炎症和/或内毒素休克的治疗的制作方法

专利名称：炎症和/或内毒素休克的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及炎症和/或内毒素休克的治疗和/或炎性趋化因子的水平的降〗氐，并涉及用于炎症和/或内毒素休克的治疗，或用于炎性介质的水平降^f氐的纟且合物。
背景技术：
炎症是许多人类和动物疾病的致病才几理的组成部分，而且也作为人类或动物身体组织的物理、化学或外伤性损伤的结果而发生。通常，免疫应答导致内源性化学介质的全身释i文，这会导致血管舒张、中性白细胞迁移、趋化作用、及脉管的渗透性增加。无论免疫应答发生在何处以及是由什么引起的，其原因基本上是相同的。应答可以为急性的(短暂的)或者可以是慢性的(持续的)。
内毒素休克，有时也被称为感染性休克，被认为是由于血管内暴露于由炎症样应答导致的大量内毒素而发生的。暴露于内毒素导
致产生大量细胞因子，包括TNFcx和IL-1。补体系统和凝结级联(coagulation cascade),包括因子VII也受到刺激。这种反应的结果可以是组织损伤、发热、血管舒张、心动过速和血管内凝固。
炎性应答通常是有益的，使得炎症部位进入的营养素、氧、抗体和治疗性药物增加，以及纤维蛋白的形成增加和毒素稀释。然而，如果炎症是不希望的或延长的，则会造成组织的损伤。在这样的情况下，通常使用抗炎性药物。存在两种主要类型的抗炎性药物，皮
7质激素类和非甾体抗炎药(NSAIDs)。这些药物中的大多凄史具有不希望的副作用。延长的皮质激素给予通常与拟态的库欣病(Cushing's disease )的严重副作用相关，库欣病是一种由皮质醇产生过剩而导致的肾上腺;t几能障碍。其他可能的副作用包括体重增加、胸部、面部、颈部和上背部脂肪沉积、水肺、高血压、冲唐尿病、伤口愈合不良、容易发生感染、皮肤变薄、情绪不稳定和抑郁。NSAIDS的最严重的副作用是肾衰竭、肝功能衰竭、溃疡以及损伤或手术后的持续出血。 一些个体对NSAIDs过敏，而患有哮喘的人对阿司匹林的严重过敏反应存在较高风险。因此，需要鉴定具有抗炎性作用的可选药剂。
凯莫瑞(Chemerin， 一种脂肪细胞因子，是孤独G蛋白偶联素受体chemerin R的内源性配体)是一种存在于人类炎性'渗出物(包括腹水和滑液)中的丰富蛋白(Wittamer V " a/. J Exp Med. 2003年10月6日；198(7) :977-985; Meder Wet d a/. FEBS Lett. 2003年12月18日；555 (3) : 495-499)。人类凯莫瑞(Chemerin)是作为称为前体凯莫瑞(ProChemerin )的163个氨基酸(aa )前体(小鼠(Musmusculus),鼠类等同物为162aa)而分泌的，其经历N-和C-末端截短以产生13 7aa的趋化蛋白(小鼠中为140aa) ( Wittamer V W a/.J Exp Med. 2003年10月6曰；198(7) :977-985; Zabel BA " a/. J BiolChem. 2005年10月14日；280(41):34661-34666; Wittamer V " a/. JImmunol. 2005年7月1曰；175(1) :487-493; Samson M a/. Eur JImmunol. 1998年5月；28(5) : 1689-1700)。凯莫瑞的预测结构表明了与趋化因子的结构类似性，它已经被描述为"相反的"趋化因子，潜在地具有无序的羧基-末端、a-折叠片和|3-螺旋氨基-末端结构域(Zabel BA d a/. Exp Hematol. 2006年8月;34(8) :1021-1032 )。该结构使人联想到存在于组织蛋白酶和激肽原中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)折叠，其也经历蛋白水解过程以实现活化(Zabel BA"A Exp Hematol. 2006年8月；34(8) :1106國1114; Colman RW， BiolChem. 2001年1月；382(1) :65-70; Yamasaki K W FASEB J. 2006年10月1曰2006;20(12) :2068-2080 )。

发明内容
根据第一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞(Chemerin)蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于治疗炎症的药物中的应用。
才艮据另一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于制备内毒素休克的药物中的应用。
根据另 一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于降低一种或多种炎性介质水平的药物中的应用。
根据又一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物，以用于治疗炎症、和/或治疗内毒素休克、和/或降低一种或多种炎性介质的水平。
该一种或多种炎性介质可以包括介导炎症的细胞因子、趋化因
种或多种趋化因子TNFa、 IL-la、 IL-1J3、 IL-6、 IL-12、 G-CSF、MCP-2(CCL8 )、 GROa( CXCL1 )、 GRO卩(CXCL2 )、 IL-8( CXCL8 )、TECK ( CCL25 )、 MCP-1 ( CCL2 )、干4尤素y和RANTES ( CCL5 )。优选地，该药物能够降<氐TNFa的水平。
出人意料的是，衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽具有抗炎特性，可以用于治疗、预防或改善炎症和/或内毒素〗水克。该药物可以具有治疗和/或予贞防应用。
优选地，该肽在约5到约30个氨基酸之间。更优选地，所述肽在约5到约25个氨基酸之间，优选地，所述肽在约5到约20个氨基酸之间。
优选地，该肽包含约5到约30个书f生自Chemierin蛋白的C-末端的氨基酸，或它们的类似物或衍生物。更优选地，所述肽在约5到约25个氨基酸之间，优选地，所述肽在约5到约20个氨基酸之间。
凯莫瑞(Chemerin)蛋白是指凯莫瑞的处理形式，其中前体凯莫瑞的前体(PreProChemerin )中存在的N-末端氨基酸已经^皮蛋白水解去除，前体凯莫瑞(ProChemerin )前体中存在的C-末端氨基酸已经;故蛋白水解去除，从而产生称为凯莫瑞的蛋白的活性截短形式。
优选地，该肽来生自人类形式或非人形式的凯莫瑞。优选地，该肽来自人类或哺乳动物形式的凯莫瑞。哺乳动物非人凯莫瑞可以来自啮齿动物，如大鼠或小鼠、马、狗、猫、牛、羊或猪。
优选地，衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的肽具有至少30%或更高的同一性。优选地，所述肽与天然存在的凯莫瑞蛋白的C-末端肽序列具有至少40%、 50%、60%、 70%、 80%、 90%或更高的同一性。
优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的约最后5个到约最后30个，优选约最后10个到约最后25个氨基酸具有至少30%或更高的序列同一性。优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的约最后5个到约最后30个，优选约最后IO个到约最后25个氨基酸具有至少约40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或 更高的序列同一性。
优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端中的最后30个 氨基酸中的5到25个氨基酸具有至少30%或更高的序列同一性。 优选地，该肽与天然存在于凯莫瑞蛋白C-末端的最后30个氨基酸 中的5到25个氨基酸具有至少约40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高的序列同 一性。
关于凯莫瑞蛋白中的"最后的氨基酸"是指该蛋白C-末端的氨基酸。
图2A中给出了人类和鼠凯莫瑞、前体凯莫瑞(ProChemerin ) 和前体凯莫瑞前体(PreProChemerin )的全长序歹'J, Seq ID no: 31 、 32、 33中分别反映了对于人类蛋白质，而Seq ID no: 34、 35、 36 中分别反映了小鼠蛋白质。优选地，凯莫瑞肽具有S叫ID No: 31 或34的序列。来自其他物种，如牛和大鼠的凯莫瑞蛋白的序列可 以容易i也乂人GenBank获得并且本领域才支术人员可以容易地获4寻。
^尤选:l也，i亥月太与Seq ID no: 31 (l人类序歹'J )和Seq ID no: 34 (小 鼠序列)的凯莫瑞的最后5到最后30个氨基酸具有至少30%或更 高，更优选40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高的序列同一性。
百分比氨基酸序列同 一 性被定义为在比对序列以及在必要时 引入空位(gap)以获得最大的百分比序列同一性之后，序列中的 与天然存在的凯莫瑞蛋白中的氨基酸相同的氨基酸残基的百分比。 用于确定百分比序列同一'l"生的比对(Alignment)可以以本领域^支术 人员/>知的许多方式实现，包括，例如，利用BLAST和ALIGN算 法。该肽可以包含相对于凯莫瑞蛋白c-末端的天然序列的添加、插
入、缺失、倒位或易位，以使得该肽与具有天然序列的肽相比，具
有至少50%的抗炎活性，和/或至少50%的抗内毒素休克活性，和/ 或将一种或多种炎性介质水平降低至少50%的能力。
术语"类似物"或"衍生物"是指这样的肽，其具有与天然存 在的序列不同的序列，4旦是与具有天然存在序列的肽一起^L察时， 其包含基本上相同或更多，以及至少约50%、优选约60%、 70%、 80%或90%的抗炎活性、和/或抗内毒素^木克活性、炎性介质减少活性。
肽类似物或衍生物可以具有任何氨基酸残基，包括N或C-末 端残基的一个或多个缺失、插入、或^f奮饰。该肽可以-故乙酰化、酰 化、烷基化、糖基化等。该肽还可以在C或N末端或C和N末端 包含另外的氨基酸。
该肽、类似物或衍生物可以为融合蛋白的部分。
与天然存在的氨基酸序列相比，该肽可以包4舌一个或多个〗呆守 的氨基酸置换。
优选地， 一种或多种所述肽包含选自包含以下的序列组的序
列
PHGYFLPGQFA ( Chemerinll-小鼠；Cllm; Seq ID No:l); PHGYFLPGQFAF ( Chemerinl2画小鼠；C12m; S叫ID No:2 ); PHGYFLPGQFAFS ( Chemerinl3-小鼠；C13m;; Seq ID No:3 ); AGEDPHGYFLPGQFA ( Chemerinl5画小鼠；C15m; Seq ID No:4 ); AGEDPHGYFLPGQFAF (Chemerinl6國小鼠；C16m; SeqlDNo:5); AGEDPHGYFLPGQFAFS(Chemerinl7-小鼠；C17m; S叫ID No:6 ); DPHGYFLPGQFA (Chemerinl2A-小鼠；C12Am; Seq ID No:7 );EDPHGYFLPGQFA ( Chemerinl3A-小鼠；C13Am; Seq ID No:8 ); GEDPHGYFLPGQFA ( Chemerinl4A-小鼠；C14Am; SeqlDNo:9); DPHGYFLPGQFAF ( Chemerinl3B画小鼠；C13Bm; SeqlDNo:10); EDPHGYFLPGQFAF( Chemerinl4B-小鼠；C14Bm; SeqIDNo: 11); GEDPHGYFLPGQFAF( Chemerinl5A-小鼠；C15Am; S叫ID No: 12);
DPHGYFLPGQFAFS(Chemerinl4C-小鼠；C14Cm; SeqIDNo: 13); EDPHGYFLPGQFAFS( Chemerinl5B-小鼠；C15Bm; S叫ID No: 14 ); GEDPHGYFLPGQFAFS ( Chemerinl6A-小鼠；C16Am; S叫ID No:15 );
PHSFYFPGQFA ( Chemerinll-人类；Cllh; Seq ID No: 16); PHSFYFPGQFAF ( Chemerinl2-人类；C12h; Seq ID No: 17); PHSFYFPGQFAFS ( Chemerinl3-人类；C13h; S叫ID No: 18); AGEDPHSFYFPGQFA ( Chemerinl5陽人类；C15h; Seq ID No: 19); AGEDPHSFYFPGQFAF (Chemerinl6-人类；C16h; SeqlDNo:20); AGEDPHSFYFPGQFAFS( Chemerinl7-人类；C17h; SeqlDNo:21); DPHSFYFPGQFA ( Chemerinl2A-人类；C12Ah; Seq ID No:22 ); EDPHSFYFPGQFA (Chemerinl3A-人类；C13Ah; SeqlDNo:23); GEDPHSFYFPGQFA ( Chemerinl4A-人类；C14Ah; S叫ID No:24 ); DPHSFYFPGQFAF (Chemerinl3B-人类；C13Bh; SeqlDNo:25); EDPHSFYFPGQFAF ( Chemerinl4B-人类；C14Bh; S叫ID No:26 ); GEDPHSFYFPGQFAF( Chemerinl5A國人类；C15Ah; SeqlDNo:27); DPHSFYFPGQFAFS (Chemerinl4C画人类；C14Ch; SeqlDNo:28); EDPHSFYFPGQFAFS ( Chemerinl5B-人类；C15Bh; S叫ID No:29 ); 以及
GEDPHSFYFPGQFAFS(Chemerinl6A-人类；C16Ah; Seq ID No:30 )
或它们的类〗以物或4汙生物。
优选地， 一种或多种该肽包含选自包括以下序列的组的序列AQAGEDPHGYFLPGQFAFS( Chemerinl9國小鼠；C19m; S叫ID No:37);以及
QRAGEDPHSFYFPGQFAFS ( Chemerinl9扁人类；C19h; Seq ID No:38);或它们的类々乂物或书亍生物。
优选地，该肽与上文中^皮称为SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的一种或多种肽具有至少 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高的序列同一'l"生。
优选地，该肽与上文中^皮称为SeqIDNo: 37或38的一种或多 种肽具有至少30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或更高 的序列同一性。
优选地，书f生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽的类似物或书f生物包 括肽的小分子^t拟物。
该肽、类似物或衍生物，可以乂人天然系统分离，或者可以合成 ;也或重组地产生。合成的肽可以由标准的化学方法产生，包4舌由自 动程序合成。
重组肽可以以纯化形式使用。可替换地，可以使用来自表达重 组肽的细胞的上清液。
该肽、类似物或书f生物可以形成净交大的蛋白或分子复合物的部分。
该肽可以为直链或环爿犬的。 该肽可以包4舌耐蛋白酶的主链。该肽可以包4舌在C和/或N末端的》务饰。
该月太可以通过本4页i或已^口的方法4皮才示i己，^口方文射寸生才示i己、荧光 标"i己、质i普标签、生物素等。
所述药物可以包含其他活性成分，包括其他已知的抗炎药剂、 和/或其他已知的抗内毒素休克药剂、和/或其4也已知的降4氐趋4匕因 子水平的药剂。
所述药物还可以包含药用f武形剂。该J3武形剂可以包含大的大分 子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共 聚物、海藻糖、脂质聚集体和非活性病毒颗粒。这样的赋形剂是本 ^页i或才支术人员熟^口的。
所述药物还可以包含緩冲剂、增粘剂、溶剂、稳定剂和防腐剂 中的一种或多种。
所述药物的^合药途径可以为通过肠胃外、皮下、静月永内、月几肉 内、腹膜内、动脉内、损伤内、关节内、局部、经口、直肠、经鼻、 吸入、或任何其他合适的途径注射或输注。
所用的肽的剂量取决于肽、耙标和处理。纟会药剂量和途径确定 是在普通医师的技术范围内。正常剂量的给药方案可以在约1 pg/kg 到约100 mg/kg的范围内变化，更优选地，该剂量在约10 pg/kg到 约1 mg/kg,更优选i也在约10 pg/kg到约100 ng/kg的范围内变4匕。 优选地，这些剂量是每日剂量。
出人意料的是，已经发现根据本发明的肽的低至0.32 ng/kg的 剂量在对小鼠体内的无菌性腹膜炎具有效能，而需要使用1.2mg/kg 的地塞米松才能观察到类似程度的效能。优选地，才艮据本发明的应用的药物可以意图以约10 pg/kg到约 1 mg/kg的剂量给药，更优选地，以约10 pg/kg到约100 ng/kg或者 约10pg/kg到约10ng/kg的剂量给药。这些剂量比所需要的地塞米 松的剂量低至少三个对数级(log)。
才艮据本发明的另一方面，才是供了治疗/处理、预防或改善受试者 体内炎症的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的 C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。
根据本发明的另一方面，提供了治疗/处理、预防或改善受试者 体内内毒素休克的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞 蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物或衍生物。
根据本发明的另 一方面，提供了降低受试者体内的 一种或多种 炎性介质水平的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋 白的C-末端的肽、或它们的类似物或书f生物。
所述治疗(处理)可以是治疗性的、预防性的或美容用的。
优选地，该肽以有效量纟皮给予，有效量即为，足以(i)诱导或 导致炎症减少，或防止或减少炎症；(ii)诱导或导致内毒素休克的 减少，或防止或减少内毒素休克；和/或(Ui)降^f氐一种或多种炎性 介质水平的量。
可替4戈地，本发明的药物可以;波直4妄施用于医学装置以减少炎 症相关的装置的风险。这可以通过将药物施用于该装置的表面或通 过用 一种或多种4汙生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类似物 或衍生物浸渍所述装置的表面来实现。
根据另 一方面，本发明提供了用 一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白 的C-末端的肽、或它们的类似物或4汙生物浸渍的医学装置。该医学装置可以为支架或导管。
根据又一方面，本发明提供了用 一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白
的C-末端的肽、或它们的类似物或4汙生物浸渍的伤口lt扦或绷带。
本发明的〗壬zf可方面所涉及的炎症可与以下病症相关，例如青少 年慢性关节炎、脊柱关节病、系统性硬化症(硬皮病)、原发性炎
性月几病(皮月几炎、多月几炎)、干燥综合4i ( Sjogren's syndrome )、系 统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减 少症、阵发性夜间血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(原发 性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、曱状腺炎(格 雷夫斯氏病、桥本氏甲状腺炎、青少年淋巴细胞甲状腺炎、萎缩性 甲状腺炎)、自身免疫性炎性疾病(如变应性脑脊髓炎、多发性硬 化症、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性视网膜炎、甲状腺毒症、 硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、炎性肠病(如克罗恩 病、溃痴性结肠炎、局限性肠炎、回肠末端炎、肉芽肿性肠炎、局 限性回肠炎、末端回肠炎)、自身免疫性曱状A泉疾病、恶性贫血、 同种异体移植物排斥、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾 d、管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘病如多发性硬化 症、原发性脱髓鞘性多发性神经病或格林-巴利综合征、和慢性炎性 脱髓鞘性多发性神经病、肝胆病如传染性肝炎(曱、乙、丙、丁、 戊型肝炎和其他非嗜肝病毒)、自身免疫性慢性活动型肝炎、原发 性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎、谷蛋白敏感性肠 病、惠普尔氏病、自身免疫性或免疫介导的皮肤疾病包括大疱性皮 月夫病、多形性红斑和4妻触性皮炎、4艮屑病、变态反应病如哞喘、变 应性鼻炎、特应性皮炎、食物超敏反应和荨麻疹、肺部免疫性疾病 如嗜酸细月包性月申炎、先天性力申纤维症和过壽丈性肺炎(hypersensitivity pneumonitis )、移才直相关疾病包4舌移才直4非斥和移才直物抗宿主病、感 染性疾病包括病毒性疾病如AIDS(HIV感染)、疱渗等、细菌感染、真菌感染、原生动物感染、寄生虫感染、及呼吸道合胞病毒、人类 免疫缺陷病毒等、湿渗和内毒素休克。
根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善炎症的肽，
该肽选自包4舌具有S叫ID No: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、
26、 27、 28、 29、 30的序列的肽牙口它们的类A乂物或书亍生物纟且成的纟且。
根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善炎症的肽， 该肽选自包括具有S叫ID No: 37、 38的序列的肽和它们的类似物或 书f生物纟且成的纟且。
^4居另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善内毒素4木 克的肽，该肽选自包4舌具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30的序歹'J的狀禾口它耵]的类^f以4勿或书亍生冲勿 组成的组。
根据另一方面，本发明提供了能够治疗、预防或改善内毒素休 克的肽，该肽选自包括具有SeqIDNo: 37、 38的序列的肽和它们的 类似物或书亍生物组成的组。
根据另 一方面，本发明提供了能够降低一种或多种炎性介质水 平的肽，该肽选自包括具有S叫IDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30的序歹寸的狀禾口它力']的类^f以净勿或书亍生4勿 组成的组。
根据另一方面，本发明提供了能够降低一种或多种炎性介质水 平的肽，该肽选自包4舌具有Seq ID No: 37、 38的序列的肽和它们 的类似物或书亍生物组成的组。根据另一方面，本发明提供了包含一种或多种肽的药物组合
4勿，该肽选自包4舌具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、和30的序歹'J的狀和它力1的类4以净勿或书亍生净勿 组成的组。
根据另一方面，本发明提供了包含一种或多个种的药物组合 净勿，i亥狀选自包才舌具有SeqIDNo: 37和38的序歹寸的欣禾口它々]的类 4以物或书亍生物《且成的纟且。
该药物组合物可以用于治疗和/或预防炎症、和/或治疗和/或预 防内毒素休克、和/或用于降低一种或多种炎性介质(如细胞因子和 趋化因子)的水平。
才艮据又一方面，本发明提供了具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序歹寸的月太或它Cl的类々乂 物或々t生物。
才艮据另一方面，本发明^是供了具有S叫IDNo: 37或38的序列 的肽或它们的类似物或书f生物。
根据又一方面，本发明提供了与具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序歹'J的肽具有至少 50%序列同一'l"生的肽。优选地，该肽与具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序歹'J的狀具有至少 60%、 70%、 80%、 90%或95。/o的序歹'J同一'l"生。才艮据又一方面，本发明才是供了与具有SeqIDNo: 37或38的序 列的肽具有至少50%的序列同 一性的肽。优选地，该肽与具有S叫ID No: 37或38的序列的肽具有至少60%、 70%、 80%、 90%或95% 的序列同一性。
根据另 一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一 种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于处理伤口的药物 中的应用。
根据另一方面，本发明提供了治疗、预防或改善受试者的伤口 的方法，包括给予受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的 肽，或它们的类似物或书于生物。
根据另 一方面，本发明提供了用于处理伤口的包含一种或多种 肽的药物組合物，该肽选自包括具有SeqIDNo'. 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 37或38的序歹寸的月大或它 们的类似物或书于生物组成的组。
才艮据另 一方面，本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一 种或多种肽，或它们的类似物或衍生物，以用于炎症的治疗和/或预 防、和/或内毒素<木克的治疗和/或预防、和/或用于降^氐一种或多种 炎性介质(如细胞因子和趋化因子)的水平。
根据另 一方面，本发明提供了 一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的 C-末端的肽，或它们的类似物或衍生物，以用于伤口的处理。
本领域寺支术人员将iU只到上文4皮露的任何优选的特征能够应 用于本发明的任何方面。


以下将仅以举例的方式参照以下附图和实施例来描述本发明 的^尤选实施方式。
图1a至图1f-图1a和图ib示出了 Chemerin140以蛋白水解 依赖性的方式抑制通过巨噬细胞的炎性介质的产生。利用Luminex 和ELISA试-验分析来自巨噬细胞或活化的巨噬细胞(用100 ng/ml
LPS和20 ng/ml干扰素y处理)的上清液的细胞因子表达。在所示 剂量的重组体鼠凯莫瑞(Chemerin)或地塞米^^存在或在夹乏的情况 下以及蛋白酶抑制剂亮抑酶肽(leupeptin ) ( 15 mg/ml)存在或缺乏 的情况下將育细胞。图lC-通过qRT-PCR(IL-10，TGF卩)将巨噬细胞 细月包因子mRNA 7K平定量化和标准化为HPRT。图1d-在LPS/IFNy-激发前用凯莫瑞(0.1-1 pM )±百日咳毒素(PTX; 200 ng/ml )对PMO 进行预处理。图1e-用凯莫瑞(1 pM )对PMO预处理1小时士PTX， 随后用LPS/IFNy刺激4小时、8小时或15小时。相对于LPS/IFNy 处玉里的才羊品，***， p< 0.001; **, p<0.01; *， p<0.05。才目只于于f几 莫瑞处J里的才羊品，###， p< 0.001; ##， p<0.01; #， p < 0.05。图 1f-用凯莫瑞(1 pM)、凯莫瑞(1 pM) +蛋白酶#卩制剂(亮抑酶肽 [Leu] 、 E-64、 Pefabloc [Pef]、胃酶抑素A[Pep A] 、 4丐蛋白酶抑制剂
(Calp印tin) [Cal]、 组织蛋白酶S抑制剂[Cath S]、组织蛋白酶L 抑制剂[CathL])对腹膜巨噬细胞(PMO)预处理lh，随后用LPS
(100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml)刺5敫15小时。图表示出了来自 3陽8次独立实验的平均值士SEM。 nd:低于该试验的4全测限，ns，不 显著；
图2a-示出了人类(上方序列)和小鼠(下方序列)凯莫瑞(Tig2) 的氨基酸序歹'J比对。
利用 PeptideCutter (http:〃www.expasy.org/tools/peptidecutter/)对人类(蛋白质数据库 登录号为NP—002880)和鼠(NP_082128)凯莫瑞的氨基酸序列进行比对和分析以产生预测的胰蛋白酶裂解位点(黑色垂直线)。粗
体和灰色的全长序列为前体凯莫瑞的前体(PreProChemerin的序歹ll ) (人类序列为SeqIDNo: 33,小鼠序列为Seq ID No: 36 )。灰色N 末端氨基酸^皮去除的序列为前体凯莫瑞(ProChemerin)序列(人类 序列为Seq ID No: 32,小鼠序列为Seq ID No: 35 )。灰色N末端和 C-末端氨基酸被去除的粗体序列为凯莫瑞的序列(人类序列为S叫 ID No: 31,小鼠序列为SeqIDNo: 34)。
还《会出了 C-末端肽Cllm( SeqIDNo: 1 )、C13m( SeqIDNo: 2 )、 C15m ( Seq ID No: 3 )和C17m ( Seq ID No: 4 )的序列；
图2B-示出了抑制通过活化巨噬细胞产生的前-炎性介质的衍 生自凯莫瑞的C-末端部分的肽。在该幅图中，标号肽C13、 C15和 C17分别指的是前文中描述为C13m、 C15m和C17m的肽；
能的岁几莫瑞肽。在该幅图中，标号月太Cll、 C13、 C15和C17分别 指的是前文中描述为Cllm、 C13m、 C15m和C17m的肽；
图4A至图4H-示出了由凯莫瑞(Chemerin )、凯莫瑞月太和凯莫 瑞处理的上清介导的趋化性。^f吏经过或未经过百日咳毒素预处理 (PTX;200 ng/ml) 30分4中的PMO (0.4x106),月向？支良的Boyden 室的底部孔中的化学引-秀物迁移超过4小时(图4A; rmChemerin， 图4B; C15,图4C; Cll，图4D; C13,图4E; C19,图4F; C6, 图4G; C8 )。图4H」使PM①(7.5x105)朝向改良的Boyden室的底 部孑L中的来自未处理的巨嗟细胞和用LPS/IFNY士凯莫瑞或C15处理 的巨噬细胞的条件培养基迁移超过4小时。图表示出了每个处理组 的平均迁移指凄史士SEM ( n = 4次独立的实-睑)。相对于PMO + PTX， ***, p<o.001; **,P<0.01; *, P < 0.05 (学生氏t才全马全)。该图中的参考符号肽C11、C13、C15和C19分别是指前文中描述为Cllm、 C13m、 C15m和C19m的肽；
图5-示出了巨噬细月包显示出朝向来自凯莫瑞-处理的巨噬细月包 的条件培养基的趋化性降低。在该图中，参考符号肽C15和C17 分别是指前文中描述为C15m和C17m的肽；
图6-示出了 Chemerinl5-小鼠抑制酵母聚糖-诱导的腹膜炎。该 图中的参考符号肽C15是指前文中描述为C15m的肽。Z是指酵母 聚糖；
图7A至图7G-示出了 chemerin15改善了小鼠中酵母聚糖-诱导 的腹膜炎。图7A和图7B-C57B16/J小鼠被i.p.给药PBS或 chemerin15 ( 0.32 ng/kg )， 1小时后再注射PBS或酵母聚并唐(10 ]^ig， 每个腔 2><106个颗粒)。在多个时间点(图7A和图7B; 5-6只小鼠 /处理)或4小时后(图7C-图7E; 6-15只小鼠/组)通过腹月莫灌洗 收集腹膜渗出物细胞。图7C至图7E-将灌洗液中的总细胞数定量 化，并利用FACS分析确定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬细胞)。 细月包用2.4G2抗-FcyRII/III阻断，并用Ly-6G-PE和7/4-FITC染色。 在两个群周围构建门(gate),这两个群是中性白细月包(N; 7/4高, Ly-6G高)和炎性单核细胞(Mo; 7/4高，Ly-6G 4氐)。图7E-示出 了每个处理组在酵母聚糖后4小时的典型FACS图。图7F-通过 ELISA分^f腹月莫灌洗液的TNFa和KC，并通过Luminex试-睑分才斤 IL-6、 IL-ip和MCP-1。 C15; Chemerin15， Z;酵母聚泮唐。对于酵 母聚4唐-处多里的动物，***, P〈0.001; **, P<0.01 ** (学生氏t才企 验)。图7G-提前1小时(C15预处理)或2小时后(C15后处理) 对小鼠(6-8/处理)i.p.给予酵母聚糖(10吗)和C15 ( 8 pg )或PBS。 腹膜灌洗在酵母聚糖激发后4h进行。该图中的参考符号肽C15是 指前文中描述为C15m的肽；图8A-图8D-示出了抗-凯莫瑞抗体中和凯莫瑞物质并使腹膜炎 恶化。图8A-PMO用于巨噬细胞趋化性试验(详见图7中来进行)， 并使得其存在或不存在抗-rmChemerin抗体或对照IgG的情况下朝 向RANTES、凯莫瑞或C15迁移。图表示出了对于每个处理组的平 均迁移指数士SEM (n-4次独立的实-睑)。相对于4匕学引i秀物，***, P < 0.001; **, P < 0.01; *， P < 0.05。图8B-在存在或不存在抗 -rmChemerin 4元体或乂于照IgG的'清况下，PMO用1 pM C 15或1 pM 凯莫瑞预处理达1小时，随后用LPS( 100 ng/ml )和IFNy( 20 ng/ml) 刺激15小时。16小时后通过ELISA (n-4个独立的实-验)测定巨 噬细月包上清液中的RANTES的平均表达士SEM。相对于LPS/IFNy-处J里的才羊品，**, P〈0.01; *， P<0.05。图8C和图8D-C57B16/J 小鼠i.p j会予PBS、抗-rmChemerin抗体(100 ng/小鼠)或对照IgG (100 ng/小鼠)，1小时后注射PBS或酵母聚糖(10 itig/腔)。在酵 母聚糖注射后4小时和24小时通过腹膜灌洗收集腹膜渗出物细胞， 并如图7中所示进4亍处理。Z;酵母聚泮唐，ChAB;抗-rmChemerin 抗体。相对于酵母聚糖-激发的小鼠**， P<0.01。该图中的参考符 号肽C15是指前文中描述为C15m的肽；
图9-示出了^又注射0.32 ng/kg C15m不会"i秀导中')"生白细月包或巨 噬细胞募集，但是会降低腹膜TNFa水平。该图中的参考符号肽C15 是指前文中描述为C15m的肽；
图10-示出了<务饰的Chemerinl3-人类肽抑制鼠巨噬细胞中 RANTES和TNFa转录物表达。该图中的参考符号肽hC13是指修 饰的C13h肽；
图11-示出了 C17m不影响C140-诱导的巨噬细胞趋化性。该图 中的参考符号肽C17是指前文中描述为C17m的肽；图12-示出了 Chemerinl5-小鼠和Chemerinl7-小鼠抑制由酵母 聚糖刺激的鼠巨噬细胞的TNFa分泌。该图中的参考符号肽C15和 C17分别是指前文中描述为C15m和C17m的肽。Dexa是指;也塞米 松；
图13-为棋盘分析，示出了 Chemerin140和Chemerinl5-小鼠诱
导真正的巨噬细胞趋化性而不是化学运动性。该图中的参考符号肽 C15是指前文中描述为C15m的肽；
图14A-图14B-示出了 chemerin15在酵母聚糖腹膜炎中抑制单 核细月包和中性白细月包募集超过C15和酵母聚^t剂量的范围。图 14A-C57B16/J小鼠(5-6只动物/处理)被i.p给予PBS或C15 ( 0.32 ng/kg), 1小时后注射PBS或酵母聚冲唐剂量范围(10pg-lmg; A )。 图14B-小鼠(5-6只动物/处理)i.p给予PBS或C15剂量范围(4-40 pg/小鼠)，lh后注射PBS或酵母聚糖(10 ng; 2xl(^个颗粒/腔)。 酵母聚糖激发后4小时通过腹膜灌洗收集腹膜渗出物细胞。如图7 中所描述的，将灌洗液中的总细胞数定量化，并利用FACS分析确 定细月包组成(中性白细月包与单核吞卩笪细月包)。C15; Chemerin15， Z; 酵母聚糖。相对于酵母聚糖处理的动物，***， P< 0.001; **， P<0.01 **; P < 0.05 * (学生氏t才企马全)。该图中的参考才寻号肽C15或 chemerin15是指前文中描述为C15m的肽；以及
图15-示出了由巨噬细胞的酵母聚糖识别的焚光测定，其被表 达为相对识别指H实验在各种浓度的存在或缺乏C15的情况下进 行。数据代表四次集合的、标准化的实验的平均数(士s.e.m.)。
具体实施例方式
本文中的参考符号Chemerin140或C140是指序列ID No: 34的 140个氨基酸的小鼠凯莫瑞(Chemerin )蛋白(Chemerin-140-小鼠)。实施例
Chemerin140对^皮蛋白S^押制剂消除(abrogated)的活4匕巨 嗟细j!^^抗炎作用
先前的研究已经表明由多形核细胞(PMN)在脱粒后释放的丝 氨酸蛋白酶裂解前体凯莫瑞(ProChemerin)的C-末端并释放其趋 ;昝能(Wittamer V " a/, J Immunol. 2005年7月 1日； 175(1) :487-493 )。然而，通过凯莫瑞的进一步蛋白水解处理所产生 的肽的抗炎作用是具备新颖性和创造性的。
在多种条件下培养鼠腹膜巨噬细胞(PM9,本文中也称为 PM①)未处5里；LPS ( 100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml), 15小时； 凯莫瑞(1 pM)预处理1小时，随后LPS/IFNy, 15小时；亮抑酶 肽(蛋白酶抑制剂；15 mg/ml)和凯莫瑞(1 pM )， 1小时，随后 LPS/IFNy， 15小时；或》也塞米+> (阳性只于照；1 ^M,预处理1小 时，随后LPS/IFNy, 15小时。
分析来自凯莫瑞+月旨多糖/干扰素-y ( LPS/IFNy )-处理的巨噬细 胞的上清液的趋化因子含量，结果表明，与LPS/IFN，处理的样品 相比，凯莫瑞处理的细胞表现出显著低水平的TNFa (70%)、 IL-12 p40 ( 54% )、 RANTES ( CCL5; 40% )、 IL-6 ( 42% )和IL-lp ( 60% )
(n=5; p<0.001，图1A和图1B)。这种抗炎作用受到广"i普蛋白酶 抑制剂(亮抑酶肽)的抑制(其在被加入到巨噬细胞时防止任何抗 炎作用)，表明在这些抗炎肽的产生中另外的凯莫瑞裂解的重要性
(图1A禾口图1F)。
通过利用抗-凯莫瑞中和抗体，进一步表明的是这些作用是凯莫 瑞特异性的；所述抗体去除了凯莫瑞的抗炎作用(图8B)。图1A中的柱状图示出了如通过Luminex试-验士SEM确定的细 胞因子的平均表达。对于每个处理，实验用一式三份的测定进行。 示出了采用来自C57B16/J小鼠的不同组的细l包的三次独立实-睑的 代表性数据。除非另外陈述，相对于LPS/IFN 处理的样品，p < 0.001 ***; p<0.01**。 Dexa是才旨;也塞米爭〉(1 mM )。
图IB示出了与上文中关于图1A中讨论的类似的结果，还有 另外的邀:据表明0.1 pM、 0.5 pM和1.0 pM的不同浓度的凯莫瑞的 作用。
此外，图1C表明凯莫瑞诱导用于抗炎细胞因子TGFP(54。/。)和 IL-10 (89%)的mRNA的表达。
凯莫瑞的作用是剂量依赖性的，在1 pM观察到最大应答(图 1B和图1C ),并且对百日咳毒素敏感，表明这与Gai-偶联的GPCR 有关(图1D)。
此夕卜，在给予LPS/IFNy后4h、 8h和15h 7见察到抗炎作用，而 在所有的时间点抗炎作用均4皮PTX消除(图1E)。
先前的研究已经表明，粒细胞在脱粒后释放的丝氨酸蛋白酶裂 解前体凯莫瑞(prochemerin )的C-末端并释力丈其趋化潜能(Wittamer, V.， W /， (2005) ， J/wwimo/ 175:487-493 )。研究了鼠0l莫瑞可经历 由鼠M①活化后释放的酶进行的进一步蛋白水解处理的可能性。如 上文中关于图1A所讨:论的，凯莫瑞与亮抑酶肽(一种丝氨酸和半 胱氨酸蛋白酶抑制剂)的同时给药消除了其抗炎效果(图1A和图 1F)。 E-64 (—种半胱氨酸蛋白酶抑制剂)也表现出这种效果，同 时酸性蛋白酶抑制剂胃酶抑素A (Pepstatin A)和丝氨酸蛋白酶抑 制剂Pefabloc对于MO活化的凯莫瑞-介导的抑制不起作用(图IF )。 这些数据表明凯莫瑞以半胱氨酸蛋白酶依赖的方式对MO活化起 抑制作用。组织蛋白酶L抑制剂(Z-FF-FMK)、组织蛋白酶S抑制剂(Z-FL-COCHO)和钩蛋白酶I和II抑制剂、钙蛋白酶抑制剂 (calpeptin )被用于进一步探测凯莫瑞裂解中涉及的特异性半胱氨 酸蛋白酶(图1F)。发现凯莫瑞的抗炎作用依赖于钙蛋白酶和组织 蛋白酶S却独立于组织蛋白酶L。总之，结果首次表明经典地活化 的鼠MO能够通过母体分子的特异性半胱氨酸蛋白酶-介导的裂解 将凯莫瑞转化为M(D活化的有效的肽抑制剂，最可能包括钙蛋白酶 II牙口纟且织蛋白酶S。
具有抗炎活性的C-末端凯莫瑞肽
利用Ensembl中的序列比对功能设计一系列11-20aa肽作为重 要的保守残基的指示物(指征，indicator )并命名为Cllm( P144-A154; PHGYFLPGQFA Seq ID No: 1 ) 、 C13m ( P144-S156; PHGYFLPGQFAFS Seq ID No: 3 ) 、 C15m ( A140-A154; AGEDPHGYFLPGQFA S叫ID No: 4 )和C17m ( A140-S156; AGEDPHGYFLPGQFAFS Seq ID No: 6 ) 、 C19 ( A138-S156; AQAGEDPHGYFLPGQFAFS Seq ID No: 37)、 N19 ( E23画K41; ELSETQRRSLQVALEEFHK Seq ID No: 44)和M20 (K86-K105; KPECTIKPNGRRRKCLACIK S叫ID No: 45 )。图2A示出了对于这 些肽中的一些的序列比对。凯莫瑞肽(1 pM-100nM)在才艮才居所述 的试验方案的巨噬细胞活化试验中被表征。
鼠PM0在多种条件下被培养未处理的、LPS ( 100ng/ml)和 IFNy ( 20 ng/ml), 15小时；凯莫瑞肽(浓度为1 pM-100 nM )预处 理1 h,随后LPS/IFNy， 15小时。显示的浓度^表在两个实-验中对 于每一种肽的最佳有效剂量。图2B中的柱状图表示RANTES的平 均表达和TNFa蛋白士SEM。对于每个处理，实-验用一式三4分的测 定进行。示出了采用来自C57B16/J小鼠的不同组的细胞的五次独 立实-睑的代表性数据。相对于LPS/IFNY处理的样品。p<0.01**; p < 0.001 ***。C-末端肽C13m ( 100 pM )、 C15m ( 1 pM )和C17m ( 1 pM ) 抑制LPS/IFNy國i秀导的RANTES分泌(CI 3m-32%; C15m-41%; C17m-49%)和TNFa表达(C13m-10%; C15m-56%; C17m-66%, 图2B )。 C15m和C17m抑制巨噬细胞活化达到类似于在使用相同 浓度的C130时的程度。
表1中示出了类似的结果，其中C-末端肽C13和C19中度抑 制LPS/IFNy-豫导的RANTES和TNFa表达，最佳剂量为100 pM(表 1)。然而，Chemerin15 ( C15 )以与凯莫瑞具有类似的效能和潜能 (最佳剂量1 pM )保持了由蛋白水解的凯莫瑞示出的抗炎活性并抑 制细胞因子表达。此夕卜，Cll、 N-末端肽(N19)、中流肽(中段肽， midstream peptide) ( M20 )和只于照肽(舌L序的C15; C15-S , GLFHDQAGPPAGYEF; Seq ID No: 39，和突变型CI5; C15-M， AGEDPHGYALPGQAA; Seq ID No: 40 )在M<D活化试'验中缺乏抗 炎活性。还发现在通过凝固和纤维蛋白溶解级联的蛋白酶的前体凯 莫瑞(prochemerin )裂解期间去除的6 aa( RALRTK; Seq ID No: 41 ) 和8 aa ( FSRALRTK; S叫ID No: 42 )肽，分别称为C6和C8在M0> 活化试验中未检出抗炎活性。
表1
LPS/lFNy-谈导的炎性细胞因子表达的百分比抑制 细月* 如皇拔
:， 、C6 C8 Cll C13 C15 C15-S C15-M C19 N19 M20
因子 (Chemerm)
TNFa 70
RANTES 40
IL-1J3 60 IL-12 P40
IL-6 42
0 0 0 10 61 0 0 21 0 0
0 0 0 32 47 0 0 41 0 0
- - _ _ 54 - _ _ — 一
_ — — _ 47 - _ 一 _ _
_ _ _ _ 43 - _ _ _ _
参照表1,如图IB所述培养凯莫瑞-来源的肽的抗炎活性-鼠 PM。，并用LPS ( 100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml)激发(challenge ) 15h,使用/不用肽(0.1 pM-100nM)预处理lh。当肽表现出抗炎特性时，LPS/lFNy-诱导的巨噬细胞活化的百分比抑制代表用最佳剂量 的效果(1 pM凯莫瑞和C15或100 pM C13和C19)。肽序列为 Cll ( P144-A154 ; PHGYFLPGQFA ) 、 C13 ( P144-S156 ; PHGYFLPGQFAFS )、 C15 ( A140-A154; AGEDPHGYFLPGQFA )、 C19 (A138画S156; AQAGEDPHGYFLPGQFAFS; Seq ID: No. 37)、 N19 ( E23-K41; ELSETQRRSLQVALEEFHK Seq ID No: 44 )和M20
(K86画K105; KPECTIKPNGRRRKCLACIK S叫ID No. 45 )。对照 肽乱序的C15 (C15-S; GLFHDQAGPPAGYEF)和突变型C15
(C15画M; AGEDPHGYALPGQAA; F148A & F153A )。凄t据代表通 过ELISA和Luminex试—验测定的4-8次独立的实-验的由经典地活4匕 的巨噬细月包产生的细月包因子的平均百分比抑制。
Chemerin140，而不是其C-末端^f生的抗炎肽，是_有效的巨谨 细胞化学引诱物
改良的博j尹登室(Boyden-chamber )试—验用于展示C140的巨 噬细胞化学引诱物特性。观察到小鼠Chemerin140在10 nM时具有 最佳趋化性的典型钟形曲线，其后下降，推测接着会发生受体脱敏 或化学引诱物梯度的破坏(breakdown)(图3 )。这也在图4A中示 出，还有其他的数据表明百日咳毒素预处理(PTX: 200 ng/ml)的 作用。
PMe (0.5xl06)朝向改良的博伊登室底部的孔中的化学引诱物 (Chemerin140或凯莫瑞肽)迁移超过4h。将过滤器固定在4%甲 醛中，随后用DAPI对迁移的细胞核实施染色并<吏其可#见化。无血 清培养基(SFM)用作阴性对照，巨噬细胞化学引诱物RANTES(25 ng/ml; 3 nM )用作阳性对照。图表示出了对于每个处理组(n = 5-6 ) 的平均迁移指数(化学引诱物％阈值区/SFM。/。阈值区)士SEM。 对于SFM处理的孑L， p < 0.001 ***; p < 0.01 ** ; p < 0.05 *。
30与C140( 1 pM-50nM)或阳性对照CC趋化因子RANTES( 25 ng/ml; 3nM)相比，7见察到Cllm、 C13m和C15m ( 1 pM-lOO nM ) 具有4艮小的趋化活性。在100pMC15m以及10nMC13m和Cllm 处观察到最大的巨噬细胞迁移。然而，C17m在所有的测试浓度都 没有表现出趋化活性(0.1 pM-500nM;n = 5独立的实验；(图3)。 结果还在图4B-图4D中示出，还有其他的凄t据示出了百日咳毒素 预处理(PTX: 200 ng/ml)的作用。参照图4E， C19在所有的测试 浓度也都没有表现出趋化活性(0.1 pM-500 nM;图4E )。因此，已 经确定衍生自凯莫瑞的肽保留了抗炎活性但却不表现出对M①的趋 化活性，这表明存在能够被治疗性开发的凯莫瑞的不同的功能-特异 性成分。人们发现4汙生自前体凯莫瑞(prochemerin )的肽，C6和 C8,缺乏MO抗炎活性，在所有的测试浓度也均不能诱导M①迁 移(0.1 pM-500nM;图4F-G )。因此，数据似乎表明主要的趋化物 质是裂解的凯莫瑞分子本身，或还没有鉴别出的肽。
表明凯莫瑞和chemerin15诱导由巨噬细胞的化学引诱物产生 的嗜HE4抑制的其他实施例
考虑到M O -来源的化学引诱物在炎症期间的免疫细胞募集中 的既定作用(Glabinski， A. R.， " W. ， (1998) .Neuroimmunomodulation 5:166-171; Huang, D. J. W a/., (2001) ,M^/. 193:713-726 )，条 件培养基4吏用来自趋化性试-睑中的未处理的M①和由凯莫瑞 +LPS/IFNy、 C15+LPS/IFNy处理和4叉由LPS/IFNy处理的M0>，以 评估通过凯莫瑞和合成的C-末端肽对M<D活性的抑制程度，C15 会进一步影响M0>募集(参见图4H )。未处理的M①-条件培养基本 身并不表现出对于M①的趋化活性(迁移指凄t 1.0 ±0.15);然而， LPS/IFN^处理的巨噬细胞培养基诱导M0>趋化性的显著提高(迁 移指数9.3士0.4;图4H)。此夕卜，MO表现出/人凯莫瑞+LPS/IFNy和 C15+LPS/IFNY-处理的巨噬细胞朝向条件培养基的趋化性分别降低 49%和55% (图4H )。这表明凯莫瑞和C15 i秀导M①-来源的MO化学引诱物的大范围的普遍抑制以达到影响条件培养基的趋化活性 的程度。
进一步的第二趋化性试验显示出受到抑制的朝向来自
Chemerinl40-小鼠、Chemerinl5-小鼠和Chemerinl7-小鼠-处理的巨 噬细胞的上清的巨噬细胞趋化性。这些结果表明用C15m和C17m
或生物活性降〗氐，因此这些肽可以显著地减少向炎症部位的持续的 单核细胞/巨噬细胞募集。
在第二趋化性试一险中使用来自用C140 + LPS/IFNy、 C15m + LPS/IFNy、 C17m + LPS/IFNy和Y又用LPS/IFNy处理的巨噬细月包的 条件培养基以评估与通过C140及其C-末端肽的巨噬细胞活化的抑 制对目关的潜在的病J里生理反应(repercussions )。
使细胞(0.5xl06)朝向改良的博伊登室的底部孔中的化学引诱 物(凯莫瑞肽)或条件培养基迁移超过4小时。无血清培养基(SFM) 用作阴性对照。将过滤器固定在4%甲醛中，随后用DAPI将细胞 核染色并使其可视化。柱状图表明对于每个处理组的平均迁移指数 (化学引诱物o/o阔值区/SFMo/o阈值区)土SEM。每个柱代表至少三 个孑L，每个处5里取6巾l)图。除非另夕卜才旨明，p< 0.001 ***; p<0.01 ** 显著性是相对于LPS/IFNy条件培养基。AB是指抗-鼠凯莫瑞抗体。
从图5中表示的结果可以看出，巨噬细胞-条件培养基本身并不 表现出对于巨噬细月包的趋化活性，然而，LPS/IFNy-处理的巨噬细月包 培养基诱导巨噬细胞趋化性的显著提高。此外，巨噬细胞表现出朝 向来自C140+LPS/IFNy、 C15m+LPS/IFNy和C17m+LPS/IFNY國处理 的巨噬细胞的条件培养基的趋化性降低，表明C140、C15m和C17m 诱导巨噬细胞化学引诱 的大范围普遍抑制的能力。为了排除凯莫瑞-处理的上清液包含凯莫瑞-衍生的趋化蛋白/ 肽的可能性，在评估巨噬的细胞迁移之前将上清液与中和凯莫瑞抗 体一起孵育。凯莫瑞没有表现有助于在凯莫瑞-处理的上清液中的迁移。
Chemerinl5-小鼠抑制酵母^t3秀导的^M炎
腹膜炎可以通过引起急性炎性反应的酵母聚糖颗粒(酵母细胞 壁成分)的腹膜内注射而被诱导。酵母聚糖-诱导的腹膜炎遵循小鼠 腹膜腔中中性白细胞然后是单核细胞的已知的时间依赖性聚集(综 述参见 Lawrence T e/1 a/. Nat Rev Immunol. 2002 年 10 月；2(10) :787-795 )。这个模型已经被用于证明确定的介质(mediator ) 月旨氧素A4 (Lipoxin A4)和膜联蛋白-l的前-溶解(pro-resolving ) 特性，该特性通常伴随着较早的组织结构和功能的恢复以及中性白 细胞和单核细胞的渗出的抑制而缩短炎症的时程。文献中才艮道的先 前的实验使用了一定剂量范围的酵母聚糖A颗粒(10昭-l mg) (Taylor PR " a/. Eur J Immunol. 2005年7月；35(7) :2163-2174; Arita Ma/. J. Biol. Chem. 2006年8月11日；281(32) :22847-22854 )。
考虑到凯莫瑞的高趋化潜能和对于蛋白水解的固有需求，使用 C-末端合成肽chemerin15对无菌腹力莫炎才莫型中的抗炎作用进行体 内表征，这是因为C15在很大程度上缺乏趋化活性(图3和图4B ), 而且还起到相当于蛋白水解的凯莫瑞的抗炎作用(表1 )。
参照图6中示出的结果，这一研究4吏用10 pg/小鼠(每个定居 巨嗟细胞1-2个颗粒)，因为这被认为更接近地代表病理生理剂量。
更具体地，雄性C57B16/J小鼠(8-12周)被腹膜内注射0.5 ml PBS或0.5 ml Chemerinl5國小鼠(0.32 ng/kg ),接着在1小时后注射 0.5mlPBS或酵母聚糖(2xl(^个颗粒/腔)。4小时后，将动物处死， 用5ml PBS-3 mM EDTA冲洗腹膜腔。利用台盼蓝4非除测i式获4寻总细胞计数。为了测定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬细胞)，用
2.4G2抗-FcgRII/III mAB对细月包阻断(block) 5分钟并用PE-共專厄 的抗-小鼠Ly-6G和FITC-共扼的抗-小鼠7/4 mAB染色10分钟。在 用CellQuest软件进行FACS分析前将细胞固定在1%曱搭中。在两 个群的周围构建门(gate),这两个群为中性白细胞(N; 7/4*, Ly-6G 高)和炎性单核细月包(Mo; 7/4*)。 C15是指Chemerinl5-小鼠。相 只于于酵母聚4唐-处理，Z是指酵母聚4唐，p<0.01** ; p<0.05*。
中性白细胞(7/4高，Ly-6G * )、单核细胞(7/4高，Ly-6G低)和 定居巨嗟细胞群(7/4低，Ly-6G低)才艮据Gordon S and Taylor PR Nat Rev Immunol. 2005;5(12) :953; Taylor PR " a/. Eur J Immunol. 2003 年8月；33(8) :2090-2097;和Taylor PR d a/. Eur J Immunol. 2005年 7月；35(7) :2163-2174来确定。
这一研究结果表明用0.32 ng/kg (8 pg/小鼠)剂量的C15m处 理的小鼠表现出酵母聚糖-引发的单核细胞和中性白细胞募集分别 降低42%和52% (图6 )。在用C 15m处理的小鼠中TNFa的水平 也降低。
上述结果纟皮进一步研究。为了确定C15肽在体内的抗炎特性， 持续超过48小时进行时程实验。通过FACS分析根据公开的试验 方案(Taylor, P. R. " a/. ， ( 2005 J/附画wo/ 35:2163-2174; Taylor, P.R.,(2003).￡wr J/wmimo/ 33:2090-2097 )来确定腹月莫灌洗液中的中 性白细月包(7/4高，Ly-6G*)和单核细胞(7/4*， Ly画6G低)群。酵 母聚糖给予到小鼠腹膜腔内产生炎性细胞外渗入腹膜腔中的时间 依赖，其遵循急性炎性应答的典型特征(图7A-图B,实线)。中性 白细胞是渗透至腔内的第一白细胞，可在给予酵母聚糖后2小时检 测到，白细月包在4小时达到峰^直(1.95xl06个细月包)。单核细月包流入 发炎的腹膜腔在4小时后可首次检测到(0.69><106个细胞)，在注射 酵母聚糖后24小时达到峰值(1.25xl()S个细胞)，其后下降。在酵
34母聚4唐激发前1小时用8pg/小鼠(-0.32ng/kg)剂量的C15预处理， 使得中性白细胞提前到2小时达到峰值，约为酵母聚糖激发的小鼠 的峰^直大小的50% (,人1.25xl0"条到0.62><106个细月包；图7A，点 线)。可在2小时(50% )、 4小时(66% )和4小时(50% )观察到 C15对中性白细胞浸润的显著抑制。8 pg的单一剂量的C15肽在减 少所有时间点的发炎的腔中的腹膜单核细胞的数量方面也是有效 的，在4小时(63°/。)、 8小时(61%)、和48小时(64%;图7B, 点线)可观察到超过60%的抑制。单核细胞浸润比率在酵母聚糖注 射后2-4小时最高(0.51xl06/h), C15的给予降低了流入发炎的腔 中的比率(0.18xl06/h)。因此，酵母聚糖-激发前的单一剂量的C15 肽提供了针对酵母聚糖-诱导的腹膜炎症的显著保护，超过实验的 48小时的持续时间。
时程实-验鉴定酵母聚糖后4小时时间点为C15的抗炎活性生效 的合适的时间点。在该研究中，单一剂量的C15产生酵母聚糖-引 发的中性白细胞和单核细胞募集的剂量依赖性的下降，该募集在8 pg/小鼠C15 (-0.32ng/kg;图7C-图7E和图16A-图16B )时最大。 当C15在酵母聚糖-激发前1小时被给予时，中性白细胞数量从 1.9x106减少到0.78xio6 (减少63%;图7C )，单核细胞水平从 0.69><106减少到0.30x106 (减少62%;图7D,图7E中示出了4戈表 性的在4小时时间点的FACS图)。给予C15还显著地减少了在4h 时腹膜灌洗液中前-炎性细胞因子的表达，包括TNFa(5"/。)、 L-l卩 (67%)、 IL-6 (67%)、 MCP-1 (59%)、和KC (38%;图7F )。还 发现在以与C15的相同剂量和时间体内给予时，缺乏体外抗炎活性 的对照肽C15-S和C15-M (表1 )不是保护性的，这是通过单核细 胞和中性白细胞水平来判断的(图7C-图7D)。当在酵母聚糖注射 后2小时给予相同剂量的C15时，给予酵母聚糖后4小时仍然可观 察至U单牙亥i田月包(0.69x 106至'J 0.42x 106个纟田月包；)咸少、420/0 )牙口中斗生白 细胞募集(1.9xl()6到0.83xl()6个细胞；减少60%)的显著抑制(图7G)。这表明C15能够在已经建立的炎性情况(setting)下减少中 性白细胞和单核细胞募集，并提供了 C15/C15-衍生物可以代表靶向 炎性病状的引人注目的药效团的另 一指征。
内源性凯莫瑞物质的阻断^J^炎症恶化
通过在酵母聚糖激发前4小时或24小时对小鼠i.p注射中和单 克隆抗-rmChemerin抗体(ChAb )或对照IgG 1 h来研究凯莫瑞和 凯莫瑞-衍生的肽的潜在内在作用。先前发现ChAb能够体外抑制 C15和凯莫瑞-i秀导的M(D趋化性和抗炎作用，而对照IgG不具备 该作用(图8A-图8B)。在体内，发现相对于对照IgG-处理的小鼠， 内源性凯莫瑞物质的中和导致在4小时时间点腹膜中性白细胞的数 量增加63%而单核细胞水平提高45%,以及在酵母聚糖注射后24 小时腹膜中性白细胞和单核细胞的水平提高170%和86% (图8C-图8D)。在24小时内腹膜炎症的加重表明凯莫瑞物质在体内重要 的内源性4元炎作用。
^SU吏用Chemerinl5-小鼠不i秀导中'性白细胞或巨嗟细胞募集但 是降低TNFa水平
雄性C57B16/J小鼠(8-12周)经腹膜内注射0.5 ml PBS或0.5 mlChemerinl5-小鼠l (0.32ng/kg)。 4小时后，^!寻每个处J里纟且的三只 动物处死，用5ml PBS-3 mM EDTA沖洗腹膜腔。利用台盼蓝排除 试验获得总细胞计数。为了确定细胞组成(中性白细胞与单核吞噬 细月包)，用2.4G2抗-FcgRII/III mAB将细月包阻断(block) 5分钟并 用PE-共轭的抗-小鼠Ly-6G和FITC-共轭的抗-小鼠7/4 mAB染色 10分钟。在用CellQuest软件进行FACS分析前将细胞固定在1%曱 醛中。在两个群周围构建门(gate),这两个群为中性白细胞(N;7/4 高，Ly画6G高)和炎性单核细胞(Mo; 7/4高，Ly國6G低)。C15是指 Chemerinl5-小鼠。相对于PBS-处理，p < 0.01 **。 Ns是指没有统 计学上的显著差异p > 0.05。从图9中的结果可以看出，0.32 ng/kg的C15m不会造成单才亥 细胞或中性白细胞迁移。然而，观察到TNFa的显著减少。
研究小鼠无菌腹膜炎的这个模型广泛用于实验医学和药理学， 代表由中度组织创伤或感染造成的轻孩i炎症。所述结果显示C15m 能过实现治疗性抗炎作用。
H^冲的Chemerinl3-人类4中制鼠巨逸细胞中Rantes和TNFa 转录物的表达
在各种条件下培养鼠腹膜巨噬细胞(PM0):未处理的、LPS (100 ng/ml)和IFNy (20 ng/ml), 15小时，{奮饰的Chemerinl3-人类(1 nM)预处理1小时，随后LPS/IFNy 15小时。柱状图显示 由qRT-PCR确定的并祐:才示准4匕为管家基因(看家基因， housekeeper),次黄噤呤磷酸核糖转移酶(HPRT )的细胞因子转录 物的平均表达。对于每个处理，实验以一式三份的测定进行，n=l 独立的实验。对于LPS/IFNY-t处理的样品，除非另外指出，p<0.01 ** ; p < 0.05 * 。 <奮饰的 C13h 肽的序歹'j 为 NH2-FHSFYFPGQFAFS-COOH ( Seq ID No: 43)國在这个序列中， C13h中的N末端P被氨基酸F取代，该肽因此被称为修饰的C13h。
乂人图10中的结果可以看出，》务饰的C13h <吏TNFa和RANTES 的表达显著减少。
Chemerin 17-小鼠不影响C140 i秀导的巨虔细^^4匕'性
在用BioGEL J朱刺激腹月莫4天后，募集PMe。用5 ml PBS-2 mM EDTA灌洗雄性C57B16/J小鼠的腹膜腔。细胞经离心并重悬浮在补 充有0.5% BSA和25 mM Hepes的RPMI中。4吏细月包(0.5x106 )朝 向底部孔中的化学引"i秀物(C140、 C17m或C17m+C140)迁移超过 4小时。将过滤器固定在4%甲醛中，随后用DAPI对细胞核进行染色并4吏其可3见化。无血清;咅养基用作阴性对照(-/-)。细月包在趋4匕
性试-验前与百日咳毒素(PTX) —起预孵育30分钟。图11中的柱 状图示出了每个处理组的平均迁移指凄t士SEM。每个4主代表至少三 个孔并且每个处理至少取3幅图。除非另外指出，对于SFM处理 的孑L， p< 0.001***; p<0.01**; p<0.05*。
图11中的结果表明C17m与C140的共同给予不显示影响巨噬 细月包向C140迁移。
Chemerinl5-小鼠和Chemerinl7-小鼠抑制通过用酵母聚糖刺 激鼠巨逸细胞的TNFa分泌
在多种条件下培养PM0:未处理的；酵母聚辟唐15h;凯莫瑞(1 pM)预处理1小时+酵母聚糖15小时。柱状图显示通过ELISA士SEM 测定的TNFa的平均表达。对于每个处理，实验用一式三^f分的测定 进行。图12中示出了采用来自不同供体细胞的三次独立实验的代 表性凄t据。对于酵母聚糖-处理的样品，p<0.001***; p<0.01**。 Dexa是指地塞米松(1 mM )， nd是指低于检测下限(0.25 ng/ml )。
可以看出，用C15m (1 pM)和C17m ( 1 pM )处理可抑制酵 母聚糖-诱导的TNF表达(C15m; 21%， C17m; 30% )。因此，C15m 和C17m抑制由细菌(LPS )和酵母(酵母聚糖A )诱导的巨噬细 胞活化。
棋盘(Checkerboard ) ^^f斤表明Chemerin140和Chemerinl5誦
小鼠资导巨噬细J!fe^化性而非化学运动性
棋盘分析允许区分趋化性和化学运动性。趋4b性是通过在專交4氐 的孔中向较高浓度的化学引诱物迁移而示出的。化学运动性是指无 方向性细胞运动增加，并且其发生与存在的浓度梯度无关。棋盘分
析是这才羊进4亍的将细月包与C140 ( 10-500 pM)或C15m ( 10-1000
38pM) —起预孵育，并使它们在较低的孔中分别朝向C140 ( 10-1000 pM)或C15m ( 10-1000 pM)迁移以形成;农度的才其盘。
更具体地，在用BioGEL珠刺激腹膜4天后募集PM0。用5 ml PBS-2 mM EDTA灌洗雄性C57B16/J小鼠的腹膜腔。细胞经离心并 重悬浮在补充有C57B16/J的RPMI中。在趋4匕性试-验前将细月包
(0.5x106 )与C140或C15m —起孵育30分钟，随后使其在底部孔 中朝向化学引诱物迁移超过4小时。将过滤器固定在4%曱醛中， 随后用DAPI对细胞核进行染色并使其可视化。无血清培养基
(SFM)用作阴性对照(-/-), CC趋化因子RANTES用作阳性对 照(25 ng/ml)。图13中的柱状图示出了对于每个处理组的平均迁 移指数士SEM。每个柱代表至少三个孔并且每个处理至少取3幅图。 ^目只于于SFM-处玉里的孑L， p< 0.001 ***。
已经发现C140和C15m在迁移入博伊登室的下部孔时引发真 正的趋化性而不是化学活动性，这种迁移仅在其中具有较高浓度的 化学引诱物时发生，而在过滤器的上侧具有较高浓度的化学引诱物 时则不发生。
C15m被显示为比C140弱得多的巨噬细胞趋化性的31诱物。 C15 i秀导酵母彩瞎的巨噬细^^喧作用
为了通过巨噬细胞在体外识別酵母聚津唐，通过用PBS中的水冷 2 mM EDTA灌洗从在用Biogel珠(2%w/v )处理前4天已经腹膜 内处理的小鼠分离出腹膜渗出物细胞。以2.5xl()S个细胞/孔的密度 将巨噬细月包平4甫在Optimen J告养基中的24孔4反中。在O.lpM、 1 pM、 10 pM、 100pM或lnM Chemerin15的存在下，在识别试-验中，细 胞在加入添加有异石克氰酸荧光素(FITC )-标记的酵母聚糖 (Invitrogen)之前用培养基冲洗细月包三次，巨嗜细月包/颗冲立比率为 10:1。载体=没有Chemerin15的对照样品。FITC-酵母聚糖摄取之后进行FACS分析，FITC-酵母聚糖摄取被表达为相对识别指数，即， 摄取酵母聚糖的。/。细胞的比率xC15处理的巨p筮细胞的几何平均数/ 用载体处理的巨嗟细月包的几4可平均#:的比。
图15中示出的结果表明，Chemerin15诱导酵母聚糖的巨噬细 胞吞噬。巨嗟细胞吞谨作用的诱导在Chemerin15浓度为10 pM时 最大。这些结果表明凯莫瑞肽可以通过增加巨噬细月包对凋亡细胞 (apoptotic cell )、细月包石卒片、病原体和病原体产物的吞p笪而力口速伤 口修复。
讨论
多种介质协同急性炎症的初始事件是已知的。例如，脂质-来源 的类花生酸(eicosanoids )、细胞因子和趋化因子调节血管变化和炎 性细胞募集。前-炎性细胞因子，包括TNFa和IL-lY活化内皮细胞 中的信号传递途径，导致粘附分子表达的上调，促进循环白细胞的 捕获。上文指出的结果显示书f生自Chemerin140的C-末端肽能够抑 制炎性应答的所有成分。结果还显示杏t生自Chemerin140的C-末端 肽能够降低趋化因子水平并能够用作用于内毒素^^克的治疗剂。
在该研究中4吏用的所有肽均为凯莫瑞-4汙生的，并显示出难以置 信的高效能(1(T12M)，这种高效能确保这些介质加入到补体-来源 的化学吸引素、C5ades-arg ( l(r12M)、曱酰-曱二磺酰基-亮氨酰-苯 丙氨酸(fMLP; IO-UM)、白三烯B4(LTB4; 1(T"M)、 TNFa( lO^M )、 LPS ( 1(T15M )和IL-1 ( 1(T14M )的行列中。申请人知道还没有药物 制剂被证明在10-UM-10-"M表现出药理作用。实际上，地塞米松通 常以微摩尔范围的浓度体外给予，并且在酵母聚糖-诱导的腹膜炎模 型中在30 鼠(1.2 mg/kg )处实现单核细月包和中性白细胞流入
的50%下调。Chemerinl5-小鼠将单核细胞和中性白细胞的募集下调到与30吗地塞米松类似的程度。在该鼠炎症才莫型中，Chemerinl5-小鼠以仅8 pg/小鼠(0.32 ng/kg )的剂量就能产生相当的抗炎作用。
第二趋化性试验使得来自巨噬细胞活化试验的上清液的趋化 潜能被定量化，并确定了凯莫瑞-介导的趋化因子抑制对介质趋化特 性的影响。这些结果的分析揭示了与单独的LPS/IFNy相比，巨噬 细胞向来自凯莫瑞+LPS/IFNy-处理的巨谨细胞的上清液的迁移下 降，这表明了巨噬细胞化学引诱物的大范围普遍抑制。给出的实施 例表明，与C140相比，凯莫瑞-来源的抗炎肽的化学引诱物特性是 有限的或不具备化学？ 1诱物特性。
总之，结果显示凯莫瑞的C-末端肽在体外和体内均表现出非常 强的抗炎性能。
材料和方法 动物
所有的动物研究都得到了地方伦理认可并按照英国内政部规 则(动净勿、;套， 一牛学牙呈序y去案(Guidance on the Operation of Animals, Scientific Procedures Act) ,1986)进行。
抗体和试剂
4元人01莫瑞、4元鼠Chemerin AB、hChemerin 137(序歹'J ID no: 31, 可以作为重组体011121- Serl57乂人RandD获4寻)、mChemerin 140 (Seq ID no: 34) 、 4元-mRANTES Capture AB 、 4元-mRANTES Detection AB 、 mRANTES 、 mTNFa、抗-mTNFa Capture AB 、抗扁mTNFa Detection AB均购自R&DSystems。 g几莫瑞肽(ClIm、 C13m、 C13h、 C15m、 C17m)通过生物合成净皮合成(www.biosyn.com)。；也塞米木>、月旨多 糖(大肠杆菌(E.coli))、亮抑酶肽从Sigma Aldrich获得。干扰素 Y (IFNy)购自Peprotech。 OPD片乂人Dakocytomata获4f ，凌元生蛋白链菌素(Streptavidin ) -HRP和Str印Av-HRP稀释緩冲剂购自 Endogen。 Luminex 6隱plex^式剂盒(IL-12 p40， IL-ip， IL一6， MCP隱l, TNFa, IL-IO )由Bio-rad提供，并利用Bio-rad分冲斤4义和X软件分析。
巨噬细胞活化的抑制-巨噬细胞活化试验
将无菌石粦酸盐-緩沖盐水(PBS )中的1 ml 2% BioGEL聚丙烯 酰胺i朱腹膜内注射(ip )入C57B1/6J小鼠。ip BioGEL主合予后四天， 才艮才居英国内iE文部准则通过C02方法处死小鼠。用10ml无菌PBS-2 mMEDTA冲洗腹膜腔以获得BioGEL-引起/引发的细胞渗透物。获 得的细胞的悬浮液在4。C在1000xg离心5分钟。弃上清，将细胞 沉淀重悬浮在补充有2 mM谷氨酰胺、50单位/ml青霉素和50 pg/ml 链霉素的6mls OptiMEM ;咅养基中。巨噬细l包在冰上与特克(Turk's ) 溶液一起孵育5-10分钟后利用血球细胞计数器定量化。将细胞悬浮 液(2mls; 1.5><106/孔)平铺在六孔组织培养板(直径为35 mm: Costar， UK)中，并使其在37。C在包含5%C02的湿润气氛中附着 2小时以通过附着来分离巨噬细胞群。通过细胞离心涂片 (cytospinning )、用亚甲蓝和曙红对细胞进行染色并基于细胞形态 学计数，这得到了大于95%的纯度。未粘附的细胞(主要为粒细胞) 被丟弃，孔用无菌PBS冲洗三次以去除^^散附着的细胞或死细胞。 为了评估巨噬细胞活化的潜在抑制和由此带来的前-炎性介质的表 达减少，^l务巨p藍细月包(1.5xl()6细月包/孑L)与凯莫瑞月大(Cllm，C13m, C15m, C17m; 1(T12-10-8M)或阳性对照(地塞米+>; 1 |iM ) —起预 《浮育1小时，卩逭后用LPS ( 100 ng/ml)和IFNy ( 20 ng/ml) S敫发15 小时。为了确定其对PTX的敏感性和对蛋白水解的依赖性，将细胞 与PTX (200ng/ml)或亮抑酶肽(15吗/ml) —起预孵育。其他的 细胞仅用肽处理。收集上清液，储存在-20。C以用于酶联免疫吸附 试马全(ELISA )和Luminex实-睑。将细月包裂解以通过TRIZOL方法提取总RNA。将裂解物储存在-80。C,按照制造商的指导手册 (Qiagen， RNeasy Mini Prep Kit)来提取RNA。
通过ELISAs和Luminex检领'J分泌、的蛋白
通过ELISA评估细月包上清液中RANTES、肺瘤坏死因子 (TNFa)和CCL9的;农度。通过Luminex ;危式《效J朱法(Luminex multiplex bead assay) ( Bio-rad 6 多孩史主朱阵歹l)法(Bio-rad 6 plex assay))确定IL-12p40、 IL國IO、 IL-1|3、 TNFa、 MCP-1 (单冲亥纟田月包 化学引谈物蛋白-1 )和IL-6水平。ELISA的检测下限为0.1-0.5 ng/ml， Luminex法的4全测下限为10-50 pg/ml。
RNA制备和RT-PCR
利用Qiagen RNeasy试剂盒才是取总RNA,利用Sybr-Green方法 使其^皮反转录并经受qRT-PCR。利用2-AACT方法分析数据(Livak, KJ. & Schmittgen T. D. (2001) , Me/Zzc^ 25:402-408 )。
通过利用透孔膜(ChemoTX， 6-mm直径，8卞m孔径)来评估细 胞迁移。简言之，收集BioGEL-引发的细胞并将其置于补充有25 mM Hepes和0.1%牛血清白蛋白的RPMI中的透孑L膜上(250000个细月包 /膜)。 -使细月包朝向凯莫瑞肽(lpM-100nM)迁移4小时。通过在 将细胞置于透孔膜上之前30分钟将细胞与百日咳毒素(PTX， 200ng/ml, Sigma- Aldrich ) —起予贞孵育30分4中来阻断经由G蛋白4禺 联受体的信号转导。在膜的下侧迁移的细胞被固定(3%甲醛)并用 DAPI染色。迁移^皮定量为共焦显獨H竟下DAPI染色的细月包冲亥中的 像素数(2幅照片/膜，每个处玉里至少3个平4亍的孑L )。利用Metamorph Offline软件分析图像以确定被迁移的细胞占据的百分比阈值区域 (TA)。通过划分处理TA无血清培养基TA获得迁移指示物(migration indices )。对于第二趋化性试-睑，以50000个细胞/膜嫂_ 用ChemoTx 3-mm直径，8卞m孑L月莫。
鼠,炎
C57BL6/J小鼠在i.p.给予500nl 10昭酵母聚糖A前1小时i.p. 主会予500nl Chemerinl5-小鼠(0.32 ng/kg )或仅主会予载体(无菌PBS )。 4小时后将其人道处死后，通过用5 ml无菌PBS-3mM EDTA进行 腹腔灌洗来收集腹膜渗出物。获得无细胞灌洗液以用于ELISA,制 备'渗出物细月包以用于下述分才斤。
差别白细胞计数和FACS ^^斤
C57BL6/J小鼠在i.p.给予500 jal 10吗酵母聚糖A前1小时i.p. 纟会予500 pi Chemerin15 ( 0.32 ng/kg )或载体(PBS )。 2小时、4小 时、8小时、16小时、24小时和48小时后，将其人道处死。制备 灌洗细胞的等分试样以用于总的和差别的白细胞计数测定。为了确 定细月包纟且成(PMN与单4亥细月包)，用4元-小鼠2.42G FcnII/III (0.5 pg/0.1x106个细月包)阻断细月包10分钟，并用FITC-共扼的抗-小鼠 7/4和PE-共轭的抗-小鼠Ly-6G( 0.5 jug/0.5x106个细胞；克隆rmC5-3 和RB6-8C5,分別来自BD Pharmingen )染色(10分钟)。在 FACSCalibur流式细胞仪上用CellQuest软件对细胞进行分析。对于 每个样品，最少获得10,000个事件。在三个群周围构建门，这三个 群是中性白细胞(7/4高，Ly-6G * )、单核细胞(7M高，Ly_6G低)和定 居巨噬细胞(7/4、 Ly-6Gte)。测量每个群中的总事件百分比。此 外，J]文集无细月包灌;先液以用于ELISA和Luminex i式马全。
统计
利用GraphPad Prism软件进行学生氏t 4全验和一元ANOVA。
权利要求
1.衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物在制备用于治疗炎症的药物中的应用。
2. 书f生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似 物或^f汙生物在制备用于治疗内毒素^f木克的药物中的应用。
3. 书于生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似 物或衍生物在制备用于降低一种或多种炎性介质水平的药物 中的应用。
4. 一种治疗、预防或改善受试者体内的炎症的方法，包括^会予所 述受试者一种或多种4汙生自凯莫瑞蛋白的C-末端的^^、或它 们的类々乂4勿或书f生物。
5. —种治疗、预防或改善受试者体内的内毒素4木克的方法，包括 给予所述受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的 肽、或它们的类似物或书f生物。
6. —种降^f氐受试者体内的一种或多种炎性介质的水平的方法，包 括给予所述受试者一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的 肽、或它们的类4以物或书于生物。
7. 根据权利要求3所述的应用或权利要求6所述的方法，其中， 所述一种或多种炎性介质选自包4舌TNFou IL-la、 IL-1(3、 IL-6、 IL画12、 G-CSF、 MCP-2 ( CCL8 )、 GROa ( CXCL1 )、 GRO|3(CXCL2 )、 IL-8( CXCL8 )、 TECK( CCL25 )、 MCP-1 ( CCL2 )、 干4尤素y和Rantes ( CCL5 )的组。
8. 衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似 物或4汙生物在制备用于处理伤口的药物中的应用。
9. 一种治疗、预防或改善受试者的伤口的方法，包括给予所述受 试者一种或多种书于生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的 类4以物或书1"生物。
10. 根据权利要求l、 2、 3、 7或8所述的应用，其中，所迷药物 用于治疗和/或预防和/或美容应用，或者根据权利要求4、 5、 6、 7或8所述的方法，其中，所述治疗/处理为治疗性的和/ 或预防性的和/或美容用的。
11. 才艮据前述^又利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽 在约5到约30个氨基酸之间。
12. 才艮据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽 包含衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的约5到约30个氨基酸，或 它们的类似、物或书f生物。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述衍 生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽与所述凯莫瑞蛋白的天然存在 的C-末端具有至少30%或更高的同一性。
14. 才艮据前述斥又利要求中4壬一项所述的应用或方法，其中，所述肽 与才艮才居Seq ID no: 31 (人类序歹'j )和Seq ID no: 34 (小鼠序歹'J ) 的凯莫瑞蛋白的最后5个至最后30个氨基酸具有至少30%的 序列同一性。
15. 4艮据前述4又利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述类所述抗炎活性、和/或所述抗内毒素<木克活性、和/或所述炎性 介质水平降低活性。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中，所述肽 中的一种或多种具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29和30的序歹'J或者为它力']的类合乂4勿或 书亍生物；或根据前述权利要求中任一项所述的应用或方法，其中， 所述肽中的一种或多种具有Seq ID No: 37和38的序列或者 为它们的类4以物或书f生物。
17. 才艮l居4又利要求16所述的应用或方法，其中，所述肽与SeqID No: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 ,16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30中的一种或多种肽具有至少30%的序列同一'l"生；或才艮据4又利要求16所述的应用或方法，其中，所述肽与S叫 ID No: 37或38中的一种或多种肽具有至少30%的序列同一 性。
18. 根据权利要求1至15中任一项所述的应用或方法，其中，所 迷肽类似物或衍生物包含衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽的 小分子模拟物。
19. 才艮据前述4又利要求中4壬一项所述的应用或方法，其中，所述肽、 或它们的类似物或书f生物，旨在以约10pg/kg到约Img/kg的剂量给药。
20. 根据权利要求19所述的应用或方法，其中，所述肽、或它们 的类似物或书f生物，旨在以约10 pg/kg到约100 ng/kg的剂量给药。
21. 用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类 似物或书f生物浸渍的医学装置。
22. 用一种或多种衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽、或它们的类 似物或书f生物浸渍的伤口敷冲牛或绷带。
23. —种药物组合物，包含一种或多种选自包括具有SeqIDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 的用稀释剂、载体或赋形剂；或一种药物组合物，包含一种或多种选自包括具有Seq ID No: 37和38的序列的肽及它们的类似物或书1"生物组成的组中 的肽、以及药用的《希释剂、载体或l武形剂。
24. 根据权利要求23所述的组合物在炎症的治疗和/或预防、和/ 或内毒素休克的治疗和/或预防、和/或用于降低一种或多种炎 性介质的水平中的应用。
25. 根据权利要求23所述的组合物在处理伤口中的应用。
26. 具有S叫IDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 或30的序列的肽或它们的类如乂物或书f生物；或者 具有序歹'J SeqIDNo: 37或38的肽或它们的类似物或书亍生物。
27. —种肽，与具有S叫IDNo: 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30的序列的肽具有至少50%的序列同 一性；或一种肽，与具有SeqIDNo: 37或38的序列的肽具有至 少50%的序列同一寸生。
28. —种或多种书于生自凯莫瑞蛋白的C-末端的肽，或它们的类似 物或衍生物，在炎症的治疗和/或预防、和/或内毒素休克的治 疗和/或预防、和/或用于降^f氐一种或多种炎性介质如细月包因子 和趋化因子的水平；或用于伤口的处理中的应用。
全文摘要
本发明提供了衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物用于治疗受试者体内炎症和/或内毒素休克和/或处理受试者体内伤口和/或降低受试者体内炎性趋化因子水平的应用，以及衍生自凯莫瑞蛋白的C-末端的一种或多种肽，或它们的类似物或衍生物用于炎症和/或内毒素休克的治疗，和/或伤口处理，或用于降低炎性介质的水平的应用。
文档编号A61K38/04GK101641114SQ200880009305
公开日2010年2月3日 申请日期2008年3月25日 优先权日2007年3月22日
发明者安德烈亚斯·鲁斯, 戴维·R·格里夫斯, 詹纳·L·卡什 申请人:Isis创新有限公司