总蛋白、S0D、MDA。总蛋白用总蛋白测定试剂盒测定，722分光光度计550nm测定吸光度，总蛋白计算公式如下测定管吸光度血清总蛋白(g/1)-X50标准管吸光度SOD和MDA分别用SOD和MDA试剂盒测定。每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U)。722分光光度计550nm测定吸光度SOD的计算公式如下对照管吸光度—测定管吸光度组织匀浆中SOD活力(U/mgprot)=对照管吸光度10反应液总体积+50%X"^^^+组织中蛋白含量(mgprot/ml)MDA测定按照测定说明书操作，722分光光度计532nm测定吸光度。MDA的计算公卿"aa旦测定管吸光度一测定空白管吸光度式如下组织中MDA含量-对照管吸光值-X标准品浓度(10nmol/ml)+蛋白含量(mgprot/ml)3.8结果3.8.1对张口呼吸时间的影响各组小鼠断头后，均经历一个从激烈张口呼吸到相对静止到再次张口呼吸数次最后死亡的过程。实验结果见表3。阴性组张口呼吸时间为20.6±2.7秒；阳性对照组尼莫地'平5mg/kg张口呼吸时间为23.l土3.4秒，与阴性组比较有显著性增加(p〈0.05)。FBD低剂量组张口呼吸时间为19.8±1.9秒；中剂量组张口呼吸时间为21.3±3.6秒与阴性组比较稍有延长。高剂量组张口呼吸时间为22.9土5.3秒，与阴性组比较延长了2秒左右。尼莫地平可使小鼠断头全脑缺血模型张口呼吸时间明显的增加。FBD高剂量对小鼠断头全脑缺血模型张口呼吸时间有一定的延长作用，但与阴性组比较没有显著性差异(表3)。数据以平均值土标准差(；土SD)表示，数据差异统计采用t检验，组间差异以P<0.05判断。表3.FBD对小鼠断头全脑缺血模型张口呼吸时间的影响组别张口呼吸时间(s)阴性组尼莫地平FBD16161620.4±2.723.0±3.3*22.9±5.1*p<0.05,**p<0.01，与阴性组比较。3.8.2对SOD和MDA的影响各组脑组织均按照实验方法处理，并测定吸光度，分别测定总蛋白含量以及MDA含量和SOD活力。测定结果见表4。阴性组MDA含量为3.11±0.43nmol/mgprot，与阴性组比较各组的MDA值均没有明显的升高和降低(与阴性组比较没有显著性差异)。阴性组SOD含量为59.48±27.00U/mgprot，尼莫地平组为83.72±17.08U/mgprot(P<0.05)，显著性升高了近23U/mgprot。FBD组S0D含量为83.98士21.25U/mgprot(P〈0.05)'也显著性升高了近24U/mgprot;尼莫地平对断头MDA含量没有明显影响，但可以使脑组织中的S0D活力显著性升高。(表4)。表4.FBD对小鼠断头全脑缺血模型MDA含量以及S0D活力的影响。组别n总蛋白含量(mg/ml)MDA含量(nmol/mgprot)S0D活力(U/mgprot)阴性组101.87±0.533.11±0.4359.48±27.00尼莫地平101.53±0.633.57±0.8583.72±12.08*FBD101.42±0.713.06±0.5683.98±21.25**p〈0.05，**p〈0.01,与阴性组比较试验例4FBD抗四动脉阻断全脑缺血再灌损伤药效学研究4.1实验目的观察FBD对四动脉阻断大鼠全脑缺血再灌注损伤的预防作用。4.2动物品系Wistar大鼠性别雄性体重250270g来源上海斯莱克实验动物责任有限公司动物合格证号SCXK(沪)2003-0003饲养恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2°C。4.3药品4.3.1试验样品同1.3.14.3.2阳性对照样品同2.3.14.4实验仪器4.4.1名称SW-30射频双极凝固器来源上海市检测技术所检测仪器厂4.4.2名称SJ-42四道生理记录仪来源上海医用电子仪器厂4.5动物分组50只雄性大鼠按随机数字法各分为5组，每组10只。4.6药液配制I.尼莫地平用0.5X西黄蓍胶配制成10mg/ml的注射液II.FBD受试样品的的配制同1.54.7实验方法取健康雄性Wistar大鼠，体重250-350g，分阴性对照组、FBD组及阳性尼莫地平组。于缺血前1小时灌胃给药，体积为0.5ml/100g。将动物用12%的水合三氯乙醛腹腔麻醉(350mg/kg)，在枕后暴露第一颈椎横突孔，用双极电凝对准横突孔电灼凝固双侧椎动脉。然后在颈部作一切口暴露双侧颈动脉，分离后，用1号丝线穿好备用，缝合伤口。于术后24小时，大鼠清醒时，用带硅胶管的动脉夹将双侧颈动脉夹闭，即造成4根动脉闭塞全脑缺血，取出动脉夹可使血流再通，为再灌流期。该实验缺血与再灌时间均为1小时。凡缺血1小时内脑电图未消失或出现严重抑制一律剔除。观察指标为缺血后脑电图消失时间、再灌后脑电图恢复时间及翻正反射恢复时间。所有数据均用f土s表示，统计学分析用t检验。4.8实验结果从表5可以看出，与阴性组相比，FBD组能延长模型大鼠缺血后脑电图消失时间、縮短再灌注后脑电图恢复时间和翻正反射恢复时间，效果与剂量呈正相关。与阴性组相比，阳性药尼莫地平亦能使灌注后脑电图恢复时间和翻正反射恢复时间明显縮短(P<0.05或P〈0.01)(表5)。表5.FBD对全脑缺血再灌注大鼠的脑电图和行为学影响(7士SD)组别n脑电图消失时间(S)脑电图恢复时间(S:翻正反射恢复时间(S)阴性组1066±341221±13592376±1335尼莫地平1078±35173±143*784±433"FBD1()169±110"104±86*292±176*"AA*P〈0.05，"P<0.01，"*P〈0.001与阴性对照组比较；AP<0.05，AAP〈0.01与尼莫地平组比较；试验例5FBD对麻醉犬外周及脑血流量影响的研究5.1实验目的观察FBD十二指肠给药对麻醉犬心率、外周动脉血压、外周动脉和脑动脉流量以及脑血管阻力的影响。5.2动物品系杂种犬性别雌雄兼用体重10.1土0.7kg来源上海医药工业研究院动物房5.3药品5.3.1试验样品同1.3.15.3.2对照样品同2.3.25.3.3其它药品肝素钠140U/mg，中国医药(集团)上海化学试剂总厂批号F200209305.4主要仪器5.4.1名称ElamaMinogograf-82型八导生理记录仪来源西门子公司5.4.2名称MFV—2100电磁流量计来源日本光电公司5.4.3名称GPS—2型高频手术器来源江苏武进无线电厂5.5动物分组每组6只。根据大鼠有效剂量折算出犬的给药剂量。5.6药液配制I.FBD药液的配制FBD:l片(V邠两昔蓍昤>1mlII.尼莫地平150mg0-5%两昔蓍將150ml5.7.实验方法将犬用3%戊巴比妥钠30mg/kg静脉注射麻醉。将动物仰卧位固定于手术台上,于右侧腹股沟处分离股静脉，插入导管作输液用，分离右侧股动脉插管，连接压力换能器，测定外周血压。分离左侧股动脉，以备测定外周动脉血流量。分离右侧颈动脉直到颈外动脉和颈内动脉的分叉处，结扎颈外动脉，颈内动脉留用，将电磁流量计钩在同侧的颈总动脉上以备测定颈内动脉的血流量。从腹中线剪开动物腹部约5cm，找到十二指肠，并缝制荷包，插管以备给药。待动物手术后稳定30min，药物从十二指肠给予，给药时间为lmin。给药后观察3小时，分别在给药前和给药后5、10、15、30和60、90、120、180分钟记录动物心电图以及外周动脉血流量和颈内动脉血流量和血压。阴性对照组以同样方法给予0.5%西黄蓍胶，lml/kg。给药后180分钟处死犬，取大脑称重。以右颈总动脉血流量乘以2代表全脑血流量(CBF)。脑血管阻力(R)可用以下公式计算-R=MAP(kPa)/[CBF(ml/min)100g脑]。试验数据从记录上测量得到。MAP计算公式为lmmHg=0.1333KPa实验数据用平均值土标准差(X±SD)表示。实验结果统计用给药后同给药前的变化值和阴性对照组同时间点的变化值进行t检验5.8实验结果FBD十二指肠给药对麻醉犬心率、血压、外周及脑血流量以及脑血管阻力的影响见表6-12，图1-4。阴性组，外周血压稳定变化不大，心率随着时间的推移有所降低，外周血流量和脑部血流量均逐渐降低，因此脑部血管阻力逐渐增加。尼莫地平组外周血流量在给药后12min和120min显著性增加，在给药后的30、60、90、180min均非常显著性增加。而给予尼莫地平后的颈动脉流量在第10、15分钟非常显著性增加，而在30-180分钟显著性增加。同时外周血压在给药后的15-180分钟均显著性降低，特别是外周动脉舒张压，在给予尼莫地平后的15min显著性降低，在后来的30-180min均非常显著性降低(与阴性组同一时间点的变化率比较)。心率在给药后的5、60、90min即显著性降低，在15min非常显著性降低。脑部血管阻力在给药后的5min显著性降低，在10-180min均非常显著性降低。FBD十二指肠给予麻醉犬后对外周动脉流量和血压以及脑部血管阻力均没有明显的影响，仅在给药后的30min，其脑部血流量有一定的增加，在给药后30min,血管阻力有非常显著性降低，但降低的绝对值并不多。因此FBD对麻醉犬具有一定的降低脑部血管阻力，增加脑部血流量的作用，并且对动物的外周血压也有类似尼莫地平的作用降低外周血压，特别是舒张压；减慢心率。但作用强度和作用时间均小于尼莫地平。FBD十二指肠给药对脑部血流的改善作用在给药后30min最明显。表6.FBD十二指肠给药对麻醉犬外周动脉血流量的影响(n=6，^土SD)样品股动脉流量.给药前给药后(min)(ml/min)051015306090120180阴性平均值26.3±17.627.2±22.924.7±18.924.7±19.922.7±11.920.5±9.723.5±12.524.5±11.321.3±10.8对照变化％_-2.2±12.5-IO.I土12.8陽12.1土14.7陽9.1土-17.9.12.5±28.0-4.4±28.95.4±41.7-11.7±25.9FBD平均值29.8±14.628.5±14.028.2±14.029.7±16.229.2±17.224.0±14.621.肚9.522.2±8.820.7±6.2变化％-2.1±-3.3±1.5±0.7±-15.8±-192±-16.4-20.fe16.215.624.628.527.028.4±31.531.3平拘倍W2士n^25.5±33'5±41.2±54.7±57.5±57.5±56.2±57.0±尼莫"f^J1旦J1J"。9.818.521.328.727.829.627.727.5地平变化％-14.8±5.1±26.3±69.9±78.8±79.0±75.7±79.7±15.124.832.7*56.0**35.5**57.7**53.7*55.1***P<0.05，**P<0.01与阴性组比较表7.FBD十二指肠给药对麻醉犬脑动脉血流量的影响(n=6，；±SD)颈内动脉给药前给药后(min)样口口流量(ml/min)05101530609012018030.5±30.0±29.7±27.7±26.8±25.7±26.0±24.5±阴性平均值31.0±13.112.513.013.612.913.512.812.811.7对照-1.4±-3.7±-5.4±陽12.0士-15.2±-18.6±-17.4±-22.0±变化o/。一2.34.65.85.07.38.09.17.338.0±38.7±38.3±39.2±37.3±35.5±34.8±33.8±平均值38.0±20.920.921.221.021.321.219.920.621.0FBD-0.5±2.1±2.3±5.8±-1.8±-6.1±-8.3±-11.1±变化％-1.35.39.813.5*7.3*7.7*11.012.325.3±39.3±40.5±33.0±29.5±28.7±28.2±26.7±尼莫平均值21.3±5.79.712.412.511.313.512.513.210.8地平9.0±62.7±77.6±54.9±42.5±38.8±36.8±31.4±变化％一17.742.6**55.5**62.9*47.7*44.8*47.1*49.0*P<0.05，P〈0.01与阴性组比较表8.FBD十二指肠给药对麻醉犬动脉平均压的影响(n=6,;±SD)股动脉给药前给药后(min)枰品血压(mmHg)051015306090120180141.7±140.8±142.8±139.7±139.2±139.5±140.3±144.2±阴性平均值1楊±29.035.034.631.528.527.327.018.925.6对照0.4±-0.2±1.8±-0.2±0.1±0.7±1.9±4.1±变化％一5.25.62.81.79.712.910.910.6160.8±166.7±160.8±164.2±162.5±161.2±160.0±156.7±FBD平均值跳8±27.519.325.025.024.029.818.120.020.716尼莫地平变化％_平均值148.3±17.8变化％_0.9±4.3±0.3±2.6±0.9±1.3±0.5±-1.5±6.67.6《15.05.58.89.310.4141.7±120.肚110.0±96.7±97.5±97.5±跳8±103.3±14.721.515.521.622.125.824.827.50.6±-7.5±-15.2±-26.1±-29.8±-30.6±1-27.1±-28.6±5.011.012.7*18.1**14.2**8.0**16.2**17.6***P<0.05，"P<0.01与阴性组比较表9.FBD十二指肠给药对麻醉犬动脉收縮压的影响(n=6，；±SD)股动脉给药前给药后(min)秤品血压(mmHg)051015306090120180167.5±173.3±170.8±168.3±跳3±171.7±175.0±173.3±阴性平均值170.8±31.134.034.931.729.130.127.323.720.4对照-2.2±1.2±0.0±-0.7±-l.l士0.9±3.5±2.7±变化％—4.35.45.44.77.86.58.58.4199.2±220.8±198.3±205.8±205.0±200.0±198.3±192.5±平均值203.3±20.215.036.413.715.015.58.48.813.3FBD-l.肚9.0±-2.2±1.6±U士-1.1±-1.8±-4.7±变化％—4.018.53.36.64.17.59.610.5179.2±171.7±160.肚145.0±144.2±153.3±154.2±151.7±尼莫平均值185.8±19.317.723.620.827.635.832.429.223.2地平-0.3±-2.4±-8.7±-17.0±-18.6士扁16.3士-13.5土-16.5±变化％_4.07.77.0*11.1**16.2*14.7*14.5*11.3**PO.05，P<0.01与阴性组比较表10.FBD十二指肠给药对麻醉犬动脉舒张压的影响(n=6,^士SD)股动脉样品血压(mmHg)给药前给药后(min)051015306090120180129.2±126.7±128.3±123.3±130.0±130.0±133.3±135.8±33.231.132.832.232.130.325.226.7-0.1±-1.9±-0.8±-4.8±0.8±0.9±4.6±6.5±5.25.36.07.39.47.86.06.0阴性对照平均值128.3±27.9变化％_<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>对照FBD尼莫地平变化％平均值变化％平均值变化％0.48±0.280.72±0.312.0±3.7±7.9±13.7±19.5±25.4±25.0±35.2±6.05.56.16.821.223.521.424.40.50±0.50±0.46±0.46±0.49±0.53±0.55±0.55±0.330.310.240.230.270.340.350.340.9±1.6±-2.0±-2.1±2.7士7.9±10.5±12.6±6.64.76.110.1**8.812.217.719.10.64±0.35±0.29±0.30±0.35±0.34±0.37±0.40±0.330.180.150.150.190.150.180.21-14.0±-52.5±-59.6±-56.8±-50.4±-49.4±-45.1±-40.6±16.4*16.4**11.2**12.6**16.4**18.9**22.5**25.9**P<0.05，P<0.01与阴性组比较试验例6FBD对脑微循环障碍的影响6.1实验目的观察FBD对大鼠脑膜微循环障碍的影响，探讨其抗脑缺血作用机制。6.2动物品系SD大鼠性别雄性体重240260g来源上海斯莱克实验动物责任有限公司动物合格证号SCXK(沪)2003-0003词养恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2°C。6.3药品6.3.1试验样品同1.3.16.3.2阳性对照样品名称丹参注射液来源上海中西药业股份有限公司批号030305含量3g/2ml性状淡黄色液体6.4实验仪器6.4.1名称307-6台式牙钻车来源上海齿科医械厂6.4.2名称SXP-1B手术显微镜来源上海医用光学仪器厂6.4.3名称SQF-E解剖显微镜来源上海万科仪器有限公司6.4动物分组48只雄性大鼠按随机数字法各分为6组，每组8只。6.6药液配制I.丹参原液使用II.FBD受试样品的的配制同1.56.7实验方法FBD于高分子右旋糖苷注射后20分钟灌胃给药，给药体积为0.5ml/kg。丹参注射液于高分子右旋糖苷注射后20分钟尾静脉注射给药，给药体积为2ml/kg。将大鼠用3%的戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉，作颅骨开窗术，剪开硬脑膜暴露一侧大脑半球的额顶区，以解剖显微镜观察软脑膜微循环，在观察软脑膜微循环后，自股静脉注射10%的高分子右旋糖苷(分子量50万)生理盐水溶液，剂量15ml/kg，假手术组给15ml/kg的生理盐水，在注射后20分钟观察软脑膜微循环变化。当证实已造成微循环障碍(血流缓慢，血细胞聚集)，再根据分组给药治疗，于给药后60min,观察微循环情况。观察指标如下①流态红细胞的流态可分为4级0级，直线(带)状；I级，虚线状；II级，粒状；III级，淤滞状。②毛细血管网点计数取面积约为1平方毫米左右的固定区域(此区域由血管围成边界)，计算此区域中毛细血管与边界(血管)的交点数。未与边界相交的毛细血管不计算在内。③血色观察血色，分鲜红、暗红、淡红等。④毛细血管周围的变化主要观察毛细血管周围有无渗出、和出血现象。网点计数数据用；土SD表示，统计学分析用t检验。其它质反应资料不作统计学分析。6.8实验结果脑膜微循环流态变化对照组和实验各组动物在注射高分子右旋糖苷后，血液流态有异常改变。血液流态由正常的带状、线状变为虚线状、粒状，甚至变为淤滞状，阴性对照组动物在注射生理盐水后，血液流态未见改善。而丹参组和FBD不同剂量组于给药后，血液流态有不同程度的改善，表现为血细胞聚集程度有所减轻，如血液流态由淤滞状变为粒状，或由粒状变为带状或线状，或由虚线状变为线状(表14)。血色变化对照组和实验各组动物在注射高分子右旋糖苷后，血色与原来相比无明显改变。毛细血管周围的变化实验各组动物在注射高分子右旋糖苷及样品后，与原来相比毛细血管周围未见渗出和出血。给药前后毛细血管网变化表13显示，阳性药丹参注射液和FBD组可明显增加软脑膜微循环血管的网点计数(与给药前相比p〈0.05)。表13.FBD不同剂量组对脑膜毛细血管网点计数的影响(；土SD，n=10)组别血淤前网点计数治疗前网点计数治疗后网点计数正常组5.10±0.745.10±0.745.10±0.74阴性组5.00±0.473.60±0.7CT3.60±0.70丹参5.20±0.633.80±1.03**4.80±0.92A5.OO土O.673.70±0.67*'4.70±0.82A*p<0.05，**p<0.01与血淤前相比；△p<0.05,,〈0.01与治疗前相比表14.FBD不同剂量组对脑微循环流态的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>试验例7FBD对血小板聚集功能的影响7.1实验目的观察FBD对血小板聚集功能的影响。7.2动物品系SD大鼠性别雄性体重250270克来源上海斯莱克实验动物责任有限公司动物合格证号SCXK(沪)2003-0003饲养恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2°C。7.3药品7.3.1试验样品同1.3.17.3.2阳性对照样品名称阿司匹林肠溶片来源BayerHealthCareAG规格100mg/片批号BTA4E31性状白色药片7.3.3其它试剂7.3.3.1名称ADP来源Sigma公司批号129F04967.3.3.2名称AA(花生四烯酸)来源Fluka公司批号318175/11937.3.3.3名称胶原来源TrinityBiotechPlc，Bray，Co.Wicklow，Treland.公司批号200501147.4实验仪器7.4.1名称80—2型离心机来源上海手术器械厂生产7.4.2名称MK4/HC血小板计数仪来源美国BakerInstruments公司7.4.3名称Laboraggregometer-153型双道血小板聚集仪来源德国LaborGmbHHanburg公司7.5动物分组每组10—12只。7.6药液配制I.阿司匹林_0.5%两黄蓍3一20mlII.FBD受试样品的的配制同1.5III.ADP:pH7.4磷酸缓冲液配成200)aM浓度溶液，一20。C冰箱保存备用。AA:0.1MNa2C03缓冲液配成0.5mmol/L浓度溶液，一18。C冰箱保存备用。胶原制剂标识量2.0mg/ml，28t冰箱保存，白色粉针剂，临用前以双蒸水溶解，0.5ml/支，现配现用。7.7实验方法试验药物单次口服灌胃，体积为5ml/kg，阴性对照组给予同体积西黄蓍胶。口服灌胃给药后1小时腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg麻醉，仰卧固定，腹主动脉采血，用3.8%枸橼酸钠按1:9比例抗凝，以500rpm离心5分钟，取上部血浆即为富血小板血浆(PRP)，余下部分再次以3000rpm离心15分钟，上清液为贫血小板血浆(PPP)，用血小板计数仪计数PRP血小板数，用PPP调整PRP的血小板数至6X1()5个/mm3左右。在测试管中加入PRP200ial，调节记录仪至零点，另用一PPP管放入测试孔，调节增益至记录仪行程为60格，以此为100%。样品管37。C保温2分钟后开始搅拌1分钟，搅拌子转速500rpm，再加入ADP5^1或AA4pl或胶原8|al，使ADP终浓度为AA浓度为4pM;胶原浓度为8|liM;，记录加入ADP或AA或胶原后的记录笔移动的行程，按下式计算聚集率-窓佳步0/力口ADP后的行程聚集率％=o-io(w的行程x100/0计算出各试验组的平均聚集率及标准差，用t-检验同西黄蓍胶组进行比较。并按下式计算各试验组的聚集抑制率聚集抑制率％=聚集率(阴性组)一聚集率(试验组)X100%聚集率(阴性组)7.8实验结果实验结果表明，阳性药阿司匹林(25mg/kg)对ADP、胶原、AA诱导的血小板聚集均有非常显著的抑制作用(P〈O.OOD。FBD对ADP诱导的大鼠血小板聚集均有抑制作用，且抑制作用与剂量正相关。FBD对AA诱导的大鼠血小板聚集均有抑制作用，且抑制作用与剂量呈正相关。实验结果见表1517。表15.FBD对ADP诱导的大鼠血小板聚集的影响组别最大聚集率(%)聚集抑制率(%)阴性组12阿司匹林1087.4±9.660.8±13.1'30.5FBD1084.9±9.02.9*P〈0.05，**P〈0.01、***P<0.001与西黄蓍胶组比较表16.FBD对胶原诱导的大鼠血小板聚集的影响组别(%)聚集抑制率(%)阴性组阿司匹林121038.7±7.224.8±2.3材*35.823<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>*P〈0.05，**P〈0.01，***P<0.001与西黄蓍胶组比较表17.FBD对M诱导的大鼠血小板聚集的影响组别最大聚集率聚集抑制率(%)阴性组阿司匹林FBD12101052.8±5.034.9±2.8':47.9±11.333.89.3*P〈0.05，**P〈0.01，***P<0.001与西黄蓍胶组比较结论通过以上试验结果可以看到FBD对大鼠线栓法局灶性脑缺血及四动脉阻断全脑缺血模型均有治疗或预防作用，表现为改善大鼠行为学评分，减小大脑坏死面积；延长模型大鼠缺血后脑电图消失时间、縮短再灌注后脑电图恢复时间和翻正反射恢复时间，其效果优于尼莫地平(25mg/kg)。在9.2g/kg的剂量时，对小鼠断头全脑缺血模型也能延长其张口呼吸时间，提高SOD的活力，但效果低于尼莫地平(5mg/kg)。此外，在FBD对麻醉犬外周及脑血流量影响的研究中，FBD组对麻醉犬具有一定的降低脑部血管阻力，增加脑部血流量的作用，并且对动物的外周血压也有类似尼莫地平的作用降低外周血压，特别是舒张压；减慢心率。但作用强度和作用时间均小于尼莫地平(5mg/kg)。其对脑部血流的改善作用在给药后30min最明显。在作用机制方面的研究中发现FBD可以抑制大鼠动静脉旁路血栓形成，降低血栓湿重；FBD与阳性药丹参注射液(3000mg/kg)对大鼠脑微循环障碍的血液流态有不同程度的改善，表现为血细胞聚集程度有所减轻，如血液流态由淤滞状变为粒状，或由粒状变为带状或线状，或由虚线状变为线状，使脑膜毛细血管网点计数明显增加。FBD对AA和ADP诱导的血小板聚集亦有明显的抑制作用，对胶原诱导的血小板聚集则无明显的抑制作用。以下通过实施例对本发明作进一步的阐述实施例1取茯苓25g，白术12g，当归7g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加;^"乙醇沉淀，得多糖(2.3g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(0.71g),合并水提取物有效部位(多糖与正丁醇提取物)，加入适量辅料后，压成片剂。实施例2取茯苓50g，白术40g，当归20g,混合后，C02超临界萃取提取挥发油(2.5ml)，控制提取萃取罐压力为10.0MP，温度为35'C，提取时间为2小时。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为90%，沉淀，得到总多糖(4.2g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取,合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物(7.5g)，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。实施例3取茯苳40g，白术20g，当归10g，混合后，C02超临界萃取，控制萃取罐压力为12.0MP，温度为35C，提取时间为2小时，得到超临界萃取物。药渣用水提取后，加乙醇至含醇量为85%，沉淀，得到总多糖，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，合并超临界萃取物，总多糖及正丁醇提取物，加适量辅料，制粒，灌制胶囊。实施例4取茯苓40g，白术20g，当归12g，混合后，用乙醇用夹带剂，进行C02超临界萃取提取挥发油(1.64ml)，药渣用水提取后，加乙醇沉淀，得到总多糖(2.74g)，上清液回收乙醇后甩正丁醇萃取(4.9g)，合并挥发油，总多糖及正丁醇提取物，加适量淀粉，制粒，灌制胶囊16粒。服用剂量一日服用2次，每次2粒。实施例5取茯苓50g,白术25g，当归15g，混合后，用水煎煮，水提取液浓缩后，加入乙醇沉淀，得多糖(4.77g)，上清液回收乙醇后用正丁醇萃取，得正丁醇部位(1.46g)，合并多糖与正丁醇提取物，加入适量辅料后，制成片剂18片。服用剂量一日服用2次，每次2片。实施例6取茯苓50g，白术40g，当归20g，混合后，C02超临界萃取提取挥发油(2.5ml)，控制提取萃取罐压力为IO.OMP，温度为35'C，提取时间为2小时。药渣用水提取后，得到水提取物，合并挥发油及水提取物，加适量辅料，压制成片。2权利要求1、一种中药组合物在制备防治脑缺血的药物中的应用，所述的中药组合物由茯苓、白术和当归三种原料药的超临界萃取物和/或水提取物，或者超临界萃取物和/或水提取物有效部位组成。全文摘要本发明公开了一种中药组合物在制备防治脑缺血的药物中的应用，该中药组合物由茯苓、白术和当归三种原料药的超临界萃取物和/或水提取物，或者超临界萃取物和/或水提取物有效部位组成。文档编号A61K36/185GK101601710SQ200810189050公开日2009年12月16日申请日期2005年12月20日优先权日2005年12月20日发明者严永清,周迎新,朱丹妮,林志宏,沈平孃,伟虞,阮克锋申请人:上海中药制药技术有限公司;中国药科大学