专利名称：化合物及其在治疗良性前列腺增生及相关症状中的应用的制作方法
本申请为2004年9月24日提交的申请号为200410080081.7、发明名称为“化合物及其在治疗良性前列腺增生及相关症状中的应用”的专利申请的分案申请。
发明领域 本发明涉及1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3在制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生(BPH)及相关症状的药物中的用途。本发明还涉及预防和/或治疗良性前列腺增生及相关症状的方法，该方法包括单独施用或与其它活性剂联合施用预防和/或治疗所述疾病有效量的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3。
背景技术：
BPH是老年男性中的一种常见疾病，在60岁的男性中大约有50％的人发病，在那些85岁的男性中约有90％的人发病。BPH为一种特殊的以基质和上皮细胞增生为特征的组织病理学疾病。
一个多世纪以来，BPH发病机制的两个已知致病因素为老龄和存在有功能的睾丸。然而，随着前列腺生物科学的发展，这一观念由于不能覆含BPH发病机制的所有方面而显得不足。在前列腺的生长调节中，其它的致病因素也发挥了重要作用。特别是有证据显示，前列腺的生长受前列腺细胞所产生的特殊生长因子的直接控制，所述生长因子以旁分泌机制局部作用于相邻的细胞或以自分泌机制作用于同种细胞。因此，目前正在投入大量的工作以确定旨在抑制前列腺内生长因子的治疗策略。
BPH为可同时影响排尿周期中的充盈(刺激症状)期和排尿(梗阻症状)期的慢性下泌尿道症状的常见病因。这些症状影响着患者的社交、心理、家庭、工作、身体健康以及性生活，对其生活质量产生深远的负面影响。除此之外，BPH还可导致其它更急性的泌尿系统并发症，特别是通常被认为是BPH的最严重并发症的急性尿潴留(AUR)以及发病频率稍低的反复发作性泌尿道感染、上泌尿道扩张、膀胱结石形成以及反复发作性血尿。
BPH的控制伴随着极高的社会成本，据估计仅在美国，1993年便花费了40亿美元，并计划在2003年还将花费260亿美元。
目前BPH的药物治疗包括口服5α还原酶抑制剂(近期通过FDA认证的非那雄胺和度他雄胺(dutasteride))以及α1受体拮抗剂(特拉唑嗪、多沙唑嗪、坦洛新以及西罗多辛(silodosin)、AIO-8507L、RBx-2258等)。每一种可供选择的治疗措施均伴有与其不同作用机制有关的优缺点。尽管α1受体拮抗剂可非常有效地减轻与下泌尿道症状(LUTS)相关的症状，但其在减小前列腺体积方面却没有效果，因而也无法避免与BPH相关的手术。相反，5α还原酶抑制剂，如非那雄胺和度他雄胺，可以通过减少二氢睾酮形成来减小前列腺的大小，从而减少对手术的需求。此外，涉及超过18,000名健康老年男性的为期七年的前列腺癌预防试验的近期结果表明，非那雄胺可预防或延迟前列腺癌的发生(参见Thompson IM等，《新英格兰医学杂志》(New England Journal of Medicine)(2003)349第215-224页)。但是，正如所预料的(参见Kassabian VS，Lancet(2003)362，60-62页)，非那雄胺并没有消除其对性功能的抗雄激素不良作用，例如降低性交能力、减弱性欲以及男性乳房发育，而这大大削弱了其作为防癌药品的吸引力。此外，非那雄胺治疗与高分化前列腺癌检测增多相关，可能因为非那雄胺诱导的低雄激素状态可选择最具侵袭性的、雄激素不敏感的恶性生长细胞(参见Scardino PT，《新英格兰医学杂志》(2003)349第297-299页)。
因而，仍需要一种新型的用于BPH药物治疗的药物，它应当能够预防急性尿潴留，并同时能够通过降低雄激素诱导的前列腺生长来避免相关的对手术的需求而不会直接干扰雄激素受体(AR)，因此不会有前列腺以及前列腺外的抗雄激素不良作用，例如性方面的副作用。这种药物通过中断前列腺内的生长因子信号传导，不仅可用于治疗BPH，而且可用于预防前列腺癌，并可防止选择出AR不敏感的恶性克隆。
本发明描述 如文中所述，本发明人已经确定出不会引起高钙血症的、耐受性良好的维生素D3类似物1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3(化合物A)就是这种药物的一个基本范例，它可通过不依赖于雄激素受体的方式以多种控制BPH细胞生长(包括生长因子介导的前列腺增生)的途径为靶向，来对抗BPH。
1，25-二羟基维生素D3[1，25(OH)2D3]为维生素D3的活化形式，是一种开环甾体物质(secosteroid)，它不仅在骨骼和钙代谢中起着中心作用，还与免疫反应的调节以及许多细胞种类、包括恶性细胞的分化和凋亡有关。
但是，骨化三醇治疗应用的一个问题为其本身所具有的诱导高钙血症和高磷酸盐血症的特性。因此，便开发出了保留其生物活性但不引起高钙血症副作用的骨化三醇类似物。
美国专利5,939,408和EP808833公布了许多1，25(OH)2D3的类似物，包括化合物1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3(化合物A)。美国专利5,939,408和EP808833揭示，这些化合物在许多皮肤和癌细胞系中可诱导分化和抑制增殖，并可用于治疗过度增殖性皮肤疾病(如牛皮癣)、肿瘤性疾病(如白血病、乳腺癌)、皮脂腺疾病(如痤疮和脂溢性皮炎)以及骨质疏松。
目前，在本发明人所进行的多项研究中，已令人惊奇的发现，与某些其它的1，25(OH)2D3类似物不同，1，25(OH)2D3类似物化合物A
化合物A 可在体外通过介导人体BPH细胞凋亡而显著减慢其生长并在体内减慢前列腺生长，而不影响睾酮和二氢睾酮水平。此外，在不引起高钙血症的剂量下便可抑制前列腺生长。因此，化合物A是一种用于治疗良性前列腺增生的有效药剂。
如文中的实施例所述，化合物A可减小前列腺大小。此外，如使用非那雄胺所观察到的，化合物A也可在体内和体外对抗睾酮的增殖活性。但是，值得注意的是，与非那雄胺不同，化合物A不抑制1类或2类5α还原酶活性，并且不仅能对抗睾酮，甚至还能对抗二氢睾酮所介导的BPH细胞生长。正如化合物A不能与AR相结合，也不能作为AR激动剂或拮抗剂所示，化合物A的这些抗雄激素特性与和AR的相互作用无关。此外，化合物A不影响性激素分泌。在我们的研究中，化合物A对PSA水平没有明显影响，因此使用化合物A治疗不会掩盖可能患前列腺癌的这一重要指标。
化合物A的另一个显著优点为体外实验显示，此药物与非那雄胺不同，它能够抑制膀胱细胞的基础生长和睾酮所刺激的生长，预计可用于预防和/或治疗人体膀胱功能障碍。膀胱功能障碍的有效大鼠膀胱出口梗阻模型中的体外实验也已同样显示了化合物A的有益效果。因为膀胱功能障碍为BPH的常见和麻烦的后遗症，因而这一点很重要。因此化合物A能够减小前列腺大小并改善膀胱功能，即通过化合物A对前列腺和膀胱两者的直接作用同时改善膀胱功能以及BPH的膀胱相关症状。预计这一效果可以超过仅仅是减小前列腺大小所能带来的膀胱症状改善。膀胱症状包括膀胱过动症，膀胱功能改善的指标包括非排尿收缩减少和残余尿减少。
因此，本发明提供了1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3在生产用于预防和/或治疗良性前列腺增生的药物中的用途。化合物A的可药用酯和盐也包括在本发明的范围内。
本发明提供了1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯在生产用于预防和/或治疗良性前列腺增生的药物中的用途。
本发明还提供了一种在有需要的患者中预防和/或治疗良性前列腺增生的方法，该方法包括施用治疗有效量的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯。
本发明还提供了1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯用于预防和/或治疗良性前列腺增生的用途。
本发明还提供了用于预防和/或治疗良性前列腺增生的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯。
本发明还提供了1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯用于预防和/或治疗良性前列腺增生并且没有前列腺内和前列腺外的抗雄激素副作用的用途。本发明还提供了一种在有需要的患者中预防和/或治疗良性前列腺增生并且没有前列腺内和前列腺外的抗雄激素副作用的方法，该方法包括施用治疗有效量的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯。
本发明还提供了1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯用于预防和/或治疗良性前列腺增生并同时预防和/或治疗膀胱功能障碍的用途。本发明还提供了一种在有需要的患者中预防和/或治疗良性前列腺增生并同时预防和/或治疗膀胱功能障碍的方法，该方法包括施用治疗有效量的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯。
1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3系一种已知的化合物，其制备在美国专利5,939,408中有述，其说明书引入本文作为参考。
其酯包括一种可药用的不稳定酯，在体内可水解释放出化合物A。
化合物A的盐包括其与碱和碱土金属离子以及金属离子盐(如钠离子、钾离子和钙离子及其盐，例如氯化钙、丙二酸钙等)所可能形成的加合物和复合物。
化合物A或其盐或酯，可用作单药治疗，也可联合其它已知的抗良性前列腺增生活性剂给药，如肾上腺素α受体阻断剂，例如α1受体拮抗剂(例如特拉唑嗪、多沙唑嗪、坦洛新或西罗多辛、AIO-8507L或RBx-2258)或5α还原酶抑制剂(例如非那雄胺和度他雄胺)。“抗良性前列腺增生活性剂”这种表述包括那些能够或已知在治疗或预防BPH中具有活性的药剂，如上述的举例药物。联合的配伍药物可与化合物A或其盐或酯以不同比例混和，并以单独或联合的药物制剂的形式分别、相继或同时给药。已知治疗剂的合适剂量是本领域技术人员易于掌握的。可以设想化合物A与两种或多种例如3种BPH活性化合物联合，例如与一种α1受体拮抗剂和一种5α还原酶抑制剂联合。当与化合物A(或盐或酯)联合给药时，与单独用药相比，联合配伍药物可以使用较低的剂量，甚至可以为单独用药时的亚治疗剂量。
因此，本发明还提供了如上所述的用途，其中的药物以单独或联合的药物制剂的形式与第二种抗良性前列腺增生活性剂分别、相继或同时给药。
因此，本发明还提供了1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯与第二种抗良性前列腺增生活性剂联合在制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生的药物中的用途。
本发明还提供了一种在有需要的患者中预防和/或治疗良性前列腺增生的方法，该方法包括以单独或联合的药物制剂的形式与第二种抗良性前列腺增生活性剂分别、相继或同时给药治疗有效量的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯。
上述的联合用药可以药物制剂的形式便利的使用。这样生产的药物制剂也代表了本发明的另一个方面。
本发明的药物制剂中活性成分的剂量水平和给药时程可以变化，以便获得可以使特定的患者、组合物以及给药模式产生所需治疗反应的活性成分的有效量，同时又不会对患者产生毒性。化合物A的示范剂量范围为每天0.1至300μg，举例来说为每天50至150μg，例如每天75或150μg。单位剂量制剂优选含有50至150μg(例如75或150μg)，并且优选每天给药一次。
特别的，化合物A的优选剂量是患者能够耐受并且不会发生高钙血症或其它不良副作用(如高钙尿症)的最大剂量。优选将化合物A以约0.001μg至约100μg/Kg体重、约0.001至约10μg/Kg或约0.001μg至约100μg/Kg的剂量给药。上述所列数值之间的范围也是本发明的一部分。
如上所述，化合物A可以其可药用盐或酯的形式给药，但是，优选使用化合物A，即，不以其酯或盐的形式给药。
该剂量可以常规的药物制剂的形式根据达到最佳效果的需要通过单次给药、多次给药或控释给药来递送，优选每天一或两次口服给药(特别是每日一次)。在某些情况下，更改每日剂量也证明可获得所需的治疗反应。
精确剂量和配方以及最适给药方案的选择特别受制剂的药学特性、所治疗疾病的性质和严重程度、以及药物接受者的健康状况和精力充沛度的影响。
代表性给药方式包括口服、胃肠外给药(包括皮下、肌肉内、静脉内给药)、直肠给药、口腔给药(包括舌下给药)、肺部给药、透皮给药、以及鼻内给药，最佳为口服给药。可持续或间断给药(例如推注(bolus injection))。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗良性前列腺增生的药物组合物，其含有1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯以及一种可药用载体。
本发明还提供了一种包装的制剂，其包含一种含有1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯以及可药用载体的药物组合物并包装附有用于治疗良性前列腺增生的使用说明书。
如上所述，该组合物可制备成用于胃肠外(皮下、肌肉内或静脉内)给药、特别是液态的溶液或混悬液的形式；用于口服或口腔给药、特别是片剂或胶囊的形式；用于肺部或鼻腔内给药、特别是粉剂、滴鼻液或喷雾剂的形式；以及用于直肠或透皮给药的形式。
组合物可以单位剂量形式方便的给药，并可通过药学领域中任何熟知的方法制备，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版(Mack出版公司，Easton，PA)中所述。用于胃肠外给药的制剂可含有赋形剂无菌水或盐水、亚烷基二醇(例如丙二醇)、聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)、植物油、氢化萘等。用于鼻腔给药的制剂可为固态并可含有赋形剂(例如乳糖或葡聚糖)，或者也可为用于以滴鼻液或计量喷雾形式使用的含水或油性溶液。用于口腔给药的典型的赋形剂包括糖类、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预糊化淀粉等。
口服给药组合物可为固体或液体形式，并可包含一种或多种生理学相容性载体和/或赋形剂。片剂和胶囊可用粘合剂(如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)以及表面活性物质(如月桂硫酸钠)制备。液体组合物可含有常规的添加剂，例如助悬剂(如山梨醇糖浆、甲基纤维素、糖浆、明胶、羧甲基纤维素或食用脂肪)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)、植物油(如杏仁油、椰子油、鳕鱼肝油或花生油)、防腐剂(如丁基化羟基苯甲醚(BHA)以及丁基化羟基甲苯(BHT))。液体组合物可封装在例如明胶胶囊中以提供一种单位剂量形式。
优选的固体口服剂量形式包括片剂、两节的硬壳胶囊以及软弹性明胶(SEG)胶囊。由于SEG胶囊较其它两种形式有独特优点，因而倍受关注(参见Seager H.“软明胶胶囊一种许多片剂问题的解决方法”，PharmaceuticalTechnology，第9期(1985年))。使用SEG胶囊的部分优点为a)因为药物被溶解或分散在液体中，且液体可精确的按剂量装入胶囊中，故而在SEG胶囊中，剂量含量均一性最优；b)因为药物被溶解、增溶或分散在水可混溶的液体或油性液体中，因此在体内释放时，溶液溶解或乳化产生高表面面积的药物分散度，因而SEG胶囊配制的药物可显示良好的生物利用度；c)因为软明胶胶囊的干外壳可提供一种抵御氧气扩散的屏障，因而软明胶胶囊可预防在长期储存中，对氧化作用敏感的药物降解。
干外壳配方通常含有约40％至60％浓度的明胶、约20％至30％浓度的增塑剂(如甘油、山梨醇或丙二醇)以及约30％至40％浓度的水。也可同时含有其它材料，如防腐剂、染料、遮光剂和矫味剂。液体填充材料包含已溶解、增溶或分散(与助悬剂一起分散，如蜂蜡、氢化蓖麻油或聚乙二醇4000)了的固体药物，或在赋形剂或赋形剂的组合(如矿物油、植物油、甘油三酯、乙二醇、多元醇以及表面活性剂)中的液体药物。
在一个制剂的实例中，软明胶胶囊为2号、白色、不透明的、含有液体填充物的椭圆形明胶胶囊，其液体填充物由溶于Miglyol 812(经分馏的C8-C12椰子油脂肪酸甘油三酯)中的活性成分化合物A以及作为防腐剂的丁基化羟基甲苯(BHT)和丁基化羟基苯甲醚(BHA)组成。软明胶胶囊可配制含有0.01至25mg化合物A，如75或150μg化合物A。软明胶胶囊应避光保存于2至8摄氏度。
含有化合物A或其可药用盐或酯并任选地含有第二种抗良性前列腺增生活性剂的制剂可以通过将各成分混合来制备。
优选在黄光灯下、氮气中制备制剂。
现在，本发明将参照下述非限定性实施例和附图加以说明 附图描述 附
图1显示BPH细胞增殖受骨化三醇和化合物A的抑制。(图A)增加骨化三醇(圆圈)或化合物A(正方形)的浓度(10-18-10-7M)，孵育48小时可导致BPH细胞生长有明显的剂量依赖性抑制(＊与对照相比，P值＜0.01)。ALLFIT分析显示，两种开环甾体物质有着相同的最大细胞生长抑制(Imax＝43±1％)，但效能等级有显著差异(-logIC50化合物A＝15.8±0.3；-logIC50骨化三醇＝10.2±0.6，P值＜0.005)。实验结果以在三个不同实验中(每个实验又进行三次)相对于其相应对照的抑制％表示(平均值±SEM)。(图B)化合物A浓度增加(10-18-10-7M)对T(10nM，正方形)、KGF(10ng/ml，圆圈)或Des(1-3)IGF-I(10ng/ml，三角形)刺激的BPH细胞增殖的影响。在存在所有试验的刺激物时，化合物A均可对BPH细胞生长产生显著抑制(＊与T或GF处理的细胞相比，P值＜0.01)，并且有着相似的最大抑制率Imax＝66.6±7.3％。但是，化合物A抑制T对细胞生长的刺激(-logIC50＝16.4±0.6)较抑制其它两种生长因子对细胞生长的刺激更加有效(-logIC50Des(1-3)IGF-I＝12.7±0.6，-logIC50KGF＝14.2±0.6，P值＜0.0001)。实验结果以在三个不同实验中(每个实验又进行三次)相对于最大刺激的变化％表示(平均值±SEM)。
附图2显示化合物A、环丙孕酮以及非那雄胺对雄激素刺激的BPH细胞生长的影响。在存在T(10nM，图A)或DHT(10nM，图B)时，将BPH细胞与化合物A(1nM)或雄激素拮抗药(非那雄胺，F，1nM；环丙孕酮，Cyp，100nM)一起孵育48小时。图A同时也显示了在未受刺激的BPH细胞中所获得的结果。实验结果以在三个不同实验中(每个实验又进行四次)相对于其相应对照的变化％表示(平均值±SEM)。化合物A和环丙孕酮均可显著阻滞T-和DHT-诱导的细胞生长，而非那雄胺只可有效抑制T诱导的细胞生长。＊与对照相比，P值＜0.01；°与雄激素处理的细胞相比，P值＜0.01。
附图3显示化合物A对人体AR无激动剂或拮抗剂特性。将稳定转染了人体AR的AR缺陷型PC3细胞系以2×104细胞/孔的密度铺于24孔平板上。24小时后，将细胞用AR反应性质粒pLSPP转染。48小时后，将细胞与浓度递增的DHT(正方形)或化合物A(圆圈)一起孵育18小时(图A)；或者在比卡鲁胺(正方形)或化合物A(圆圈)的存在下，将细胞与固定浓度的DHT(3nM)一起孵育18小时(图B)。实验结果(三次转染实验的平均值)以每μg总蛋白的生物发光百分率表示。将DHT 100nM时设定为荧光素酶活性100％以评估激动剂活性(图A)；将DHT 3nM时设定为荧光素酶活性100％以检测拮抗活性(图B)。
附图4显示大鼠前列腺腹叶生长受化合物A或非那雄胺的抑制。图A将阉割并注射了T庚酸盐(30mg/千克体重/周)的大鼠，以口服赋形剂或口服剂量递增的化合物A(10、30、100和300μg/Kg)或非那雄胺(F，10和40mg/Kg)进行处理(每周处理5天，连续处理两周)。其前列腺腹叶重量以相对于未阉割的、赋形剂处理的大鼠前列腺腹叶重量的变化％表示(平均值±SEM)(^P值＜0.01；＊与对照大鼠相比，P值＜0.01；°与补充T的大鼠相比，P值＜0.01)。图B未阉割的成年大鼠以赋形剂(对照)或浓度递增的化合物A(10、30、100和300μg/Kg)或非那雄胺(F，10和40mg/Kg)口服给药处理一个月(每周处理5次，总计给药27次)。其前列腺腹叶重量以相对于对照的、赋形剂处理的大鼠前列腺腹叶重量的变化％表示(平均值±SEM)(＊与对照大鼠相比，P值＜0.01)。
附图5显示在大鼠前列腺腹叶中，化合物A和非那雄胺对凝聚素(clusterin)基因表达的影响。图A赋形剂处理的未阉割大鼠前列腺腹叶中(泳道1)或睾丸切除的大鼠前列腺腹叶中(泳道2)的凝聚素mRNA表达的Northern分析。泳道3-6显示了在补充两周T庚酸盐(30mg/千克体重)的睾丸切除大鼠中，口服赋形剂(泳道3)、化合物A(300μg/Kg，泳道4和100μg/Kg，泳道5)或非那雄胺(40mg/千克体重，泳道6)处理后的凝聚素基因表达。每一泳道加量10μg的总RNA。印迹下方显示相应的GAPDH表达和凝胶的溴乙锭染色。印迹代表两个独立的实验。图B用赋形剂(泳道1)、浓度递增的化合物A(10、30μg/Kg，泳道2和3)或非那雄胺(40mg/Kg，泳道4)口服处理一个月(每周处理5次，共计给药27次)的成年未阉割大鼠前列腺腹叶中，凝聚素mRNA表达的Northern分析。每一泳道加量10μg的总RNA。印迹下方显示相应的GAPDH表达和凝胶的溴乙锭染色。印迹代表两个独立的实验。
附图6显示化合物A对阉割并补充T的大鼠前列腺腹叶的形态学影响。图A、B、C和E为从整个前列腺横切面所获取的，用抗大鼠凝聚素的单克隆抗体免疫染色，并经苏木素复染的代表性视野。在赋形剂处理的于四天前阉割的大鼠中，可在萎缩的立方上皮细胞胞浆中检测到凝聚素标记(图A，10×)。在补充两周T后(图B，10×)，几乎所有的凝聚素标记均消失。相反，在使用T和不同剂量的化合物A(100μg/Kg，图C；300μg/Kg，图E，黑箭头)处理的大鼠中，凝聚素阳性细胞仍然存在。为突出通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)所确定的DNA碎裂，图D和F显示了与图C和E连续的切面。两周化合物A(100μg/Kg，图D；300μg/Kg，图F)的处理(9次给药)在大部分的上皮和基质细胞中引起了大规模的凋亡。应注意(黑箭头)，所有凝聚素阳性细胞均产生凋亡，同时与此相一致的一部分凝聚素未标记的细胞也显示核碎裂。
附图7显示化合物A和非那雄胺对未阉割的成年大鼠前列腺的形态学影响。图A、B、D、E、F和H为从整个前列腺横切面所获取的，用抗大鼠凝聚素的单克隆抗体免疫染色，并经苏木素复染的代表性视野。在图A中(10×)，一抗被省略了。图B(10×)显示，在未处理的成年大鼠中，在一些腺体中只有极少的上皮细胞被标记(黑箭头)。相反的，在经过浓度递增的化合物A处理后的大鼠前列腺中，显示出萎缩特点的立方上皮细胞被凝聚素剂量依赖性的染色(见黑箭头，10μg/Kg，图D；30μg/Kg，图E；100μg/Kg，图F，10×)。在用非那雄胺(40mg/Kg，图H，10×)处理的大鼠中获得了相似的结果。为突出通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)所确定的DNA碎裂，图C、G和I分别显示了与图B、D和F中相连续的切片。应注意(黑箭头)，所有凝聚素阳性细胞均产生凋亡，同时与此相一致的一部分凝聚素未标记的细胞也显示核碎裂。
附图8显示狗的慢性毒性实验结果。与安慰剂相比，在使用化合物A处理9个月后，前列腺重量可显示有明显减轻。
附图9显示狗的慢性毒性实验结果。与安慰剂相比，在从化合物A处理中恢复后，前列腺重量减轻。
附图10显示化合物A对睾酮刺激的膀胱细胞生长的影响。“hB”＝人体膀胱。
附图11显示化合物A和其它对照的化合物对受刺激的和基础膀胱细胞生长的影响。“T 10nM”＝睾酮；“F 1nM”＝非那雄胺。
附图12显示维生素D化合物对膀胱重量的影响。
附图13显示维生素D化合物对自发性非排尿收缩频率的影响 附图14显示维生素D化合物对自发性非排尿收缩幅度的影响。
附图15显示维生素D化合物对排尿压力的影响。
附图16显示维生素D化合物对残余尿的影响。
附图17显示维生素D化合物对膀胱条的EFS(电场刺激)收缩反应的影响。
实施例 实施例1化合物A在体外对BPH细胞的影响 材料和方法 材料 最低基础培养基(MEM)和DMEM-F121∶1混和液、Ham’s F12培养液、磷酸盐缓冲液(PBS)、牛血清白蛋白(BSA)第五部分、谷酰胺、geneticine、胶原酶IV、维生素D3、睾酮(T)、二氢睾酮(DHT)、环丙孕酮、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸3’-磷酸(NADPH)、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲磺酰氟(PMSF)以及测量血钙的试剂盒购自Sigma公司(St.Louis，MO)。蛋白测量试剂盒购自Bio-Rad Laboratories公司(Hercμles，CA)。胎牛血清(FBS)购自Unipath公司(Bedford，UK)。β链特异性单克隆抗大鼠凝聚素抗体(小鼠单克隆免疫球蛋白IgG)购自UPSTATE Biotechnology(Lake Placid，NY)。Apop Tag原位末端标记(ISEL)试剂盒购自Oncor(MD，USA)。CHO1827和CHO 1829由Serono Internationl(Geneva，瑞士)提供。Instagel plus购自Packard(St Louis，MO)。非那雄胺(纯药)(17β-(N，叔丁基)氨甲酰-4-氮杂-5α-雄甾-1-烯-3-酮)由Merck Sharp & Dohme Reaserch Laboratories(Rahway，NJ)惠赠。比卡鲁胺由AstraZeneca(AstraZeneca，米兰，意大利)惠赠。类似物1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3(化合物A)由Bioxell(Bioxell，米兰，意大利)提供。角质细胞生长因子(KGF)购自Perpro Tech EC(伦敦，英国)，人体类胰岛素生长因子-1[Des(1-3)IGF-I]购自GroPep有限公司(Adelaide，澳大利亚)。用于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)的原位细胞死亡检测试剂盒POD购自Roche Diagnostics Corpotation(Indianapolis，IN)。用于细胞培养基的塑料器皿购自Falcon(Oxnard，CA)。用于生长培养基制备的一次性过滤部件购自PBI International(米兰，意大利)。用于荧光素酶转染的Lipofectamine 2000及Opti-MEM I培养基购自Invitrogen Life Technologies(San Giμliano Milanese，米兰，意大利)。薄层色谱(TLC)硅胶板获自Merck(Darmstad，德国)。庚酸睾酮(T庚酸盐)购自GeymonaT(Anagni，意大利)。Coat-A-
总睾酮检测试剂盒购自Medical System(Genova Struppa，意大利)。大鼠黄体生成素(rLH)[125I]分析系统购自Anersham Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)。
BPH细胞 如文献所述(Crescioli C等人，《临床和内分泌代谢杂志》(Journal ofClinical and Endocrinology)(2000)85第2576-2583页)制备、保存以及使用的人体BPH细胞得自5名患者的前列腺组织，这5名患者在知情同意并经当地伦理委员会批准后，行BPH的耻上腺体切除术。在手术前三个月内，这些患者均未接受任何药物治疗。
5α还原酶转染的CHO-1827和CHO-1829细胞系 分别转染了5α还原酶1(5αR-1)或2(5αR-2)的CHO-1827和CHO-1829细胞(参见Steers W，《泌尿科学》(Urology)(2001)58第17-24页)，保存于补充有5％FCS的Ham’s F12培养液中。
AR-转染的PC3细胞系 如文献所述(参见Bonaccorsi L等人，《内分泌科学》(Endocrinology)(2000)141第3172-3182页)，使稳定转染了质粒p5HbhAR-A (含有人体雄激素受体(hAR))的人体前列腺癌PC3细胞在75cm2培养瓶的Ham’s F12培养液中生长，培养液中含有50μg/ml的geneticine、10％FCS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100mg/ml)。
BPH组织 用于结合试验的前列腺组织获自行BPH耻上腺体切除术的患者。患者在手术前3个月内，未行任何药物治疗。手术后，立即将所取组织置于液氮中，并于-80摄氏度保存直至进行加工处理。
大鼠组织 快速切除大鼠前列腺腹叶，称重，并立即于干冰中冷冻。在14微米厚连续的低温切片中进行免疫组织化学实验以直接比较组织形态学、凝聚素表达和通过TUNEL的凋亡定位。收集4至6只大鼠的前列腺腹叶用于总RNA提取和Western印迹分析。
BPH细胞增殖实验 将4×104BPH细胞接种于12孔平板上的生长培养液中以用于所有的细胞增殖实验，先使细胞于含0.1％BSA的无酚红、无血清培养液中受饿24小时，然后再使用特定刺激物处理48小时。使用含0.1％BSA的无酚红、无血清培养液中的细胞作为对照。此后，如先前所报道的(参见Crescioli C等人，《临床和内分泌代谢杂志》(Journal of Clinical and Endocrinology)(2000)85第2576-2583页)，使用胰蛋白酶消化细胞，并且每一实验点均得自血球计数器计数，每孔至少取六个不同视野的平均值。使用浓度递增(10-18-10-7M)的骨化三醇或化合物A，在不含或含有固定浓度T(10nM)、KGF或Des(1-3)IGF-I(10ng/ml)的条件下进行实验。同时，使用固定浓度的雄激素(10nM)，在不含或含有化合物A(1nM、10nM)或抗雄激素的非那雄胺(F，1nM)和环丙孕酮(Cyp，100nM)的条件下进行生长试验。同时也使用固定浓度的T(10nM)或GF(10ng/ml)，在不含或含有化合物A(10nM)的条件下进行生长试验。在同一实验中，每一实验点均重复三次或四次，同时每一实验进行三次。实验结果以相对于最大T或GF诱导的刺激的变化％表示(平均值±SEM)。
原位末端标记(ISEL) 依照制造商提供的使用说明，使用Apop Tag原位凋亡检测试剂盒过氧化物酶对BPH细胞进行ISEL。在不含或含有化合物A(10nM)的条件下，将细胞与T(10nM)、KGF(10ng/ml)或Des(1-3)IGF-I(10ng/ml)一起孵育。在五片不同的切片中计算凋亡细胞的百分率(染色细胞的数量除以总细胞数量)，每一切片至少计算五个不同的视野。实验结果以得自三次不同实验的平均值±SEM表示。
5α还原酶抑制试验 如文献所述(参见Guarna A等人，《药物化学杂志》(Journal of MedicinalChemistry)(2000)43第3718-3735页)，使用转染了5α-1的CHO 1827细胞或转染了5α-2的CHO 1829细胞进行5α还原酶抑制试验。在10-9至10-5M浓度范围内添加化合物A，每一实验同时使用非那雄胺作为对照抑制剂。
结合试验 如前所报道的(参见Crescioli C等人，《内分泌科学》(Endocrinology)(2003)144第3046-3057页)，在BPH碎片的细胞液成分上进行结合试验(最终蛋白浓度1.8mg/ml)。在不含或存在([3H]-R18811nM)浓度递增的冷R1881(10-10-10-6M)、DHT(10-10-10-6M)、T(10-10-10-6M)、比卡鲁胺(10-10-10-4M)以及化合物A(10-10-10-4M)的条件下，将细胞液成分与浓度递增(0.125、0.25、0.5、1nM)的[3H]-R1881(比活性83.5Ci/mmol)一起孵育。为防止R1881与黄体酮受体结合，向每支试管中添加1μM的曲安奈德。如前所述(参见Crescioli C等人，《内分泌科学》(Endocrinology)(2003)144第3046-3057页)进行分离结合和未结合的配体。使用BSA作为标准，通过已知的Bradford法确定蛋白质含量。
荧光素酶实验 将稳定转染人体AR的PC3细胞以2×104的密度，铺于24孔板上添加了10％FCS的Ham’s F 12培养液中。24小时后，根据制造商所提供的使用说明，使用Lipofectamine 2000(1mg/ml)，用含有已结合至萤火虫荧光素酶基因的野生型MMTV-LTR序列结构的pLSPP质粒(750ng/孔)转染细胞。(参见Pazzagli M等人，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)(1992)204第315至323页)。48小时后，将细胞与DHT (10-12-10-6M)或在存在3nM的DHT的条件下与比卡鲁胺(10-9-10-5M)以及等摩尔浓度的化合物A一起孵育18小时。将类固醇和化合物A类似物溶于乙醇。与乙醇一起孵育的转染细胞只可作为阳性对照。
根据制造商所提供的使用说明，使用Berthold光度计(LuciferaseAssay System，Promega，米兰，意大利)进行荧光素酶实验。使用200μl裂解缓冲液直接在平板中裂解细胞。在加入100μl的虫荧光素后，取20μl细胞裂解液测定其荧光素酶活性10秒钟。取20μl细胞裂解液进行总蛋白测定。一式两份地进行至少三次独立实验。
结果 将BPH细胞与浓度递增的骨化三醇或化合物A一起孵育可抑制细胞生长(附图1图A)。两种化合物均可剂量依赖性地抑制细胞增殖。ALLFIT(参见De Lean A等人，《美国生理学杂志》(American Journal of Physiology)(1978)235第E97至E102页)分析显示，尽管骨化三醇和化合物A (图中的“Cmpd A”)的最大细胞生长抑制率之间没有显著的统计学差异(Imax＝43±1％)，然而其相对抑制能力，化合物A要较骨化三醇有效数个对数单位(-logIC50化合物A＝15.8±0.3；-logIC50骨化三醇＝10.2±0.6，P值＜0.005)。
睾酮(T)和生长因子(GF)(如Des(1-3)IGF-I或KGF)可显著增加BPH细胞的增殖(P值＜0.01)(T，156±8％；Des(1-3)IGF-I，194±6％；KGF，183±5％)。在细胞经T或GF刺激了48小时后(附图1，图B)，化合物A的抑制效果甚至更加显著(Imax＝66.6±7.3％)。抑制曲线的数学模拟(参见DeLean A等人，《美国生理学杂志》(American Journal of Physiology)(1978)235第E97至E102页)显示，化合物A抑制T对细胞生长的刺激(-logIC50＝16.4±0.6)较抑制其它两种生长因子对细胞生长的刺激更加有效(-logIC50Des(1-3)IGF-I＝12.7±0.6，-logIC50KGF＝14.2±0.6，P值＜0.0001)。
化合物A(1nM)不只可以拮抗T-刺激的BPH细胞增殖，也可拮抗DHT-刺激的BPH细胞增殖，并且其拮抗的程度与AR拮抗剂环丙孕酮相似(Cyp，100nM；附图2，图A和B)。相反，5α还原酶抑制剂非那雄胺(F，1nM)只可拮抗T诱导的细胞生长(附图2，图A)。此外，化合物A甚至可以减慢非雄激素刺激的细胞生长(附图2，图A)。
为评估化合物A可能的抗雄激素特性，除BPH细胞生长抑制外，我们还研究了其与AR的相互作用。首先，我们使用合成的雄激素[3H]-R1881作为标记的配体，通过在人体BPH组织匀浆中进行竞争性试验，排除了化合物A与AR相结合的可能。数据的LIGAND分析(参见Munson PJ等人，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)(1980)107第220至239页)显示，非标记的R1881、DHT、T以及AR拮抗剂比卡鲁胺完全取代[3H]-R1881结合(表I)。相反，在任何检测浓度，化合物A均不竞争[3H]-R1881结合(表I)。使用荧光素酶报道基因分析可证实并拓展这些结果。在表达结合至荧光素酶报道基因的全长AR的PC3细胞中，DHT刺激荧光素酶活性剂量依赖性增加(EC50＝2±1.3nM，图A)，而比卡鲁胺抑制受DHT刺激的活性(IC50＝194±80nM，图B)。在此系统中，增加化合物A的浓度既不刺激也不抑制AR介导的荧光素酶活性增加(附图3)。最后，为检验化合物A是否与DHT(T的活性代谢物)的形成发生相互作用，我们在转染了1类和2类5α还原酶的CHO细胞中进行了实验，并将结果与使用非那雄胺(F)所进行的实验结果进行了比较。结果为F以预期的IC50抑制T转化为DHT(1类5α还原酶IC50＝659±100nM，2类5α还原酶IC50＝53.7±11nM，n＝3)，而直至微摩尔范围，化合物A也不妨碍任一种同工酶的转化(数据未显示)。
表I在人体BPH组织匀浆中，通过[3H]-R1881结合检测得到的雄激素激动剂(R1881、DHT、T)、拮抗剂(比卡鲁胺)以及化合物A的亲和常数。
化合物A在BPH细胞中的作用应归于(至少部分归于)通过ISEL所检测到的细胞程序死亡的激活(n＝3，表II)。在暴露于10nM化合物A 48小时后，凋亡细胞核的百分数显著升高(270％)(与对照相比，P值＜0.01)。相反的，与未经处理的细胞相比，使用T(10nM)或GF(10ng/ml)处理可显著降低发生凋亡的BPH细胞数(Des(1-3)IGF-I＝-42％；KGF＝-54％；T＝-27％)。但是，即使在存在GF或T时，化合物A也可诱导ISEL-阳性的BPH细胞数量持续(250％以上)和显著(p＜0.01)的升高。
凋亡指数(％) 表II在BPH细胞中，化合物A(10nM)、GF(10ng/ml)或T(10nM)对DNA碎裂的作用。凋亡指数(％)代表在每张切片的至少5个不同视野中，通过ISEL检测得到的染色细胞数量占总的BPH细胞百分数。在三个独立的实验中，实验结果以平均值±SEM的形式表示。化合物A能够在未经处理的BPH细胞以及与GF或T一起孵育的BPH细胞中，均诱导凋亡(a与对照相比，P值＜0.01；b与经化合物A处理的细胞相比，P值＜0.01；c与经GF或T处理的细胞相比，P值＜0.01)。
实施例2化合物A在体内前列腺生长模型中的抗增殖特性 动物实验方案 雄性斯普拉格-道利鼠(28日龄)购自Charles River Laboratories(Calco，Lecco，意大利)。所有动物实验均依照公认的动物保护标准进行。在氯胺酮/赛拉嗪麻醉下，经阴囊路径对大鼠进行阉割。在阉割三天后，不使用T庚酸盐对大鼠进行处理，或分别在两周内经皮下注射的方式使用T庚酸盐(30mg/Kg)对大鼠进行处理(每组5-8只大鼠)。使用赋形剂(Miglyol812)、化合物A(10、30、100以及300μg/Kg)或非那雄胺(10和40mg/Kg)对大鼠口服给药处理，第一周，处理5天；第二周，处理四天，共计给药9次，一日后处死大鼠。
或者，除非另有说明，否则给以成年未阉割的雄性斯普拉格-道利鼠(体重250g)口服赋形剂(Miglyol 812)、化合物A(10、30、100以及300μg/Kg)或非那雄胺(10和40mg/Kg)，先连续给药五周(每周给药5天)，在接下来的两周各在第六天给药一次(共计给药27次)。在每一实验方案结束时，获取动物血液以用于钙和激素检测。
Northern杂交分析 使用来自Molecμlar System(San Diego，CA)的RNAFast提取总RNA。依照所报道的步骤(Bettuzzi等人，《生物化学杂志》(Biochemical Journal)(1989)，257，第293-296页以及Marinelli等人，《生物化学和细胞生物学》(Biochemical and Cell Biology)(1994)，72，第515-521页)准备印迹、标记、杂交条件和探针。使用LKB μltrascan XL光密度计，通过光密度扫描获取放射自显影定量。
免疫组织化学 如文献所述(Astancolle等人，《内分泌科学》(Endocrinology)(2000)167第197-204页)，同时平行处理获自对照大鼠和处理后大鼠的所有低温切片。对于每一实验条件，检查来自三个不同大鼠前列腺的三个不同切片。阴性对照经反应中排除特异抗体制得，其显示无特异染色。使用苏木素对切片进行复染，并使用EukitT(O.Kindle GmbH&Co，德国)固定盖玻片。通过显微镜，使用CCD相机获取高倍放大彩色数字影像。
原位DNA碎裂分析(TUNEL) 如制造商所推荐的，使用原位细胞死亡检测试剂盒In Stitu Cell DeathDetection Kit(POD，Roche)，通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)对前列腺低温切片中的DNA碎裂进行确定。通过显微镜，使用CCD相机获取其高倍放大彩色数字影像，并通过影像对TUNEL阳性调亡细胞核进行记录。使用伊红对切片进行复染，并使用Eukitt(O.Kindle GmbH & Co，德国)固定盖玻片。
钙测定 使用市面上可购得的比色测定装置(Sigma)，依照制造商所提供的使用说明，测定血清钙水平。
睾酮和rLH测定 通过市面上可购得的放射免疫测定试剂盒，依照制造商所提供的使用说明，测定血清T和rLH水平。欲测定大鼠中血清T水平，首先向样本中添加4体积的乙醚，轻柔翻转混匀15分钟，然后于2000rpm离心5分钟。在干冰中冷冻溶液水相，同时回收有机相并在氮气中蒸干，最后按照如下比例在实验缓冲液中重新溶解干燥后的提取物在未阉割大鼠中(1∶1体积)，在阉割大鼠中(4∶1体积)。
统计分析 在合适时，使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)及成对或不成对学生t-检验进行统计分析。使用计算机化程序LIGAND对结合数据进行分析(Munson等人，《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)(1980)107第220-139页)。
使用计算机程序ALLFIT(DeLean等人，《美国生理学杂志》(AmericanJournal of Physiology)(1978)235第E97-E102页)对S形剂量反应曲线进行分析，以获得半最大抑制值(IC50)和半最大刺激值(EC50)以及最大抑制值(Imax)和最大刺激值(Emax)。数据以(平均值±SEM)表示。
结果 为测试化合物A在体内前列腺生长模型中的抗增殖特性，将阉割和未阉割的大鼠以浓度递增的化合物A(10-300μg/Kg)或非那雄胺(F)(10，40mg/Kg)口服处理。如附图4图A所示，阉割显著的减小前列腺腹叶重量，而两周的庚酸睾酮(T)处理(30mg/Kg)不仅使前列腺腹叶完全复原，还进一步刺激了其生长。在任何测试的剂量时，化合物A均可完全阻滞被T刺激的前列腺过度生长，减轻前列腺腹叶重量，使其低于未处理大鼠的前列腺腹叶重量。使用非那雄胺(10、40mg/Kg)可获得相似的结果。使用化合物A处理未阉割成年大鼠一个月可显著降低其前列腺腹叶重量，并在测试的最高剂量(300μg/Kg)时获得最大的重量减轻(30％)。在此剂量时，化合物A对前列腺生长的抑制效果与10或40mg/Kg非那雄胺所诱导的抑制效果相当(附图4图B)。在所有的实验方案中，口服不同剂量的化合物A时，仅在所试验的最高剂量(300μg/Kg)时，化合物A可导致很弱的血钙升高(表III)。尚未观察到其它明确的副反应。
表III在不同剂量(10、30、100以及300μg/Kg)的化合物A处理后，经T替代治疗的被阉割大鼠的血钙(mg/dl)。与对照相比，化合物A不会改变经T庚酸盐替代治疗(30mg/Kg/周)的被阉割大鼠的血清钙水平。在未阉割的大鼠中也可获得相似结果(未显示)。结果代表大鼠/组的平均值±SEM。
化合物A可诱导前列腺重量减轻，为更好的理解这一现象之下的分子机制，通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)来鉴定凝聚素基因和蛋白的表达以及凋亡的形态学标志。凝聚素为一普遍存在的产物基因，并与细胞周期阻滞及凋亡严格相关，其表达可被雄激素下调。附图5图A显示在补充T及未补充T的睾丸切除大鼠前列腺中，通过Northern分析所检测得到的凝聚素mRNA的表达。阉割可显著上调凝聚素mRNA数量，而此效果在给以两周的T后可被完全逆转。同时给以不同浓度的化合物A(300和100μg/Kg)或F(40mg/Kg)处理可部分阻滞T诱导的凝聚素基因表达下调。在未阉割的大鼠中(附图5图B)，给以一个月的不同浓度的化合物A(30和100μg/Kg)处理可在前列腺中引起凝聚素基因表达的持续升高，且此基因表达增强与40mg/Kg的F所诱导的基因表达增强相当，甚至更高。
附图6显示睾丸切除大鼠前列腺中凝聚素的局部表达。阉割在前列腺中引起了显著和广泛的萎缩，几乎所有面对腺体管腔的立方上皮细胞均为凝聚素阳性(图A)。T替代治疗(图B)可逆转萎缩的形态学标志，并持续减弱凝聚素染色。同时给以化合物A处理可预防此效果(图C和E)。图D和F显示与图C和E中相邻切片中的TUNEL结果。化合物A处理(图D100μg/Kg，图F 300μg/Kg)在上皮和基质细胞中导致了明显的细胞核碎裂，并且在凝聚素阳性和阴性细胞中均可检测到凋亡。附图7的前两张图显示在略去(图A)和未略去(图B)一抗时，经凝聚素检测处理过的未阉割大鼠前列腺的形态。应注意在未经处理的成年大鼠前列腺中，凝聚素标记几乎完全缺失(图B)，细胞核碎裂也和此情况相同(TUNEL，图C)。相反，不同剂量的化合物A处理可诱导凝聚素表达(图D-F)及凋亡(图C、G和I)。用于比较，图F显示前列腺中非那雄胺(40mg/Kg)对凝聚素阳性的影响。
为排除化合物A通过影响垂体或睾丸功能从而减慢体内前列腺生长之可能，对经阉割和未阉割大鼠中的黄体生成素(rLH)和T的血清水平进行了测定。如预期所料(表IV，表A)，阉割显著降低T的血清水平，而升高rLH的血清水平。给以T庚酸盐(30mg/Kg)处理两周可完全逆转阉割的影响。T替代治疗的经阉割大鼠，给以化合物A(100和300μg/Kg)口服处理不显著影响其rLH或T的血清水平。在未阉割大鼠中也获得相似结果(表IV，表B)。实际上，未阉割大鼠长期(一个月)给以化合物A(10、30、100和300μg/Kg)或F(40mg/Kg)不改变rLH或T的血清水平。
表A 表B 表IV T替代治疗的阉割大鼠(表A)或未阉割大鼠(表B)中，使用不同剂量的化合物A处理后的rLH(ng/ml)和T(nM)血清水平。表A阉割显著降低血清T水平(＊与对照相比，P值＜0.01)，而升高血清rLH水平(＊与对照相比，P值＜0.05)。使用T庚酸盐治疗后(30mg/Kg/周)，rLH和T的血清水平恢复。在所有的测试剂量下，化合物A均不显著影响任何rLH或T的血清水平。表B长期(一个月)给以F(40mg/Kg)或化合物A(10、30、100μg/Kg)在未阉割大鼠中不改变任何rLH或T的血清水平。
本实验表明，化合物A可减小未阉割大鼠的前列腺大小，其减小程度与使用非那雄胺相似。另外，如非那雄胺一样，化合物A可消除睾酮的体外和体内增殖活性。但是，与非那雄胺不同，化合物A不抑制1类或2类5α还原酶活性，同时不仅可对抗T诱导的BPH细胞生长，还可对抗DHT诱导的BPH细胞生长。正如化合物A不能与AR相结合，在AR转染的PC3细胞中也不能作为AR激动剂或拮抗剂所示，化合物A的这些抗雄激素特性与和AR的相互作用无关。此外，因为在大鼠中，每日给以化合物A直至一个月，其促性腺激素和T的血浆水平没有改变，因而化合物A不影响性激素的分泌。因此，化合物A作用于下游的AR受体-配体相互作用。不希望被理论所束缚，此作用最可能通过中断睾酮-生长因子的交流而发生。
非常低浓度的化合物A不仅能完全拮抗T刺激的BPH细胞增殖，还能完全拮抗另外两种最重要的前列腺内生长因子所诱导的细胞增殖IGF-I和KGF。此外，即使在存在T或GF时，化合物A也可在BPH细胞中诱导凋亡。同时，在未阉割的大鼠以及补充T的睾丸切除大鼠中，化合物A所诱导的程序死亡均很明显，并且其特征为弥漫出现的DNA碎裂，并伴随有凝聚素基因和蛋白表达的增加。凝聚素系一种前列腺中严格受雄激素调节的蛋白(Bettuzzi等人，《生物化学杂志》(Biochemical Journal)(1989)，257，第293-296页)。尽管对凝聚素的功能仍未很好了解，但在腺体萎缩(Bettuzzi等人，《肿瘤学》(Oncogene)(2002)，21，第4328-4334页以及Betuzzi等人，《内分泌杂志》(Journal of Endocrinology)(1992)，132，第361-367页)和凋亡(Leskov等人《生物化学杂志》(BiochemicalJournal)(2003)，278，第11590-11600页)时，其显著上调。因此，化合物A所产生的凝聚素诱导与该化合物在前列腺细胞中抑制增殖和诱导凋亡的性能一致。
总之，此实验显示，在不同的实验模型中，化合物A可有效减慢前列腺细胞生长。
实施例3经化合物A处理的健康狗中前列腺重量的减轻。
在四组雄性比格犬中进行了一项9个月的毒性实验。在实验中，每日通过管饲法口服施用0.5μg、1.5μg和5μg/千克体重/天的化合物A(在赋形剂Miglyol 812中)或单独使用赋形剂进行处理。对于接受最高剂量(5μg)的组，在处理后再接以两个月的恢复期，然后再测量前列腺重量。除全部有利的毒性资料外，在使用化合物A处理结束时(参见附图8)和恢复期后(参见附图9)，还观察到较低的前列腺重量。通过单尾学生t检验对恢复期后所得的结果进行统计学分析，并发现在化合物A和赋形剂之间有显著差异(P值＜0.05)。这些结果进一步表明化合物A在体内减小前列腺大小的能力。
实施例4软明胶胶囊的口服剂量形式 在黄光灯下、氮气中配制用于口服给药的胶囊，所述胶囊含有填充在软明胶胶囊中的在150mg经分馏椰子油(例如Miglyol 812)中的0.01至25.0mg化合物A以及0.015mg丁基化羟基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羟基苯甲醚(BHA)。
按照以下步骤制备胶囊 1.将BHT和BHA悬浮于经分馏的椰子油(如Miglyol 812)中，并搅拌加热至约50摄氏度，直至其溶解。
2.在50摄氏度，将化合物A溶解于步骤1中的溶液中。
3.将步骤2所得溶液冷却至室温。
4.将步骤3所得溶液装入软明胶胶囊中。
避自然光并在氮气保护中进行所有制造步骤。
实施例4A软明胶胶囊的口服剂量形式 在黄光灯下、氮气中配制用于口服给药的胶囊将150mg经分馏椰子油(Miglyol 812)中的150μg化合物A以及0.015mg丁基化羟基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羟基苯甲醚(BHA)装入软明胶胶囊中。
实施例4B软明胶胶囊的口服剂量形式 在黄光灯下、氮气中配制用于口服给药的胶囊将150mg经分馏椰子油(Miglyol 812)中的75μg化合物A以及0.015mg丁基化羟基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羟基苯甲醚(BHA)装入软明胶胶囊中。
实施例5人体临床试验中前列腺重量的减轻 在患有BPH的患者中进行随机、双盲、安慰剂对照、平行组试验以确定化合物A(1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3)的作用。
其主要入组标准为经诊断患有BPH且经直肠超声(TRUS)确定其前列腺体积＞40ml的男性患者。
统计方法 计划对符合治疗方案人群(Per-Protocol(PP)Popμlation)使用初级效益分析(primary efficacy analyse)，同时，也对意向治疗(intent-to-treat)人群进行相同分析以作支持。可以进行经符合治疗方案分析的患者为满足治疗方案标准并完成了整个试验疗程，同时没有重大治疗方案违背并进行了前列腺体积有效确定的所有随机化患者。满足意向治疗(ITT)人群的患者为接受至少一种试验药物剂量并且具有在基线及12周就诊时的有效前列腺体积数据的所有随机化患者。
对接受至少一种试验药物的所有随机化患者进行安全性分析评定。
在基线时以描述性意义(descriptive meaning)对所有患者评估治疗组可比性。通过Chi-Square检验和ANOVA模型对数据进行处理以得到分类变数和连续变量。
通过常用方法来计算描述统计(descriptive statistics)平均值、标准偏差、连续变量的最小和最大值、以及分类变量的绝对和相对频率。每次治疗和每周就诊均进行描述统计。合并少于4名患者的试验中心。
初级效益变量为通过统一的MRI轴向扫描所测定的前列腺体积变化百分数。将治疗和试验中心作为固定影响，使用ANOVA模型用于分析。
试验参与者每天早晨服用一次150μg的胶囊(如实施例4A所述，在安慰剂的情况下，胶囊中不含药物)。治疗为期12周。所涉及的患者数如下 通过轴向扫描所测定的前列腺体积变化百分数 符合治疗方案人群中的前列腺体积变化百分数为化合物A组为1.89+5.2，安慰剂组为4.99+5.99，P值＜0.0001，有显著意义并支持化合物A。治疗组间差异(化合物A减去安慰剂)的估算值为-7.24，其95％置信限为-9.54和-4.94。中心影响也很显著(p＝0.0176)。对意向治疗人群所进行的相同分析证实了此结果(p＝0.001)，即化合物A可较安慰剂更有效的减小前列腺体积。
与基线前列腺体积＜60ml的患者中治疗组间的差异相比(p＝0.0320)，基线前列腺体积＞＝80ml的患者中治疗组间的差异(p＝＜0.0001)更加明显，特别是在PP人群中。
在年龄在61-70岁之间的患者中，其治疗组间的差异始终也支持化合物A，且较更高龄的患者(年龄＞70岁)更加明显。事实上，在ITT人群中，年龄＞70的患者中的治疗组间差异的显著性p＝0.0540，而其它各年龄组患者p＝＜0.0001。
反应者 在PP人群中，使用化合物A所观察到的反应者比例为27.5％，无变化的比例为65％，只有7.5％的患者无反应。在安慰剂组中，反应者组为零，实际上，患者被合理的分为无变化和无反应组(每组50％病人)。比较各组比例的Chi-Square检验证实了在初级效益变量中所观察到的结果，p＝＜0.0001，即化合物A可较安慰剂更有效的减小前列腺体积。
在ITT人群中，此结果得到了证实在化合物A组中，反应者比例为28.8％，其治疗组间的Chi-Square p值＜0.0001。
在PP人群中，与基线体积相比，反应者患者中平均前列腺体积减小为-6.88±2.5，而在化合物A组和安慰剂组，无变化患者的平均差异分别为-0.35±2.3和0.40±2.0。对于无反应患者，在化合物A组及安慰剂组其平均差异分别为3.93±0.8及7.48±4.9，这证实化合物A控制和减小前列腺体积的效果更显著。
通过统一的旁轴和过渡(transitional)扫描所测定的前列腺体积变化百分比 对旁轴和过渡扫描所采集资料的支持性分析证实了轴向扫描所得结果。特别是，在PP人群中，旁轴扫描所获得的变化百分比为化合物A组中-1.30±6.9，安慰剂组中2.57±6.8，p＝0.0172；而过渡扫描所获得的变化百分比为化合物A组中-0.22±9.6，安慰剂组中6.18±10.9，p＝0.0028。同时，在ITT人群中，治疗组间在减小前列腺体积方面也存在支持化合物A的显著差异。
血清总PSA和激素水平 PP人群中，化合物A组和安慰剂组中的平均PSA变化为0.23±1.3与0.43±1.7。两治疗组间未观察到显著差异(p＝0.2722)。
同样对于睾酮，在PP人群中，化合物A组和安慰剂组中的平均变化分别为0.07±1.5与0.22±1.4，两治疗组间也无显著差异(p＝0.2150)。
对于二氢睾酮，在PP人群中，化合物A组和安慰剂组中所观察到的平均变化分别为-30.77±227.71和-166.76±490.26，两治疗组间也无显著差异(p＝0.7275-PP人群)。
对于PP人群，化合物A组和安慰剂组中LH的平均变化分别为-0.02±1.7和-0.00±1.8，亦无差异(p＝0.9320-PP人群)。
除DHT外，所观察到的PSA和激素水平的平均变化约为零，化合物A不改变激素水平。
在ITT人群中证实了相同结果。
安全性 至少发生一种不良事件的患者数为31名(化合物A组中17名，安慰剂组中14名)；没有患者因为不良事件而退出试验，只有一名安慰剂组患者发生了严重的不良事件急性胆囊炎，经住院治疗处理解决。
与化合物A治疗相关的不良事件患者数为3名(5.26％)，而在安慰剂组中与治疗相关的不良事件患者数为6名(9.68％)。与化合物A相关的不良事件为眩晕、头痛、性欲下降和潮红；而与安慰剂相关的不良事件为尿磷升高、头痛、晕厥、性欲下降(3名患者)、高钙尿症、勃起障碍和热潮红。
尿钙值在试验全程均进行了监测，化合物A组与安慰剂组之间尿钙值并没有显著差异。
结论 本试验研究了化合物A对前列腺大小的影响，在此概念研究(conceptstudy)的预检验中，该药物经证实有效。试验基本变量分析(即前列腺大小的评定)显示，化合物A和安慰剂之间存在显著差异，因而证实了被试验药物能够阻滞疾病的进展。该药物的安全性方面良好，在化合物A和安慰剂之间，不良事件的发生率没有差别，同时，在化合物A组中也未报道发生严重的不良事件。测试药物无任何抗雄激素作用，对PSA水平没有影响，同时对钙离子的体内稳定作用也没有显著影响。
实施例6化合物A对膀胱细胞生长和功能的活性 化合物A显示可有效抑制膀胱细胞的基础生长和经睾酮刺激的生长。该活性以前从未报道过，它是剂量依赖性的，对于1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3(“化合物A”/图中的“Cmpd A”)(对经刺激的细胞)为1.6±7×10-15(参见附图10和附图11)。
化合物A的此作用显著强于在泌尿生殖系统疾病的治疗中所广泛使用的抗雄激素药物非那雄胺的作用(附图11)。
实施例7膀胱出口梗阻模型中化合物A对膀胱功能障碍的作用 实验 材料 1.1动物 雌性斯普拉格-道利鼠，重200-250g 1.2分组 A组BOO大鼠，自梗阻产生一天后开始，使用化合物A处理2周(n＝12) B组BOO大鼠，自梗阻产生一天后开始，使用赋形剂处理2周(n＝12) C组假手术大鼠，自手术一天后开始，使用化合物A处理2周(n＝12) 1.3试验 a)有知觉状态下的膀胱内压测量法(末次给药/赋形剂后约18小时，解除梗阻结扎后12小时)。
b)膀胱重量测量 c)体外研究 2.方法 2.1膀胱出口梗阻(BOO) 通过下腹中线切口暴露膀胱和尿道膀胱连接处。将一0.9mm的金属棒插入近端尿道，然后以3-0丝线沿尿道和金属棒周围紧紧结扎，然后去除金属棒。依照此手术步骤，不施行结扎，进行假手术。13天后，去除结扎，并将一导尿管取道皮下插入膀胱顶中。
2.2膀胱内压测量 在置入导尿管的第二天早晨，不施行任何麻醉或代谢笼约束，进行膀胱内压测量研究。通过连接至力-位移传感器的液体收集器测量排出尿量。在室温下，向膀胱中持续注入盐水。同时，导尿管也连接至一压力传感器。30-60分钟的稳定期后，在实现可重复的排尿模式时，记录为期30分钟的下列参数基础膀胱压力、排尿压力、临界压力、排尿间隔和容量、以及非排尿收缩。在膀胱内压测量结束时，手动测量三次残余尿量。依据所测得数值计算膀胱容量。
2.3体外研究 2.3.1标本。
完成膀胱内压测量后，通过一氧化碳窒息并接以放血处死大鼠。通过下腹中线切口进入腹腔，然后打开耻骨联合。仔细游离解剖膀胱，并立即置于冰冷的Krebs液中，同时切割膀胱条标本。
2.3.2力学活性记录 在膀胱颈水平分离膀胱和尿道，并从逼尿肌的中三分之一制备半环形膀胱条(1×2×5mm)。所有标本在切除后立即使用。
将膀胱条移至5ml含有Krebs液的组织浴中。
在37摄氏度保存Krebs液，并持续鼓入95％O2和5％CO2的混合气泡，使其pH值为7.4。通过丝线结扎，使膀胱条悬挂在两L形钩之间。一个钩子连于可调整被动张力的可动装置上，另一个钩子连于Grass FT03C(Grass Instruments Co，MA，美国)力传感器上。使用Grass多导生理仪(7D)记录等张力。安装后，牵拉膀胱条使其被动张力为4mN(所有标本均同样张力)，在进行下一步实验前，平衡膀胱条45-60分钟。
2.3.3电场刺激 将两铂金电极置于标本两侧以实现电场刺激(EFS)，使用Grass S48或S88刺激器，以选定的频率传输单方波脉冲进行电场刺激。脉冲串的持续时间为5s，脉冲持续时间为0.8ms，刺激间隔2分钟。通过极性变换设备在每一脉冲后，改变电极的极性。
2.3.4步骤 将标本暴露于高K+(124mM)Krebs液直至获得两次可重复的收缩以开始每次实验。然后进行如下实验 a)在没有和存在阿托品时，分别进行神经电刺激并获取频率-响应关系。
b)构建卡巴胆碱和ATP的浓度-响应曲线。
结果 使用上述有效的大鼠膀胱出口梗阻模型测试化合物A控制和治疗膀胱功能障碍的性能。实验目的评估一种维生素D3的类似物(1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3-化合物A，剂量为150μg/Kg/天)是否能预防膀胱肥大和膀胱功能障碍(例如膀胱过度活动症)。
在该模型中，通过手术在放置导尿管的膀胱出口周围进行结扎。这样在拔除导尿管时，膀胱将承受增大的尿道阻力。持续对大鼠进行膀胱内压测量以评估膀胱功能。此外，在电场刺激(EFS)下，体外研究离体膀胱标本对神经刺激和外界刺激反应的收缩特性。
研究下列膀胱内压参数(参见附图12-16) -排尿压力(排尿中的最大膀胱压力) -膀胱容量(排尿后的残余容积加上引起排尿所注入的盐水体积) -排尿量(所排尿液的体积) -残余尿(膀胱容量减去排尿量) 以及 -膀胱内压自发改变的频率和幅度(非排尿收缩)。
在该模型中，所评估的类似物对膀胱功能具有有益作用。该作用在正常膀胱中很明显，并在膀胱出口梗阻模型中得到保持。特别的，在如下参数中观察到相对于赋形剂的显著差异 -自发非排尿收缩的频率和幅度(附图13和14)； -残余尿(使用化合物A无残余尿，附图16)； -排尿压力(附图15)； 此外，体外试验证实了其对膀胱功能的有益作用 -K反应； -EFS反应(附图17)； -卡巴胆碱反应。
最后，使用化合物A观察到膀胱重量轻微减轻(附图12)。
这些数据显示了化合物A(从50μg至300μg的剂量范围-相当于人体中约0.725至5μg/千克体重)在预防和治疗膀胱功能障碍(例如膀胱过度活动症)中的用途，正如例如在患有BPH患者中所显示的。
缩写 T 睾酮 DHT二氢睾酮 GF 生长因子 BPH良性前列腺增生 PP 符合治疗方案 ITT意向治疗 ANOVA 方差分析 TRUS 经直肠超声 BOO膀胱出口梗阻 AR 雄激素受体 PSA前列腺特异性抗原 本申请中所涉及的所有参考文献包括专利及专利申请均尽可能最大程度的引入本文作为参考。
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权利要求
权利要求
1.包含50-150μg 1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3的单位剂量药物制剂。
2.权利要求1所述的包含50-150μg 1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3的单位剂量药物制剂，条件是不包括50μg。
3.权利要求1或权利要求2所述的单位剂量药物制剂，其包含75-150μg 1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3。
4.权利要求1至3任意一项所述的单位剂量药物制剂，其包含75μg1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3。
5.权利要求1至3任意一项所述的单位剂量药物制剂，其包含150μg1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3。
6.用于口服给药的权利要求1至5任意一项所述的单位剂量药物制剂。
7.用于口服给药的权利要求6所述的单位剂量药物制剂，其为片剂或胶囊的形式。
8.权利要求1至7任意一项所述的单位剂量药物制剂，其包含溶解于经分馏的椰子油中的1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3以及一种或多种防腐剂。
9.权利要求8所述的单位剂量药物制剂，其中经分馏的椰子油为Miglyol 812。
10.权利要求8或权利要求9所述的单位剂量药物制剂，其中的防腐剂选自丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚以及其混合物。
11.权利要求9所述的单位剂量药物制剂，其在150mg经分馏的椰子油(Miglyol 812)中包含150μg化合物A以及0.015mg丁基化羟基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羟基苯甲醚(BHA)。
12.权利要求9所述的单位剂量药物制剂，其在150mg经分馏的椰子油(Miglyol 812)中包含75μg化合物A以及0.015mg丁基化羟基甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羟基苯甲醚(BHA)。
13.在其中填充有权利要求11或权利要求12所述的单位剂量药物制剂的软明胶胶囊。
14.权利要求1至12任意一项所述的单位剂量药物制剂，其包含1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3以及第二种或另外的抗良性前列腺增生活性剂。
15.权利要求1至12任意一项所述的单位剂量药物制剂在生产用于每天给药一次的药物中的用途。
16.权利要求15所述的单位剂量药物制剂的用途，用于生产治疗良性前列腺增生的药物。
全文摘要
本发明涉及1-α-氟-25-羟基-16，23E-二烯-26，27-双高-20-表-维生素D3或其可药用盐或酯在制备用于预防和/或治疗良性前列腺增生(BPH)及相关症状的药物中的用途。
文档编号A61K31/593GK101352446SQ20081021251
公开日2009年1月28日 申请日期2004年9月24日 优先权日2003年9月24日
发明者L·阿多里尼, E·科利 申请人:拜奥克塞尔有限公司