专利名称：富含半乳糖的改性多糖在炎症性肠病治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及富含半乳糖的改性多糖在药物制备中的应用，具体涉及富含半 乳糖的改性多糖在防治炎症性肠病药物中的应用。
背景技术：
炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎与克隆氏病，是一类与免疫失调、 菌群紊乱及遗传因素相关的自身免疫性疾病，以结肠粘膜非特异性炎症反应、 溃疡形成为病理特征；以腹痛、腹泻、粘液便、脓血便，反复发作，迁延不愈 为临床表现。在欧美国家，IBD的发病率高达200-300/10万[l];在业洲地区， 包括我国香港、上海，止呈快速跃升趋势[2]。近年来，我国人群高热量、高蛋 A.低纤维食品摄入明显增多，IBD的发病率逐年上升，目前尚无治疗IBD的 特效药物。IBD尤其是溃疡性结肠炎，反复发作、迁延不愈容易引起癌变，在 西方国家平均癌变率达25%，病程25-30年患者的癌变率高达43%;结肠癌病 死率高，位居肿瘤死亡率第三位[3-4]。由于IBD发病人群日渐年轻化，发病年 龄向20-30岁人群聚集，因此阻止IBD，尤其是溃疡性结肠炎的癌变是结肠癌 幾病率降低的重要措施，是提高患病人群生活质量的重要手段。
Toll like receptor 4(TLR4)与其相关分子在维持肠道粘膜免疫平衡，促进肠 道粘膜损伤修复中意义重大，TLR4是革兰阴性菌LPS的主要受体，在IBD患 者高表达，肠上皮活化的TLR4抑制肠上皮细胞的移行和增殖，引起细胞凋亡， 高表达的TLR4促进炎症反应，抑制细胞损伤的修复[5]。我们的研究表明，与其伴行的凝集素galectin-3与TLR4在IBD发生发展中的表达变化趋势相反。 随着炎症的发生，TLR4表达增加，随着炎症的逐渐缓解，TLR4表达则降低， 而galectin-3在急性炎症中表达降低，随着炎症恢复galectin-3表达升高， galectin-3促进肠上皮细胞的移行和增殖，抑制细胞凋亡，高表达的galectin-3 促进细胞损伤的修复。我们已经证明富含半乳糖的改性植物多糖，与galectin3 有良好的亲和力，能够调节IBD时galectin-3的表达升高，进而调节TLR4的 变化。我们采用富含半乳糖的改性苹果多糖治疗结肠炎，取得良好疗效，改性 苹果多糖诱导galectin-3的高表达TLR4的表达变化，促进损伤修复。
IBD的发病原因及其发病机制尚不明了，缺乏有效的治疗措施；临床上-般采用抗炎、调节免疫和抗菌等措施缓解症状；虽然甾体和非留体抗炎药能暂 时控制症状，但由于严重的副作用，限制了其临床应用。因此IBD的治疗成为 世界性的难题，WHO将本病列入世界十大难治性疾病。
因此，现有技术中还没有靶向galectin-3的能有效针对炎症性肠病进行治疗 的方法及合适的药物。 参考文献 Delaunoit T, Limburg PJ, Goldberg RM， Lymp JF, Loftus EV Jr. Colorectal cancer prognosis among patients with inflammatory bowel disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4(3): 335-342 Chung DC. The genetic basis of colorectal cancer: insights into critical pathways of
tumorigenesis. Gastroenterology 2000; 119: 854-865 [4] Munkholm P. The incidence and prevalence of colorectal cancer in inflammatory bowel disease.
Aliment Pharmacol Ther 2003; 18 (supple2): 1-5 [5] Gribar SC, Anand RJ, Sodhi CP, Hackam D J. The role of epithelial Toll-like receptor
signaling in the pathogenesis of intestinal inflammation. J. Leukoc. Biol.2008， 83: 000—000
发明内容
本发明拟提供富含半乳糖的改性多糖在防治炎症性肠病药物中的应用，以填补防治炎症性肠病药物的空白。
本发明提供的技术方案是富含半乳糖的改性多糖在治疗炎症性肠病中的 应用，该富含半乳糖的改性多糖包含有天然胶或植物多糖。
所述改性天然胶的制备方法是将果胶、瓜儿胶、刺槐豆胶经过酶水解
(pH=4-5)，或碱(pH=9-10)与酸(pH=3-5)水解，或硼氢化钠还原，或甲醇 皂化后，醇沉、透析、半乳糖苷酶酶解(pH=4-6， 37°C)，以暴露末端半乳糖， 经过醇沉、透析、浓缩、冻干获得改性天然胶。采用凝胶色谱法或分子量截流 方法，获得目的分子量(5000-50000Da)的含半乳糖的天然胶；
所述改性植物多糖的提取方法是将芦荟、枸杞子、苹果、大枣或大黄粉 碎，乙醇回流去除脂溶性成分后，水回流、乙醇沉淀、透析、浓縮、冻干，获得 粗多糖；将粗多糖经过半乳糖苷酶酶解(pH=4-6， 37°C)，以暴露末端半乳糖， 经过醇沉、透析、浓縮、冻干获得改性多糖。采用凝胶色谱法或分子量截流方 法，获得目的分子量(5000-200000Da)的含半乳糖的植物多糖。
我们的研究表明，与其伴行的凝集素galectin-3与TLR4在旧D发生发展 中的表达变化相反趋势相反。随着炎症的发生TLR4表达增加，随着炎症的逐 荐ii缓解，TLR4则降低，而galectin-3在急性炎症中降低，而随着炎症恢复 galectin-3则升高，galectin-3促进肠上皮细胞的移行和增殖，抑制细胞凋亡，高 表达的galectin-3促进细胞损伤的修复。
本发明的优点是本发明以galectin -3为作用靶点，通过调节galectin-3 的变化，影响TLR4在IBD中的变化，从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，促 进损伤修复。采用富含半乳糖的改性多糖治疗结肠炎，疗效良好，可诱导 galectin-3的高表达，促进损伤修复。具有副作用小，可长期使用的特点。
图l为果胶结构模式图； 图2为瓜尔胶结构模式图。
具体实施例方式
下面将结合实施例对本发明做详细的说明。
本发明涉及富含半乳糖的改性多糖在IBD治疗药物中的应用。
其中涉及的多糖详细说明如下
果胶 一种多糖胶，由半乳糖醛酸直链构成。
瓜尔胶 一种非离子多糖胶主要由半乳糖和甘露糖聚合而成；属于天然半 乳甘露聚糖，它以聚甘露糖为分子主链，D-吡喃甘露糖单元之间以|3(1-4:>键连 接。而D-吡喃半乳糖则以a(l-6)键连接在聚甘露糖主链上。瓜尔胶中甘露糖与 半乳糖单元之摩尔比为2:1。
刺槐豆胶为无色、无味的植物胚乳精制多糖，主要含有甘露糖及半乳搪。
目前已知果胶、瓜儿胶、刺槐豆胶等含有半乳糖单糖的天然胶具有调节肠 道菌群、降血脂的作用，但是其作用尚未在制药领域中得到应用。
芦荟多糖、枸杞子多糖、苹果多糖、大枣多糖及大黄多糖富含半乳糖，具 有明显的免疫调节作用，该作用也未在制药领域中得到应用。
本发明提供的技术方案是富含半乳糖的改性多糖在治疗炎症性肠病中的 应用，该富含半乳糖的改性多糖包含有天然胶或植物多糖。
所述改性天然胶的制备方法是将果胶、瓜儿胶、刺槐豆胶经过酶水解 (pH=4-5)，或碱(pH=9-10)与酸(pH=3-5)水解，或硼氢化钠还原，或甲醇 皂化后，醇沉、透析、半乳糖苷酶酶解(pH=4-6， 37°C)，以暴露末端半乳糖，经过醇沉、透析、浓縮、冻干获得改性天然胶。采用凝胶色谱法或分子量截流
方法，获得目的分子量(5000-50000Da)的含半乳糖的天然胶；
所述改性植物多糖的提取方法是将芦荟、枸杞子、苹果、大麥或大黄粉 碎，乙醇回流去除脂溶性成分后，水回流、乙醇沉淀、透析、浓縮、冻干，获得 粗多糖；将粗多糖经过半乳糖苷酶酶解(pH=4-6， 37°C)，以暴露末端半乳糖， 经过醇沉、透析、浓縮、冻干获得改性多糖。采用凝胶色谱法或分子量截流方 法，获得目的分子量(5000-200000Da)的含半乳糖的多糖。
下面提供具体制备的实施例便于进一步理解。
实施例1
取100g果胶，微湿润后，与果胶酶37。C孵育4小时(pH=4-6)，调pH值 至中性，过夜，釆用HPLC检测酯化度，醇沉、透析、测定分子量，凝胶层析 或分子量截流，获得分子量5000-50000Da的含半乳糖的果胶。
实施例2
取100g瓜儿胶，微湿润后，回流4小时(pH=9-10)，调pH值至中性，过 夜，再回流2小时(pH=3-4)，醇沉、透析、浓縮、冻干。采用半乳糖苷酶水 解(pH=4-6， 37°C)，醇沉、透析、浓縮、冻干。凝胶层析或分子量截流获得 目的分子量(5000-50000Da)的含半乳糖的瓜儿胶。
实施例3
取100g刺槐豆胶，微湿润后，用甲醇回流(1NNaOH， 24小时)，调pH 值至中性，过夜，醇沉、透析、浓縮、冻干。采用半乳糖苷酶水解(pH=4-6， 37°C)，醇沉、透析、浓縮、冻干。凝胶层析或分子量截流获得目的分子量 (5000-50000Da)的含半乳糖的刺槐豆胶。
实施例4
将2g果胶分批加入400mL 0.5M的HCl/咪唑溶液(pH=7)，强力搅拌至溶 液各相均匀，称取10gNaBH4少量多次加入到上述溶液中，室温下强力搅拌4h， 加入25 mL乙酸终止反应，继续搅拌30min后加入足量无水乙醇出现胶状沉淀，过滤，60%乙醇和5。/。HC1洗涤沉淀2次，60%乙醇洗涤沉淀2次，足量无水乙 酉f再次沉淀，减压抽滤至干，6(TC烘箱干燥过夜，获得改性果胶。然后采用半 乳糖苷酶水解(pH=4-6， 37°C)，醇沉、透析、浓縮、冻干。凝胶层析或分子 量截流获得目的分子量(5000-50000Da)的含半乳糖的果胶。 实施例5
取100g芦荟粗多糖，用半乳糖苷酶水解以暴露末端半乳糖(pH=4.5-6.5， 37°C)。改构多糖经过醇沉、透析、浓縮、获得冻干粉。采用凝胶层析分离纯化 或分子量截流而得到5000-200000Da多糖组分。
实施例6
取100g枸杞子粗多糖，用半乳糖苷酶水解以暴露末端半乳糖(pI^4.5-6.5，
37°C)。改构多糖经过醇沉、透析、浓縮、获得冻干粉。采用凝胶层析分离纯化 或分子量截流而得到5000-200000Da多糖组分。 实施例7
取100g苹果粗多糖，用半乳糖苷酶水解以暴露末端半乳糖(pH=4.5-6.5， 3 °C)。改构多糖经过醇沉、透析、浓縮、获得冻干粉。采用凝胶层析分离纯化 或分子量截流而得到5000-200000Da多糖组分。
实施例8
取100g大枣粗多糖，用半乳糖苷酶水解以暴露末端半乳糖(pH=4.5-6.5, 37°C)。改构多糖经过醇沉、透析、浓縮、获得冻干粉。采用凝胶层析分离纯化 或分子量截流而得到5000-200000Da多糖组分。
下面将通过具体治疗的实施例来进一步说明治疗效果
富含半乳糖的改性多糖用于IBD的治疗作用中，采用TNBS/乙醇诱导大鼠 克隆氏病(CD)模型，地塞米松为阳性对照药，改性多糖胶剂量采用50、 100、 200mg/kg;改性植物多糖剂量采用100、 200、 400mg/kg; TNBS/乙醇给大鼠灌 肠6小时后，给予改性多糖灌胃治疗，每天一次共7次，第8天处死动物，通 过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性(MPO)，检测治疗效果。采用DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型，地塞米松为阳性对照药，
改性多糖胶剂量采用50、 100、 200mg/kg;改性植物多糖剂量采用100、 200、 400mg/kg; 2.5。/。DSS给小鼠日常饮水，共7天，同时给予改性多糖灌胃治疗， 每天一次共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶 活性(MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性多糖可显著抑制炎症，促进结 肠的溃疡修复。 实施例1
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为 阳性对照药，分别采用改性果胶50、 100、 200mg/kg灌胃治疗，每天一次共7 次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性(MPO)， 检测治疗效果。结果表明，改性果胶IOO、 200mg/kg可显著抑制炎症，促进结
肠的溃疡修复。 实施例2
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为 阳性对照药，分别采用改性瓜儿胶50、 100、 200mg/kg灌胃治疗，每天一次共 7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性(MPO)， 检测治疗效果。结果表明，改性瓜儿胶IOO、 200mg/kg可显著抑制炎症，促进
结肠的溃疡修复。 实施例3
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为 阳性对照药，分别采用改性刺槐豆胶50、 100、 200mg/kg灌胃治疗，每天一次 共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性(MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性刺槐豆胶IOO、 200mg/kg可显著抑制炎症，促
进结肠的溃疡修复。 实施例4
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为 阳性对照药，分别采用改性芦荟多糖100、 200、 400mg/kg灌胃治疗，每天一 次共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性 (MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性芦荟多糖200、 400mg/kg可显著抑 制炎症，促进结肠的溃疡修复。
实施例5
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为 阳性对照药，分别采用改性枸杞子多糖100、 200、 400mg/kg灌胃治疗，每天 一次共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性
(MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性枸杞子多糖200、 400mg/kg可显著 抑制炎症，促进结肠的溃疡修复。
.实施例6
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为 阳性对照药，分别采用改性苹果多糖100、 200、 400mg/kg灌胃治疗，每天一 次共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性 (MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性苹果多糖200、 400mg/kg可显著抑 制炎症，促进结肠的溃疡修复。 实施例7
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为阳性对照药，分别采用改性大枣多糖100、 200、 400mg/kg灌胃治疗，每天一 次共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性 (MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性大枣多糖200、 400mg/kg可显著抑
制炎症，促进结肠的溃疡修复。 实施例8
采用TNBS/乙醇诱导大鼠CD模型，DSS诱导小鼠UC模型，地塞米松为
阳性对照药，分别采用改性大黄多糖100、 200、 400mg/kg灌胃治疗，每天一
次共7次，第8天处死动物，通过结肠指数、溃疡面积、髓过氧化物酶活性
':MPO)，检测治疗效果。结果表明，改性大黄多糖200、 400mg/kg可显著抑
制炎症，促进结肠的溃疡修复。
附表是改性天然胶和改性植物多糖的治疗作用结果。
本发明不仅限于说明书中所列举的实施例，药物剂型可以是片剂、胶囊剂 等口服剂型，供口服。
附表1改性多糖对TNBS/乙醇诱导大鼠克隆氏病的治疗作用
组别结肠指数(mg *g—、溃疡面积(％)MPO(U/mg)
正常3.1±1.1—0.93±0.1
模型7.9±3.4d54.5±16.4d1.8±2.3
果胶50mg/kg6.9±1.7d47.7±21.9d9.7±3.4
果胶100mg/kg5.4±0.9d41.5±17.3d7.5±2.1
果胶200mg/kg5.2±1.4a32.8±12.4d5.1±1.2
瓜儿胶50mg/kg7.1±2.946.1±18.4b8.9±2.3
瓜儿胶100mg/kg6.4±1.7a31.8±15.6a6.7±2.4
瓜儿胶200mg/kg5.6±24a17.2±14.5a5.6±1.3
刺槐豆胶50mg/kg7.1±1.6a49.6±12.7a9.9±2.3
剌槐豆胶100mg/kg6.6士2,4341.2±21.1a7.2±2.7
刺槐豆胶200mg/kg5.8±2.1b35.7±2.4a5.2±3.2芦荟多糖100mg/kg 6.9±2.4b 47.1±13.9
芦荟多糖200mg/kg6.1±2.9b39.5±12.7a8.3±2.6
芦荟多糖400mg/kg5.1±2.9a31.6±18.9a5,9±3.1
枸杞于多糖lOOmg/kg7.1±2.1a44.2±15.4a9.3±2.4
枸杞子多糖200mg/kg6.8±1.6b37.1±16.8a7.4±1.8
枸杞子多糖400mg/kg6.1±l.la32.4±15.15.8±2.6
苹果多糖lOOmg/kg6.9±2.8a45.5±15.4a9.4±3.2
苹果多糖200mg/kg6.3±1.8b41.4±13,4a7.5±2.3
苹果多糖400mg/kg5.8±2.7a33.2±18,9a6.1±1.7
大枣多糖lOOmg/kg7.1±2.4a48.7±12.8a8肚2.7
大枣多糖200mg/kg6,2±2.1b43.6±18.96.9±2.2
大枣多糖400mg/kg5.8=t2.1b37肚16.735.3±1.4
大黄多糖lOOmg/kg6.9±2.1a44.6±12.7a8.8±2.2
大黄多糖200mg/kg6.1±1.4a38.2±21.1a6.4±1.8
人黄多糖400mg/kg5.4±2.8b35.7±2.4a5.3±1.9
权利要求
1、富含半乳糖的改性多糖在治疗炎症性肠病中的应用，该富含半乳糖的改性多糖包含有天然胶或植物多糖。
2、 如权利要求1所述的富含半乳糖的改性多糖在炎症性肠病治疗药物中的 应用，其特征在于所述改性天然胶的制备方法是将果胶、瓜儿胶、刺槐豆 胶经过酶水解(pH=4-5)，或碱(pH=9-10)与酸(pH=3-5)水解，或硼氢化钠 还原，或甲醇皂化后，醇沉、透析、半乳糖苷酶酶解(pH=4-6， 37'C)，以暴 露末端半乳糖，经过醇沉、透析、浓縮、冻干获得改性天然胶。
3、 如权利要求1或2所述的富含半乳糖的改性多糖在炎症性肠病治疗药物 中的应用，其特征在于所述改性植物多糖的提取方法是将芦荟、枸杞子、 苹果、大枣或大黄粉碎，乙醇回流去除脂溶性成分后,水回流、乙醇沉淀、透析、 浓縮、冻干，获得粗多糖；将粗多糖经过半乳糖苷酶酶解(pH=4-6， 37°C)， 以暴露末端半乳糖，经过醇沉、透析、浓縮、冻干获得改性多糖。
全文摘要
本发明涉及富含半乳糖的改性多糖在药物制备中的应用，具体涉及富含半乳糖的改性多糖在防治炎症性肠病药物中的应用。本发明拟填补靶向gm-3-TLR4通路防治炎症性肠病药物的空白，所提供的技术方案是富含半乳糖的改性多糖在治疗炎症性肠病中的应用，该富含半乳糖的改性多糖包含有天然胶或植物多糖。本发明的优点是本发明以galectin-3为作用靶点，通过调节galectin-3的变化，影响TLR4在IBD中的变化，从而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，促进损伤修复。采用富含半乳糖的改性多糖治疗结肠炎，疗效良好，可诱导galectin-3的高表达，促进损伤修复。具有副作用小，可长期使用的特点。
文档编号A61K31/732GK101428036SQ20081023274
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月22日 优先权日2008年12月22日
发明者莉 刘, 阳 孙, 晨 李, 李宇华, 梅其炳 申请人:中国人民解放军第四军医大学