一种包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的药物组合物的制作方法

本发明提供了一种药物组合物，更具体而言，提供了一种包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的可用来治疗癌症的药物组合物，属于药物化学领域。

背景技术：

喹唑啉酮衍生物作为一类非常重要的含氮杂环化合物，被广泛应用于医药、农业、化工等行业。目前，许多喹唑啉酮类药物已广泛应用于现实生活中，如抗高血压药哌唑嗪、利尿药甲苯喹唑酮等。

作为喹唑啉酮衍生物中的一种，喹唑啉酮并吲唑衍生物也是一类重要的含氮稠环化合物，其具有多种特定的性能，例如：

Weiguang Yang等人(Palladium-Catalyzed Cascade Reaction of2-Amino-N’-arylbenzohydrazides with Triethyl Orthobenzoates To Construct Indazolo[3,2-b]quinazolinones，J.Org.Chem.，2015,80,482-489)中公开了一类吲唑并[3,2-b]喹唑啉酮化合物的合成方法及其所具有的荧光特性。

K.Siva Kumar等人(A new cascade reaction:concurrent construction of six and five membered rings leading to novel fused quinazolinones)公开了吲唑并喹唑啉酮化合物可用作磷酸二酯酶4(PED4)抑制剂，从而可具有用来治疗哮喘、慢性肺阻塞疾病等疾病，并具有抗炎和支气管扩张等效果，具有潜在的药物用途。

如上所述，现有技术中公开了吲唑并喹唑啉酮化合物的一些用途，但目前这些用途大部分仅仅局限于其荧光性能和呼吸系统疾病治疗领域，而没有对于其它疾病尤其是癌症的任何扩展应用的报道。

技术实现要素：

本发明人进行了深入的研究，在付出了大量的创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明的技术方案和内容涉及一种包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的可用来治疗癌症的药物组合物。

在本发明的所述药物组合物中，所述喹唑啉酮并吲唑衍生物是下式(I)的化合物：

其中，R₁、R₂各自独立地选自H、卤素或C₁-C₆烷基；

R₃选择H、卤素、C₁-C₆烷基或卤代C₁-C₆烷基。

在本发明的所述药物组合物中，所述卤素的含义是指卤族元素，非限定地例如可为F、Cl、Br或I。

在本发明的所述药物组合物中，所述C₁-C₆烷基的含义是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，其包括了C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基或C₆烷基，非限定性地例如可为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基或正己基等。

在本发明的所述药物组合物中，所述卤代C₁-C₆烷基的含义是指被所述卤素取代的上述定义的“C₁-C₆烷基”，非限定性地例如为三氟甲基、五氟乙基、二氟甲基、氯甲基等。

在本发明的所述药物组合物中，优选R₁为H。

在本发明的所述药物组合物中，优选R₂为H。

在本发明的所述药物组合物中，优选R₃为H或卤代C₁-C₆烷基。

在本发明的所述药物组合物中，优选R₁为H、R₂为H和R₃为卤代C₁-C₆烷基。

在本发明的所述药物组合物中，最优选R₁为H、R₂为H和R₃为三氟甲基。

在本发明的所述药物组合物中，作为一种优选，所述喹唑啉酮并吲唑衍生物是下式(I-1)化合物：

在本发明的所述药物组合物中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或助剂。

其中，“药学可接受的载体”是指对有机体不引起显著刺激也不消除所施用的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。通常，这些包括了患者出于药理学/毒理学方面的考虑，以及制药化学家出于组合物、制剂、稳定性、患者接受度和生物利用度的物理/化学方面的考虑认为是可以接受的特性和/或物质。

其中，“赋形剂”或“助剂”是指添加到药物组合物中从而进一步有助于化合物的施用的惰性物质，其实例包括但不局限于：碳酸钙、磷酸钙、多种糖和多种淀粉、纤维素衍生物(包括微晶纤维素)、明胶、植物油、聚乙二醇、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂、崩解剂以及类似物。

在本发明的所述药物组合物中，所述癌症可为肝癌、肺癌、胃癌,宫颈癌和胰腺癌中的任意一种或任意多种，最优选为肝癌。

发明人发现，式(I)的喹唑啉酮并吲唑衍生物具有良好的抗癌活性，尤其是上式(I-1)化合物通过诱导细胞线粒体失活和阻碍Nrf2-ARE信号通路，可有效抑制肝癌细胞Hep3B的生长，且对正常肝细胞HL-7702无害。还观测到在Hep3B细胞中Caspase-3激活、Bcl-2下降引起线粒体凋亡，同时膜蛋白VDAC1的上调导致线粒体膜电势下降，共同作用促使线粒体失活，从而引起细胞凋亡。同时，在内源性抗氧化应激通路Nrf2-ARE中，Nrf2受到衍生物影响而下调，其下游的NQO1受到抑制，从而直接或间接损伤细胞导致细胞凋亡。通过细胞活性试验(MTT染色法)直接说明上式(I-1)化合物对Hep3B细胞的生长具有明显的抑制作用，而并不影响HL-7702的细胞活性，进一步表明所述化合物对肝癌细胞具有较好的抗癌活性，可作为潜在的抗肝癌药物。

综上所述，本发明提供了一种包含喹唑啉酮并吲唑衍生物的抗癌药物组合物，所述组合物中的特定喹唑啉酮并吲唑衍生物具有良好的抗肝癌活性，可作为潜在的抗肝癌药物，具有良好的应用前景和价值。

附图说明

附图1是式(I-1)化合物对HL-7702和Hep3B细胞调亡及相关蛋白表达的影响活力的影响。

附图2A-2C是式(I-1)化合物对HL-7702和Hep3B细胞中线粒体膜电位和电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)蛋白的影响。

附图3是式(I-1)化合物对核转录因子Nrf2及下游NQO1蛋白表达的影响。

附图4A-4B是ARE-荧光素酶测定结果及下游基因的表达。

具体实施方式

下面通过具体的实例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

实施例1：对不同细胞系的细胞毒性GI₅₀

实验步骤：其中所使用的Miapaca-2为胰腺癌细胞、Hela为人宫颈癌细胞和Hep3B为人肝癌细胞。分别将各个细胞于含有质量百分比含量为10％胎牛血清的DMEM培养液生长，培养液中的抗生素浓度为100μ/ml青霉素和链霉素100μg/ml，细胞培养是在温度为37℃、二氧化碳体积浓度为5％的培养箱中进行。

将细胞均匀铺板于96孔板上，细胞密度约为5×10³，每孔加入200μl完全培养液，过夜培养。待细胞顺利贴壁生长，加入含有25μm药物的不含血清DMEM培养基，处理24小时。配制MTT的PBS(磷酸缓冲液)溶液，使得MTT至浓度为5μg/m，加入无血清培养基中于37℃孵育4小时。吸弃培养基，每孔中加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，置于摇床室中摇晃20分钟，至沉淀溶解完全。通过酶标仪测定96孔板在490nm处吸光值，并通过软件处理。

实验结果：通过细胞活性试验(MTT染色法)测量式(I-1)化合物对不同细胞系的细胞毒性GI₅₀(处理细胞光密度相对于未处理细胞光密度下降至50％时的细胞浓度，SEM为平均偏差)，结果见下表1。

表1

从中可知，(I-1)化合物对癌细胞毒性较大，尤以Hela细胞最为显著，其次为Hep3B细胞，对Miapaca细胞毒性最小。整体看(I-1)化合物对癌细胞均有不同程度的毒害作用，其中对Hep3B非常显著，适合作为抗肝癌药物。

实施例2：对HL-7702和Hep3B细胞凋亡及相关蛋白表达的影响

实验步骤：其中所使用的HL-7702为人正常肝细胞，培养条件与上述Hep3B的培养一致。

用化合物处理Hep3B和HL-7702细胞24小时，胰酶消化并收集细胞。用预冷的PBS冲洗三次，加入100μl细胞裂解液RIPA于冰上裂解30分钟，期间不时涡旋振荡。4℃离心后收集上清液并采用bradford法测定蛋白浓度。计算合适上样浓度后，将蛋白样品加入合适比例上样缓冲液，并高温变性5分钟。配置分离胶质量含量为10％、浓缩胶质量含量为5％的聚丙烯酰胺凝胶，上样跑胶，电流40mA、时间为2小时。将蛋白转移至PVP膜，电流110mA，时间为90分钟。将膜室温封闭2小时后，TBST冲洗三次，加入相对应的抗体孵育过夜，TBST冲洗三次，孵育对应二抗2小时，TBST冲洗三次后曝光显色，并采用软件处理分析。

实验结果见图1，其中四幅图的纵坐标均为“凋亡蛋白/内参蛋白的相对比率”，以及“*”表示P<0.05和“**”表示P<0.01。

细胞凋亡的发生与发展可概括为诱导细胞凋亡、调节凋亡及效果执行，在这个阶段中线粒体电子传递链在细胞凋亡的起始阶段发挥着重要作用。Caspase-3是凋亡执行阶段的关键点，一旦激活将进一步诱导细胞凋亡。此外，Bcl-2控制多种凋亡基因，并同时受到caspase-3调控及影响。

从图1中可见，式(I-1)化合物可致使Hep3B细胞中caspase-3激活。而经过与标准品相对比，发现其由35kDa激活成17kDa左右的小片段，进而Bcl-2的表达也同时降低。这进一步说明，式(I-1)化合物可诱导Hep3B细胞凋亡，而对HL-7702细胞则伤害较小。

实施例3：对HL-7702和Hep3B细胞中线粒体膜电位和电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)蛋白的影响

实验步骤：采用JC-1细胞凋亡检测试剂盒，测定细胞的线粒体膜电位(MMP)。JC＝1作为线粒体膜电位特异性荧光探针，存在两种形态，处于低电位时为单体，发射绿色荧光；处于高电位时聚集为复合体，发射红色荧光。完整的线粒体膜电位处于高电位，而一旦电子链出现损伤，即细胞发生凋亡现象，线粒体膜电势就会降低。JC-1的荧光变化可被视为线粒体膜状态的一个指标。

将HL-7702细胞和Hep3B细胞经药物处理24小时后，胰酶消化细胞并收集。PBS冲洗两次，用JC-1染剂工作液37℃避光孵育30分钟，然后用预冷的缓冲液冲洗两次，后悬浮于缓冲液中采用流式细胞仪分析。设置通道分别为FL1(FITC，绿色荧光)和FL2(PE，红色荧光)进行检测，后采用modfit软件分析数据。

电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)蛋白作为线粒体膜上的电子传递链中的关键蛋白，可使用实施例2中的相同方法进行提取。

经流式细胞仪(结果见图2A-2B)检测，以及VDAC1蛋白/内参蛋白相对比率直方图(见图2C，其中“*”表示P<0.05)，结果见图2A-2C。

其中，图2C中，两幅图的纵坐标均为“VDAC1蛋白/内参蛋白相对比率”。

线粒体功能在细胞存活与凋亡中发挥重要作用。电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)蛋白是一种多功能蛋白，主要定位于线粒体外膜，调节一系列生理病理活动，例如细胞内钙离子平衡，能量代谢和细胞凋亡。为进一步确定(I-1)化合物是否可以诱导细胞凋亡导致线粒体损伤，我们研究了线粒体膜电位变化情况及VDAC1表达情况。从图2A-2B中可知，在正常肝细胞HL-7702中，经(I-1)化合物处理后，红色荧光为79.4％。同时，在肝癌细胞Hep3B中，经(I-1)化合物处理后，绿色荧光为81.6％。可见，(I-1)化合物对于Hep3B细胞的线粒体膜电位影响更为突出，显著降低了线粒体膜电位，说明化合物对于肝癌细胞存在更高的毒害作用。

此外，同正常的细胞相比，经(I-1)化合物处理后，Hep3B细胞中VDAC1蛋白的表达明显上升，这种异常表现，有可能是导致线粒体膜电位损伤的原因。

实施例4：对核转录因子Nrf2及下游NQO1蛋白表达的影响

实验步骤：提取蛋白及western blot与实例2相同。

细胞经化合物处理24小时，收集细胞提取蛋白检测含量变化，结果见图3，其中，所有四幅图的纵坐标均为“Nrf2(NQO1)蛋白/内参蛋白的相对比率”，以及“*”表示P<0.05。

为阐明化合物介导细胞凋亡的分子机制，我们研究了(I-1)化合物通过Nrf2-ARE信号通路在HL-7702细胞和Hep3B细胞中发挥的作用。Nrf2-ARE信号通路用于适应氧化应激，其下游存在众多抗氧化基因，包括NQO1、HO-1、Gclc等。在正常状体的癌细胞中，Nrf2蛋白大量激活，导致癌细胞具有比正常细胞更强的抗氧化属性。图3显示，经(I-1)化合物处理后，Hep3B细胞中Nrf2蛋白的表达明显下降，甚至低于HL-7702中的蛋白含量。化合物(I-1)化合物对Hep3B毒害作用显著的同时，对HL-7702细胞的影响较小。此外，下游基因NQO1也显著下降，这一现象，对Hep3B细胞氧化应激体系产生较严重的损伤，进一步导致细胞凋亡。

实施例5：ARE-荧光素酶测定结果及下游基因的表达

实验步骤：将HL-7702细胞和Hep3B细胞以3×10⁴/孔的密度接种至24孔板，待细胞铺板约70％进行转染。质粒购自addgene，即pARE-luc(用于检测ARE信号通路激活)和pRL-SV40-N(携带renilla luc基因，用于检测转染效率)。质粒根据碧云天生物技术研究所购买的质粒小抽试剂盒提取，-80℃储存备用。采用脂质体法转染质粒，按照3:1比例，分别转染pARE-luc质粒和pRL-SV40-N质粒。转染6小时后吸弃培养液，加入含有25μm化合物的培养基，分别处理2小时、6小时和24小时。按照时间安排，胰酶消化细胞并收集，采用luc荧光素酶试剂盒检测，并分析数据。

提取收集细胞的mRNA。采用Trizol试剂进行提取，具体步骤为：收集细胞并用PBS冲洗三次，离心后倒掉上清，向细胞沉淀中加入500μl Trizol试剂，涡旋细胞分散为单细胞，室温静置5分钟。4℃离心，吸取上清至新管中，加入200μl氯仿，上下颠倒至混匀，室温静置2分钟后离心。小心吸取分层液体中最上层至新管中，加入500μl异丙醇，上下颠倒后离心倒弃上清液，管底即为mRNA。再加入预冷的质量百分比浓度为75％的乙醇清洗mRNA，离心后挥发乙醇，加入ddH₂O，测定mRNA浓度。保存于-80℃，用于后续RT-PCR和Q-PCR实验。

mRNA按照反转录试剂盒反转录为cDNA，测定浓度后，按照5μl Mix、3μl H₂O、1μl cDNA和0.5μl引物的比例进行RT-PCR实验。按照10μl SYBR、6μl H₂O、2μl cDNA和1μl引物的比例进行Q-PCR实验。

考察了(I-1)化合物对HL-7702和Hep3B细胞中Nrf2氧化应激信号通路的影响；实时荧光定量PCR测定Nrf2-ARE信号通路下游基因(HO-1、NQO1、Gclc)的表达情况，结果见图4A-4B(“*”表示P<0.05和“**”表示P<0.01。)。其中图4A中两幅图的纵坐标均为“荧光素酶单元表达的相对值”，图4B中三幅图的纵坐标均为“光相对密度”。

从图4A中可知，经(I-1)化合物处理后，细胞Nrf2-ARE信号通路出现不同程度活化现象。处理2小时和6小时时，Hep3B细胞的Nrf2-ARE信号通路处于抑制状态，而HL-7702细胞的Nrf2-ARE信号通路不受影响，甚至还在6小时时出现略有上升的迹象。但在24小时时，可能处理时间过长，(I-1)化合物浓度下降等原因，(I-1)化合物对细胞的影响逐渐减少，Hep3B细胞的抑制状态基本解除，其中ARE-luc荧光明显上升。

同时，还检测了mRNA的变化情况，发现(I-1)化合物处理后对Hep3B的影响较大，其中尤其是下游基因NQO1和GCLC。mRNA水平的降低，直接导致蛋白的表达(见图4B)。由于可知，(I-1)化合物对Hep3B存在较大影响，它们可以抑制氧化应激通路信号传递，减少Nrf2蛋白表达，从而影响下游抗氧化基因的表达，进而导致Hep3B细胞凋亡。

综上所述，由上述所有实施例可明确看出，本发明所述的喹唑啉酮并吲唑衍生物具有良好的治疗癌症的药物活性，尤其是对肝癌具有良好的治疗效果，而不影响正常肝细胞的正常生理功能，从而在肝癌治疗领域具有良好的应用前景和潜力。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。