抑制血管通透性及凋亡的方法

专利名称：抑制血管通透性及凋亡的方法
抑制血管通透性及凋亡的方法
本申请是申请人于2004年6月18日进入中国的国际申请 PCT/US2004/019420的分案申请。原案的申请名称为"抑制血管通透 性及凋亡的方法"，国家申请号为200480017548.1。
关于联邦政府资助研发的声明
依照国家健康石开究所颁发的基金号HL67330和HL70694 ，美国政 府对本发明拥有一定权利。
背景技术：
新的血管形成的过程被称作"血管新生(angiogenesis)"。在血管 新生中，血管内皮细胞依次经过增殖、迁移及形态发生形成新的毛细 管网络。在正常或非病态情况下，血管新生在非常确定的情况下发生， 例如在伤口愈合、缺血应答以及胚胎发育中。然而，持续的或不受控 制的血管新生可以导致多种疾病状态或情形，且对于实体瘤而言，可 能是维持病态的必要条件。
很多胞外和胞内信号分子与细胞受体相互作用并调节血管系统内 的行为，包括与血管新生相关的过程。鞘氨醇4-磷酸(S1P)是一种具 有生物活性的鞘脂，其通过与质膜定位G蛋白偶联受体的内皮细胞分化基因家族(EDG亦被称作S1P。受体)中的成员相互作用介导多种细胞 应答。至今，该家族中5个成员已在不同类型细胞中被识别为S1P受体， S1P,/EDG-1、 SlP2/EDG-5、 SlP3/EDG-3、 SlP4/EDG-6和SlPs/EDG-8。 特别地，已经证实在体外S1P与S1P,和S1P3受体的相互作用在内皮细胞 的存活和形态发生中发挥重要作用且S1P!对体内血管成熟是必需的。但 是，S1P对其它器官系统如免疫系统和生殖系统也产生有效的作用，意 味着其是多功能脂质介导因子。
S1P及其受体参与血管系统的调节。因此希望利用S1P受体，特别 是在血管系统疾病的治疗中。

发明内容
一种对需要接受血管通透性疾病治疗的哺乳动物的治疗方法，包 括以有效量的血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂对哺乳动物给药，其 中该血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂不是鞘氨醇-1-磷酸。
一种对需要4娄受有害血管内皮细胞凋亡治疗的哺乳动物的治疗方 法，包括以有效量的血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂对哺乳动物给 药，其中该血管内皮鞘氨醇-l-磷酸受体拮抗剂不是鞘氨醇-l-磷酸，且 其中有害血管内皮细胞凋亡不涉及移植排斥。
一种刺激哺乳动物体内新血管生成的方法，包括以有效量的血管 内皮鞘氨醇-l-磷酸受体拮抗剂在哺乳动物体内位点给药，其中该血管 内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂不是鞘氨醇-l-磷酸。
在一个具体实施方案中，公开了 一种血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂、其 一 制药学可接受形式或其 一磷酸化形式在制备用于治疗血 管通透性疾病的药物上的应用，其中该血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮 抗剂不是鞘氨醇-l-磷酸。
在另 一具体实施方案中，公开了 一种血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体 拮抗剂、其一制药学可接受形式或其一磷酸化形式在制备用于治疗有 害血管内皮细胞凋亡的药物上的应用，其中该血管内皮鞘氨醇-1-磷酸 受体拮抗剂不是鞘氨醇-l-磷酸，且其中该有害血管内皮细胞凋亡不涉 及移植排斥。
在另 一具体实施方案中，公开了 一种血管内皮鞘氨醇-l-磷酸受体 拮抗剂、其一制药学可接受形式或其一磷酸化形式在制备刺激哺乳动 物体内新血管形成的药物上的应用，其中该血管内皮鞘氨醇-l-磷酸受 体拮抗剂不是鞘氨醇-l-磷酸。


现参考附图，其中同样的成分在一些附图中编号相同
图1是暴露于FTY720和(R)-AAL的HUVECs通过或没有通过细胞
培养的细胞迁移实验的结果图。
图2细胞迁移实验的结果图，证实了内皮细胞激活FTY720和
(R)-AAL的能力被鞘氨醇激酶(SK)抑制剂二甲基鞘氨醇(DMS)阻断。
图3是使用条件培养基(CM)和HUVECs全细胞提取物(TCE) 进行的体外激酶实验的薄层层析(TLC)-放射自显影图。图4是用栽体对照293T细胞(293T) 、 SKI过量表达293T细胞 (SKI-293T)和SK2过量表达293T细胞(SK2-293T)的提取物进行的 体外激酶实验的TLC-放射自显影图。SK1-293T (白柱)和SK2-293T (黑柱)vs.载体转染293T的特定活性的诱导倍数在底图中显示。
图5是使用指定浓度的S1P (100 nM) 、 FTY720-P (FTY720-P) 或(R) -AFD ( (R) -AAL的磷酸化形式)的HUVECs迁移实验(白 柱对照；黑柱百日咳毒素(Pertussis toxin)治疗)。
图6显示了用指定浓度的S1P、 FTY720-P (FTY720-P) 、 FTY720 (FTY) 、 (R) -AFD或(R) -AAL刺激5分钟后HUVEC内的磷酸-Akt、 总Akt、磷酸-ERK4/2和总ERK-1/2水平的蛋白质印迹(Westem Blot)。
图7显示了证明百日咳毒素治疗防止了 S1P、FTY720-P(FTY720-P) 和(R) -AFD对Akt和ERK-1/2的磷酸化的蛋白质印迹。
图8显示了FTY720-P对凋亡的影响的实验，该实验通过测量引入 {甲基」H)-胸苷后HUVEC细胞内的DNA片断的百分比进行。
图9是DNA片断分析，该分析显示百日咳毒素治疗去除了 S1P、 FTYMO-P以及(R) -AFD对凋亡的保护作用。
图10是免疫荧光分析，其中C:赋形剂对照；S1P: 100nMSlP; FTY: 10nMFTY720; FTY720-P: 10 nM FTY720-P; AAL: 10 nM (R) -AAL; AFD: 10nM (R) -AFD。刻度柱二50[xm。
图11是VEGF诱导的细胞旁通透性的时程分析图VEGF: 20 ng/mL, FTY720-P: 100 nM FTY720-P。
图12是证明100nMSlP (S1P) 、 100 nM FTY720-P (FTY720-P)和100nM (R) -AFD ( (R) -AFD)抑制VEGF-诱导细胞旁通透性 的图。
图13显示了鼠耳微血管通透性分析的焚光成像图。 图14显示了耳内血管外荧光的定量。
发明的具体说明
如在此被引作参考的美国专利号6,486,209; 6,476,004; 6,471,980; 6,372,800; 6,274,629; 6,187,821; 6,004,565和5,948,820中所示，FTY720 是一种有效的免疫调节因子，其在器官移植的动物模型中已经呈现作 用。近来显示该化合物作用机制包括磷酸化形成FTY720-P，该化合物 是对T淋巴细胞5种S1P受体中4种的拮抗剂。此前已经显示FTY720 是淋巴细胞归巢迁移(trafficking)的有效调节因子，然而，FTY720对 血管成分的作用此前是未知的。
在此i正实血管内皮细胞包含酶系统以"激活"FTY720及其类似物。 培养的内皮细胞如人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)是用于研究血管 新生的可接受的体外模型系统。在与HUVEC条件培养基或细胞提取物 培养后，FTY720被磷酸化且能够激活内皮细胞以百日咳毒素敏感方式 迁移，暗示其激活G「偶联S1P受体。在此显示内皮细胞衍生的鞘氨醇激 酶-2 (SK2)参与FTY720形成FTY"0-P的代谢。
在此还显示FTY"0-P及其类似物(R) -AFD以一种类似于SIP 的方式激活血管SIP受体并刺激信号通路。这些事件造成了对内皮细 胞凋亡的抑制，该凋亡在血管系统受压力的各种病理情况中发生。SIP受体拮抗剂的另 一 生理相关效应是诱导内皮细胞内的粘合连接装配。
还显示了在S1P、 FTY720-P和(R) -AFD剌激后诱导了 VE-钙粘蛋白的易位。细胞一细胞连接分子是调节血管通透性的介导因子的重要耙点。S1P、 FTY720-P和(R) -AFD可以在体外阻断VEGF-诱导细胞旁通透性并在体内阻断VEGF-诱导的血管通透性。内皮细胞内FTY720-P和(R) -AFD对粘合连接装配的诱导可能在体内具有2项重要应用。一方面，这可能是FTY720作用机制的一部分。FTY720通过调节窦内衬(sinus-lining)内皮的细胞一 细胞连4I"能防止淋巴细胞从淋巴窦的溢出。事实上，FTY720-P体外抑制趋化因子诱导的T淋巴细胞通过单层内皮细胞的迁移。另一方面，FTY720可以在急性血管病变情形如作为脓毒病并发症发生的呼吸窘迫综合症中抑制血管通透性。此外，血管通透性的长期变化是内皮细胞损伤的标志，且可以造成在缺血性心血管疾病和与糖尿病相关的周边血管疾病中常见的慢性病。FTY720-P是血管系统有效的修饰剂，且其可在内皮细胞受到损害的情况下用作内皮细胞完整性的保护剂。
因此本发明涉及对需要接受血管通透性疾病治疗的哺乳动物的治疗方法，涉及抑制血管内皮细胞凋亡的方法，且涉及刺激新血管形成的方法。上述方法包括对哺乳动物以除S1P本身外的血管内皮S1P受体拮抗剂的有效量给药。血管内皮S1P受体拮抗剂或其 一 制药学可接受形式可被用于制备治疗对血管内皮S1P受体拮抗剂有应答的疾病、紊乱或状态的药物。合适的血管内皮S1P受体包括例如S1P、S1P2、 S1P3、 S1P4、S1P5以及包含一种或多种前述受体的混合物。在一具体实施方案中，S1P受体包括S1P,、 S1P3及其混合物。血管内皮S1P受体拮抗剂可以是制药
学可接受的盐和/或由鞘氨醇激酶2磷酸化。
血管内皮S1P受体的合适拮抗剂包括例如1，2-氨基醇、其制药学可接受盐、其磷酸化形式以及包含一或多种前述拮抗剂的混合物。在此使用的血管内皮S1P受体拮抗剂的"制药学可接受形式"包括制药学可接受盐、水合物、溶剂合物、晶体形式、多晶型体、螯合物、非共价络合物、酯、包合物、前药以及这些化合物的混合物。制药学可接受盐是一种合适的制药学可接受形式。
"制药学可接受盐"包括血管内皮S1P受体拮抗剂的衍生物，其中母化合物通过制备成无毒的酸性或碱性盐加以修饰，且进一步指这些化合物和这些盐的制药学可接受溶剂合物。制药学可接受盐的实施例包括
但不限于碱性基团例如胺的无机或有机酸盐；酸性基团如羧酸的碱性或有机盐；等等。制药学可接受盐包括从例如无毒的无机或有机酸形成的母化合物的传统无毒盐和季铵盐。例如，传统的无毒酸性盐包括衍生自无机酸例如盐酸、氢溴酸、石克酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐；以及々t生自有4几酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、鞋基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲磺酸(mesylic)、乙磺酸(esylic)、苯磺酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、反丁烯二酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙基磺酸、HOOC-(CH2)n-COOH其中n是0 —4,等等。制药学可接受盐可以通过常规化学方法从母化合物、 -减性或酸性基团合成。 一般地，将这些化合
9物的游离酸形式和合适的碱(例如Na、 Ca、 Mg或K的氢氧化物、碳酸
盐、碳酸氢盐等)的根据化学剂量比的量进行反应，或将这些化合物
的游离碱形式和合适的酸的根据化学计量比的量进行反应，制备这些
盐。这些反应典型地在水中或在有机溶剂或在两者的混合物中进行。
一般地，在可操作的情况下，非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异
丙醇或乙腈是优选的。可以在例4口Remington's Pharmaceutical Sciences，
第17版，Mack出版公司，Easton,Pa.，第1418页(1985)中找到额外
的合适的盐的列表。
合适的1，2-氨基醇具有结构式
(pH2OR3》一 —CH2(0)nRa& H2C-R, ①
其中R,是取代或未被取代的具有12至22个4^原子的直链或支链碳链，该碳链可选择性地被取代的或未取代的亚苯基或苯氧基打断；各R2、R3、 R4及R5独立地是氢原子或Cw烷基；且n是0或l。在一具体实施方案中，结构式I的化合物是其中&是具有13至20个碳原子的直链或直链烷基的化合物，烷基选择性地由确基、卣素、氨基、羟基或羧酸取代，且更优选地是其中R,是(苯基)烷基-的化合物，其中苯基由直链或支链的由卣素选择性取代的C^烷基或C6—14烷氧基链取代，且烷基部分是由羟基选择性取代的CV6烷基。在一具体实施方案中，R,是(苯基)
C,—f,烷基-，其苯基上被直链或支链Cf,—14烷基或<^14烷氧基链取代。C^,4烷
基链可以在邻-f立、间4立或对位上。在一个具体实施方案中，112至115均为氢。
在此使用的选择性地打断指烷基链可在烷基链内的任何位点被插
入。例如见结构式2。用于非两个字母或符号之间的破折号("-")表示
取代基的连接位点。例如(苯基)烷基-是通过烷基基团的-炭原子连接的。
在此使用的"烷基"试图包括具有特定碳原子数的支链和直链饱
和脂肪碳氢化合物基团。因此，在此4吏用的术语C广C6烷基包括具有1至6个碳原子的烷基基团。当Q-Q烷基在此结合另一基团使用时，例如(苯基)Co-Q烷基，指示基团，本例中的苯基，通过单个共价键(C。)直接连接或通过具有特定数目^5炭原子，本例中从l至大约4个碳原子的烷基链连接。烷基实施例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和仲戊基。优选烷基是低碳烷基，具有l至大约8个碳原子的烷基，例如C厂Cs和CVQ，烷基。
1，2-氨基醇衍生物可以有一或多个手性中心。因此，人们可以选择性地只制备一种光学异构体，包括非对映异构体和对映异构体，例如通过手性起始材料、催化剂或溶剂；或可以一次性制备两立体异构体或两光学异构体，包括非对映异构体和对映异构体(外消旋混合物)。由于化合物可以以外消旋混合物存在，光学异构体包括非对映异构体及对映异构体或立体异构体的混合物可以使用已知方法分离，如通过例如手性盐和手性层析的应用。
此外，人们认识到一种光学异构体包括非对映异构体和对映异构体或立体异构体可以具有优于其它异构体的性质。当在此讨论外消旋混合物时，明确地意味着其包含两光学异构体，包括非对映异构体和 对映异构体，或基本不包含另一种立体异构体的立体异构体。
结构式1的合适的化合物包括2-氨基-2-[2-(4-八苯基(octaphenyl》乙 基]丙—1,3 二醇，也称作FTY720 (结构式II)和已知为AAL的FTYWO 的一衍生物，其中羟亚甲基取代基被甲基替代，或2-氨基-2-甲基-4-[4-庚氧基—苯基]丁-1-醇 (结构式III)。
(ni)
在体内，FTY720和AAL可以被内源激酶如SK2激酶磷酸化以分 别制备结构式(IV)的化合物(FTYW0-P或2-氨基-3-磷酸-2-[2-(4-八苯 基)乙基]丙-l-醇)以及(V) ( (R) -AFD或2-氨基-2-甲基-4_[4-庚氧基 -苯基]l-二磷酸)的化合物。<formula>formula see original document page 13</formula>血管内皮鞘氨醇-1 -磷酸受体拮抗剂可以是2-氨基-2-[2-(4-八苯基) 乙基]丙-1，3-二醇；2-氨基-2-甲基-4-[4-庚氧基-苯基]丁-l-醇；2-氨基-3-磷酸-2-[2-(4-八苯基)乙基]丙4-醇；2-氨基-2-甲基-4-[4-庚氧基-笨基]1-二 磷酸；或包含一或多种前述拮抗剂的混合物。
可以对哺乳动物以血管内皮S1P受体的拮抗剂的有效量给药以治 疗血管通透性疾病。这些疾病包括例如内皮损伤、血小板减少、动脉 石更化症、心血管缺血症、外周血管缺血症、糖尿病相关外周血管病、 登革出血热、成人(急性)呼吸窘迫综合症、血管渗漏综合症、败血 病、自身免疫血管炎、以及包含前述一种或多种疾病的综合症。
内皮损伤可以由高血压、压力诱导激素、化学毒素、污染、胆固 醇、传染剂(例如肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌、疱渗病毒、白色念珠菌)、高半胱氨酸以及各种疾病引起。内皮损伤相关的病情包括动脉 硬化症和血管瘤。动脉硬化症与在内皮下间隙的脂质堆积相关。脂质 的堆积可能是由局部提高的血管内皮通透性引起的。动脉粥瘤是动脉 粥样硬化损伤中心的坏死物质。血管瘤是由扩张的血管形成的良性肿瘤。
血小板减少症是血小板(一类血细胞)数目异常低的一种疾病，
有时与异常出血相关。成人特发性血小板减少性紫癜(ITP)通常是由 于产生针对结构血小板抗原的抗体(自身抗体)造成的。与ITP相似 的造成血小板减少的其它疾病包括胶原血管性疾病(例如SLE)或淋 巴组织增生性疾病引起的免疫血小板减少症。肝素诱导血小板减少症 由肝素-抗体复合物与血小板表面细胞膜上的Fc受体结合造成的。在血 小板减少症中，内皮损伤、提高的血管通透性和組织水肿是普遍的。
缺血性心脏病是由于血液供应缺乏或相对不足引起的心肌损伤或 心肌不能有效工作的状况。该疾病最经常地由动脉;硬化症引起且包括 心绞痛、急性心急梗塞、慢性缺血性心脏病和猝死。该疾病也被称作 冠心病(CHD)。
与糖尿病相关的一些血管通透性疾病包括糖尿病4见网膜病变、糖 尿病肾病变、糖尿病小血管病变、糖尿病大血管病变和阻塞性血管疾 病。
登革出血热由黄病毒属(Flavivirus)的四种密切相关但抗原可区别 的病毒血清型(DEN-1、 DEN-2、 DEN-3和DEN-4)中的一种引起。 一种这些血清型的感染不提供交叉保护免疫，因此个体在登革热寿命期间内可能遭受四种登革热感染。登革热是一种热带疾病，且造成该 疾病的病毒的生命周期涉及人和埃及伊蚊(Aedes aegypti)， 一种地域 性的、以人为食的白天叮咬的蚊子。在登革出血热/登革休克综合症 (DHF/DSS)中观察到的主要病理生理异常是血管通透性的急性增加。 登革热的特征为突发性高烧、寒战、头痛、皮渗、出血迹象、味觉变
化、咽喉痛、恶心、呕吐、腹泻以及严重的肌肉痛和关节痛。在极端 病例中，登革休克导致血浆渗漏，且如果血浆渗漏严重将随后导致血 容量减少性休克。
系统性血管渗漏综合症是一种疾病，其特征为由于10% —70%血 浆突发短暂渗漏造成的复发性低血压和血液浓缩。临床上，该综合症 表现为低血压、血液浓缩和低血清蛋白。在静息期，毛细血管的通透 性正常。渗漏只发生在发作期。该渗漏的病理生理原因还是一个谜。 经典通路补体的激活、持续低水平的5-脂氧酶的内源刺激和白介素-2 的作用被提议为可能的诱因。
成人(急性)呼吸窘迫综合症(ARDS)是急性进行性肺功能特别 是吸取氧气的能力衰竭，并常伴随着其它器官的功能衰竭。病情通常 伴随着广泛的肺部感染和受感染器官的小血管损伤。起始的损伤为毛 细血管上皮或肺泡上皮的损伤。毛细血管通透性提高后伴随着组织 (organization)和结疱。炎症细胞和介导因子如白细胞和损害上皮并造陷。
败血病是能够导致系统性炎症反应综合症(SIRS)的状况。典型地，感染是局部的，然而，感染可以严重至造成活性介导因子从感染 的局部位点溢至血流中或感染性生物可以自该位点扩散并造成系统性 感染或败血病。大约50%的败血病是由革兰氏阴性生物造成的，该生 物中主要的效应分子是脂多糖。败血病可导致升高的血管通透性且在 极端病例中可造成多器官衰竭。
自免疫血管炎是一类疾病，其特4正为被认为由自免疫应答造成的 血管炎症和损伤。血管炎诱导的血管损伤可以导致升高的血管通透性、 造成动脉瘤形成或出血的血管弱化、以及导致阻塞和局部缺血的内膜 增生和血检。
本发明还包括通过血管内皮S1P受体拮抗剂的有效量的给药治疗
有害血管内皮细胞凋亡如凋亡相关疾病的方法。有害凋亡不涉及移植 排斥。凋亡是最终导致细胞死亡的精细控制的系列细胞事件。凋亡的 形态学特征包括细胞萎缩和细胞—细胞接触的消失、核染色体浓缩并 随后形成片断、细胞膜皱褶、细胞膜泡和凋亡小体的出现。在过程的 最后，相邻细胞和巨噬细胞吞噬凋亡细胞的片断。最明确定义的凋亡
的生化事件包括核DNA的顺序解体。凋亡信号促进了专一的钙和镁依 赖的核酸内切酶的活化，该酶将核小体之间连接区域的双链DNA切 断。该过程导致了多个大约180至大约200碱基对的DNA片断的生成。 凋亡的失调在疾病状态中具有重要作用，且疾病可由于过量的或 过少的凋亡的发生而引起。与过少凋亡相关的疾病的实施例将是某些 癌症。与过量或不恰当的凋亡相关的凋亡相关疾病的实施例包括缺血 性疾病(再灌注损伤除外)、外周血栓、神经退行性疾病、外周神经损伤、再生障碍性贫血、肝损伤以及HIV感染。此外，内皮凋亡是用 于治疗肺瘤的放疗的标志。S1P受体拮抗剂可用于治疗接受放疗的病人
以保护血管功能。
凋亡是心脏衰竭中细胞死亡的主要原因。缺血性疾病的实施例包 括心脏病如特发性心肌病、药物(例如阿霉素)或慢性酒精中毒诱发 的心肌病、家族性心肌病、病毒性心肌炎或心肌病、心肌4更塞、心绞 痛、充血性心脏衰竭和心律不齐，以及脑血管疾病如脑中风、蛛网膜 下腔出血、脑才更塞和脑血栓。
凋亡还涉及 一 些神经退行性疾病。这些神经退行性疾病的实施例 包括阿尔兹海默氏疾病、帕金森氏病、亨丁顿氏病、肌姿缩性脊髓侧
索硬化症和视网膜色素变性。血管内皮S1P受体拮抗剂的使用可修复 诱导神经元损伤的血管损伤。
本发明进一步包括通过血管内皮S1P受体拮抗剂的给药刺激新血 管生长的方法。新血管的形成可以以器官专 一性的方式刺激例如通过 病毒转导在指定组织中表达鞘氨醇激酶-2和通过FTY720的口服给药 诱导FTY720-P的局部生成。这些治疗可用于治疗糖尿病人具有血管生 长缺陷的腿。血管内皮S1P受体拮抗剂在该状况下可被用于刺激血管 生长。此外，在心脏中刺激新血管生长可能对患有心脏病的个体的心 脏功能有利。例如，通过病毒基因治疗可在心脏中诱导鞘氨醇激酶-2 的表达，随后进行FTY720的给药以在局部产生FTY720-P并诱导心脏 中的血管新生。
血管内皮S1P受体拮抗剂的每日给药剂量可以根据例如使用的拮抗剂、宿主、给药模式以及治疗状况的严重程度而变化。合适的日剂
量是每天大约0.01至大约10毫克每公斤(mg/kg),或每天大约0.1 至大约2.5mg/kg，作为单次剂或分次剂给药。用于口服给药的合适的 单元剂量形式包含大约1至大约100 mg,或大约5至大约50 mg的活 性成分如FTY720以及一种或多种制药学可接受稀释剂或载体。作为替 换，拮抗剂可以以游离形式给药或也可以以制药学可接受盐形式，例 如按以上说明的剂量每周2 — 3次给药。
包含血管内皮S1P受体拮抗剂的制药学组合物可包含额外的用于 治疗血管通透性及血管内皮细胞凋亡相关疾病的药理学试剂。合适的 额外的药理学试剂包括例如细胞毒试剂、化疗试剂、激素、类固醇类 消炎药(例如强的松、皮质类固醇等)、非类固醇消炎药(例如NSAIDs 、 阿斯匹林、对乙酰氨基酚等)；以及包含一或多种前述额外药理学试 剂的混合物。
制药学组合物可使用 一或多种生理学可接受载体或赋形剂配制。 因此，化合物及其生理学可接受盐及溶剂合物可用于配制用于吸入或 吹入(通过口或鼻)给药或口服、口腔、非肠道或直肠给药的药物。
为了 口服给药，制药学组合物可以和制药学可接受赋形剂通过本 领域已知方法制备成片剂或胶嚢的形式，赋形剂如粘合剂(例如预胶 化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如 乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、云母或硅 石)；分解剂(例如土豆淀粉或幾甲基淀粉钠)；润湿剂(例如十二 烷基疏酸钠)；以及包含一种或多种前述赋形剂的混合物。片剂可以
18通过本领域熟知方法包被。口服给药的液体制剂可以采用例如溶液、 糖浆或悬浮剂的形式，或者可作为干燥产品存在，在使用前加入水或 其它合适的赋形剂。这些液体制剂可以用传统方法与制药学可接受添 加剂一同制备，添加剂如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或
氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性 赋形剂(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏蔬菜油)；防腐剂(例如 对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)；以及包含一种或 多种前述添加剂的混合物。制剂还可以包含合适的緩冲盐、调味剂、 着色剂以及甜味剂。
可以恰当地制备口服给药的制剂以实现活性化合物的控制释放。 对于口腔给药，组合物可以通过本领域已知技术配制成片剂或锭剂的 形式。对于吸入给药，化合物可以通过加压包装或喷雾器中的气雾剂 形式常规给药，并使用一合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲 烷、二氯四氟乙烷、二氧化^f友或其它合适的气体。在加压气雾剂的实 例中，通过"f是供阀门定量给药可以确定剂量单位。用于吸入剂或吹入 剂的例如凝胶的胶嚢以及药筒可经配制包含化合物和合适的粉末基如 乳糖或淀粉的粉末混合物。化合物可被配制用于通过注射如团注或连 续灌注的非肠道给药。用于注射的配方可以以单位剂量形式如针剂或 多剂容器形式存在，并含有一添加的防腐剂。组合物可以采用诸如悬 浮剂、溶液或油乳剂或水乳剂的形式并包含配方试剂例如悬浮剂、稳 定剂及/或分散剂。可替换地，活性成分可以是粉末形式，在使用前加 入合适的赋形剂例如无菌的不含热原的水。化合物还可以配制成直肠組合物如栓剂或灌肠剂，其中包含常规栓剂基如可可黄油或其它甘油 酯。除了之前说明的配方，化合物还可以配制成储库型制剂。这些长 效配方可以通过移植(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射给药。 因此，例如化合物可以与合适的多聚或疏水材料(例如成为一种可接 受的油乳剂)或离子交换树脂一同配制，或配制成微溶衍生物例如微落盐。
由于SK2激酶^本外和体内磷酸化FTY720,个人SK2激酶的水平测 定可以在疾病治疗中用于预测血管内皮S1P受体拮抗剂的有效性。例 如，该测试可用于预测指定个体是否是FTY720治疗的候选人。可替换 地，如果个体SK2激酶水平低，优选的给药化合物可以是血管内皮S1P 受体拮抗剂的磷酸化形式或具有不同化学结构的另一 S1P受体拮抗剂。
本发明进一步用以下非限定性实施例说明。 实施例 一般方法
试剂不含脂肪酸的血清白蛋白(ffa-BSA) 、 4-脱氧吡多醇和p-甘 油磷酸、异疏氰酸荧光素(FITC)-右旋糖苷(平均,=2，000千道尔 顿(kDa)和165kDa)购自Sigma化学品公司。鞘氨醇、N，N-二甲基鞘 氨醇(DMS)和S1P购自Biomol Research Laboratories有限公司(Plymouth Meeting, PA) 。 {丫-32P}ATP (专一活性6,000 Ci/mmol)以及(甲基-3H}-胸苷(专一活性86 Ci/mmol)购自Amersham。 FTY720、磷酸FTY720、 (S) -AAL、 (R) -AAL和磷酸-(R) -AAL由V. Brinkmann博士， Novartis 提供。磷酸-Akt、 Akt、磷酸-ERK1/2以及ERK1/2抗体购自Cell SignalingTech.，以及VE-转粘蛋白抗体购自Santa Cruz Biotech。
小鼠SKI和SK2的cDNA克隆使用小鼠肝脏RNA (Ambion)通 过反转录PCR扩增鼠鞘氨醇激酶(SKI和SK2) cDNA，分别使用正向 引物SEQ ID NO: 1 (AGC CCC ATG TGG TGG TGT TGT)和SEQ ID NO: 2 (ATT ATG GCC CCA CCA CCA CTA CT),以及相应的反向引 物SEQ ID NO: 3 (GGC ACA GAGTTATGGTTC TTC)和SEQ ID NO: 4 (AGG TCA GGC TTG TGG CTT TTG AC)。将得到的PCR产 物克隆进pcDNA3.1 Topo载体(Invittogen)，且确认DNA序列。随 后将SKI和SK2 cDNAs克隆进pcDNA3.1原核表达载〗本(Invittogen)。
细胞培养和转染在补充了 10%胎牛血清(FBS)以及肝素-稳定内 皮细胞生长因子的Ml99培养基中培养HUVEC (Cloneticsp4-11)。通 过磷酸4丐法用4微克([jig)的空载体和含有SK构建体的载体在60 mm 培养皿中转染293丁细胞。转染后24小时，在4t用400微升([xl) 25 毫摩尔(mM) HEPESpH7.5、 5mMMgCl2、 1X蛋白酶抑制剂混合物
(Calbiochem)刮擦收获细胞并用简单的超声法破碎细胞。在4°C以 20,000 X g将细胞匀浆离心10分钟。
统计分析所有实验进行2至5次，且代表性实验在此显示。在迁 移和凋亡实验中，结果代表了 3次重复的平均值。使用Microsoft Excel 软件通过学生t检验(student' s t test)计算P值。
实施例1:在血管内皮细胞内鞘氨醇激酶对FTY720的磷酸化
由于S1P是内皮细胞趋化性的有效诱导因子，测试了 FTY720及其类似物对内皮细胞迁移的影响。使用96孔趋化性微室(Neuro Probe有 限公司)对HUVEC迁移进行了分析(Paik，J.H.等，J Biol Chem 276: 11830-11837 (2001))。简言之，孔径为8微米([jim)的聚碳酸酯滤 器包被了 5微克每毫升(pg/ml)纤维连接蛋白。S1P、 FTY720、 AAL、 FTY720-P或(R) -AFD用0.1 %ffa-BSA稀释至合适浓度。将来自HUVEC 的85(xl溶液或条件培养基加入下方培养室中。将悬浮于含有0.1°/。牛血 清白蛋白的M199中的大约5X10"个细胞置于上方培养室中。在5°/0 (:〇2的潮湿培养室中允许细胞在37。C迁移4小时。在培养期以后，去除 滤器，在％孔板中用0.1%结晶紫对细胞染色并用10%醋酸洗脱细胞。 用Spectramax 340读斧反4义(Molecular Devices)才艮据575納米(nm)的吸 收值定量。
细胞用M199普通培养基(plain medium)洗涤3次并与含有不同 浓度FTY720或(R) -AAL的0.1%不含脂肪酸的BSA培养3小时进行 内皮细胞对FTY720和(R) -AAL的活化。
在培养后，去除条件培养基，以l，OOOXg离心10分钟，并用于迁 移分析。
图1显示了使用以下趋化剂的HUVECs迁移实验的结果(白柱对 照；黑柱百日咳毒素治疗)S1P (100纳摩尔(nM) ) 、 FTY720 (FTY)和AAL的可变浓度，与FTY720 (FTY) 、(R) -AAL或(S) -AAL的指定浓度培养3小时后的内皮细胞的条件培养基。数据=重复 3次的代表性实验(N = 3)的3組值的平均值土SE。 *p<0.01 vs.赋形剂 对照，# p<0.01 vs.没有百日咳毒素的细胞。
22FTY720或其结构类似物(R) -AAL在广泛的浓度范围内均不能诱 导内皮细胞的迁移(图l)。然而，当FTY720或(R) -AAL与HUVEC 培养3小时后，它们被活化成对内皮细胞有效的趋化剂。该条件培养 基诱导的迁移是剂量依赖且百日咳毒素敏感的，意味着G「偶联受体的 参与。作为对比，不能被鞘氨醇激酶(SK)磷酸化的对映异构体(S) -AAL在与内皮细胞培养后没有诱导迁移。这些数据与假设一致，即内 皮细胞磷酸化并活化FTY720和(R) -AAL成为磷酸化衍生物，这些衍 生物是内皮细胞的趋化剂。4吏用引物SEQIDNOs: i-4; SK1的 TGGAGTATGAATGCCCCTAC ， CGCTAACCATCAATTCCCC和SK2 的GATCACCCCTGACCTGCTAC ， GGCATCTTCACAGCTTCCTC通过 RT-PCR在HUVEC细胞中观察到SK1和SK2转录产物的存在(数据未显 示)。
为了进一步研究SK1和SK2参与FTY720磷酸化的可能性，测试一 种SK抑制剂DMS对FTY720和(R) -AAL向活性形式转化的阻断。图2 显示了HUVECs迁移实验的结果，该试验使用10punDMS不存在(白 柱)或存在(黑柱)时的S1P (100 nM)或与100nMFTY720 (FTY) 或100nM (R) -AAL培养3小时的内皮细胞条件培养基。* p<0.01 DMS vs.赋形剂对照。DMS处理(10[jim)有效地抑制了内皮细胞活化FTY720 以及(R) -AAL的能力(图2)。这些结果暗示着HUVEC中存在的SK 活性能够磷酸化和活化FTY720和(R) -AAL。
实施例2: FTY720和R-AAL磷酸化的确认为了确定FTY720和(R) -AAL能够被内皮细胞磷酸化，用HUVEC 全细胞提取物和条件培养基进行体外激酶分析。细胞用M199普通培养 基洗涤3次并与0.1% ffa-BAS培养指定的时间。在培养后，去除条件 培养基，以l，OOOXg离心10分钟并用于激酶活性分析。用400 [xl25mM HEPES pH 7.5、 5 mM MgCl2、 1 X蛋白酶抑制剂混合物在4°C刮擦细胞 并用简单超声法破碎。以20,000 X g于4°C将细胞匀浆离心10分钟。在 激酶分析中，使用HUVEC的300 pl条件培养基(衍生自5乂105细胞培 养3小时)或10 [xg全细胞提取物作为激酶活性的来源。反应包含20 鞘氨醇或100 pMFTY720或AAL、 [Y-32P]ATP (lOpCi) 、 5mMMgCl2、 15mMNaF、 0.5 mM 4-脱氧晚多醇、40 mM-甘油磷酸以及300 pd M199 且在37。C培养30分钟。提取脂肪且将样品重悬于50txl氯仿中。使用 1-丁醇/乙酸/水(60/20/20体积/体积)緩沖液在硅胶G60上进行脂肪 的TLC分析并用磷屏成像(Phosphorlmager)(Molecular Dynamics)定 量。
如图3所示，FTY720和(R) -AAL被HUVEC中存在的激酶活性 磷酸化(图3上图，专一活性依次为3.85±0.75以及15±0.93皮摩尔 每毫克每分钟)。和预测的一样，鞘氨醇是该激酶活性的有效底物(专 一活性75.7士6 (皮摩尔每毫克每分钟(pmol/mg/min)))。相反地， 观察不到(S) -AAL的磷酸化，与迁移实验中获得的结果一致。FTY720 和(R) -AAL的磷酸化被DMS (50[xM)抑制。相似地，在HUVECs 的条件培养基中观察到了激酶活性(图3，底图)且活性被Triton X-100 抑制并由KC1 (200 mM)提高(数据未显示)，上述都是对SK酶活性有利的条件。
实施例3: SK2在FTY720和(R) -AAL磷酸化中作用的确定
为了确定SK2在FTY720和(R) -AAL磷酸化中的作用，用包含 SK1或SK2 cDNA的pcDNA3.1/Neo表达载体瞬时转染HEK293T细胞， 并检测FTY720、 (R) -AAL和(S) -AAL的磷酸化。图4显示了体外 激酶实验的TLC-放射自显影，该实验用对照载体293T细胞(293T)、 SK1超量表达293T细胞(SK1-293T)以及SK2超量表达293T细胞
(SK2-293T)的才是取物进行。4吏用对照载体=(C) 、 100 [jlM FTY720 =(F) 、 100 [xM (R) -AAL= (R) 、 100 (S) -AAL= (S)或20 jxM鞘氨醇二 (SG)作为底物。当标记(+ )时包含SOpMDMS。显 示了 N = 3-5的代表性实验。底图中显示了 SK1-293T(白柱)和SK2-293T
(黑柱)vs.载体转染293T的专一活性诱导倍数。箭头表示磷酸化化 合物。
在载体转染细胞中观察到适量的内源性鞘氨醇激酶活性(图4)。 SK1细胞提取物呈现出与对照293T细胞相似的FTY720或(R) -AAL 激酶活性而在SK1-293T细胞中的鞘氨醇磷酸化显著提高(专一活性 48.1 pmol/mg/min vs. 293T中的10.5,图4)。然而SK2-293T细胞相比 于对照293T细胞显示了提高的FTY720和(R) -AAL激酶活性(分别 诱导3.7和7倍)。SK2-293T中FTY720、 (R) -AAL和鞘氨醇的专一 活性依次为41.6、 199.5和319.9 pmol/min/mg。 293T、 SK1-293T和 SK2-293T细胞中几乎观察不到(S) -AAL的磷酸化。通过与DMS (50pM)培养，FTY720、 (R) -AAL和鞘氨醇激酶活性被阻断。这些结果 暗示着SK2在将FTY720和(R) -AAL磷酸化并因此将这些化合物活 化成S1P受体拮抗剂中的作用。此外，这些结果意味着HUVEC能够 磷酸化和活化存在于胞外基质中的FTY720和(R) -AAL。
实施例4: FTY"720-P对内皮细胞应答的作用
在HUVEC中研究了FTY"0-P及其类似物(R) -AFD的作用。在图 5中，数据二三次重复的平均^f直土SE。 N = 3。 *p<0.01治疗vs.赋形剂 对照，#p<0.01vs.没有百日咳毒素的细胞。FTY720-P和(R) -AFD是 HIJVEC的有效趋化剂(图5)。两者在10nM具有最大作用(分别诱 导13和9倍)，虽然S1P略微更有效(14倍诱导)。FTY7M-P和(R) -AFD诱导迁移被百日咳毒素(200ng/mL)阻断，意味着这是由异三聚 体&蛋白质通路介导的作用。
内皮细胞形态发生， 一种要求内皮细胞迁移、存活和粘合连接装 配的现象，由S1P,和S1P3受体的配体依赖性活化介导。已显示S1P诱导 内皮细胞内的Akt蛋白激酶和ERK蛋白激酶磷酸化，且Akt-介导的 S1P/EDG-1受体的磷酸化是S1P诱导迁移所需要的。FTY720和类似物 在HUVEC对Akt和ERK磷酸化作用通过蛋白质印记分析研究。在处理 前将HUVEC细胞的铺满培养物在0.1% ffa-BSA中血清饥饿2小时。随 后，用冰冷的含有1 mM氟化钠和1 mM原钒酸钠的磷酸盐緩冲液(PBS) 洗涤细胞并用放射免疫沉淀实验緩冲液(0.1%十二烷基磺酸钠(SDS)、 0.5%脱氧胆酸钠、1% NP-40、 1 mM原钒酸钠、50 mM p-甘油磷酸和1 X蛋白酶抑制剂混合物)将细胞匀浆化。用10,000 X g将样品离心10 分钟，用Bradford分析(BioRad蛋白染色试剂)确定上清液的蛋白浓度。 在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离等量的蛋白并印记至硝酸纤維素膜上。 使用磷酸-Akt、 Akt、磷酸-ERKl/2或ERKl/2抗体进行免疫印记分析。
在5分钟后，FTY720-P和(R) -AFD诱导Akt (在100nM相应地 3/7和4.5倍，图6)和ERK-1/2 (在100 nM相应地9.3和8.2倍，图6) 磷酸化水平的提高。对于FTY720-P、 (R) -AFD和SIP，该磷酸化的时 程分析相似，在刺激5分钟后实现磷酸化水平的最大化(数据未显示)。 FTY720-P和(R) -AFD对Akt和ERK磷酸化的作用是剂量依赖性的(数 据未显示)且由FTY"720-P和(R) -AFD诱导的磷酸化程度高于由SIP诱 导的程度。但是，非磷酸化衍生物，FTY720或AAL,在内皮细胞内没 有诱导磷酸-Akt或磷酸-ERK-1/2的水平。S1P、 FTY720-P和(R) -AFD 对Akt和ERK-1和ERK-2的磷酸化通过与百日咳毒素的培养阻断(图 7),意味着&偶联受体的参与。
实施例5: FTY"0-P和(R) -AFD对凋亡的作用
由于ERK-1和ERK-2活化的是S1P在内皮细胞中的存活作用所必需 的，对FTY720-P及其类似物(R) -AFD能否在HUVEC中防止由血清饥 饿诱导的凋亡进行了测试。在该测试中，用(甲基-3H}-胸苷(1 pCi/mL) 标记HUVEC细胞16小时。随后洗涤细胞并加入包含不同处理的0.1% ffa-BSAM199。 8小时后，溶解片断DNA并如所述定量。
图8和9显示了结果。FTY720-P和(R) -AFD以剂量依赖方式显著防止细胞凋亡(图8)，其在极端低浓度——10nM具有最大效应( 70G/o地抑制DNA片断化)。在S1P处理中观察到对DNA片断化的相似 抑制但需要更高的浓度(1 ^M) 。 S1P、 FTY720-P和(R) -AFD的抗凋 亡作用也被百日咳毒素处理阻断(图9)，意味着通过G,的信号是关键 的。
实施例6: FTY720-P体外调节粘合连接装配及血管通透性
对FTY720-P和(R) -AFD对VE-4丐粘蛋白装配的作用进行了评估， 该装配是形成粘合连接所必需的，粘合连接是内皮细胞形态发生和通 透性的关键细胞亚结构。钙粘蛋白是参与形成特定的细胞—细胞接触 的一家族细胞粘附分子。已显示VE-钙粘蛋白(或钙粘蛋白-5)位于细 胞-细胞接触的胞间连接(粘合连接)中。数个实验观察暗示该钙粘蛋 白参与到和血管新生相关的血管生物学的各个方面，包括内皮细胞至 管状结构的装配。
通过免疫荧光分析研究FTY720-P和(R) -AFD对VE-钙粘蛋白定位 的影响。在该^f究中，2X1()S个细胞被分入35毫米玻璃底petti皿中。3 天后，在处理前洗涤细胞并血清饥饿3小时。随后，用水冷的PBS洗涤 细胞、固定细胞并用VE-钓粘蛋白抗体进行免疫荧光分析(1 pg/ml Santa Cruz)。 一次抗体染色用若丹明偶联羊抗鼠(1: 1000， Cappd) IgG呈 现。在ZdssLSM510激光扫描共聚焦显微镜上进行共聚焦显微观察。 使用543 nm氦/氖激光激发若丹明荧光并用530 rim长通滤镜观察发射 荧光。用FTY720-P和(R) -AFD对细胞进行的30分钟处理导致了 VE-钙粘蛋白在细胞一细胞接触区定位的增加(图IO)。该作用与在S1P 上观察到的作用相当。但是，非磷酸化前体FTY和(R) -AAL不能诱 导VE-钙粘蛋白迁移至粘合连接上。这些结果意味着FTY720-P和(R) -AFD作用于血管S1P受体从而诱导内皮细胞内的粘合连接装配。
一些研究已显示VE-钙粘蛋白可能是血管通透性的重要决定因子。 VEGF诱导的VE钩粘蛋白酪氨酸磷酸化在体外造成血管通透性增加。 此外，显示S1 P通过S1 P/Gi/Rac依赖过程抑制凝血酶诱导的细胞旁通透 性。使用细胞系统评价S1P、 FTY720-P和(R) -AFD对血管通透性的影 响。在Transwell聚碳酸盐滤器(直径6.5mm， 0.4[xm孑L; Costar)中培 养小鼠胚胎内皮细胞2天，用不含血清/酚红的DMEM(HEPES緩冲液、 L-谷氨酸以及吡多醇盐酸)(O.lml上室，0.6ml下室)置换培养基。细 胞用FTY720、衍生物或S1P预处理1小时。在存在或不存在小鼠重组 VEGF (50ng/ml)的情况下将FITC-右旋糖苷(平均MW二2,000 kDa) 加入上方小室中。在指点时间段(5 — 45分钟)后取下方孔中的培养基。 将样品置于黑色固体底板的％孔板(Costar)且使用CytoFluor (R)荧 光多孔板读板^f义(Applied Biosystems)在488 mn激发波长处测量荧光强 度。数据^两次重复的平均值土SE。 N = 2。 * p<0.01 VEGF vs.未处理 的，弁p<0.01处理+ VEGFvs.仅VEGF。
图11和12显示了细胞旁通透性分析的结果。没有VEGF时下方 小室中的焚光随着时间增加(图ll)。然而，当细胞用VEGF处理时， 观察到下方小室中荧光的显著增强，该增强被S1P、 FTY720-P和(R)-AFD显著抑制(图12，显示了45分钟的时间点)。这些结果意味着 VEGF诱导的细胞旁通透性被S1P受体拮抗剂S1P、 FTY720-P和(R) -AFD拮抗。
实施例6: FTY720-P体内调节粘合连接装配和血管通透性
在体内测试了血浆FTY720-P或(R) -AFD在血管通透性调节中的 作用。为了测试此种可能性，在FTY720、 (R) -AFD或(S) -AAL预 处理小鼠中使用了体内血管通透性模型。通过喂食FTY720 (50化)、 S-AAL对映异构体(50pig) 、 R-AAL对映异构体(50 (xg)以及作为赋 形剂对照的水，对正常FVB/N雌性或雄性小鼠进行了处理。喂食后5 小时，用2%阿佛丁顶(0.5cc/20g)对动物进行麻醉并通过尾部血管 注入100 [xl FITC-右旋糖普(5 mg/ml， 165 kDa)。将动物置于荧光解剖 显微镜(Zeiss STVll,Zeiss公司)下的温暖桌面上且对耳的中心血管进 行成像。使用30号(gauge)针(30 pd)将对照盐或小鼠血管内皮生长 因子(mVEGF, 10ng/ml)皮内注射至中耳内。随后在固定的位置以固 定的曝光时间在注射后5至120分钟对耳血管系统成像。随后使用 ImageProPlus (Media Cybernetics7>司)的基于4象素的阈ii (pixel-based threshold)对荧光图像定量。
图13和14显示了结果。在分析前5小时对小鼠进行单剂口服给药 的预处理显示FTY720显著抑制VEGF诱导的血管通透性(图13和14)。 (R) -AAL而不是(S) -AAL也能在体内有效抑制血管通透性。这些 数据暗示鞘氨醇激酶在体内对FTY720和(R) -AAL的磷酸化以及对内皮细胞上的SIP受体的活化导致了 VEGF诱导的血管通透性的抑制。 已经显示血管内皮S1P受体的拮抗剂对血管通透性、凋亡以及血 管新生具有作用。特别地，已经显示FTY720以及其类似物在体内被磷 酸化成能够结合血管内皮S1P受体的形式(例如FTY720-P)。血管内 皮S1P受体拮抗剂可被用于血管通透性疾病、与过量血管内皮凋亡和 新血管生长相关的疾病的治疗。
所有引用的专利、专利申请以及其它参考文献在此被完整地引用 作为参考。
尽管参考优选具体实施方案对本发明进行了说明，本领域技术人 员将明白在不背离本发明范围的情况下可以进行各种变化且发明中的 成分可被等价物取代。此外，在不背离本发明基本范围的情况下可对 本发明的指导进行很多改进以适应特定的情形或材料。因此，希望本 发明不受到作为实现本发明预想的最佳模式而在此公开的特定具体实 施方案的限制，但是本发明将包括落入所附权利要求范围的所有具体 实施方案。序列表
<110> 康涅狄格大学健康中心(University of Connecticut Health Center) 蒂莫西.HLA (HLA, Timothy) 特雷莎.桑切斯 (SANCHEZ, Teresa) 朴智惠(PAIK， Ji-Hye) 凯文.P.克拉费(CLAFFEY，Kevin，P.)
<120>抑制血管通透性及凋亡的方法
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tggagtatga atgcccctac
<210> 2 <211> 19 <212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 2
cgctasccat caattcccc 19
<210> 3 <211> 20 <212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus) <400> 3
gatcacccct gacctgctac
<210> 4 <211> 20 <212> DNA
<213> 小家鼠(Musmusculus) <400> 4
ggcatcttca cagcttcctc 20
权利要求
1、一种血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂、其一制药学可接受形式、或其一磷酸化形式在制备用于治疗血管通透性疾病的药物上的应用，其中该血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂不是鞘氨醇-1-磷酸，其中血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂是1，2-氨基醇、其一制药学可接受盐形式、或其一磷酸化形式，具有结构式其中R1被具有12至22个碳原子的直链或支链碳链取代或未被取代，且各R2、R3、R4和R5独立地是氢或低碳烷基；其中该血管通透性疾病是内皮损伤、血小板减少、动脉硬化症、缺血性心血管疾病、缺血性周边血管疾病、与糖尿病相关的周边血管疾病、登革出血热、成人(急性)呼吸窘迫综合症、血管渗漏综合症、败血病、自体免疫脉管炎，或包含一种或多种前述疾病的综合症。
全文摘要
说明了血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体的拮抗剂。化合物如FTY720可被鞘氨醇激酶-2磷酸化成作为鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂的磷酸化形式。将血管内皮鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂用于治疗哺乳动物血管通透性疾病和有害血管内皮细胞凋亡以及新血管生长的方法。鞘氨醇-1-磷酸受体拮抗剂可被用于治疗血管通透性疾病和有害血管内皮细胞凋亡以及新血管生长的药物的制备。
文档编号A61K31/00GK101518524SQ20081021236
公开日2009年9月2日 申请日期2004年6月18日 优先权日2003年6月24日
发明者凯文·P·克拉费, 朴智惠, 特雷莎·桑切斯, 蒂莫西·拉 申请人:康涅狄格大学