专利名称：新颖抗高血压肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于一种抗高血压多肽。
背景技术：
高血压，在2000年的时候全球约有26.4%的成年人具有该症状，预 期2025年该比例将会上升为29.2% (Kearney d a/.， 2005，丄""cW. 365:217-223)，此症状被认为是心血管疾病，例如心肌梗塞(myocardial infraction)、中风、心脏衰竭(heart failure)、末期糖尿病等疾病的重要危险 因子。每降低5 mmHg的血压等同于减少16%心血管疾病发生的机率 (FitzGeraldeffl/.， 134: 980S-988S)。美国第七届高血压联合委
员会(The seventh Joint National Committee, JNC7)的报告中指出，当收縮 压 (systolic blood pressure)/舒张压 (diastolic blood prssure)的值高于 115/75 mmHg的时候，心脏疾病和中风发生的机率也会相形提高。该学会 建议一些为高血压潜在族群的人(收縮压为120-139 mmHg或是舒张压为 80-89 mmHg),应该将生活形态改为健康的方式来预防血压的提升和心血 管疾病的发生。因此，在全球上有关能帮助控制血压的成分或营养剂的认 识和需求已经增加。
许多来自于牛奶蛋白质中具有生物活性的多肽，已被发现具有促进健 康的营养潜力。这些多肽能够直接影响许多生物机制，例如抗菌、抗凝 血、免疫调节、携带矿物质、鸦片类似物或是血管收縮素转化酶 (angiotensin I-converting enzyme, ACE)的抑制育g力(Clare and Swaisgood, 2000, /DmVy <SW. 83: 1187-1195)。在这些生理机转中，血管收縮素转化 酶抑制多肽受到高度的重视，且已有广泛的研究在于其预防高血压上的应 用上(Li " a/.， 2004， A^r. T 仏24: 469-486)。 血管收縮素转化酶是一个
4位于不同组织上的胞外酶，并且在肾素-血管收縮素系统
(renin-angiotensin)、血管舒张素-激肽系统(kallikrein-kinin)和免疫系统上 扮演重要的角色。这个酵素负责将血管收縮素-1转换为可促进血管收縮的 血管收縮素-2，同时也能分解会造成血管扩张的缓激肽(bmdykinin)和脑 啡肽(enkephalins)。因此，抑制血管收縮素转化酶被认为是个有效治疗高 血压的标的。直到今日，许多许多严重的副作用，例如低血压、钾浓度 的提升、降低眼睛功能、咳嗽、血管水肿、皮肤起疹以及致畸胎都被认为 跟抑制血管收縮素反转酶的药品有关。不过，来自于天然食物中的血管收 缩素转化酶抑制多肽，被认为较为温和且安全而且也不具有药物所带来的 副作用。
在发展新的控制血压的功能性食物的过程中，许多来自于牛奶蛋白质 的血管收縮素转化酶抑制多肽已被发现。(Yamamoto W 1994, / 5W. 77: 917-922; Maeno 1996， / D勿5W. 79: 1316-1321; Yamamoto,
1997, B&;7d[y. 43: 129-134; Pihlanto-LeppSla a/. 1998, /"A DmVy 乂 8: 325-331; Yamamoto and Takano， 1999，扁謂g 43: 159-164; Clare and Swaisgood, 2000, sw/ ra; Minervini a/., 2003, v4/ p/. ￡ vz>ow. Mz'croZ^o/. 69: 5297-5305; Li W a/., 2004， w ，ra; Robert " a/., 2004, /々Wc. Food Ozem. 52: 6923-6931; and Quir6s W a/., 2005， / DmVy 88: 3480-3487)。 不过这些多肽尚未在活体中验证其效果。只有少数的血管收縮素转化酶抑 制多肽在自发性高血压大鼠(SHRs)(FitzGeraldWa/.， 2004， sw/ ra)中，表 现出抗高血压的能力。目前市场上有数种来自于发酵乳或是牛奶蛋白质水 解物的产品，例如Calpis sour milk drink (Calpis Co., Japan)和C 12 peptide (DMV International, The Netherlands)。在这些产品中，抑制血管收 縮素转化酶多肽包括IPP、 VPP和FFVAPFEVFGK已经被发现。然而， 抑制血管收縮素转化酶多肽的低剂量口服产品仍具有很大的需求。
发明内容
本发明主要的目的在于提供一种新颖的多肽，其能够在活体上提供降 低血压的显著效果。此多肽可来自于天然蛋白质，或是通过化学合成和基因重组的方式来制备，并且能够应用于食品、类药剂营养品以及医药制品， 来控制血压或是降低心血管疾病发生的机率。
因此，本发明特征在于一段纯化的抗高血压多肽，并将该多肽命名为
"AP-1" (Anti-hypertension Peptide 1)。举例来说，API的氨基酸序列为
Val-Leu-Ser-Leu画Ser國Gln-Pro-Lys國Val-Leu誦Pro-Val-Pro-Gln國Lys-Ala-Val-Pr o画Gln(SEQIDNO: 1)。
术语"纯化"，如同用于"纯化的抗高血压多肽"，指的是获得多肽的 属性，例如从本来存在有该多肽的物质中取出。"多肽" 一词指短的氨基 酸聚合物(例如50个或更少)，其中互相以酰胺键连接。
本发明的另一特征在于一种医药组合物，其含有该纯化的抗高血压多 肽以及医药上可接受载体。该医药组合物以口服的方式给予。
本发明的另一特征在于食品，含有该抗高血压多肽，例如AP1。举
例来说，该食品可为发酵乳制品。
在又另一实施方式中，本发明的特征在于一种治疗高血压或是心血管 疾病的方法，该方法是通过将有效剂量口服给予于需要该治疗的受体来达成。
"治疗" 一词在本发明中意指将含有该抗高血压多肽给予有高血压或 是心血管疾病的受体，该受体有此两项疾病的症状，或是有此两项疾病的 倾向。给予之后，可让该受体达到医治、治疗、减轻、缓和、改变、矫正、 改善、促进或影响这两种疾病，或是此两种疾病的症状，或是此两项疾病 的倾向。
"有效量" 一词在本发明中意指该抗高血压多肽在受体上达到医疗效 果的量。该有效量可由所属技术领域的技术人员根据给予的方法、赋形剂 的使用或其它共同使用的药剂来变更。
为了说明本发明的目的，在附图中显示现阶段较佳的具体实施例。不 过，应了解本发明非限于所示的具体实施例。
图1是表示由实施例1所取得的发酵乳的离心上清液冻干粉，单一剂
量以口服方式给予十小时间，SHRs和WKYs的SBP检测值。处理组为 SHRs (n=9， )或WKYs (n=6, O)给予发酵乳上清液冻干粉(35 mg/kg BW)。对照组为SHRs (n=6， ■)或WKYs (11=6,口)给予原料乳上清液冻干 粉(35 mg/kg BW)。数据以平均值士标准差表示。星号表示为在每个时间 点相对于对照组具有显著性差异*表示P < 0.05， **表示P < 0.01。
图2是表示由实施例1所取得的发酵乳的离心上清液冻干粉，单一剂 量以口服方式给予十小时间，SHRs和WKYs的DBP检测值变化。处理 组为SHRs(n-9， )或WKYs(n=6， ^)给予35 mg/kgBW来自于发酵乳上 清液冻干粉。对照组为SHRs (n=6， ■)或WKYs(n=6,n)给予原料乳上清 液冻干粉(35 mg/kg BW)。数据以平均值士标准差表示。星号表示为在每 个时间点相对于对照组具有显著性差异*表示P < 0.05， **表示P
< 0.01。
图3是表示口服给予由实施例2中所取得的区份A和区份B十个小 时之间，SHRs的SBP变化。处理组为给予35 mg/kgBW来自实施例1中 所获得的发酵乳上清液冻干粉(n=9, )，给予1 mg/kg BW区份A (n=9， ▲)，或是给予1 mg/kgBW的区份B (n=6, A)。对照组为给予35 mg/kg BW 原料乳上清液冻干粉(11=6， ■)。数据以平均值士标准差表示。星号表示为在 每个时间点相对于对照组具有显著性差异*表示P < 0.05， **表示P
< 0.01。
图4是表示口服给予由实施例2中所取得的区份A和区份B十个小 时之间，SHRs的DBP变化。处理组为给予35 mg/kgBW发酵乳上清液冻 干粉(11=9, )，给予1 mg/kgBW区份A(n=9, ▲)，或是给予1 mg/kgBW 的区份B (n=6, △)。对照组为给予35 mg/kg BW原料乳上清液冻干粉(11=6, ■)。数据以平均值士标准差表示。星号表示为在每个时间点相对于对照组 具有显著性差异**表示P < 0.01。
图5是HPLC色谱图，该色谱图显示出由实施例2RP-HPLC所获得
7的区份A的图谱。将其中两个主要的区份分别搜集起来并进行二维电泳系 统。箭头指出该区份(A)所含有的多肽，其等电点(pl)约为IO且分子量大 小(Mw)约为2kDa。
图6表示口服给予源自区份A的抗高血压多肽 Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: l)以及Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)的合成物，十小时间， SHRs 的 SBP 变化。处理组为给予 1 mg/kg BW 的 Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1) (n=9， )，或是1 mg/kg BW的Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)(n=6, x)。对照组为给予35 mg/kg BW原料乳上清液冻干粉(n=6， ■)。数 据以平均值士标准差表示。星号表示为在每个时间点相对于VPP具有显著 性差异*表示P < 0.05, **表示P < 0.01。
图7表示口服给予源自区份A的抗高血压多肽 Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln曙Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gln(SEQIDNO: l)以及Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)的合成物，十小时间， SHRs 的 DBP 变化。处理组为给予 1 mg/kg BW 的 Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1) (n=9， )，或是1 mg/kg BW的Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)(n=6， x)。对照组为给予35 mg/kg BW原料乳上清液冻干粉(n=6, ■)。数 据以平均值士标准差表示。星号表示为在每个时间点相对于VPP具有显著 性差异*表示P < 0.05， **表示P < 0.01。
图8表示口服给予合成的多肽Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln -Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln國Lys-Ak國Val画Pro-Gln (SEQ ID NO: 1)， Lys-Val國Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)以及Lys國Val-Leu-Pro腸Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)十小时间，SHRs的SBP变化。处理组为给予1 mg/kg BW 的
Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1) (n=9, )， 或是 1 mg/kg BW 的 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3) (n=6,C>)，或是1 mg/kg BW的Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)的(n=6， □)。对照组为给予35 mg/kg BW原料乳上清液冻干粉(r^6, ■)。数据以平均值士标准差表示。星 号表示为在每个时间点相对于Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)具 有显著性差异*表示P < 0.05， **表示P < 0.01。正号表示为在每 个时间点相对于Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)有显著性差 异+表示< 0.05， ++表示P < 0.01。
图 9 表示口服给予合成的多肽 Val—Leu-Ser—Leu-Ser—Gln-Pro-Lys—Val画Leu-Pro-Val誦Pro-Gln國Lys—Ala-Val—Pro-Gin (SEQ ID NO: 1)， Lys-Val誦Leu國Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)以及 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)十小时间，SHRs的DBP变 化。 处 理 组 为 给 予 1 mg/kg BW 的 Val—Leu-Ser—Leu-Ser—Gln-Pro-Lys—Val誦Leu誦Pro-Val-Pro-Gln-Lys—Ala—Val—Pro-Gin (SEQ ID NO: 1) (n=9， )， 或是 1 mg/kg BW 的 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3) (n=6,^)，或是1 mg/kg BW的 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)的(n=6, □)。对照组为给予35 mg/kg BW牛乳上清液冻干粉(11=6， ■)。数据以平均值±标准差表示。星号 表示为在每个时间点相对于Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)具有 显著性差异*表示P < 0.05, **表示P < 0.01。正号表示为在每个 时间点相对于Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)有显著性差 异+表示< 0.05， ++表示P < 0.01。
图10表示在口服给予单 一 剂量合成的多肽 Val-Leu画Ser國Leu國Ser國Gln國Pro國Lys誦Val國Leu國Pro腸Val垂Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro國 Gin (SEQ ID NO: 1), Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)， Lys画Val画Leu画Pro國Val画Pro (SEQ ID NO: 3)以及Lys-Val誦Leu-Pro陽Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)后五小 时，SHRs的SBP的下降量及其显著差异性。所有喂食组皆给予1 mg/kg BW。数据以平均值士标准差表示。两组之间的户value显示于图上。
图 11 表示合成的多肽
Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Pro-Lys画Val画Leu-Pro-Val國Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro國 Gin (SEQ ID NO: l)的MALDI-TOF-MS质谱。
9图12 表 示 合 成的多 肽
Val-Leu-Ser-Leu曙Ser-Gln-Pro-Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala曙Val曙Pro-Gin (SEQ ID NO: 1)，在经过模拟胃肠消化试验后的MALDI-TOF-MS质谱。
具体实施例方式
以下名词在此处可用于权利要求与说明书的更好的例示说明。
以下为本发明中所使用到的名词縮写
ACE，血管收縮素转化酶(angiotensin I-converting enzyme);
CVD,心血管疾病(cardiovascular disease);
DBP，舒张压(diastolic blood pressure);
SBP,收縮压(systolic blood pressure);
SHR， 自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat);
WKY， Wistar-Kyoto品系的大鼠；
HPLC，高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography);
API,抗高血压多肽(Anti-hypertension Peptide 1)
本发明提供了一种抗高血压多肽，其中包含AP1的氨基酸序列。"抗 高血压多肽" 一词或"API"意指具有SEQIDNO: 1氨基酸序列的多肽， 或是在结构及功能上的变体。"在结构及功能上的变体"意指一个和SEQ ID NO: 1氮基酸序列具有至少75% (例如80%， 85%, 90%或是95%)以上 相似度的多肽，且该多肽具有抗高血压的活性。此变体可由SEQIDNO: 1 的突变而来，例如在一个不影响抗高血压活性的位置进行突变。因为SEQ ID NO: 1只具有19个氨基酸，因此所属技术领域的技术人员可以轻易地 推测出其有关或无关抗高血压活性的氨基酸序列位置，例如利用点突变 分析。进一步也可利用以相似化学性质的氨基酸加以取代，而不影响到多 肽的活性。任何SEQ ID NO: 1的结构上变体也被预期保留其抗高血压的 活性。该结构上的变体可以通过实施例1的方法来检测其活性。本发明的多肽可由天然来源所纯化，例如发酵乳制品，也可由核苷酸 的重组方法或化学合成所取得。
从发酵乳制品获得本发明的多肽，可通过以下所列的一种或多种微生
物一起发酵乳酸菌，其细菌属为丄acto6a"7/us,丄"ctococc^，5^e/3tococcws， 禾口 5折(ioZ acten'w附；以及酵母菌，例如其属为Sacc/wfra附yc&s, C"wfe/fl,尺/10/veraw3/ces,和P/cWa。低温杀菌后全脂或是脱脂的哺乳类乳 汁，乳清(whey)或是酪蛋白都可作为乳类蛋白发酵的原料。发酵的最适 当温度在15-45"C之间，发酵时间最适合在8-180小时之间。含有本发明 的多肽或是具有相同功能的变体的发酵乳制品，可直接作为其它加工食品 或是类药物营养剂的原料。
用来制备上述所列举的发酵乳制品的乳汁可来自于表达正常的p-酪 蛋白的一般品种的牛、羊、绵羊、猪或马等。同时也可以由基因改造表达 变化的(3-酪蛋白的牛、羊、绵羊、猪或马等，来制造结构上或功能上变异 的SEQIDNO: 1。
本发明的抗高血压多肽也可由传统酵素水解牛奶蛋白质的方法，或传 统有机化学合成的方法获得。这些方法将可由所属技术领域的技术人员， 在不用进行过度实验的情况下完成。
因为此多肽在活体中抗高血压的能力非常好，本发明的多肽以及相关 的变体可当作一种活性成分，使用于医药组合物中，并用来预防或治疗高 血压或/和心血管疾病。
当本发明的抗高血压多肽来自于发酵或是酵素水解，该包含抗高血压 多肽及功能上的变体的发酵乳制品，可直接作为医药组合物中的活性成 分。除此之外，该多肽也可由柱色谱法或是其它任何可去除非抗高血压多 肽的生化方法获得。
本发明的医药组合物可由传统上已知的方法，和一种或多种医药可接 受的载体制造而成。"医药可接受的载体" 一词意指包含任何标准医药上 可接受的载体。这些载体可以是，但不受限于下列物质食盐水、盐类缓 冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇或是以上的组合物。本发明的医药组合物可由投与的途径选择制造成任何适当的形式。举 例来说，适合口服投与的固体形式，如药丸、胶囊、颗粒、锭剂和粉末， 或是液体形式，如饮料、糖浆、溶液、以及悬浮液。其它非口服的投予 形式可包括无菌液、乳剂和悬浮液。
除了标准的载体，本发明的口服医药组合物可添加一种或多种常用于 口服配方的赋形剂，例如表面活性剂、溶解剂、稳定剂、乳化剂、浓缩 剂、色素、甜味剂、风味添加剂以及防腐剂。这些皆为所属技术领域的技 术人员所了解的赋形剂。
在本发明的一个实施例中，医药组合物为含有降低血压的有效量的抗 高血压多肽或是功能上变体的食品。该食品可为，但不受限于所列，发酵 乳制品、饮料运动饮料、老人食品、糖果或是胶质。
本发明也提供了一种降低受体血压的方法及其组合物，该方法包含给 予受体有效量的抗高血压多肽或是功能上的变体以降低血压。
在另一实施例中，本发明提供一种预防或治疗受体心血管疾病的方法 及其组合物，该方法包含给予受体有效量的抗高血压多肽或是功能上的变 体以降低血压。
本发明中的方法，投予的多肽剂量，可根据年龄、体型和接受治疗的 受体的情况，由医学专家自行决定的。
本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明并不受限于该用 于展示的实施例。
实施例l:发酵干酪品的制备与抗高血压活性测试
将100 g脱脂奶粉溶于900g双蒸水中来制备发酵乳制品。该脱脂牛 奶以63'C低温灭菌30分钟后，放至冷却备用。将2%的发酵菌元，包含 有108 CFU/mL取自kefir grain的菌类，包括丄"cto6""7/w51 ac/dop/^/ws, 丄acto6fl"'〃ws / e/vericus与acc/wromyces cerev/w'"e， 力口入低 显杀菌的脱月旨 牛奶中。发酵的温度与时间为38 'C和20小时。经发酵后的发酵乳(1L) 以12000 xg离心10分钟，上清液冷冻干燥后保存于-2(TC备用。上清液 和其冷冻干燥粉皆富含抗高血压多肽，该多肽的含量在上清液约有50-500mg/L，在冷冻干燥粉末中约有1.5-15 mg/g，实际含量取决于发酵条件。
多肽对于血管收縮素转化酶的抑制能力不一定和抗高血压能力相关， 因为有些在体外具有血管收縮素转化酶抑制能力的多肽在口服后会失去
活性。因此，前述所提，从发酵乳制品取得的上清液冷冻干燥粉末的抗高 血压活性，将由SHRs和正常血压的大鼠(Wistar-Kyoto rats, WKYs)作为 评估能预防高血压的健康食品的潜力。本发明的实施例使用的公SHRs和 公WKYs购自台湾国家实验动物中心(Taipei， Taiwan),并给予实验等级的 饲料(Rodent laboratory chow 5001， Purina Co" USA) 。 8-18周大SHRs和 WKYs的SBP和DBP由鼠尾压测定仪(Softron BP16;Softron, Tokyo, Japan) 所测量。测试样品的抗高血压能力，由口服该样品0-10小时间的SHRs 和WKYs的SBP和DBP的变化来评估。
给予单一口服剂量35 mg/kg BW的来自发酵乳的上清液冻干粉(处理 组)，或是给予相同剂量的来自于正常原料乳的上清液冻干粉(对照组)，10 小时之间，观察SBP和DBP的变化。并将结果表示在图1与图2。给予 来自发酵乳的上清液冻干粉的SHRs，喂食前其SBP平均为194.3± 3.9 mmHg， 口服后3至10小时内相较于对照组有显著性的降低(在第3、 4、 5、 6、 7、 8、 9小时，尸O.01;在第10小时，户<0.05)。 同样地，在给予 前DBP平均值为150.6 ±4.3 mmHg，在口服后2至10小时有显著性地降 低(在第2小时，PO.05;在第3、 4、 5、 6、 7、 8、 9小时，/><0.01;在10 小时，尸<0.05)。在口服的后的第9个小时，SBP和DBP有最大的下降值， 分别是42.2士2.9mmHg以及37.3±3.1 mmHg。在WKYs中，不论是SBP 或是DBP在处理组和对照组皆无显著性变化。这数据显示只有在具有高 血压的受体中，从发酵乳取得的上清液冻干粉才会展现降低血压的能力。
实施例2:从发酵乳的上清液取得一区份并确定该"区份A"的抗高血压 活性
前述的上清液粉末重新溶于双蒸水中，该溶液用来做分离。1 mL重 新溶解的液体(总多肽浓度为20mg/mL)打入使用RP-C18管柱(吵da,) 的RP-HPLC (reverse-phase HPLC)(UV画VIS detector L-7420; Pump L-7100,
13Hitachi Ltd., Japan),溶剂A (1%三氟醋酸溶于甲基氰)以及溶剂B (双蒸 水)用来做流动相(mobile phase)。多肽由以下梯度析出，流动速率 lmL/min : 0-10 min间从100°/。至10°/。溶剂B， 10-120 min间从10%至 30%溶剂B，最后120-150 min间从30%至100°/。溶剂B。吸光度检测 为215nm。该区份以分钟为单位来搜集，接着用于测量血管收縮素转化酶 的抑制活性。
血管收縮素转化酶抑制活性测定方法是根据Cushman和Cheung发表 于所oc/ze附.尸/zwmaco/. 20:1637-1648 (1971)的文献。此方法的活性是根据 血管收縮素转化酶将马尿酰组氨酰亮氢酸(Hippuryl-L-histidyl-L-leucine, HHL)分解为马尿酸的比例。简单来说，将30L待测样品溶液加入200L 50 mM sodium tetaraborate缓冲液中，其中包含有300mM氯化钾(NaCl) 和5mM马尿酰组氨酰亮氢酸(Sigma Chemical Co" St. Louis, MO)。加入 血管收縮素转化酶(2 mU， EC 3.4.15.1， 100 mU/mL， Sigma)，混和后放置于 37"C中反应35分钟。加入250 L 1 MHC1终止反应。反应中由所产生的 马尿酸由乙酸乙酯(ethyl acetate)纯化出来，利用加热蒸馏的方法去除乙酸 乙酯后，用分光光度计测量228nm的吸光度。ACE的抑制比例由下列公 式计算抑制比率=(A-B)/(A-C)xl00%，其中A是不含样本反应下马尿 酸的228nm吸光度，B是包含样本下马尿酸228 nm吸光度，C是不包含 样本和血管收縮素转化酶下马尿酸228 nm吸光度。血管收缩素转化酶抑 制物的浓度定义为能抑制50%血管收縮素转化酶活性的浓度(IC50)。
两种具有较高抑制血管收縮素转化酶活性(超过80%)的区份分别是 13-16 min间析出物(此部分混和物命名为区份A)以及32-33 min间析出物 (此部分混和物命名为区份B)。由许多次HPLC纯化搜集的区份A和区 份B，利用实施例l中的方法，以口服的方式给予SHRs并测量血压的变 化来决定其在活体中的抗高血压能力。
口服给予SHRs 1 mg/kg BW的区份A和区份B的十小时间，SBP和 DBP的改变量表现于图3和图4。给予SHRs发酵乳和原料乳上清液冻干 粉的血压作为参考值。区份A表现出抗高血压的活性，在口服4小时后 SBP最多下降52.5士2.4mmHg且DBP下降45.9±7.0 mmHg。区份B虽然在体外实验中展现高血管收縮素转化酶抑制活性，但在活体中抗高血压的
效果却很低。因此，选择区份A进行接下来测试多肽降低血压的实验。 实施例3:鉴定抗高血压多肽并合成有兴趣的多肽
在活体中有显著性抗高血压能力的区份A，经由20次的HPLC搜集 后，以RP-HPLC做进一步的纯化。进一步纯化的析出条件和之前所述不 同。溶剂A(1。/。三氟醋酸溶于甲基氰)以及溶剂B (双蒸水)用来做流动 相(mobile phase)。多肽以1 mL/min流动速率以及0-10 min间从100%至 20%溶剂B以及10-60 min间从20%至30%溶剂B的梯度来析出。
在进一步的纯化后有两个主要的峰部如图5所示。每个主要峰部析出 物进一步分离后，以二维电泳系统分析(PROTEAN IEF用于一维， Mini-PROTEAN 3用于二维，Bio-Rad Laboratories, Inc.， USA)。结果显示， 在第36分钟析出的物质在pi— 10及Mw —2 kD的位置有明显的点出现。 其它主要的峰部，该多肽无法清楚地分离。因此只有位于pi—10及Mw —2 kD这个部分的点利用蛋白质序列机(Perkin Elmer ABI Model 491， USA)
进行氨基酸序列的鉴定。
序列鉴定的结果显示区份A包含有19个氨基酸 Val-Leu-Ser-Leu曙Ser-Gln-Pro國Lys曙Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gln(SEQIDNO: 1)。此多肽发现位于一个卩-酪蛋白的一级结构，可能在发 酵的过程中从酪蛋白分解释出。此氨基酸序列SEQ ID NO: 1由Protech Technology Enterprise Co.,Ltd (Taipei, Taiwan)合成，并进行以下在SHRs上 测试抗高血压活性的实验。
实施例4:确定所欲多肽的抗高血压活性
和SEQ ID NO: 1具有相同序列的合成多肽，利用实施例1中的方法 检测其活体中抗高血压的效果。如图6和图7所示，给予SHRs单一口服 剂量lmg/kg BW在SBP和DBP上都具有抗高血压的效果。除此之外， 三多肽VPP亦合成喂饲SHRs当作对照组。Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2) 来自于P-酪蛋白，已有文献报导口服给予SHRs 1.6mg/kgBW六小时后， 能够降低SBP20mmHg((Nakamura"a/" 1995, / Z)^^5W. 78: 1253-1257;
15Nakamura"a/" 1995， /DmVy5W. 78: 777-783)。除此之外，VPP是目前 市场上常用来控制血压的健康食品Calpis发酵乳饮的两个有效成分的。 如图6和图7所示，在给予口服lmg/kgBW4小时之后，Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)最多可让SBP降低26.3±3.2 mmHg， DBP降低18.0±2.1 mmHg。 而 本 发 明 所 鉴 定 的 多 肽 Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln腸Pro國Lys-Val-Leu國Pro-Val-Pro國Gln-Lys-Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1)，在口服5小时后SBP最多可降低44.0±2.1 mmHg， 而在口服6小时后DBP最多可降低23.0±2.9 mmHg。这数据显示由实施例 3获得的多肽在活体上具有抗高血压的活性。
1996年，7kfaewo " 发表了两个取自于酪蛋白水解产物的多肽 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)和Lys画Val誦Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)，并证实其在SHRs上有降低SBP的效果(Maeno W a/.， 1996， M"wpra)。根据Mae"o"a/.的实验，以口服方式给予2 mg/kg BW六小 时后，Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)能降低SBP达到 31.5±5.6 mmHg。 因为本发明所鉴定的 Val-Leu-Ser-Leu誦Ser隱Gln-Pro誦Lys國Val-Leu-Pro國Val画Pro-Gln-Lys國Ala画Val-Pro國 Gin (SEQ ID NO: l)包含有这两个序列Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)和Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)，比较和这两个多 肽(合成)在同样lmg/kgBW的剂量下抗高血压的活性。如图8及图9 所示，19个氨基酸的多肽可以在SBP和DBP分别在5小时和6小时有 44.0±2.1mmHg 和23.0士2.9mmHg的最大下降量。但 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)在SBP和DBP分别在2小时和5 小时有27.8±3.3 mmHg禾卩17.5±4.2 mmHg最大下降量。而 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)分别在3小时和4小时有 29.2±4.0 mmHg和 14.4±3.2 mmHg最大下降量。图 10显示 Val國Leu-Ser誦Leu-Ser-Gln國Pro-Lys-Val誦Leu画Pro-Val國Pro-Gln-Lys-Ala國Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: l)相对于Val-Pro-Pro (SEQ ID NO: 2)(尸=0.00001), Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)(尸 =0.00003) 和 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)(尸=0.00007)的抗高血压活性皆有很高的显著性。
除此之外，为了证明本发明的19个氨基酸的多肽的抗高血压能力并 非来自于水解成Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)和 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4) 多肽 ， Val-Leu-Ser-Leu-Ser-Gln-Pro國Lys-Val-Leu曙Pro-Val-Pro誦Gln國Lys-Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1)的合成多肽利用肠胃道的消化条件的方法G4W"g W in D&6"es 20:875-880)进行水解。简单说明，该多肽先以胃蛋白酶
(pepsin) (pH 2.5) (EC 3.4.23.1; 1:10000; Sigma， USA)在37。C下水解1.5小 时，再以Corolase PP (pH 7.5) (pancreatic protease; Rohm, Darmstadt, German) 在37i:下水解2.5小时。为了去除加入的酵素，水解后的多肽在离心1000 x g 10分钟的条件下以3 kDa孔径的过滤膜过滤(Microcon YM-3, 3 kDa NMWL， Millipore Co.， USA)。 过滤后的液体利用基质辅助激光解析电离 飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)的方法来分析多肽片段。
如图11、图12和表1所示，从实施例3所得的多肽 Val-Leu-Ser-Leu-Ser曙Gln曙Pro曙Lys誦Val画Leu-Pro國Val-Pro-Gln-Lys腸Ala画Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1)，在经过肠胃道条件的水解后所得的片段并不包含 Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)和Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)。而且此含有 19个氨基酸的多肽 Val曙Leu-Ser國Leu誦Ser曙Gln-Pro國Lys誦Val画Leu誦Pro國Val-Pro-Gln誦Lys-Ala誦Val曙Pro-Gin (SEQ ID NO: l)具有比已知的多肽Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro (SEQ ID NO: 3)和Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro-Gln (SEQ ID NO: 4)显著性更高的抗高血 压的活性。
表l，
Val-Leu-Ser曙Leu-Ser-Gln-Pro-Lys曙Val-Leu曙Pro-Val曙Pro-Gln-Lys曙Ala-Val-Pro-Gin (SEQ ID NO: 1)经过模拟肠胃道消化试验的多肽片段。_
No. m/z (mi) m/z (av)Start End Sequence
1414.2347 414.484516 19 0 (K) M￡Q (-) (SEQ ID NO: 5)1 780.4978 780.9917 9 15 0
1 871.5247 872.0586 1 8 0
1 1175.7147 1176.4534 9 19 1
1 1633.0047 1634.0276 1 15 1
1 2028.2216 2029.4893 1 19 2
统计分析
所有上述的例子接利用统计软件SAS version 9.1 (SAS Institute, Cary, NC)，显著性差异的评估系通过Mann Whitney U检验。尸值<0.05判定
为具有显著性差异。
在此所列举的专利或文献仅为参考文献。所属领域的技术人员当知道 可在不偏离广义的本发明概念下修饰上述具体实施例。应了解本发明不局 限于所揭示的特定具体实施例，而意欲涵盖如权利要求所界定的本发明的 精神及范围内的修饰。
(K) VLPVPOK (A) (SEQ IDNO:6)
(-)VLSLSOPK (V) (SEQ ID NO: 7)
(K) VLPWOKAWO (-) (SEQ ID NO: 8)
(陽)VLSLSOPKVLPVPOK (A) (SEQ ID NO: 9)
M VLSLSOPKVLPVPOKAVPO (SEQ ID NO: 1)
18序列表
<110>大叶大学和国立中兴大学
〈120〉新颖抗高血压肽及其用途
<130> 8P99118-TW
〈140〉 096135346 〈141> 2007-09-21
〈160> 9
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 19
<212> PRT <213>人工序列
〈220〉
<223> 根据酪蛋白所设计的合成氨基酸序列 <400> 1
Val Leu Ser Leu Ser Gin Pro Lys Val Leu Pro Val Pro Gin Lys Ala 15 10 15
Val Pro Gin
〈210〉 2
<211> 3
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列
<220>
〈223> 根据酪蛋白所设计的合成氨基酸序列
<400> 2
Val Pro Pro 1
<210> 3 〈211〉 6 〈212〉 PRT<213>人工序列 <220>
<223> 根据酪蛋白所设计的合成氨基酸序列 <400> 3
Lys Val Leu Pro Val Pro 1 5
<210〉 4
<211> 7
<212> PRT <213>人工序列
<220>
<223> 根据酪蛋白所设计的合成氨基酸序列
<400> 4
Lys Val Leu Pro Val Pro Gin 1 5
<210> 5
<211> 4
<212〉 PRT <213>人工序列
<220〉
<223> SEQ ID N0: l通过胃蛋白酶水解后片段
<400> 5
Ala Val Pro Gin 1
<210〉 6
<211〉 7
<212> PRT <213〉人工序列
<220〉
<223> SEQ ID NO: 1通过胃蛋白酶水解后片段
<400> 6
Val Leu Pro Val Pro Gin Lys 1 5
20<formula>formula see original document page 21</formula>
权利要求
1. 一种纯化的抗高血压多肽，其特征在于包含抗高血压多肽的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于该纯化的多肽为抗高血压多肽。
3. 根据权利要求1所述的多肽，其特征在于该氨基酸序列为SEQID NO: 1。
4. 根据权利要求2所述的多肽，其特征在于该抗高血压多肽具有SEQ ID NO: 1 。
5. —种医药组合物，其特征在于包含权利要求1所述的多肽及医药 上可接受的载体。
6. 根据权利要求5所述的医药组合物，其特征在于该组合物以口服投予。
7. 根据权利要求5所述的医药组合物，其特征在于该多肽为抗高血 压多肽。
8. 根据权利要求5所述的医药组合物，其特征在于该氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1 。
9. 根据权利要求7所述的医药组合物，其特征在于该抗高血压多肽 的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。
10. —种食品，其包含抗高血压多肽的氨基酸序列的抗高血压多肽和 食物成分。
11. 根据权利要求IO所述的食品为发酵乳制品。
12. 根据权利要求10所述的食品，其特征在于该多肽为抗高血压多肽。
13. 根据权利要求IO所述的食品，其特征在于该多肽的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。
14. 根据权利要求12所述的食品，其特征在于该抗高血压多肽的氨基 酸序列为SEQIDNO: 1。
15. —种治疗高血压的组合物，其包含有效剂量的组合物，其特征在 于该组合物包含氨基酸序列为抗高血压多肽的抗高血压多肽。
16. 根据权利要求15所述的组合物，其特征在于该抗高血压多肽为抗 高血压多肽。
17. 根据权利要求15所述的组合物，其特征在于该多肽的氨基酸序列 为SEQ ID NO: 1 。
18. 根据权利要求16所述的组合物，其特征在于该抗高血压多肽的氨 基酸序列为SEQIDNO: 1。
19. 根据权利要求15所述的组合物，其特征在于该组合物为发酵乳制
20. —种治疗心血管疾病的组合物，其包含有效剂量的组合物，其特 征在于该组合物包含氨基酸序列为抗高血压多肽的抗高血压多肽。
21. 根据权利要求20所述的组合物，其特征在于该抗高血压多肽为抗 高血压多肽。
22. 根据权利要求20所述的组合物，其特征在于该多肽的氨基酸序列 为SEQIDNO: 1。
23. 根据权利要求21所述的组合物，其特征在于该抗高血压多肽的氨 基酸序列为SEQIDNO: 1。
24. 根据权利要求20所述的组合物，其特征在于该组合物为发酵乳制
全文摘要
本发明提供了一种新的抗高血压多肽，同时也提供了包含此抗高血压多肽的医药和食品的组合物，可用来治疗高血压和心血管疾病。
文档编号A61P9/12GK101508722SQ20081021231
公开日2009年8月19日 申请日期2008年9月8日 优先权日2007年9月17日
发明者陈全木, 陈小玲 申请人:大叶大学;萧介夫