专利名称：重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及目的蛋白质的重组质粒的构建、原 核表达、纯化及鉴定，特别涉及胸腺素al (Tocl) 二串体蛋白及其制备方法。
背景技术：
1、胸腺素al的生物化学特性 1. l胸腺素家族
胸腺素主要是由胸腺产生，最初由Goldstein自胎牛胸腺蛋白提取液中制 备得到，含40多种多肽成分，根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位 置，划分为a、 P、 Y三个区a区pl〈5， P区pl在5 7之间，y区pl〉7。 a 族胸腺素包括胸腺素a、前胸腺素a和旁胸腺素a。胸腺素al (Tal)是前胸腺素 a的N末端的28个氨基酸片段，其产生是由于溶酶体门冬酰内肽酶选择性裂解 位于前胸腺素原a序列中的Asn28-Gly29 。
1. 2胸腺素ocl的化学结构
胸腺素al是氨基端乙酰化的28个氨基酸组成的多肽激素，分子量为 3108，等电点PH为4.2。胸腺素al结构高度保守,氨基酸序列为 NH2-Ser-Asp-A 1a-A1a-Val-Asp-Thr-Ser-Ser~G1u_11e-Thr-Thr-Lys-Asp-Le u-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val -Glu -Glu-Ala-Glu-Asn-COOH。
化学构象研究表明，胸腺素al是一种线性多肽，在疏水性环境中显示具 有2个特征性的区域其第5 8残基间是e转角，第17 24残基间是oc螺旋。
2胸腺素al的生理功能研究进展2. l胸腺素al与免疫学功能
胸腺素al在体内外可以诱导T细胞的分化和成熟，并能拮抗环磷酰胺或 CD3单抗诱导的T细胞凋亡，增强T细胞介导同种或自身淋巴细胞反应能力，增 强机体免疫应答功能。并且增多IFN-Y、 IL-2及IL一2R的产生。胸腺素otl还 能影响NK前体细胞的募集，增强其杀伤活性，并且可以活化巨噬细胞和树突 状细胞，纠正免疫抑制及免疫缺陷，从而提高机体的免疫力。并且具有双向 性免疫调节效应，在感染病例中，可以减轻细胞因子所致炎性损害，改善感 染导致的高代谢状态。
2. 2胸腺素ocl与癌症
研究发现胸腺素txl可以诱导肿瘤细胞在胞膜上合成MHC I类分子，增加 APC的数量， 一定程度的恢复被抑制的细胞免疫。并通过上调癌细胞p53、 Bax 表达，抑制抗凋亡基因Bcl-2表达诱导多种癌细胞株凋亡，抑制部分癌细胞 株DNA合成期。实验室及临床治疗中胸腺素al与手术、放化疗药物或其他细 胞因子联合应用，可以明显加强疗效，减少不良反应，抑制肿瘤细胞的生长 并延长生存期。
2. 3胸腺素otl与造血功能
胸腺素al在正常鼠及荷瘤鼠中均能刺激骨髓造血，刺激小鼠骨髓集落形 成，通过上调各种克隆刺激因子如MSCF、 GMCSF、 GCSF和IL-3，明显增加总克
隆数和单克隆型，恢复造血机能。 2. 4胸腺素al与神经内分泌系统
实验发现，胸腺素al能在下丘脑及垂体水平影响促肾上腺皮质激素、促 乳素、促甲状腺素和促黄体生长激素的分泌，此影响的程度随Tcxl在特异作 用区的浓度而异。胸腺素al参与海马神经元兴奋性突触传递，并能影响中枢神经系统中神经分泌细胞的功能。此外，胸腺素Otl还证明能够阻止化疗患者 神经毒性的发生。
2. 5胸腺素otl与抗氧化
胸腺素ocl可以减弱果糖诱导的脂肪变性大鼠模型的脂质过氧化反应，并
改善其自由基防御系统的缺陷。使老年人减少的外周血淋巴细胞数，E花环 百分率、T细胞增加，提高萎縮后的胸腺水平，起到免疫剌激和调节作用。 3胸腺素ocl的应用前景
3. 1治疗肿瘤
作为生物反应调节剂，胸腺素od倉辦以恢复T细胞的功能并促进成熟T细 胞的增殖和细胞因子及其受体的产生，从而增强机体对肿瘤的免疫应答能力； 修饰肿瘤细胞，以诱导强烈的宿主免疫反应；可减轻化疗放疗的副作用。除 此之外，近期研究显示，高剂量胸腺素al本身还可以抑制肿瘤生长和诱导瘤细 胞凋亡，延长生^l月。并且大量文献报道，胸腺素al大剂量使用时无发热及过 敏反应，无血液系统及肾脏毒性，不良反应及其轻微。因此，给高剂量应用 和肿瘤晚期病人、高恶性程度肿瘤患者的临床应用提供了可能。
3. 2防治病毒感染
机体感染病毒5 10天后胸腺明显萎縮，胸腺功能低下，机体T细胞普遍 减少，免疫功能低下。使用胸腺素al后可以加快胸腺细胞的补充和成熟，加 速T细胞的中和抗体反应恢复并促进成熟T细胞的增殖，促进细胞因子及其受 体的产生，从而增强体内免疫细胞的作用，提高对病毒的抵抗能力，因此， Tal能够用于抗乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、爱滋病毒感染等的治疗。最近 有报道，Tal已经开始被用作流感和乙肝疫苗的佐剂使用。
3. 3治疗感染与促进创伤愈合感染后促炎因子如TNFot、 IL-6升高，同时伴抗炎因子如IL-IO等下降，导 致炎症介质和抗炎症介质的失衡。应用胸腺素otl后，细胞因子变化加快， TNF(x、 IL-6下降，IL-10上升，使炎症介质和抗炎症介质的失衡得以纠正。 胸腺素al可减轻高代谢状态，阻止蛋白质分解，保存蛋白质，从而减缓血总 蛋白和清蛋白下降的程度。并可增强内皮细胞的形态分化，加速皮下模型的 血管发生，促进单核细胞和内皮细胞的趋化作用。提示可能用于创伤愈合、 骨折修复以及消化性溃疡等的治疗，减轻炎症反应，并加快愈合速度。
4胸腺素al原核表达的研究
虽然胸腺素al有着广泛的应用前景，但由于其分子太小，难于直接在大 肠杆菌中表达。目前用于实验室及临床试验的胸腺素al多为化学合成品，价 格昂贵；而从哺乳动物组织中提取胸腺素al，产量较低而且纯度低免疫源性 强，使其应用受到限制，如何以更经济的方法获取此多肽显得非常重要。
石继红等将用重组四串体胸腺素al基因构建融合表达载体 pThioHisA-Tal，转化宿主菌T0P10。诱导后融合蛋白得到了表达，用离子交 换层析纯化出的目的蛋白进行CNBr化学裂解，再经离子交换层析可纯化出胸 腺素单体，融合蛋白和单体均具有在致有丝分裂原ConA存在的条件下刺激小 鼠脾淋巴细胞分裂增殖的能力，与化学合成的胸腺素cd相比具有相似的生物 活性。
Liang Zhou等构建重组六串体胸腺素otl表达质粒pET28a(+)-Tal⑥，将其 转化大肠杆飾L21，经IPTG诱导后表达胸腺素ocl六串体蛋白，并经羟氨裂解 后凝胶层析获得纯化的胸腺素al单体，试验证明纯化产物具有刺激脾细胞增 殖的活性。
Yuhui Chen等用大肠杆0M15表达带His标签的重组胸腺素al， IPTG诱导得到的蛋白经镍柱亲和纯化后，得到的纯化产物MTT试验证实可以促进淋巴细 胞的增殖和分化。
以上方法虽然都能够获得有活性的重组蛋白，但是仍存在诸多的缺点， 采用化学裂解法以获得胸腺素al单体的工艺，往往后期的纯化工艺非常复杂; 带有His标签的重组蛋白纯化工艺需要昂贵的镍柱亲和纯化，大大增加了成 本，不适于工业化生产；而且His标签影响了重组蛋白在临床试验的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重iTO腺素ocl 二串体蛋白及其制备方法，本发 明将胸腺素al以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，并且分离具有生物学 活性的胸腺素al二串体蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。
为了实现上述目的，本发明重组的胸腺素al二串体蛋白，通过甘氨酸和 丝氨酸串连两分子的胸腺素al (Tal)，其连接方式为Tal~Gly-Serial,其 ^^ 列如SEQ ID NO. 1戶际；其对应的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2戶际。
该重组胸腺素al 二串体蛋白的重组核苷酸是用A^U酶切位点连接2 段胸腺素al的氨基酸，在5'端加入^/el酶切位点，3'端加入终止密码子 TAG和SalI酶切位点，其连接方式为厕el酶切位点-Tal基因-勘/;H I酶 切位点-Tal基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； 重组胸腺素otl 二串体核苷酸构建于表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tocl②， 所述的pET-22b(+)-Tal②是通过Uel酶切位点和Sal I酶切位点将质粒 pET-22b(+)与权利要求3所述的重组胸腺素ocl 二串体核苷酸双酶切连接。
重组胸腺素ocl二串体蛋白的制备方法，按照以下步骤
1)构建胸腺素al二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b (+) -Tod
a)胸腺素二串体基因(Tocl②)的设计与合成依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素al的氨基酸序列转化为cDNA序 列，用免MU酶切位点连接2段胸腺素al的cDNA序列，再在5'端加入厕e I 酶切位点，3，端加入终止密码子TAG和SalI酶切位点，合成胸腺素al 二串 体基因，其核苷酸序列如下所示
catatgtctg atgcagcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag 60 aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac ggatccagcg atgcggcggt tgacaccagc 120 tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac 180 tagaagctt ; 189 划线部分分别为I 、 Sal I酶切位点，人工合成上述胸腺素al 二串体基因 基因；
b)胸腺素al二串体表达载体pET-22b(+)-Tal②的构建
用謝e I和&2 I双酶切pET-22b (+)质粒回收大片段，I和&7 I双 酶切胸腺素al二串体Pmd18-T-Tal②重组质粒回收小片断；回收的大、小片 断用T4连接酶连接构成胸腺素al 二串体表达载体pET-22b(+)-Tal②；重组 质粒pET-22b(+)-Tal②转化BL21感受态细胞，37。C恒温箱培养12h后挑取 单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100 mg/L的LB培养液中，摇床37'C培养后 收菌提取质粒，经酶切鉴定获得预期173bp大小的插入片段，DNA测序结果 显示与所合成序列相符，pET-22b (+) -Tal(l)重组质粒构建成功；
2)胸腺素al二串体蛋白的表达
重组胸腺素al二串体质粒pET-22b (+) -1061 转化大肠杆菌81^1感受态细 胞，37'C恒温箱培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨 苄青霉素100 mg/L的LB培养液中，摇床37t:培养过夜；次日以l : 100的体 积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37。C继续培养至细菌密度达至IJ0D腳=0. 4 0. 6，加入O. 1 mM IPTG诱导4 h后12000 rpm离心20min 收菌，-2(TC保存；
3)胸腺素al二串体蛋白的纯化
a) 按lg菌体加10 ml裂菌STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，所述的STE 缓冲液20慮Tris-HCl pH 7. 5， lOOraM NaCl， lmM EDTA;溶菌酶裂解菌体， 4。C条件下离心12000rpmX 20min，收集上清液，加(NH4) 2504至60%饱和度， 4。C静置lh; 4。C条件下离心12000rpmX20 min，收集上清；
b) 收集的上清i!A液平衡后的疏水柱，用B液连续梯度洗脱5 10个柱床体 积，收集含胸腺素al二串体蛋白的洗脱峰；对洗脱峰用50 100倍于其体积的 C液透析24h，中间更换C液三到四次；透析后上样于用C液充分平衡的阴离子 交换层析柱纯化，用D液连续梯度洗脱5 10个柱床体积，收集目的蛋白所在 洗脱峰，对该洗脱峰用50 100倍于其体积的0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)液进 行透析24h，中间更换PBS液三到四次；透析后用0.22um滤膜过滤除菌，即得 到目的蛋白胸腺素al二串体蛋白；
所述的A液为20mM Tris-HCl pH 7.5、 60% (NH4)2S04、 ImM EDTA; B液 为20mM Tris-HCl pH 7.5， ImM EDTA ; C液为20mM柠檬酸一柠檬酸钠缓 冲液，pH 5. 0， 1 mM EDTA ; D液为20 mM拧檬酸一柠檬酸钠缓冲液pH 5. 0， 1 M NaCl， 1 mM EDTA。
重组胸腺素otl二串体蛋白，应用于抗肿瘤药物、免疫增强剂、抗病毒药 物、造血刺激剂的制备。
用免疫印迹的半定性分析对胸腺素ocl二串体蛋白的鉴定与鼠抗胸腺素otl 抗血清特异性结合，说明胸腺素al二串体蛋白表达成功。
胸腺素al二串体蛋白的体外生物学活性检观!l按照经典的小鼠脾淋巴细胞增殖实验MTT法进行，对肿瘤细胞株的体外抑制试验采用MTT法；结果表明， 与标准品胸腺素ocl相比，胸腺素ocl二串体蛋白促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和 分化且刺激后细胞的增殖率高于标准品胸腺素al刺激组；胸腺素al二串体蛋 白可抑制HL-60、 B16、 S180、 H印G-2、 Ml这5种瘤株的增殖，且等摩尔量的胸 腺素al二串体蛋白比标准品胸腺素al有更强的抑制作用。
胸腺素al二串体体内活性检测，B16荷瘤小鼠随机分为4组，分别采用生 理盐水(对照组)、高、低剂量胸腺素al二串体(试验组)以及化学合成多肽 (标准组)腹腔注射，隔天测量瘤体积，干预12天后将小鼠摘眼球取血处死， 统计瘤重。胸腺素od二串体蛋白给药后，高剂量组有显著抑瘤效果(与生理 盐水对照组相比P〈0.01)，中剂量组也有抑瘤作用(与生理盐水对照组相比 P<0. 05)，且胸腺素al二串体蛋白与标准品胸腺素ocl相比，有更强的抑瘤作用。
与现有技术相比
本发明构建了胸腺素al二串体基因表达载体pET-22b(+)-Tal ,转染宿 主经诱导后便可高效表达目的蛋白的，诱导后菌体的裂菌上清经盐析、疏水 作用层析和离子交换作用层析，可得到纯度大于95%的目的蛋白；其分离纯化 过程简便、廉价、易于扩大化生产，为实现胸腺素al的药学用途鉴定了基础。
纯化的胸腺素al 二串体蛋白与标准品胸腺素al相比，胸腺素otl 二串体 蛋白促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化且刺激后细胞的增殖率高于标准品胸 腺素otl娜辦且，可以用做免g，强药物^^ffi。
胸腺素al二串体蛋白可抑制可以抑制肿瘤细胞株增殖并抑制荷瘤小鼠 HL-60、 B16、 S180、 H印G-2、 Ml这5种瘤株肿瘤生长的增殖，且等摩尔量的胸 腺素al二串体蛋白比标准品胸腺素al有更强的抑制作用，具有抛中 物的应
用前景。
图1是重组胸腺素al 二串体质粒pET-22b (+) -Tal(g)酶切后的琼脂糖凝胶 电泳图2是重组胸腺素al 二串体质粒pET-22b(+)-Tal②的测序结果图； 图3是胸腺素al 二串体蛋白的诱导表达和纯化聚丙烯酰胺电泳图； 图4是胸腺素al二串体蛋白的免疫印迹鉴定图5是用MTT法测定胸腺素al二串体蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 Excel统计图6是用MTT法测定胸腺素al二串体蛋白对瘤株的半数有效剂量Excel统 计图7是肿瘤体积生长曲线统计图8是肿瘤组织大体照片。
具体实施例方式
本发明所采用的技术方案是构建pET-22b(+)-Tal②原核表达载体，将 胸腺素al以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，用Western blot、脾淋巴 细胞增殖实验测定其活性表明分离出具有生物学活性的胸腺素al二串体蛋 白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。此外，体外试验证明纯 化的胸腺素al二串体可以抑制HL-60、 B16、 S180、 H印G-2、 Ml等肿瘤细胞的 增殖；用纯化的胸腺素al二串体干预B16荷瘤小鼠，可以显著抑制肿瘤生长， 其效果优于化学合成品。
上述方案具体按照以下步骤进行-
1)构建胸腺素al二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tal② a)胸腺素二串体基因(Tal②)的设计与合成依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素al的氨基酸序列转化为cDNA序 列，用泡/zH I酶切位点连接2段胸腺素ocl的cDNA序列，再在5'端加入厕e I 酶切位点，3'端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，合成胸腺素al 二串 体基因，其核苷酸序列如下所示
catatgtctg atgcagcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag 60
aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac ggatccagcg atgcggcggt tgacaccagc 120
tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac 180
tagaagctt 189
划线部分分别为NdeI、 Sall酶切位点，送北京奥科生物技术有限责任公司
合成上述胸腺素al 二串体基因基因。
b)表达载体pET-22b(+)-Tod②的构建
用M/el和6k/I双酶切pET-22b(+)质粒回收大片段(5.4kb) ， Yofe I 和I双酶切Pmdl8-T- Tal②重组质粒回收小片断(174bp);回收的大、 小片断用T4连接酶连接构成表达载体pET-22b(+)-Tal②；重组质粒 pET-22b(+)-Tal②转化BL21感受态细胞，37'C恒温箱培养12h后挑取单克隆 菌落接种于含氨苄青霉素100 mg/L的LB培养液中，摇床37。C培养后收菌。 对菌体提取质粒后厕e I和&〗I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定；如图1重组 质粒pET-22b(+)-Tal②的酶切电泳图所示，图中泳道1: DNA marker;泳道 2: Nde I和Sal I双酶切重组质粒pET-22b(+)-Tod②；泳道2显示经酶切鉴 定获得预期174bp大小的插入片段。提取质粒后DNA测序，经过比较得到插 入片段Tocl②的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，与所设计序列比较， 结果显示正确，参见图2。
至此，pET-22b(+)-Tal②重组质粒构建成功。2) 胸腺素0d二串体蛋白的表达
重组质粒pET-22b (+) -Tal②转化大肠杆飾L21感受态细胞，37。C恒温箱 培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨苄青霉素100 mg/L的LB培养液中，摇床37。C培养过夜；次日以l : 100的体积比接种于新 鲜的含氨苄青霉素100 mg/L的LB培养液中，37。C继续培养至细菌密度达到 0D600 = 0. 4 0. 6，加入O. 01 mM IPTG诱导4 h后12000 rpm离心20 min收菌， -2(TC保存。
3) 胸腺素al二串体蛋白的纯化
a)按l g菌体加10 ml裂菌STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，所述的 STE缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7. 5， 100 mM NaCl， 1 mM EDTA; 溶菌酶裂 解菌体，4。C条件下离心12000 rpmX 20 min，收集上清液，力n (朋4)2304至 60%饱和度，4。C静置l h; 4。C条件下离心12000 rpm X 20 min，收集上清；
收集的上清液过A液平衡后的疏水柱苯基琼脂糖凝胶6 FF (Phenyl S印harose 6 Fast Flow, high sub, Pharmacia公司)，用B液连续梯度洗脱5 IO个柱床体积，收集含胸腺素otl二串体蛋白的洗脱峰；对洗脱峰用50 100 倍于其体积的C液进行透析24h，中间更换C液三到四次；透析后上样于用C液 充分平衡的阴离子交换(Q琼月^^凝胶FF， QS印harose Fast Flow, Pharmacia 公司)层析柱纯化，用D液连续梯度洗脱5 10个柱床体积，收集目的蛋白所在 洗脱峰，对该洗脱峰用50 100倍于其体积的0. 01MPBS (磷酸盐缓冲液)液进 行透析24h，中间更换PBS液三到四次。透析后用0.22 um滤膜过滤除菌，即 得到目的蛋白胸腺素al二串体蛋白；所述的A为20 mM Tris-HC1 pH 7.5、 60% (NH4)2S04、 1 mM EDTA; B为20 mM Tris-HCl pH 7. 5， 1 mM EDTA ; C 为20 mM拧檬酸一拧檬酸钠缓冲液、pH 5.0， 1 mM EDTA ; D为20 mM柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液PH 5.0, 1 M NaCl， 1 mM EDTA。
4) 胸腺素otl二串体蛋白的诱导表达和纯化结果鉴定 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检观U，参见图3;图中M:蛋白质marker;
泳道l:未诱导BL21/ pET-22b(+)-Tal②全菌蛋白电泳；泳道2: 0. OlmM IPTG 诱导BL21/pET-22b(+) -T(xl②1 h全菌蛋白电泳；泳道3: 0. OlmM IPTG诱导 BL21/pET-22b(+) -Tal②2 h全菌蛋白电泳;泳道4: 0. OlmM IPTG诱导 BL21/pET-22b(+) -Tal②3 h全菌蛋白电泳;泳道5: 0. OlmM IPTG诱导 BL21/pET-22b(+) -Tal②4 h全菌蛋白电泳；泳道6:裂菌上清；泳道7:裂 菌沉淀；泳道8:硫酸铵盐析上清；泳道9:疏水作用纯化目的蛋白；泳道10: 阴离子交换作用纯化目的蛋白；电泳结果显示，IPTG诱导后目的蛋白表达， 且诱导后4小时表达量最高，如泳道l-5所示；采用本发明所述纯化方法可以 成功纯化目的蛋白，得到纯度大于95%的目的蛋白，如泳道8-IO所示。
5) 胸腺素ocl二串体蛋白的免疫印迹鉴定
对诱导前后的全菌分别进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，拆下凝胶，按 照Bio-Rad产品说明，将凝胶靠近阴极一侧、硝酸纤维(NC)膜靠近阳极一 侧，在预冷的转移缓冲液(25 mM Tris、 192 mM Glycine、 20%甲醇)中100 V 恒压电泳50分钟，将蛋白转移至NC膜上。电泳结束后，取出NC膜，洗涤液 TBST(20 mM Tris-HC1， pH7. 5、 150 mM NaCl， 0.05% Tween-20)清洗后浸入 封闭液(含2Q/。BSA的TBST)中室温封闭1 h, TBST室温洗3次，每次5 min，加入 鼠抗胸腺素al抗血清(按l:200稀释)，室温孵育l h， TBST室温洗3次，每次5 min，再加入HRP-兔抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，按1:5000稀 释)，室温孵育lh， TBST室温洗3次，每次5min，最后用TBS(20 mM Tris-HCl pH 7.5， 150 mM NaCl)洗3次，NC膜浸入DAB (3'，3，-二甲基联苯胺)显色液中，室温避光显色l min，蒸馏水冲洗终止反应。参见图4，图中泳道M: protein marker ;泳道l: 0.01 mM IPTG诱导BL21/ pET-22b(+)-Ta1②4 h;泳道2: 未诱导BL21/ pET-22b(+)-Tal;结果显示，0.01 mM IPTG诱导后重组蛋白胸 腺素al二串体表达，且可胸腺素al二串体与鼠抗胸腺素al抗血清特异性结合。
6)胸腺素al二串体蛋白体外生物学活性检测
将两只BALB/c小鼠(第四军医大学实验动物中心)颈椎脱臼处死，75%乙 醇浸泡3min，取出小鼠沥干，置于无菌纸上，在小鼠左腹侧中部剪开小口， 取出脾脏，置于不锈钢滤网上，滤网置于盛有10 ml 10% FCS RPMI 1640液 的培养皿上方，用注射器针芯轻轻研压脾脏，并用培养液反复淋洗，收集脾 细胞悬液；
取4个10ml离心管，每管加入5ml小鼠淋巴细胞分离液后，再缓慢加 入脾细胞悬液2. 5 ml，离心(1500 rpm X 20 min)后吸出淋巴细胞层，用10% FCS RPMI 1640培养液洗涤细胞一次，离心(1500 rpm X 10 min)后倾倒上 清液，加入5 ml 10% FCS RPMI 1640培养液重悬细胞并计数，调整细胞密度 为2 X 1()6细胞/ml，加入ConA，使其终浓度为2.5 ug/ml;按4 X 105细 胞/孔铺96孔细胞培养板。
将96孔板置37。C 5% C02培养箱培养6 h，再分别加入胸腺素al二串体蛋 白及标准品胸腺素al (日达仙)，使其终浓度为1.25 uM、 2.5 uM、 5 uM、 10 uM、 20nM，对照组加入等量的O. 01M的PBS (磷酸盐缓冲液)，每组设3 个复孔，继续培养72 h后加入20 ul MTT(5 mg/ml) ， 37°C 5% 0)2培养箱培 养4 h，离心(2000 rpm X 10 min)后小心吸弃上清，加入150 ul DMSO (二 甲基亚砜)，10 min后在波长570mn处读数，此实验重复3次，计算增殖率结果。如图5所示，各个浓度的胸腺素al二串体蛋白与标准品胸腺素al相比，均可促 进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化，且胸腺素al二串体蛋白刺激后细胞的增殖 率高于标准品胸腺素al刺激组，说明胸腺素al二串体蛋白相比标准品胸腺素 al有更高的生物学活性。
7) 对肿瘤细胞株的体外抑制试验
HL-60、 B16、 S180、 H印G-2、 Ml细胞常规传代，取生长良好的对数生长 期细胞，调细胞数为5X104/ml， 100ul/孔铺96孔板。细胞充分贴壁后，分别 加入胸腺素al二串体蛋白及标准品胸腺素al (日达仙)，设置浓度梯度，对 照组加入等量的PBS，每浓度设3个复孔，继续培养24 h后加入20 yl MTT(5 mg/ml)， 37°C 5% C02培养箱培养4 h，离心(2000 rpm X 10 min)后小心吸 弃上清，加入150 y 1 DMSO， 10 min后在波长570nm处读数，此实验重复3次， 计算半数有效剂量结果。如图6所示，结果说明胸腺素al二串体蛋白与标准品 胸腺素al相比，均可抑制这5种瘤株的增殖，且等摩尔量的胸腺素al二串体蛋 白比标准品胸腺素al有更强的抑制作用。
8) 胸腺素ocl二串体体内活性检测
取对数生长期B16细胞，胰酶消化后离心收集并调整细胞数，按5X105/ 只给C57小鼠背部皮下接种B16细胞。接种10天后肿瘤长出，按照大小随机 分为4组，分别采用生理盐水(对照组)、高、低剂量胸腺素al 二串体(试 验组)以及化学合成多肽(标准组)腹腔注射，每日给药，隔天测量瘤体积， 结果如图7所示。干预12天后将小鼠摘眼球取血处死，统计瘤重。如图8所 示，胸腺素al二串体蛋白给药后，高剂量组有显著抑瘤效果(与生理盐7jC对 照组相比P<0.01)，中剂量组也有抑瘤作用(与生理盐水对照组相比P< 0.05)，且胸腺素ocl二串体蛋白与标准品胸腺素od相比，有更强的抑瘤作用。采用免疫印迹法证明胸腺素al二串体蛋白可与鼠抗胸腺素al抗血清特异 性结合，说明胸腺素al二串体蛋白具有预期的胸腺素oa的空间构象。
纯化的胸腺素ocl 二串体蛋白与标准品胸腺素al相比，胸腺素al 二串体 蛋白促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和分化且刺激后细胞的增殖率高于标准品胸
腺素al刺激组，可以用做免;S^统增强药物^jt用。
胸腺素otl 二串体蛋白可抑制可以抑制肿瘤细胞株增殖并抑制荷瘤小鼠 HL-60、 B16、 S180、 H印G-2、 Ml这5种瘤株肿瘤生长的增殖，且等摩尔量的 胸腺素ocl 二串体蛋白比标准品胸腺素al有更强的抑制作用，具有抛中;lf^物的 鹏前景。核苷酸和氨基酸序列表 〈110〉中国人民解放军第四军医大学 〈120〉重组胸腺素Otl 二串体蛋白及其制备方法
<160〉3
<210>1
<211〉58
<212〉PRT
〈213>人工合成
〈400>1
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu lie Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys 15 10 15 20
Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Ser Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu 21 25 30 35 40
lie Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn 41 45 50 55 58
<210〉2
〈211〉174
〈212>DNA
〈213〉人工序列
■〉2tctgatgcag cggttgacac cagctcggaa atcaccacca aagacctgaa agagaagaaa 60
gaggtggtgg aagaagcgga gaacggatcc agcgatgcgg cggttgacac cagctcggaa 120
atcaccacca aagacctgaa agagaagaaa gaggtggtgg aagaagcgga gaac 174
〈210〉2 <211>189 <212〉DNA <213〉人工序列 <400>3
catatgtctg atgcagcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac ggatccagcg atgcggcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac tagaagctt
60 120 180 189
权利要求
1、一种重组胸腺素α1二串体蛋白，其特征在于，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的胸腺素α1(Tα1)，其连接方式为Tα1-Gly-Ser-Tα1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 如权利要求l所述的重组胸腺素al二串体蛋白，其特征在于，其对应 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2戶标。
3、 如权利要求2戶/M的重组胸腺素al二串体蛋白，其特征在于，该重组 胸腺素od 二串体蛋白的重组核苷酸是用万a/zii I酶切位点连接2段胸腺素ocl 的氨基酸，在5'端加入Ue I酶切位点，3'端加入终止密码子TAG和Sal I 酶切位点，其连接方式为yWel酶切位点-Totl基因酶切位点-Tod 基因-TAG-Sal I酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4、 如权利要求3所述的重组胸腺素ctl二串体蛋白，其特征在于，所述 的重组胸腺素al 二串体核苷酸构建于表达载体或重组质粒pET-22b(+)-Tal ②，所述的pET-22b(+)-Tal②是通过Tfefel酶切位点和Sal I酶切位点将质 粒pET-22b(+)与权利要求3所述的重组胸腺素al 二串体核苷酸双酶切连接。
5、 权利要求1所述的重组胸腺素al 二串体蛋白的制备方法，其特征在于， 其制备方法按照以下步骤1)构建胸腺素al二串体基因表达载体或重组质粒pET-22b (+) -Totl a)胸腺素二串体基因(Totl②)的设计与合成依据大肠杆菌偏爱的密码子，将胸腺素al的氨基酸序列转化为cDNA序 列，用^/zHl酶切位点连接2段胸腺素al的氨基酸序列，再在5'端加入7Vflfel酶切位点，3，端加入终止密码子TAG和Sal I酶切位点，合成胸腺素 al二串体基因，其核苷酸序列如下戶际-catatgtctg atgcagcggt tgacaccagc tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag 60 aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac ggatccagcg atgcggcggt tgacaccagc 120 tcggaaatca ccaccaaaga cctgaaagag aagaaagagg tggtggaaga agcggagaac 180 ta卿gctt s 189 划线部分分别为厕e I 、 Sal I酶切位点，人工合成上述胸腺素od 二串体基因 基因；b)胸腺素al二串体表达载体pET-22b(+)-Tal②的构建 用I和I双酶切pET-22b (+)质粒回收大片段，Mfe I和I双 酶切胸腺素al 二串体Pmdl8_T- Tal②重组质粒回收小片断；回收的大、小 片断用T4连接酶连接构成胸腺素al 二串体表达载体pET-22b (+) -Tod ;重 组质粒pET-22b(+)-Tal②转化BL21感受态细胞，37'C恒温箱培养12h后挑 取单克隆菌落接种于含氨苄青霉素100 mg/L的LB培养液中，摇床37'C培养 后收菌提取质粒，经酶切鉴定获得预期173bp大小的插入片段，DNA测序结 果显示与所合成序列相符，pET-22b (+) -1^1 重组质粒构建成功； 2)胸腺素al二串体蛋白的表达重组胸腺素al二串体质粒pET-22b (+) -Tal②转化大肠杆菌BL21感受态细 胞，37"C恒温箱培养12h后挑取边缘整齐，生长状态良好的菌落，接种于含氨 节青霉素100 mg/L的LB培养液中，摇床37。C培养过夜；次日以l : 100的体 积比接种于新鲜的含氨苄青霉素100mg/L的LB培养液中，37'C继续培养至细 菌密度达到OD咖=0. 4 0. 6，加入O. 1 mM IPTG诱导4 h后12000 rpm离心20min 收菌，-20。C保存；3)胸腺素od二串体蛋白的纯化a) 按lg菌体加10ml裂菌STE缓冲液的比例将冻存的湿菌重悬，所述的STE 缓冲液20mM Tris-HCl pH 7. 5， lOOmM NaCl， lmM EDTA;溶菌酶裂解菌体， 4。C条件下离心12000rpmX 20min，收集上清液，力n (朋4)2304至60%饱和度， 4。C静置lh; 4。C条件下离心12000rpmX20 min，收集上清；b) 收集的上清i!A液平衡后的疏水柱，用B液连续梯度洗脱5 10个柱床体 积，收集含胸腺素al二串体蛋白的洗脱峰；对洗脱峰用50 100倍于其体积的 C液透析24h，中间更换C液三到四次；透析后上样于用C液充分平衡的阴离子 交换层析柱纯化，用D液连续梯度洗脱5 10个柱床体积，收集目的蛋白所在 洗脱峰，对该洗脱峰用50 100倍于其体积的0. OIM磷酸盐缓冲液(PBS)液进 行透析24h，中间更换PBS液三到四次；透析后用O. 22 u m滤膜过滤除菌，即得 到目的蛋白胸腺素al二串体蛋白；所述的A液为20mM Tris-HCl pH 7.5、 60% (NH4)2S04、 lmM EDTA; B液 为20mM Tris-HCl pH 7.5， lmM EDTA ; C液为20nM拧檬酸一柠檬酸钠缓 冲液，pH 5. 0， 1 mM EDTA ; D液为20 mM拧檬酸一柠檬酸钠缓冲液pH 5. 0， 1 M NaCl， 1 mM EDTA。
6、权利要求l戶;M的重组胸腺素al二串体蛋白，其特征在于，胸腺素al 二串体蛋白应用于抗肿瘤药物、免疫增强剂、抗病毒药物、造血刺激剂的制 备。
全文摘要
一种重组胸腺素α1二串体蛋白及其制备方法，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的胸腺素α1(Tα1)，其连接方式为Tα1-Gly-Ser-Tα1，合成胸腺素α1二串体基因，构建了胸腺素α1二串体基因表达载体，使无法在大肠杆菌中直接表达的胸腺素α1以二串体的形式在大肠杆菌中高效表达。纯化的胸腺素α1二串体蛋白具有生物学活性，可以促进小鼠淋巴细胞增殖，抑制肿瘤细胞株增殖，并显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。为胸腺素α1的进一步研究和广泛应用奠定基础。
文档编号A61P7/06GK101544693SQ200810232700
公开日2009年9月30日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者张英起, 李维娜, 苇 韩 申请人:中国人民解放军第四军医大学