专利名称：蛋白质的聚电解质沉淀和纯化的制作方法
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此依据37CFR§1.53(b)提交的非临时申请依据35USC§119(e)要求2007年1月22日提交的美国临时申请流水号60/886068和2007年12月13日提交的美国临时申请流水号61/013446的权益，通过述及完整收入。
发明领域 本发明涉及纯化蛋白质的方法。
背景技术：
大规模的、经济的蛋白质纯化日益成为生物技术产业的重要问题。一般而言，通过细胞培养来生产蛋白质，使用通过插入含有感兴趣蛋白质的基因的重组质粒而改造成生成该蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系。由于所使用的细胞系是活的有机体，因此必须给它们进料含有糖、氨基酸、和生长因子(通常自动物血清的制备物来供应)的复合生长培养基。将期望的蛋白质与进料给细胞的化合物混合物及与细胞自身的副产物分开至足以用作人治疗剂的纯度提出了艰难的挑战。
重组治疗用蛋白质常常在数种哺乳动物宿主细胞系中生产，包括鼠骨髓瘤NS0和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Anderson，D.C和Krummen，L.(2002)Curr.Opin.Biotech.13117-123；Chu，L.和Robinson，D.K.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12180-187)。每一种细胞系在细胞所生成的蛋白质的特征和生产力方面具有优点和缺点。商业性生产细胞系的选择常常平衡对高生产力的需要与提供给定产品所要求的产品质量属性的能力。常常要求高滴度方法的一类重要的治疗用重组蛋白是单克隆抗体。有些单克隆抗体需要经由Fc区介导的效应器功能来引发它们的生物学功能。一个例子是利妥昔单抗(rituximab，
Genentech，Inc.和Biogen-Idec)，一种嵌合的单克隆抗体，其结合细胞表面CD-20并导致B细胞消减(Cartron等(2002)Blood 99754-758；Idusogie等(2000)J.Immunol.1644178-4184)。其它抗体，诸如贝伐单抗(bevacizumab，AVASTINTM，Genentech，Inc.)，一种人源化的抗VEGF(血管内皮生长因子)抗体，不要求Fc效应器功能来实现它们的活性。
发酵和细胞培养技术的进步大大提高了培养液中目标蛋白质的滴度。上游效率的这种升高导致下游加工中细胞收获阶段的瓶颈。细胞收获，或已收获的细胞培养液的澄清，是几乎所有的基于生物技术的产物的下游纯化中的重要过程。当产物存在于细胞内部的时候，使用细胞收获来降低产物提取步骤中待加工的细胞的液体体积。当产物存在于胞外的时候，使用细胞收获来将产物与细胞和细胞碎屑分开，例如自哺乳动物细胞培养物分离胞外抗体(Anthony S.Lubiniecki，编(1990)Large-Scale Mammalian Cell CultureTechnology，Marcel Dekker；Hansjoerg Hauser，Roland Wagner，编(1997)Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production，Walter GruyterPublishing)。
用于自细胞碎屑纯化蛋白质的规程最初取决于蛋白质的表达部位。有些蛋白质能被细胞直接分泌入周围的生长培养基中；其它蛋白质制备成胞内的。对于后一类蛋白质，纯化过程的第一步牵涉细胞的溶解，其可通过多种方法来进行，包括机械剪切、渗压休克、或酶促处理。此类破碎释放全部细胞内容物入匀浆中，而且另外生成亚细胞碎片，其因它们的小尺寸而难以除去。这些通常通过差速离心或通过过滤来除去。由于蛋白质生产运行过程中的细胞天然死亡和胞内宿主细胞蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质发生同样的问题，尽管规模较小。
在治疗用抗体的纯化期间，必须除去杂质，包括宿主细胞蛋白质、产物变体、宿主细胞DNA、小分子、方法相关污染物、内毒素和病毒颗粒(Fahrner，R.L.等(2001)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18301-327)。所使用的纯化技术必须是可缩放规模的(scaleable)、高效的、经济的、可靠的，且达到终产物的严格纯度要求。当前的纯化技术典型地牵涉多个采用正交分离模式的层析分离。一种典型的过程可包括如下步骤中的一些沉淀(US 7169908)、透析、电泳、超滤、亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析和/或疏水相互作用层析。常规的柱层析步骤是高效且可靠的，但是通常具有低产物通过量(加工kg/h)。因为单克隆抗体变得越来越广泛地使用，所以更加高效的生产规模生产是必需的。
层析技术利用蛋白质的化学和物理特性来实现高程度的纯化。这些化学和物理特性典型地包括尺寸、等电点、电荷分布、疏水性位点和对配体的亲和力(Janson，J.C.和L.Ryden(编)(1989)Protein PurificationPrinciples，HighResolution Methods and Applications.VCH Publishers，Inc.，New York)。层析的各种分离模式包括离子交换、层析聚焦、凝胶过滤(大小排阻)、疏水相互作用、反相、和亲和层析。离子交换层析(IEX)(包括阴离子交换和阳离子交换层析)通过各分析物(例如蛋白质)的净表面电荷的差异将它们分开。IEX是用于将所表达的蛋白质与细胞碎屑和其它杂质分开的主要工具。今天，IEX是蛋白质、肽、核酸和其它带电荷生物分子的纯化最频繁使用的技术之一，以高负载容量提供高分离度和组分离。该技术能够将只有它们的电荷特性有微小差异的分子种类分开，例如差异为一个带电荷的氨基酸的两种蛋白质。这些特性使得IEX非常适于纯化方案中的捕获、中间体纯化或精制(polishing)步骤，而且该技术用于微量规模纯化和分析至千克产物的纯化。
层析技术是可靠的，但是容量和通过量对于大规模应用可能有问题。常规的柱层析步骤是高效的且可靠的，但是通常具有低产物通过量(加工kg/h)。因为重组蛋白变得越来越广泛地使用，所以更加高效的生产规模生产是必需的。层析步骤的通过量典型地受限于层析树脂对感兴趣蛋白质的容量。随着加载至柱上的蛋白质增加，感兴趣蛋白质自杂质的分离度常常降低。
已知聚电解质(polyelectrolyte)与蛋白质形成复合物，其采取可溶性复合物(Dellacherie，E.(1991)Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.Prepr.32(1)602)、无定形沉淀(Mattiasson等(1998)Polym.Plast.Technol.Eng.37(3)303-308；Clark等(1987)Biotech.Progress 3(4)241；Fisher等(1988)Biotechnol.Bioeng.32777；Shieh等(1991)Am.Chem.Soc.，Div.Polym.Chem.Prepr.32(1)606；Sternberg等(1974)Biochimica et Biophysica Acta 342195-206；WO 2004/014942)、或团聚层(coacervate)(Wang等(1996)Biotechnol.Prog.12356-362；Veis，A.(1991)Am.Chem.Soc.Div.Polym.Chem.Prepr.32(1)596)的形式。单克隆抗体在存在抗原-聚阳离子(聚甲基丙烯酸)的情况中的木瓜蛋白酶蛋白水解产生Fab片段(Dainiak等(2000)AnalyticalBiochem.27758-66)。
蛋白质-聚电解质复合物凝聚，即分离成两个不同的液相，其中团聚层相含有大部分复合物，而另一相是平衡相(Burgess，D.J.“ComplexCoacervationMicrocapsule Formation”于Macromolecular Complexes inChemistry and Biology，Dubin，P.L.等编(1994)Springer-Verlag，Berlin；Dubin等(1994)Sep.Purif.Methods 231-16)。蛋白质的聚电解质凝聚是一种复杂的过程，而且对于广泛的蛋白质是没有用的。蛋白质-聚电解质复合物中的分子间结合是由于静电相互作用、氢键和疏水力(Cooper等(2005)CurrentOpinion in Colloid & Interface Science 1052-78；Mattison等(1999)Macromol.Symp.14053-76)。虽然已知添加聚电解质至蛋白质溶液可导致蛋白质-聚电解质复合物和更大簇的形成，并最终导致团聚体和/或沉淀，但是在进一步添加聚电解质时可出现逆过程，由此发生蛋白质重溶解，使蛋白质分离或纯化的尝试失败(Carlsson等(2003)J.Am.Chem.Soc.1253140-3149).使用聚电解质的蛋白质沉淀可为层析分离提供划算的备选方案。使用这种技术，有可能利用层析技术的官能化学来实现溶液中相似水平的蛋白质纯化。具体而言，沉淀步骤的通过量(throughout)会不再受限于特定层析树脂的容量(capacity)。
发明概述 本发明提供了涉及衍生自细胞培养液的蛋白质的分离和纯化的方法。
本发明的一个方面是蛋白质纯化方法，其通过用聚电解质，诸如聚阴离子聚电解质沉淀蛋白质。
本发明还提供了蛋白质纯化方法，其通过用聚阳离子聚电解质沉淀细胞培养液杂质。沉淀步骤可以后续阳离子交换层析、阴离子交换层析、和其它沉淀步骤。
本发明的方法包括用于抗体纯化的非亲和方法。
本发明的一个方面是纯化抗体的方法，包括 (a)调节含有抗体的混合物的酸度或盐浓度，其中该抗体衍生自已收获的细胞培养液； (b)添加带负电荷的聚电解质，由此形成蛋白质-聚电解质沉淀； (c)将蛋白质-聚电解质沉淀与选自下组的杂质分开蛋白质聚集体、蛋白质片段、宿主细胞蛋白质、胰岛素、庆大霉素、DNA、和浸出的(leached)蛋白A； (d)分离蛋白质-聚电解质沉淀；并 (e)在水溶液中重悬浮蛋白质-聚电解质沉淀。
本发明的另一个方面是纯化抗体的方法，包括 (a)调节含有抗体的混合物的酸度或盐浓度，其中该抗体衍生自细胞培养液； (b)添加带正电荷的聚阳离子聚电解质至混合物，由此形成包含带正电荷的聚阳离子聚电解质和选自下组的杂质的沉淀蛋白质聚集体、蛋白质片段、宿主细胞蛋白质、胰岛素、庆大霉素和DNA；并 (c)将沉淀与包含所述抗体的混合物分开。
附图简述
图1显示了用于纯化自已收获的细胞培养液(HCCF)纯化的蛋白A池的工艺步骤，后续左栏-阳离子交换层析(SepharoseTM fast flow，SPSFF)，然后是阴离子交换层析(QSFF)；中栏-QSFF；或右栏-pH 7的聚乙烯基磺酸(PVS)沉淀，然后是QSFF。
图2显示了纯化自已收获的细胞培养液(HCCF)纯化的SPSFF池的工艺步骤，后续左栏-QSFF；或右栏-pH 7的PVS沉淀，然后是QSFF。
图3显示了自HCCF直接捕获和纯化抗体的工艺步骤左栏-pH 5的PVS沉淀，接着是QSFF，然后是SPSFF；或pH 7的PVS沉淀，接着是QSFF，然后是SPSFF。
图4显示了在pH 5、在3.0和5.6mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲线(蛋白A池)。mS＝毫西门子，电导率的单位。
图5显示了在pH 7、在0.7、1.5、3.0和4.7mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲线(蛋白A池)。
图6显示了在pH 7、在0.8和1.5mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲线(SPSFF捕获池)。
图7显示了在pH 5和3.0mS/cm；及在pH 7和0.7mS/cm的PVS(1800Da)中的rhuMab 2H7溶解度曲线(HCCF)。
图8显示了比较抗CD20抗体2H7在pH 5和5mS/cm的PVS(1800Da)沉淀与PAA(1200和8000Da)沉淀的溶解度曲线。
图9显示了比较抗CD20抗体2H7在pH 7和1.5mS/cm的PVS(1800Da)沉淀与PAA(1200和8000Da)沉淀的溶解度曲线。
图10显示了抗CD20抗体(利妥昔单抗)在pH 7和1.5mS/cm的溶解度曲线，与分子量范围为1200-1,100,000Da的PAA相比较。
图11显示了抗CD20抗体rhuMab 2H7的下游加工结果汇总表(a)经过蛋白A加工的HCCF；(b)经过SPSFF加工的HCCF；(c)HCCF的PVS沉淀。
图12显示了在pH 5.5和5.1mS/cm；pH 6.0和3.0mS/cm；pH 6.0和5.5mS/cm在PVS(1800Da)中的Apomab溶解度曲线。
图13显示了在pH 6.5和1.5mS/cm；pH 6.5和3.2mS/cm；及pH 7.0和0.7mS/cm在PVS(1800Da)中的Apomab溶解度曲线。
图14显示了装有Apomab的蛋白A池的烧瓶的照片，其含有(左)无PVS(0％)，(中)0.1％PVS(w/v)，和(右)1％PVS(w/v)，在pH 5.5。
图15显示了在pH 4和2mS/cm；pH 5和1mS/cm；pH 5和2.4mS/cm；pH 6和0.5mS/cm；pH 7和0.5mS/cm在PVS(1800Da)中的抗cMet溶解度曲线。
图16显示了用于自CCF直接捕获和纯化rhuMab 2H7抗体的工艺步骤左栏-离心得到HCCF，接着是使用PVS的抗体沉淀，然后是QSFF；右栏-聚精氨酸絮凝/杂质沉淀，离心得到HCCF，使用PVS的抗体沉淀，然后是QSFF。
图17显示了用于自已收获的细胞培养液(HCCF)纯化rhuMab 2H7抗体的工艺步骤左栏-Prosep vA，阳离子交换层析(SEPHAROSETM fast flow，SPSFF)，然后是阴离子交换层析(QSFF)；右栏-聚精氨酸沉淀，Prosep vA，SPSFF，然后是QSFF。
图18显示了与图17相同的用于自已收获的细胞培养液(HCCF)纯化rhuMab 2H7抗体的工艺，只是消除了Prosep vA步骤左栏-SPSFF，然后是QSFF；右栏-聚精氨酸沉淀，SPSFF，然后是QSFF。
图19显示了用于自已收获的细胞培养液(HCCF)纯化rhuMab 2H7抗体的工艺步骤，后续左栏-使用PVS的抗体沉淀，然后是QSFF；右栏-聚精氨酸沉淀，使用PVS的抗体沉淀，然后是QSFF。
图20显示了rhuMab 2H7CCF溶解度曲线-使用110kDa聚精氨酸。
图21显示了rhuMab 2H7HCCF溶解度曲线-42kDa聚精氨酸。
图22显示了rhuMab 2H7HCCF溶解度曲线-110kDa聚精氨酸。
图23显示了rhuMab 2H7、抗CD22、rhuMab C2B8HCCF溶解度曲线-42kDa聚精氨酸。
图24显示了rhuMab 2H7、抗CD22、rhuMab C2B8HCCF溶解度曲线-110kDa聚精氨酸。
图25显示了用0.075％w/v 110kDa聚精氨酸絮凝的rhuMab 2H7 CCF的PVS沉淀的溶解度曲线。
图26显示了SPSFF的穿透曲线，以自聚精氨酸沉淀的HCCF生成的蛋白A池作为加载。
图27显示了SPSFF的穿透曲线，以自聚精氨酸沉淀的生成的HCCF作为加载。
图28显示了2H7MAb中对抗体还原的抑制作用的凝胶电泳。HCCF4-12％BT，MOPS缓冲液，Sypro Ruby染料，2μg HCCF加载，5分钟，70℃，9秒曝光，2F/T运行7，RT温育，在SS迷你罐中，500μl(微升)样品立即冷冻于-70℃。
图29显示了rhuMab C2B8蛋白A池溶解度曲线-2.5kDa聚赖氨酸。
图30显示了rhuMab C2B8蛋白A池溶解度曲线-50kDa聚赖氨酸。
图31显示了rhuMab C2B8HCCF溶解度曲线-50kDa聚赖氨酸。
图32显示了rhuMab C2B8HCCF溶解度曲线-225kDa聚赖氨酸。
图33显示了人源化抗CD20溶解度曲线，1800Da至1132kDa样品，0.00％至0.20％聚苯乙烯磺酸盐(PSS)，pH 7和电导率为12mS/cm。
图34显示了每种过滤介质(A1HC、B1HC、C0HC、45CE、20CE、30CE)的容量(以克抗体每过滤面积测量)对压力下降的Vmax图。
图35显示了不同流通流速对产率的影响，就达到2H7-PVS蛋白质-聚电解质沉淀自C0HC
过滤介质完全重溶解所必需的缓冲液体积而言。LMH＝升每平方米每小时，流速的度量单位。
图36显示了两个流量范围(重溶解缓冲液流，以LMH计)对蛋白质自C0HC
滤器(2H7-PVS蛋白质-聚电解质沉淀)重溶解的影响。
图37显示了管线内HCCF条件化/PVS沉淀设置的工艺示意图。
图38显示了抗体回收产率，连续给料条件化/沉淀。
发明详述 现在将会详细地述及本发明的某些实施方案，所附结构和公式中例示了它们的例子。虽然将会连同所列举的实施方案来描述本发明，应当理解它们并非意图将本发明限于那些实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有备选方案、修改、和等同方案，其可以包括在权利要求所限定的本发明范围内。本领域技术人员会领会与本文中所描述的方法和材料相似的或等同的许多方法和材料可用于实施本发明。本发明绝非限于所描述的方法和材料。倘若所收入的文献、专利、和相似的材料与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语的用法、所描述的技术、诸如此类，以本申请为准。
定义 除非另有说明，以下术语和短语在用于本文时意图具有如下含义 术语“已收获的细胞培养液”，也称作HCCF，意指通过包括离心或过滤在内的手段已经从中除去了细胞的原核或真核细胞培养液。细胞培养指在受控条件下使原核或真核细胞生长的过程。术语“细胞培养”指培养衍生自多细胞真核生物(包括动物细胞)或单细胞原核生物(包括细菌和酵母)的细胞。真核细胞培养包括哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞)、杂交瘤、和昆虫细胞。凭借适宜的细胞培养容器，能从贴壁依赖性细胞或悬浮细胞系获得分泌型蛋白质。哺乳动物细胞培养包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
术语“微生物发酵”意指经过遗传工程改造而生成化学品(诸如蛋白质)的细菌或酵母的细胞培养。使用发酵来繁殖所克隆的细菌和酵母以及其它微生物并生成有价值的蛋白质。通过供应特定的生长培养基和控制各种环境因素(诸如pH、温度、和通气)，这些有机体的细胞生产力和生长得到最大化。细菌发酵液可衍生自大肠杆菌。
术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性。抗体可以是鼠的、人的、人源化的、嵌合的、或衍生自其它物种的。
抗体是由免疫系统生成的蛋白质，其能够识别和结合特定的抗原(Janeway等(2001)“Immunobiology”，第5版，Garland Publishing，New York)。靶抗原一般具有众多由多种抗体上的CDR识别的结合位点，也称作表位。每一种特异性结合不同表位的抗体具有不同的结构。如此，一种抗原可具有超过一种的相应抗体。
术语“抗体”在用于本文时也称作全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性结合感兴趣靶物的抗原或其部分，所述靶物包括但不限于癌细胞或生成与自身免疫病有关的自身免疫性抗体的细胞。本文中所公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、和IgA)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、gG4、IgA1和IgA2)或亚类的。免疫球蛋白可衍生自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白是人、鼠、或兔起源的。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2、和Fv片段；双抗体；线性抗体；由Fab表达库生成的片段；抗独特型(抗Id)抗体；任何上述的免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的CDR(互补决定区)、ECD(胞外结构域)、和表位结合片段；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指自基本上同质的抗体群获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优点在于它们可以在不受其它抗体污染的情况中合成。修饰语“单克隆”指示抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，要依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler等(1975)Nature 256495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(US 4816567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等(1991)Nature，352624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222581-597中记载的技术从噬菌体抗体库分离。
有用的单克隆抗体是针对特定抗原性决定簇(例如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学品、核酸、或其片段)的同质抗体群。针对感兴趣抗原的单克隆抗体(单抗)可通过使用本领域已知的、通过培养的连续细胞系提供抗体分子生成的任何技术来制备。这些包括但不限于最初由
和Milstein(1975)Nature 256495-497)记载的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunology Today 472)、和EBV-杂交瘤技术(Cole等(1985)于Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，页77-96)。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类的，包括IgG、IgM、IgE、IgA、和IgD及其任何亚类。生成本发明中所使用的单抗的杂交瘤可以在体外或在体内培养。
对于本发明的方法有用的治疗用单克隆抗体包括曲妥单抗(trastuzumab，
Genentech，Inc.，Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285-4289；US 5,725,856)；抗CD20抗体，诸如嵌合抗CD20“C2B8”(US 5736137)、利妥昔单抗(rituximab，
)、ocrelizumab即2H7抗体的一种嵌合的或人源化的变体(US 5721108；WO04/056312)或托西莫单抗(tositumomab，
)；抗IL-8(St John等(1993)Chest，103932；及WO 95/23865)；抗VEGF抗体，包括人源化的和/或亲和力成熟的抗VEGF抗体，诸如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1，贝伐单抗(bevacizumab，
Genentech，Inc.，Kim等(1992)Growth Factors753-64；WO 96/30046；WO 98/45331)；抗PSCA抗体(WO 01/40309)；抗CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO 00/75348)；抗CD11a(US 5622700；WO 98/23761；Steppe等(1991)Transplant Intl.43-7；Hourmant等(1994)Transplantation 58377-380)；抗IgE(Presta等(1993)J.Immunol.1512623-2632；WO 95/19181)；抗CD18(US 5622700；WO 97/26912)；抗IgE，包括E25、E26和E27(US 5714338；US 5091313；WO 93/04173；US 5714,338)；抗Apo-2受体抗体(WO 98/51793)；抗TNF-α抗体，包括cA2(
)、CDP571和MAK-195(US 5672347；Lorenz等(1996)J.Immunol.156(4)1646-1653；Dhainaut等(1995)Crit.Care Med.23(9)1461-1469)；抗组织因子(TF)(EP 0 420 937 B1)；抗人α4β7整联蛋白(WO 98/06248)；抗EGFR，嵌合的或人源化的225抗体(WO 96/40210)；抗CD3抗体，诸如OKT3(US4515893)；抗CD25或抗tac抗体，诸如CHI-621
和
(US 5693762)；抗CD4抗体，诸如cM-7412抗体(Choy等(1996)Arthritis Rheum39(1)52-56)；抗CD52抗体，诸如CAMPATH-1H(Riechmann等(1988)Nature332323-337)；抗Fc受体抗体，诸如针对FcγRI的M22抗体，像Graziano等(1995)J.Immunol.155(10)4996-5002中的；抗癌胚抗原(CEA)抗体，诸如hMN-14(Sharkey等(1995)Cancer Res.55(23Suppl)5935s-5945s；针对乳房上皮细胞的抗体，包括huBrE-3、hu-Mc 3和CHL6(Ceriani等(1995)Cancer Res.55(23)5852s-5856s；及Richman等(1995)Cancer Res.55(23Supp)5916s-5920s)；结合结肠癌细胞的抗体，诸如C242(Litton等(1996)Eur J.Immunol.26(1)1-9)；抗CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等(1995)J.Immunol.155(2)925-937)；抗CD33抗体，诸如Hu M195(Jurcic等(1995)Cancer Res55(23Suppl)5908s-5910s)和CMA-676或CDP771；抗CD22抗体，诸如LL2或LymphoCide(Juweid等(1995)Cancer Res 55(23Suppl)5899s-5907s)；抗EpCAM抗体，诸如17-1A(
)；抗GpIIb/IIIa抗体，诸如阿昔单抗(abciximab)或c7E3 Fab(
)；抗RSV抗体，诸如MEDI-493(
)；抗CMV抗体，诸如
抗HIV抗体，诸如PRO542；抗肝炎抗体，诸如抗Hep B抗体
抗CA 125抗体OvaRex；抗独特型GD3表位抗体BEC2；抗αvβ3抗体
抗人肾细胞癌瘤抗体，诸如ch-G250；ING-1；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结直肠肿瘤抗体(A33)；抗人黑素瘤抗体R24，其针对GD3神经节苷脂；抗人鳞状细胞癌瘤(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体，诸如Smart ID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。
有用的单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段、或嵌合人-小鼠(或其它物种)单克隆抗体。人单克隆抗体可通过本领域已知的众多技术来制备(Teng等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA807308-7312；Kozbor等(1983)Immunology Today 472-79；及Olsson等(1982)Methods in Enzymology 923-16)。
抗体也可以是双特异性抗体。双特异性抗体可具有一条臂中具有第一结合特异性的杂合的免疫球蛋白重链和另一条臂中提供第二结合特异性的杂合的免疫球蛋白重链-轻链对。由于免疫球蛋白轻链只在双特异性分子的一半中的存在提供了便利的分离方式，这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开(WO 94/04690；Suresh等(1986)Methods in Enzymology，121210；Rodrigues等(1993)J.of Immunology1516954-6961；Carter等(1992)Bio/Technology 10163-167；Carter等(1995)J.of Hematotherapy 4463-470；Merchant等(1998)Nature Biotechnology16677-681)。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的(Milstein等(1983)Nature 305537-539；WO 93/08829；Traunecker等(1991)EMBO J.103655-3659)。使用此类技术，可制备双特异性抗体，缀合成ADC，用于疾病的治疗或预防，如本文中所定义的。
依照一种不同的方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域融合至免疫球蛋白恒定域序列。融合蛋白可具有免疫球蛋白重链恒定域，其至少包含部分的铰链、CH2、和CH3区。第一重链恒定区(CH1)可含有轻链结合所必需的位点，其存在于至少一种融合蛋白中。将具有编码免疫球蛋白重链融合物和(如果想要的话)免疫球蛋白轻链的序列的核酸插入分开的表达载体中，并共转染入合适的宿主有机体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。
杂合的或双功能的抗体可通过生物学方法衍生，即通过细胞融合技术，或通过化学方法衍生，尤其是用交联剂或二硫桥形成试剂，而且可包含完整抗体或其片段(EP 105360；WO 83/03679；EP 217577)。
抗体可以是免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原、或微生物抗原的抗体或结合肿瘤细胞或基质的抗体的功能活性片段、衍生物或类似物。在这点上，“功能活性”意指该片段、衍生物或类似物能够引发与衍生该片段、衍生物或类似物的抗体识别相同抗原的抗抗独特型抗体。具体而言，在一个例示性的实施方案中，免疫球蛋白分子的独特型的抗原性可通过删除位于特异性识别抗原的CDR序列的C端的框架和CDR序列而得到增强。为了确定哪些CDR序列结合抗原，可以在使用抗原的结合测定法(本领域已知的任何结合测定法，例如BIAcore测定法)中使用含有CDR序列的合成肽(Kabat等，(1991)于Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，National Institute ofHealth，Bethesda，Md；Kabat等(1980)J.of Immunology 125(3)961-969)。
其它有用的抗体包括抗体片段，诸如但不限于F(ab’)2片段(其含有可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域，可通过抗体分子的胃蛋白酶消化来生成)；和Fab片段，其可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥来生成。其它有用的抗体是抗体的重链和轻链二聚体，或其任何最小限度片段，诸如Fv或单链抗体(SCA)(例如如US 4946778；Bird(1988)Science 242423-42；Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；及Ward等(1989)Nature 334544-54中所记载的)，或与抗体具有相同特异性的任何其它分子。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合“抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，及其此类抗体的片段，只要它们展现期望的生物学活性(US 4816567；及Morrison等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855)。嵌合抗体是其中不同部分衍生自不同动物物种的分子，诸如那些具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体(US4816567；US 4816397)。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。
嵌合的和人源化的单克隆抗体(包含人的和非人的两部分)可使用标准重组DNA技术来制备(WO 87/02671；EP 184,187；EP 171496；EP 173494；WO 86/01533；US 4816567；EP 12023；Berter等(1988)Science2401041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.1393521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218；Nishimura等(1987)Cancer.Res.47999-1005；Wood等(1985)Nature 314446-449；及Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison(1985)Science 2291202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4214；US 5225539；Jones等(1986)Nature 321552-525；Verhoeyan等(1988)Science2391534；及Beidler等(1988)J.Immunol.1414053-4060；通过述及将每一篇完整收入本文)。
完全人的抗体可使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但能表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来生成。以正常方式用选定的抗原(例如整个的或部分的本发明多肽)免疫转基因小鼠。可使用常规杂交瘤技术来获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠所包含的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，而且随后经历类别转换和体细胞突变。如此，使用这样的技术，有可能生成治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于生成人抗体的这种技术的综述参见Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365-93；美国专利No.5625126；5633425；5569825；5661016；5545806。可以自商业来源获得其它人抗体，例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)。
识别选定表位的完全人的抗体可使用称作“引导选择”的技术来生成。在这种方法中，使用选定的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)来引导识别相同表位的完全人的抗体的选择(Jespers等(1994)Biotechnology 12899-903)。也可以使用本领域已知的各种技术来生成人抗体，包括噬菌体展示库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227381(1991)；Marks等(1991)J.Mol.Biol.222581)。
抗体可以是抗体的或其功能活性片段的融合蛋白，例如其中抗体经共价键(例如肽键)在N-末端或C-末端融合至不是抗体的另一蛋白质(或其部分，诸如蛋白质的至少10个、20个或50个氨基酸的部分)的氨基酸序列。抗体或其片段可以在恒定域的N-末端共价连接至另一蛋白质。
抗体包括经过修饰的类似物和衍生物，即通过任何类型分子的共价附着，只要此类共价附着容许该抗体保留其抗原结合免疫特异性。例如，但非限制，抗体的衍生物和类似物包括那些经过进一步修饰的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解切割、对细胞抗体单元或其它蛋白质的连接、等。可通过已知技术来实施众多化学修饰之任一，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、在存在衣霉素(tunicamycin)的情况中的代谢合成、等。另外，类似物或衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸。
CD20抗体的例子包括“C2B8”，现在的利妥昔单抗(rituximab，
)(US 5736137)；钇-[90]标记的2B8鼠抗体Y2B8或ibritumomab tiuxetan(
Biogen Idec，Inc.US 5736137)；2B8(于1993年6月22日以编号HB11388保藏于ATCC)；鼠IgG2a“B1”，也称作托西莫单抗，任选用131I标记以生成“131I-B1”或“碘I131托西莫单抗”抗体(
)，可购自Corixa(US 5595721)；鼠单克隆抗体“1F5”(例如Press等(1987)Blood 69(2)584-591)及其变体，包括“框架贴片的”(frameworkpatched)或人源化的1F5(WO 2003/002607，Leung，S.；ATCC保藏物HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(US 5677180)；ocrelizumab(2H7的一种人源化变体)和其它2H7变体(WO 2004/056312；US 5721108)；HUMAX-CD20TM，其是靶向B细胞的细胞膜中的CD20分子的完全人的、高亲和力的抗体(Genmab，Denmark)。参见例如Glennie和van de Winkel，(2003)Drug Discovery Today 8503-510及Cragg等(2003)Blood 1011045-1052)；WO 2004/035607和WO 2005/103081(Teeling等，GenMab/Medarex)中列出的人单克隆抗体；有复杂的N-糖苷连接的糖链结合至Fc区的抗体(US2004/0093621，Shitara等)；结合CD20的单克隆抗体和抗原结合片段(WO2005/000901，Tedder等)诸如HB20-3、HB20-4、HB20-25、和MB20-11；结合CD20的单链蛋白(US 2005/0186216；US 2005/0202534；US 2005/0202028；US 2005/0202023)；CD20结合分子，诸如AME系列抗体，例如AME-133TM抗体(WO 2004/103404；US 2005/0025764)；及具有Fc突变的CD20抗体(WO2005/070963)；CD20结合分子(WO 2005/016969；US 2005/0069545)；双特异性抗体(WO 2005/014618)；人源化LL2单克隆抗体(US 2005/0106108)；针对CD20的嵌合或人源化B-Ly1抗体(WO2005/044859；US 2005/0123546)；＝A20抗体或其变体诸如嵌合或人源化A20抗体(分别为cA20、hA20)和IMMUN-106(US 2003/0219433)；及单克隆抗体L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2，其可得自国际白细胞分型工作组(International Leukocyte TypingWorkshop)(Valentine等(1987)于Leukocyte Typing III，McMichael，编，页440，Oxford University Press)。例示性CD20抗体包括嵌合的、人源化的、或人的CD20抗体，诸如利妥昔单抗、人源化2H7、嵌合或人源化A20抗体诸如HUMAX-CD20TM、人CD20抗体(Genmab)、和结合CD20的免疫球蛋白/蛋白质(Trubion Pharm Inc.)。
“完整”抗体指包含抗原结合可变区以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域(CH1、CH2和CH3)的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。
完整抗体可具有一项或多项“效应器功能”，其指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体(BCR))的下调；等。
根据其重链恒定域的氨基酸序列，完整抗体可分入不同的“类”。完整抗体分五大类IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，而且这些中的数类可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。与抗体的不同类对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的。
术语“氨基酸序列变体”指具有在一定程度上与天然序列多肽不同的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体会拥有与至少一种天然抗体的受体结合域或与至少一种天然受体的配体结合域的至少约70％序列同一性，而且优选的是，它们会是至少约80％，更优选的是，序列与此类受体或配体结合域至少约90％同源。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置处拥有替代、删除、和/或插入。氨基酸以常规名称，即单字母和三字母代码来表示。
“序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，氨基酸序列变体中同样的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域公知的。一种此类计算机程序是Genentech公司创作的“Align 2”，其于1991年12月10日与用户文档一起提交给美国版权局(UnitedStates Copyright Office，Washington，DC 20559)。
蛋白质表达和生产 重组蛋白是通过自载体克隆DNA和本领域已知方法来表达的。用于本发明的聚电解质纯化方法的蛋白质可以自合适的宿主细胞生成，诸如原核生物、酵母、和高等真核生物细胞。适合于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichis)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。
在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码CD20抗体的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞衍生自多细胞真核生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。
培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等(1977)J.Gen Virol.3659)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(Urlaub等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216)Mather(1980)Biol.Reprod.23243-251)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌瘤细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562)；TRI细胞(Mather等(1982)Annals N.Y.Acad.Sci.38344-68)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(HepG2)。
用上文所述用于抗体生产的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当修改的常规营养培养基中培养。
可以在多种培养基中培养用于为本发明的方法生产抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适合于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基Ham等(1979)Meth.Enz.5844；Barnes等(1980)Anal.Biochem.102255；US 4767704；US 4657866；US 4927762；US 4560655；US 5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以在必要时补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如MES和HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
一旦获得了含有感兴趣蛋白质的已收获的细胞培养液，通常使用不同层析技术的组合来试图将感兴趣蛋白质与细胞所生成的其它蛋白质分开。这些技术基于蛋白质的电荷、疏水性程度、或大小将蛋白质的混合物分开。这些技术每一种有数种不同层析树脂，容许适应所牵涉的具体蛋白质来精确剪裁纯化方案。这些分离方法每一种的本质在于能使得蛋白质或是以不同速率沿长柱向下移动，从而实现随着它们进一步向下通过柱子时进一步增大的物理分离，或是选择性粘附至分离介质，然后通过不同溶剂来差异洗脱。在有些情况中，在杂质特异性粘附至柱子，而感兴趣蛋白质不粘附时将期望的蛋白质与杂质分开，即，感兴趣蛋白质存在于“流出液”中。
在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么作为第一步，通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片，诸如对于分泌到大肠杆菌周质空间的抗体(Carter等(1992)Bio/Technology 10163-167)。在存在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)时使细胞糊在约30分钟里融化。可以通过离心除去细胞碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自此类表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
传统的纯化自细胞表达的蛋白质的方法包括羟磷灰石层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析、及其组合(Fahrner，R.L.等(2001)Biotechnol.Genet.Eng.Rev.18301-327)。蛋白质常常用作亲和配体，可以将它固定化在多种支持物上，并容许含有所表达蛋白质的已收获的细胞培养液(HCCF)的初始阶段富集。蛋白A是对于蛋白质(诸如包含Fc区的抗体)的亲和层析有用的吸附剂。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力(约10-8M)结合抗体Fc区(Sulkowski，E.(1987)Protein PurificationMicro to Macro，页177-195；Chadha等(1981)Preparative Biochemistry 11(4)467-482；Reifsnyder等(1996)J.Chromatography 75373-80；US 6127526；6333398)。可以将蛋白A固定化在固相上，诸如玻璃、硅土、琼脂糖或聚苯乙烯。固相可以是纯化柱或离散颗粒的不连续相，诸如可控孔径玻璃柱或硅酸柱，或包被有旨在防止污染物粘附至固相的试剂(诸如甘油)(US 6870034)。PROSEPATM柱(可购自Bioprocessing Limited)是经甘油包被的蛋白A可控孔径玻璃柱的一个例子。本发明所涵盖的柱子的其它例子包括POROS 50ATM(聚苯乙烯)柱或重组蛋白A SEPHAROSE FAST FLOWTM(琼脂糖)柱。用于蛋白A层析的固相可以用合适缓冲液平衡。例如，平衡缓冲液可以是25mM Tris，25mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.1。
在固定化到层析介质上时，蛋白A提供了用于纯化重组抗体的技术，因为它能选择性结合复杂溶液中的抗体，容许杂质(诸如宿主细胞蛋白质和小分子)流出。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.621-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等(1986)EMBO J.515671575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖所能实现的更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、和硫酸铵沉淀。
聚电解质 聚电解质是由带电荷的单体单元构成的水溶性聚合物。本发明的聚电解质的单体单元携带电解质(带电荷的官能度)基团，其根据酸度(pH)在水溶液中发生质子解离(离子化)。例示性的聚电解质的带电荷官能度包括但不限于磺酸、膦酸、羧酸、和胺，及其各自的离子磺酸盐、膦酸盐、羧酸盐、和铵。所述解离影响溶液的离子强度和电导率。
对于本发明的方法有用的聚电解质可具有范围为约一千(1000)道尔顿(Da)至约一百万(1,000,000)道尔顿的分子量。本发明的聚电解质可以以某些类型的重复单体单元的混合物形式使用，但其具有宽范围的链长度，即分子量范围为约1200道尔顿(Da)至约一百万(1,000,000)道尔顿。混合物可以是窄的范围，例如约1200Da至约2400Da、或约4000Da至约8000Da。可以在单体单元的某些聚合条件下控制平均分子量和分子量分布谱，所述条件诸如浓度、聚合引发剂或催化剂、温度、或时间。也可以在某些制备性纯化方法下选择聚电解质的平均分子量和分子量分布谱。
可以在沉淀反应中使用带负电荷的阴离子聚电解质和带正电荷的阳离子聚电解质。在溶液pH低于具体抗体的pI时，抗体是带正电荷的。在这些条件下，阳离子聚电解质可沉淀杂质并将感兴趣抗体留在溶液中。相反，阴离子聚电解质可沉淀抗体，形成蛋白质-聚电解质沉淀，将杂质留在溶液中。为本发明的方法选择聚电解质时要考虑的其它因素包括官能团稳定性和反应性、分子量、电荷密度和链刚度(chain stiffness)。
本发明的聚电解质包括携带阳离子和阴离子两种带电荷官能度的聚两性电解质(polyampholyte)。
例示性的本发明聚阴离子聚电解质包括聚丙烯酸(PAA)、聚乙烯基磺酸(PVS)、聚苯乙烯磺酸(PSS，聚(4-乙烯基苯磺酸金属盐))、聚甲基丙烯酸(PMA)、聚丙烯酰胺甲基丙磺酸(PAMPS)、羧甲基纤维素(CMC)、马来酸酐-苯乙烯共聚物(MAS)、马来酸酐-乙烯基甲基醚共聚物(MAVE)、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、硫酸右旋糖苷、果胶、藻酸、和糖胺聚糖(诸如硫酸软骨素、肝素/硫酸类肝素、和透明质酸)；及其所有的盐和共聚物。
聚丙烯酸(PAA)和聚乙烯基磺酸(PVS)，及其阴离子(分别是聚丙烯酸酯和聚乙烯基磺酸酯)是对于本发明的方法有用的聚电解质。PAA具有与PVS类似的结构特性。二者都是聚合物且具有线性碳主链。这两种聚电解质的区别在于它们的官能团。PVS具有一磺酸官能团，该磺酸官能团给予PVS大约为1的pKa。比较而言，PAA具有一羧酸官能团和大约为5的pKa。可获得一种分子量的PVS，其通过大小排阻测定为平均1800Da，其中动态光散射检测测定n为约10-20。可购得多种分子量的PAA，包括1200和8000，其中平均n分别约为15-20和约100-120。PAA和PVS购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)、Polysciences Inc.(Warrington，PA)、和Carbomer Inc.(San Diego，CA)。
聚乙烯基磺酸(PVS)
聚丙烯酸(PAA，聚丙烯酸酯)
聚苯乙烯磺酸盐((polystyrene sulfonate)PSS) 例示性的本发明带正电荷的聚阳离子聚电解质包括聚精氨酸(PLA，包括聚-L-精氨酸盐酸盐Sigma-Aldrich P-4463，MW 5-15kDa，P-7762MW15-70kDa，P-3892，MW＞70kDa，CAS No.26982-20-7，和聚-L-精氨酸硫酸盐，Sigma-Aldrich P-7637MW 15-50kDa，CAS No.26700-68-5)；聚赖氨酸(例如poly-L-赖氨酸盐酸盐CAS Number26124-78-7，Sigma-AldrichP-2658MW 15-30kDa，CAS No.26124-78-7，PLL，Jacobson，B.S.和Branton，D.(1977)Science 195，302)；聚鸟氨酸(例如聚-L-鸟氨酸，Sigma-AldrichP-2533MW 15-30kDa，CAS No.26982-21-8)；聚乙烯基胍(聚(乙烯基胍)，US 6087448)；聚二烯丙基二甲基铵氯化物；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶溴化物)；聚甲基丙烯酰胺丙基三甲基铵氯化物；聚乙烯基苄基三甲基铵氯化物；和聚组氨酸。
聚精氨酸(聚-L-精氨酸盐酸盐)
聚赖氨酸(聚-L-赖氨酸盐酸盐) 单克隆抗体纯化中的聚电解质沉淀 聚电解质沉淀可用于在纯化期间将抗体与杂质分开。这些杂质包括宿主细胞杂质，诸如CHO蛋白质(CHOP)和大肠杆菌蛋白质(ECP)；细胞培养物成分，诸如胰岛素、庆大霉素、和DNA；过程中的杂质，诸如浸出的蛋白A；和产物相关杂质，诸如抗体聚集体和片段。沉淀步骤可充当现有层析分离的替代。或者，蛋白质的聚电解质沉淀可用作来自真核或原核培养物的已收获的细胞培养液(HCCF)的直接捕获步骤，或用作中间纯化步骤。还有，聚电解质沉淀可用作蛋白质纯化中澄清步骤，澄清细胞培养液，包括HCCF。聚电解质可以在细胞培养液中形成絮状物，其沉降并容许含有蛋白质(诸如在原核或真核细胞培养物中表达的抗体)的混合物的快速和有效的澄清、富集、沉淀、或纯化。本发明的聚电解质纯化方法可代替收获操作，诸如离心、过滤、和层析操作。本发明的聚电解质纯化方法在纯化蛋白质(诸如抗体)方面提供了令人惊讶的和出乎意料的好处。
要为聚电解质沉淀优化的条件包括溶液pH、电导率、缓冲液、蛋白质浓度、聚电解质浓度、搅动的速率和类型、及添加聚电解质的速率。
可以在带搅动的反应器中实施沉淀。可以根据自溶解度曲线鉴定的最佳条件将抗体池的pH和电导率调节至目标条件。添加并混合聚电解质。搅动的速率和类型可影响沉淀效率和沉淀时间。沉淀在添加聚电解质后发生。使用过滤或离心将沉淀物与上清液分开。对于使用过滤的阴离子聚电解质沉淀，用清洗缓冲液彻底清洗沉淀物。随后将包含抗体的沉淀物重悬浮和下游加工。还有可能实施联机(in-line)沉淀，即没有混合容器，其中将抗体池调节至目标pH，然后添加聚电解质。直到稀释所述池时才会发生完全沉淀，稀释可以与过滤装置或离心机联机实施。或者，在将抗体池调节至目标pH后，联机实施稀释，后续联机添加聚电解质，之后是过滤装置或离心机。
在一个例示中，人生长激素(pI 5.2)在pH 7的缓冲液中结晶或沉淀时是带负电荷的，因此会与阳离子聚电解质相互作用或复合。类似地，具有大于9的pI的单克隆抗体(诸如利妥昔单抗(rituximab)和曲妥单抗(trastuzumab))能够在中性缓冲液中与阴离子聚电解质复合。一旦通过公众可得的程序确定氨基酸序列，就能计算蛋白质净电荷的估值。酸性蛋白质(那些具有较高的天冬氨酸(pKa 4.5)和谷氨酸(pKa 4.5)含量的蛋白质)通常具有小于6至6.4的pI。另一方面，碱性蛋白质(那些具有较高的组氨酸(pKa 6.2)、赖氨酸(pKa 10.4)和精氨酸(pKa 12)含量的蛋白质)通常具有大于约7.5至8的pI。与二者相反，中性蛋白质(那些通常具有类似量的酸性和碱性氨基酸残基的蛋白质)具有中性(pI通常为约6.5至7.5)的pI。
尽管不是综合列表，各种治疗性蛋白质的pI的一些例子如下重组人红细胞生成素(pI 4)；链球菌DNA酶α、rhDNA酶(
)(pI 5)；依那西普(etanercept，ENBRELTM)(pI 5.1)；胰岛素(pI 5.4)；粒细胞集落刺激因子(pI5.5-5.9)；TNFα(pI 5.6)；Fibrolase(pI 6.7)；IL-1β(pI 6.9)；重组组织型纤溶酶原激活剂(pI 6.5-8.5)；Orthoclone OKT3(pI 6.7-7.2)；因子VIII(pI 7-7.6)；牛生长素(pI 7.4)；白介素2(pI 7.44)；胰岛素样生长因子-1(pI 8.4)；和抑肽酶(pI 10.5)。
对阴离子聚电解质沉淀方法作为数种例示性抗体(抗CD20rhuMab 2H7，rhuMab DR5Apomab，和抗cMet)的阳离子交换(SPSFF)步骤的替代及作为rhuMab 2H7(ocrelizumab)的蛋白A(Prosep vA)步骤的替代进行评估。可通过本文所述聚电解质沉淀方法纯化其它抗体和其它蛋白质。使用溶解度曲线来为三种抗体鉴定高效的或最佳的沉淀条件(pH、电导率和聚合物浓度)。聚电解质沉淀步骤展示了减少宿主蛋白质诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)和大肠杆菌蛋白质(ECP)，浸出的蛋白A，小分子诸如胰岛素和庆大霉素以及抗体片段和聚集体的能力。根据CDC活性的测量，聚电解质沉淀步骤对2H7的生物学活性没有负面影响。使用阴离子交换(QSFF)层析自所沉淀的蛋白质中除去聚电解质PVS至低于1μg/mL的水平。
图1-3的流程图中例示了多种加工步骤系列。组合和省略各步骤以判断它们对蛋白质纯化和加工效率的结果。一种本领域当前实践的用于自已收获的细胞培养液(HCCF)纯化所表达蛋白质的标准过程使用三个层析步骤(1)蛋白A捕获(Prosep vA)，(2)阳离子交换(SPSFF)，和(3)阴离子交换(QSFF)，如图1左栏所示。尝试了通过蛋白A捕获及紧跟着的阴离子交换进行的纯化(图1中栏)。可以用pH 7的PVS沉淀步骤代替阳离子交换步骤(图1右栏)。可以在没有蛋白A捕获的情况中加工已收获的细胞培养液，即初始阳离子交换，紧接着是阴离子交换(图2左栏)，或者pH 7的PVS沉淀，跟着是阴离子交换(图2右栏)。可以如下进行聚电解质沉淀，即作为自HCCF的直接捕获，接着是阴离子交换，然后是阳离子交换层析(图3)。在pH 5(图3左栏)和pH 7(图3右栏)进行聚电解质沉淀。
为抗CD20抗体rhuMab 2H7选择沉淀条件 在一定范围的离子强度里为重组人源化抗CD20单克隆抗体rhuMab 2H7生成溶解度曲线。溶解度曲线是沉淀后上清液中留下的残余蛋白质(以百分比表述)对PVS浓度(以PVS摩尔数/抗体摩尔数表述)的曲线。pH 5和pH 7(图4和图5)的蛋白A池、用作pH 7的直接捕获步骤的SPSFF池(图6)、及pH 5和pH 7的HCCF(图7)生成溶解度曲线。使用这些曲线来选择实施制备规模沉淀的pH、离子强度和PVS浓度。
蛋白A池的沉淀(图4和图5) 随着PVS浓度的升高，在pH5处立即沉淀，如溶液中剩余的抗体百分比(C/Co，即溶液中的抗体的浓度除以总抗体)的降低所表明的(图4)。C/Co(％)是未沉淀的蛋白质除以初始蛋白质的百分比(％)。当C/Co(％)为0％时，沉淀完全。
随着离子强度降低，有可能实现更高水平的沉淀(4.7mS/cm比3.0mS/cm，其中mS为毫西门子，电导率的单位)。在pH 7，实现显著沉淀需要稀释(图5)。随着电导率降低，沉淀增加。在0.7mS/cm的电导率观察到完全的沉淀。在特定的电导率，一旦观察到最大水平的沉淀，添加额外的PVS引起沉淀物重溶解。
SPSFF池(图6)和HCCF(图7)的沉淀对SPSFF池和HCCF观察到类似的趋势。随着电导率降低，沉淀增加。在特定的电导率，一旦观察到最大水平的沉淀，添加额外的PVS引起沉淀物重溶解。
评估聚电解质分子量的影响 还生成了溶解度曲线来比较PVS与PAA。溶解度曲线是沉淀后上清液中留下的残余蛋白质(以百分比表述)对聚电解质浓度(以聚电解质摩尔数/抗体摩尔数表述)的曲线。在pH 5(图8)和pH 7(图9)为PAA(1200和8000Da)和PVS(1800Da)测量了一定范围的聚电解质当量每抗CD20抗体(rhuMab-2H7，pI 9.0，150kDa)里的溶解度曲线。与较低分子量形式(1200Da)的PAA和(1800Da)PVS聚电解质(图8)相比，较高分子量形式(8000Da)的PAA在pH 5和电导率值5mS/cm导致更多的沉淀(图8)。在pH 7，1.5mS/cm观察到类似的趋势(图9)。与较低分子量1200Da PAA和1800Da PVS聚电解质相比，较高分子量8000Da PAA在pH 7和电导率值1.5mS/cm导致更多沉淀。电导率的基础单位是西门子(S)，以前称作姆欧。电导率测量是温度依赖性的。电导率值表述为mS/cm。在两种情况中，较大的PAA聚电解质在进一步添加聚电解质引起沉淀物重溶解之前实现最大沉淀所需要的聚电解质浓度方面都具有较窄的操作范围。提高聚电解质分子量可容许在较高电导率实施沉淀。
用分子量范围1200Da至1,100,000Da内的PAA调查了聚电解质分子量对抗CD20抗体(利妥昔单抗)在pH 7和1.5mS/cm沉淀的影响(图10)。提高分子量导致这些条件下的沉淀增加。在pH 7和1.5mS/cm，直到使用分子量大于35,000Da(35kDa)的PAA才实现了完全沉淀。
还用分子量范围1800Da至1,132,000Da内的聚苯乙烯磺酸盐(PSS)调查了聚电解质分子量对人源化抗CD20抗体在pH 7和12mS/cm沉淀的影响(图33)。在此分子量范围里为人源化抗CD20抗体的PSS沉淀生成了溶解度曲线。提高分子量导致这些条件下的沉淀增加。在pH 7和12mS/cm，知道使用分子量大于220,000Da(220kDa)的PSS才实现了完全沉淀。使用PSS容许在较高电导率实施沉淀和将实现完全沉淀对降低池的电导率/离子强度的需要降至最低。
在表1的条件下测量了聚电解质分子量对杂质清除的影响，而且表2显示了下游加工结果。在沉淀步骤后，PAA 8000Da具有比PAA 1200Da或PVS高的中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)水平(表2)。对于QSFF池，对所有池观察到类似的CHOP水平，与纯化中所使用的聚电解质的分子量无关。两种分子量的PAA都减少浸出的蛋白A和抗体片段至类似的水平，而且对聚集体水平没有负面影响。
表1PAA沉淀条件 表2下游加工结果汇总
抗CD20抗体纯化 最初对聚电解质沉淀作为阳离子交换层析步骤的替代进行评估。阳离子交换步骤的主要功能是减少宿主细胞杂质，除去浸出的蛋白质、庆大霉素、DNA，和减少抗体聚集体，如果存在的话(图11)。胰岛素是通过先前的蛋白A步骤除去的。PVS沉淀步骤减少CHOP至与SPSFF步骤类似的水平。它还减少浸出的蛋白A和抗体片段。庆大霉素在沉淀步骤间有减少，只是程度与SPSFF步骤不同。DNA测定法在存在PVS的情况中不运行，因此不能在沉淀步骤间评估PVS清除。根据CDC活性的测量，添加沉淀步骤不增加抗体聚集体或影响生物学活性(图11和表3)。
为了提供更富挑战性的给料，直接在SPSFF柱间加工HCCF。在用作初始捕获步骤时，SPSFF池具有比蛋白A池高4倍的CHOP(图11)。％片段也比蛋白A捕获工艺高(9.24％比0.24％)。可能是在阳离子交换步骤间与抗体共纯化的蛋白酶导致抗体的剪裁。PVS沉淀步骤将片段减少5.63％。CHOP通过该工艺减少至4.1ng/mg，比较而言，没有沉淀步骤的情况中是71ng/mg。庆大霉素也被沉淀步骤显著减少(从146变成8ng/mg)。胰岛素和DNA被初始SPSFF捕获步骤减少至低水平，因而不能评估它们的清除。对照运行(SPSFF-QSFF)中的高片段水平导致降低的CDC活性，即87％(表3)。比较而言，PVS沉淀运行具有100％CDC活性。
还对PVS步骤作为自HCCF的直接捕获步骤进行评估。pH 7的PVS沉淀步骤除去胰岛素(图11)。比较而言，pH 5的PVS沉淀步骤仅仅部分降低胰岛素水平。pH 7的PVS沉淀清除比pH 5的沉淀多3倍的宿主细胞蛋白质。用正交层析方法(诸如疏水相互作用步骤)代替最终SPSFF步骤可进一步降低宿主细胞杂质。凭借pH 5捕获，在阳离子交换步骤间抗体片段有4.66％的增加。这在pH 7捕获步骤中没有发生。这提示在pH 5(与有SPSFF捕获步骤的情况非常相像)，酸性蛋白酶共纯化，引起抗体片段增加。根据CDC活性的测量，添加沉淀步骤不影响生物学活性(表3)。使用补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法对Q池分析生物学活性/效力。此测定法基于在存在人补体的情况中rhuMAb 2H7溶解WIL2-S细胞的能力的测量。
表3PVS沉淀对CDC活性的影响 使用基于RNA酶A抑制作用的FRET(荧光共振能量转移)测定法测定聚电解质清除(自重悬浮的抗体中除去聚电解质)。PVS是RNA酶A的有力抑制剂。该测定法使用在一端具有荧光标记物而在另一端具有淬灭物的RNA类似物。一旦RNA类似物受到RNA酶A的切割，荧光标记物自淬灭剂释放，产生发射。PVS的存在会抑制RNA酶A活性，限制荧光发射。然后可通过比较自测试样品观察到的荧光与标准曲线来测定PVS的量。在所有情况中，在QSFF层析上，PVS被清除到1μg/μl以下(表4)。
表4定量抗CD20抗体(2H7)沉淀后的PVS清除 rhuMab DR5Apomab纯化 开发和应用聚电解质沉淀工艺来纯化抗体rhuMab DR5Apomab(pI 8.0，150kDa)。含死亡结构域的受体-5(DR5)蛋白是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员(US 6872568；US 6743625)。标准层析工艺使用Prosep vA、SPSFF和QSFF树脂。修改聚电解质沉淀工艺来除去成问题的宿主细胞蛋白质杂质，谷胱甘肽-s-转移酶(GST)。Prosep vA步骤具有0.5M TMAC清洗，pH 5，而不是0.4M磷酸钾pH 7清洗。SPSFF步骤以浅梯度洗脱，产生大约12个柱体积的池体积。对PVS沉淀作为SPSFF步骤的替代进行评估。在pH范围5.5至7.0内生成溶解度曲线。随着pH升高，实现完全沉淀需要稀释来降低离子强度(图12和图13)。在图12中，实现完全沉淀需要随着pH升高而稀释来降低离子强度。在pH 5.5和电导率5.1mS/cm观察到完全沉淀。然而，在pH 6，必须将池稀释至3mS/cm来实现完全沉淀。在图13中，实现完全沉淀需要随着pH升高而稀释以降低离子强度。在pH 6.5，在1.5mS/cm观察到完全沉淀。在pH 7，必须将池稀释至0.7mS/cm来实现完全沉淀。
一旦实现了完全沉淀，添加额外的PVS引起沉淀物重溶解。图14中的照片图示了这种效应。图14图示了0.1％PVS(w/v)Apomab溶液烧瓶中的沉淀效应，及在1％PVS(w/v)时的重溶解。使用溶解度曲线来选择沉淀条件，如表5中所概述的。在介于pH 5.5和pH 7.0之间实施PVS沉淀。随着pH升高，产率略有降低，但是CHOP和浸出的蛋白A清除有所改善(表6)。随后在QSFF柱间加工这些池，并与对照运行进行比较(表6)。将CHOP清除至＜0.79ng/mg及将浸出的蛋白A清除至＜2ng/mg需要SPSFF步骤或PVS沉淀步骤，比较而言没有SPSFF或沉淀步骤的对照运行中有17ng/mg CHOP和4ng/mg浸出的蛋白A。PVS沉淀还展示了减少GST的能力，但是没有到与SPSFF步骤相同的水平。
表5Apomab沉淀条件 表6ApoMab纯化-Apomab中间池(a)和QSFF池(b)的下游加工结果
抗cMet纯化 由于有限的材料可得性，在一定范围的pH和选定的离子强度里为抗cMet生成溶解度曲线。溶解度曲线是自调节至pH 4-pH 7的蛋白A池生成的(图15)。使用这些曲线来选择实施制备规模沉淀的pH、离子强度和PVS浓度。在pH 4和电导率2mS/cm，抗cMet在大于40的PVS∶Ab摩尔比自溶液完全沉淀(图15)。在pH 5，在电导率1mS/cm和2.4mS/cm得到了溶解度曲线。在更高的电导率，抗cMet没有自溶液完全沉淀。通过将溶液电导率降低至1mS/cm，抗cMet更易于自溶液沉淀。在此电导率，在100的PVS∶Ab摩尔比发生了最大沉淀。在大于100的摩尔比，聚电解质复合物具有升高的溶解度，有可能是由于聚电解质电荷-电荷排斥效应。pH 4与pH 5(电导率约2mS/cm)的溶解度曲线的比较提示，溶液抗衡离子的静电屏蔽效应影响发生体相(bulkphase separation)分离的pH，而且溶液离子强度的降低对于升高的pH是必须的。在pH 6和pH 7及溶液电导率0.5mS/cm时，抗cMet在所测试的PVS浓度条件下没有自溶液完全沉淀。在pH 6和pH 7分别发生21％(C/Co＝.79)和12％(C/Co＝.88)的最大沉淀。抗cMet在pH 6和pH 7的溶解度曲线与具有类似蛋白质pI(8.3)的全长人源化抗体相比显著不同。例如，使用类似的条件，即pH7.0和电导率0.7mS/cm的溶液，Apomab完全沉淀(C/Co＝0)，在这些实验中使用了相同的R值。
将包括PVS沉淀的用于抗cMet(pI 8.3，100kDa)的纯化方法与使用四个层析步骤的标准方法(即先是蛋白A捕获，接着是两个以结合和洗脱模式运行的阳离子交换步骤，最后是以流经模式操作的疏水相互作用层析步骤)进行比较(表7)。阳离子交换步骤和疏水相互作用步骤都用PVS沉淀替代，接着是以流经模式运行的阴离子交换层析。在pH 4，可以在较高的离子强度实施沉淀反应。然而，pH 5的沉淀可给出更大程度地杂质清除，因为更多的宿主细胞杂质在此pH应当是带负电荷的，因此留在溶液中。根据溶解度曲线的测定，选择pH 5.0、电导率0.6mS/cm和PVS摩尔比100(0.1％w/v)的条件来使抗体沉淀最大化。抗cMet的PVS沉淀的回收率受到PVS抗体团粒溶解的影响。PVS抗体团粒是凝胶样的而且难以溶解。在团粒在QSFF平衡缓冲液中溶解后，溶液因微粒而混浊。容易地使用0.4μM真空滤器过滤溶液，得到清澈溶液，用于在Q-Sepharose阴离子交换层析上加工。
在pH 5、0.5mS/cm、和0.1％PVS(w/v)进行的PVS沉淀步骤将ECP降低至与CM-Sepharose步骤类似的水平(表7)。通过沉淀步骤，没有观察到浸出的蛋白A的显著降低或单体百分比的增加。
表7抗CMet下游加工结果汇总
用于沉淀物捕获的过滤条件的选择 在本发明的方法中可以使用具有特别适合于清除细胞培养液中生物学污染物的吸附过滤介质的深部滤器(Depth filter)。深部滤器典型地用于生物药物的生产，像衍生自哺乳动物细胞培养物的，用于澄清各种粗制品液。纤维素深部滤器，诸如可购自Millipore Corporation的
滤器，具有用吸附材料(诸如粒状吸附剂)制成的多孔固定床，装在不溶于水的热塑性容器(binder)中。所得复合滤器容许比常规深部滤器更高量的吸附剂及更小的吸附剂微粒。这些复合滤器包括一层紧密结构的纤维素深部介质，而且可根据特定应用来优化，诸如保留胶状微粒和细胞碎屑或保留全细胞和更大的碎屑。它们在单一滤筒中组合连续级别的介质，例如通过堆叠多张膜。此类深部滤器可用于精制或二次澄清过程，用以自含水产物(蛋白质)流除去小量的悬浮物。通过清除胶状污染物和其它细胞碎屑，该滤器还可以保护或延长更昂贵的下游分离过程(诸如无菌过滤和亲和层析)的使用寿命。另外，通过清除痕量的聚集的蛋白质，此类深部滤器对于病毒清除滤器的保护也是有用的。
某些深部滤器还能不同程度地保留一些在哺乳动物细胞培养物中常见地可溶性污染物，诸如核酸、宿主细胞蛋白质、脂质、表面活性剂、等。这种对某些可溶性污染物的保留能力基于深部过滤介质的吸附特性。深部滤器中通常采用的过滤介质包括精制的纤维素纤维(木浆和/或棉衍生的)、硅藻土、或水溶性热固性树脂粘合剂(US 2007/0193938)。这些复合物中的硅藻土(天然形式的含痕量的各种硅酸盐的硅土)通常为40-60％(以重量计)，吸附胶状大小生物学物质，诸如细胞碎片、细胞器和聚集的蛋白质，以及各种可溶性生物化学物质，诸如蛋白质、脂质和核酸(DNA和RNA)。
对深部过滤作为PVS抗体沉淀的捕获步骤进行了评估。沉淀物的大小分布宽对使用过滤来捕获沉淀物呈现了挑战。在正常流过滤条件下用沉淀的抗体测试了每一种过滤介质。对不同孔径大小的深部过滤介质筛选它们完全捕获沉淀物的能力。根据其完全捕获沉淀物及其加载高容量的能力来选择最佳的过滤介质。使用Vmax来评估穿过滤器的压力下降以及测定最大容量。表8显示了所评估的过滤介质。所评估的
CE(只有纤维素)系列介质包括20CE、35CE和45CE。所评估的
HC(纤维素和无机助滤剂)系列介质包括C0HC、B1HC和A1HC(Rathore等，2004年8月1日，BioPharm Intl.；US 2007/0193938)。
滤筒和滤片可得自MilliporeCorp.(Bedford，MA)。
如表8中所示，20CE介质与35CE和45CE相比更畅通(open)。20CE具有5-10微米的标定的孔径大小范围，而35CE和45CE分别具有2-4微米和0.8-2微米的标定的孔径大小。选择这些系列的过滤介质来缩小孔径大小范围，使其能够完全捕获抗体(人源化2H7变体)-PVS沉淀物。20CE介质导致沉淀物的45％捕获，而35CE导致沉淀物的48％被捕获。比较而言，45CE导致沉淀物的97％捕获。Millistak+HC系列介质比Millistak+CE系列更紧密。C0HC介质具有0.2-2微米的标定的孔径大小范围，而B1HC和A1HC分别具有范围为0.05-0.7微米和0.05-0.4微米的更紧密的孔径大小。所有三种都导致沉淀物的99％捕获。
表8 图34显示了每种过滤介质的容量(以每过滤面积的抗体(2H7)克数测量)对压力下降的Vmax图(表8)。设定17psi的压力极限来指明实验由于滤器污垢的结束。设定125g/m2的目标容量来指明实验在没有滤器污垢的情况中的结束。A1HC和B1HC过滤介质都达到了17psi，并且如此提供了最低容量。使用A1HC介质在过滤结束时的容量为40g/m2，而使用B1HC介质在过滤结束时的容量为68g/m2。C0HC以3.5psi的最大压力达到了125g/m2的极限容量。如上所述，20CE和30CE保留少于50％的沉淀物，因此没有测量目标容量。45CE以7psi的最大压力达到了目标容量。
为深部滤器内沉淀物的重溶解选择重溶解条件 评估了许多重溶解方法，用以自深部滤器回收所捕获的抗体。此步骤的目的是开发具有高抗体回收率的有力方法。所评估的第一种方法是使用高pH的高电导率缓冲液自沉淀物重溶解抗体。在高pH和电导率条件下，抗体所带正电荷较少且溶液中更多的离子屏蔽PVS和抗体，由此阻止沉淀。使用pH范围为8-8.5且电导率为约6mS/cm的50mM Tris碱/50mM乙酸钠缓冲液来重溶解抗体。用该缓冲液冲洗流过深部滤器，所得池含有抗体和PVS。评估完全重溶解抗体所需要的变量，诸如缓冲液的流速和体积。还对缓冲液流过深部滤器重循环作为生成更浓缩的池的方法进行了评估。
根据来自C0HC
过滤介质的2H7-PVS蛋白质-聚电解质沉淀物实现完全重溶解所必需的缓冲液体积，图35显示了不同流速对对产率的影响。使用600ml缓冲液，52-130LMH(升每平方米每小时，流速度量单位)和130-261LMH范围内的流量显示了类似的趋势，两条曲线导致类似的最终产率。使用600ml缓冲液，流量为130LMH时的曲线涵盖相同的趋势，而且也导致类似的产率。改变流速不会改善产率对缓冲液体积的比值。使用这种方法获得的最高抗体浓度是1g/L。
对缓冲液流过深部滤器重循环作为能潜在导致更浓缩的池的方法进行了评估。以装有缓冲液的水箱(reservoir)充当输入缓冲液和输出池二者的容器。如图36中所示，测试了两个流量范围(重溶解缓冲液流，以LMH为单位)来测定作为2H7-PVS蛋白质-聚电解质沉淀物自滤器回收大部分蛋白质的最佳加工时间。60分钟后，范围为130-261LMH的流量达到了与范围为261-522LMH的流量相同的产率(84％)。就池浓度而言，与缓冲液单次流过深部滤器相比，重循环方法导致更浓缩的池。使用重循环方法得到的最高抗体浓度是2g/L。
以连续模式操作沉淀反应和深部过滤捕获 PVS沉淀依赖于溶液中强阴离子PVS分子与仅略微阳离子抗体分子之间的离子相互作用。稀释蛋白质给料以将溶液的电导率降低至PVS沉淀可接受的范围会引起给料体积的大大增加。为了避免在制造规模可能的体积限制，有必要开发管线内(inline)调节给料条件的策划。管线内稀释可用于降低给料流的电导率且不需要混合罐。通过将PVS流与条件化给料流混合，PVS-抗体沉淀能在管线内发生且消除了规模化时对大沉淀罐的需要。图37描绘了以如下目标设定的管线内HCCF条件化/PVS沉淀的概况(i)长滞留时间和低流速以促进PVS-MAb微粒聚集；(ii)管线内反应器的横截面面积大以维持高加工通量；和(iii)实验室规模的执行。
虽然PVS和条件化给料流的管线内混合后可容易地发生PVS-抗体沉淀，但是PVS-抗体沉淀物微粒聚集过程对水流湍流、停留时间、和平均线性流速非常敏感。形成大得足以被过滤介质捕获的沉淀物微粒所需要的样品微粒聚集需要一段低搅动停留时间。高流速可阻止PVS-Ab沉淀物形成大聚集体，产生过滤介质可能难以捕获的很小沉淀物微粒流。
以实验室规模提供管线内连续式给料条件化/PVS沉淀管道连同深部过滤捕获方法，用以加工连续沉淀的给料流。对图37所示加工示意图观察到范围为71％-60％的抗体回收率(图38显示了抗体产率图)，有超过管线内PVS沉淀步骤9倍的CHOP清除。
阳离子聚电解质沉淀条件的选择 使用两种分子量的聚精氨酸(聚L-精氨酸)在CCF和HCCF中生成溶解度曲线。溶解度曲线是沉淀后上清液中留下的残余蛋白质(以百分比表述)对聚电解质浓度(以聚电解质(g)/溶液体积(mL)表述)的曲线。
在一定范围的离子强度里为rhuMab 2H7CCF(图20)和HCCF(通常在pH 7)生成溶解度曲线(图21和图22)。使用这些曲线来选择实施制备规模沉淀的最佳CHOP沉淀条件，即离子强度、聚精氨酸浓度和分子量。还用抗CD22和rhuMab C2B8HCCF生成溶解度曲线(图23和图24)以确保沉淀技术的稳健性(robustness)和一致性(consistency)。为了评估通过两个沉淀步骤、阳离子聚电解质沉淀、接着是阴离子聚电解质沉淀纯化抗体的可行性，为自CCF用0.075％w/v 110kDa聚精氨酸絮凝产生的rhuMab HCCF的PVS沉淀生成了溶解度曲线(图25)。随着聚精氨酸浓度的升高，有CHOP沉淀，正如上清液中残余CHOP(ng/mg)的减少所指明的。在0.2％w/v浓度的聚精氨酸发生最佳CHOP沉淀，CHOP减少22倍，产率95％。聚精氨酸浓度的进一步升高不会导致显著的CHOP减少，但是产率有降低。
CHOP沉淀表现为聚电解质的离子强度和分子量的函数，正如在rhuMab2H7HCCF溶解度曲线中所看到的(图21和图22)。随着电导率降低，沉淀有增加。一般而言，提高聚电解质的分子量表现出对CHOP沉淀有影响。在类似的聚精氨酸浓度，较高分子量的聚电解质(110kDa)比较低分子量的聚电解质(42kDa)沉淀的CHOP多。在特定的电导率(除了3mS/cm以外)，添加多于0.1％w/v的聚精氨酸不会导致进一步的显著的CHOP减少。在0.1％w/v的聚精氨酸浓度，用42kDa和110kDa分子量分别获得10倍和13倍的CHOP减少，而且两种分子量的产率都大于95％。
用抗CD22和rhuMab C2B8HCCF观察到类似的趋势，正如在rhuMab2H7、抗CD22、rhuMab C2B8HCCF溶解度曲线中所看到的(图23和图24)。用0.1％w/v 110kDa聚精氨酸沉淀抗CD22HCCF导致25倍的CHOP减少和95％的产率。用于rhuMab C2B8的最佳CHOP沉淀发生于0.15％w/v浓度的110kDa聚精氨酸，其导致20倍的CHOP减少和95％的产率。
随着PVS浓度升高，在所测试的pH和电导率，用聚精氨酸絮凝的给料中的抗体完全沉淀，以产率(％)的降低指示(图25)。这指明了聚精氨酸的存在对所测试的条件下抗体的PVS沉淀的最低限度干扰。在pH 7和1.5mS/cm电导率，一旦观察到最大水平的沉淀，添加额外的PVS就引起沉淀物重溶解。
rhuMab 2H7的下游加工 标准方法当前使用三个层析步骤，即蛋白A捕获步骤，后续阳离子和阴离子交换步骤。表9作为工艺流程a)显示了用0.075％w/v 110kDa聚精氨酸絮凝CCF及用PVS加工带抗体沉淀的HCCF，后续QSFF步骤。这个絮凝步骤的主要功能是通过除去固体(细胞碎屑)来澄清CCF，由此降低浊度和沉淀宿主细胞杂质(诸如CHOP和DNA)。聚精氨酸能够絮凝固体和细胞培养基成分，而且将CHOP减少至23480ng/mg(减少4倍)和完全除去DNA。如果将110kDa聚精氨酸的浓度提高至0.2％w/v，那么得到多达22倍的CHOP降低，正如溶解度曲线所指明的(图20)。所絮凝的HCCF的PVS沉淀进一步将CHOP减少至212ng/mg，这显著少于对照HCCF-PVS池中的CHOP。对照HCCF-PVS-Q池具有Poly(Arg)HCCF-PVS-Q池几乎两倍量的CHOP。DNA测定法在PVS存在的情况中不起作用，因此无法评估沉淀步骤间的PVS清除。除了PVS沉淀步骤之外的所有步骤间的产率都大于95％(表9)。PVS步骤的这些低产率可归于制备规模的沉淀规程和操作，而非沉淀的机制和条件(图25)。对这些池，没有评估百分比单体(通过SEC)、胰岛素和庆大霉素。
为了研究对下游加工的影响，用0.1％w/v 110kDa聚精氨酸沉淀HCCF并施行各种纯化方案。通过聚精氨酸沉淀，CHOP减少了18倍，DNA被完全消除，而且抗体的产率为97％。通过这种沉淀步骤没有清除胰岛素和庆大霉素。在下游加工所沉淀的HCCF之前，生成穿透曲线(breakthrough curve)以评估聚精氨酸对SPSFF树脂加载容量的影响。对于聚精氨酸沉淀的HCCF和沉淀后蛋白A池这两种加载，与对照(没有聚精氨酸沉淀)类似，在60mg抗体每ml树脂，SPSFF发生5％穿透。这指明了聚精氨酸对SPSFF的结合容量没有负面影响(图26和图27)。
标准抗体工艺(表9工艺流程b)穿过蛋白A加工聚精氨酸沉淀的HCCF，接着是离子交换层析。聚精氨酸-蛋白A池具有与对照蛋白A类似的CHOP水平，尽管加载给料中的CHOP水平差异很大。蛋白A步骤将庆大霉素和胰岛素降低至低水平。与没有沉淀步骤的情况中的307ng/mg相比，SPSFF将CHOP降低490倍至3ng/mg。与对照工艺(蛋白A-SPSFF-QSFF)相比，聚精氨酸-蛋白A-SP工艺还将DNA、浸出的蛋白A、胰岛素和庆大霉素降低至可接受的水平(表9)。由于聚精氨酸沉淀后的SPSFF池中的杂质水平是可接受的，因此没有必要在QSFF上加工它们。
非亲和抗体纯化工艺(表9工艺流程c)穿过SPSFF加工聚精氨酸沉淀的HCCF，接着是QSFF。与没有沉淀的情况中的6731ng/mg相比，沉淀后的SPSFF池具有63ng/mg CHOP(减少76倍)。SPSFF完全清除胰岛素并部分减少庆大霉素。聚精氨酸-SP工艺中的CHOP清除较好，而DNA、胰岛素和庆大霉素清除与对照工艺(SPSFF-QSFF)相当(图28)。在聚精氨酸沉淀后，SPSFF池中的CHOP水平与QSFF池类似，提示QSFF步骤在此工艺中是多余的。
两步沉淀/层析纯化工艺 聚精氨酸沉淀HCCF之后是PVS沉淀抗体，然后在QSFF上加工(表9工艺流程d)。与没有聚精氨酸沉淀的情况中的1517ng/mg相比，PVS池具有49ng/mg CHOP(减少99倍)。PVS沉淀步骤完全清除胰岛素并部分减少庆大霉素。聚精氨酸-PVS工艺中的CHOP清除较好，而DNA和胰岛素清除与对照工艺(SPSFF-QSFF)相当。在没有QSFF步骤的情况中，对照工艺中的庆大霉素清除少2倍。在聚精氨酸沉淀后，SPSFF池中的CHOP水平与QSFF池类似，提示QSFF步骤在此工艺中是多余的。
表9rhuMab 2H7下游加工结果汇总
*Q加载至30g/L；ND-未测定；NA-不适用 对抗体还原的抑制 将含有rhuMAb 2H7的HCCF用聚精氨酸处理并在不锈钢迷你罐中放置48小时，而且以规则的时间点采集样品并分析。在聚精氨酸沉淀HCCF的整个时间段里，抗体是完整的且没有还原(reduced)，相反，对照中的抗体在10小时时开始还原(图28)。通过使抗体还原剂与其它带负电荷的杂质一起沉淀，聚精氨酸抑制抗体还原剂。
对其它阳离子聚电解质的评估 为了进一步增强杂质消除的沉淀条件优化可包括使用其它聚电解质以及其它条件的优化，诸如搅动的速率和类型、及添加聚电解质的速率。选择另一种碱性聚氨基酸，即聚赖氨酸，来与聚精氨酸进行初步比较。聚精氨酸具有胍阳离子官能团，赋予其大约12.5的pKa。聚赖氨酸具有胺阳离子作为官能团，赋予其大约10.5的pKa。可以购得多种分子量形式的聚精氨酸和聚赖氨酸。
rhuMab C2B8蛋白A池溶解度曲线 带正电荷的聚阳离子聚电解质引起的CHOP沉淀与聚电解质的分子量和离子强度有关(图29和图30)。较低分子量的聚赖氨酸(2.5kDa)在电导率范围3-12mS/cm中不沉淀CHOP。然而，50kDa聚赖氨酸在3mS/cm和6mS/cm分别导致4倍和2倍的CHOP减少。在12mS/cm没有观察到显著的CHOP沉淀。一般而言，随着电导率降低，CHOP沉淀增加，而且提高聚电解质的分子量表现出对CHOP沉淀有影响。在较低的电导率，一旦获得最大CHOP沉淀，进一步添加聚赖氨酸导致沉淀物重溶解。对于所测试的所有条件，产率都大于95％。
rhuMab C2B8HCCF池溶解度曲线 对rhuMab C2B8HCCF观察到类似的趋势(图31和图32)。在3mS/cm和6mS/cm的电导率，50kDa和225kDa二者聚赖氨酸都导致9倍的CHOP减少。然而，在12mS/cm没有观察到显著的CHOP减少，甚至在225kDa聚赖氨酸的情况下都没有观察到显著的CHOP减少。这指明了在高电导率的CHOP沉淀需要高度带电荷的聚电解质(像聚精氨酸)来克服离子干扰。对于所有测试的条件，产率都大于90％。
使用聚精氨酸为三种抗体(rhuMab 2H7、抗CD22和rhuMab C2B8)生成溶解度曲线(图20-25和29-32)。CHOP沉淀是聚电解质的pKa、分子量和浓度以及溶液的离子强度的函数。抗体特性(诸如电荷密度和等电点)在杂质与抗体的分离中也可发挥作用。通过操作聚电解质浓度和离子强度来消除杂质(诸如CHOP和DNA)。聚电解质特性(诸如官能团、分子量、电荷密度和疏水性)可变化。聚精氨酸可用作CCF中的絮凝剂或HCCF中的杂质沉淀剂。沉淀是电导率依赖性的。获得了10-25倍的CHOP消除，而且检测不到DNA(表9)。聚精氨酸对SPSFF的结合容量没有负面影响，而且与使用阴离子聚电解质和阳离子交换树脂的抗体沉淀相容。对HCCF添加聚精氨酸也具有令人惊讶的和出乎意料的额外好处，包括抑制抗体还原，可能是通过使还原剂与其它杂质一起沉淀而实现的。
实施例 为了举例说明本发明，提供以下实施例。然而，应当理解，这些实施例不限制本发明，而且仅仅旨在提示实施本发明的方法。本领域技术人员会认识到，所描述的例示性的方法、方案、工艺、试剂、和装置可容易地在适应性改动后实施本发明的备选方法，认为它们也在本发明的范围内。
实施例1蛋白A层析 蛋白A柱使用Prosep vA树脂，而且用于纯化HCCF中存在的rhuMab 2H7。柱直径为2.5cm，而且床高度为14cm。以40CV/h(柱体积每小时)的流速操作柱。以多循环(2个循环)运行Prosep vA柱。平衡后，将HCCF应用于柱，而且rhuMab 2H7被保留在柱上。然后用平衡缓冲液清洗柱，接着用清洗缓冲液，再然后再次用平衡缓冲液清洗柱。完成这些清洗后，将洗脱缓冲液应用于柱。根据280nm处的吸光度(0.5OD)起始合并，并且在2个柱体积后终止。随后将再生缓冲液应用于柱。缓冲液组成和阶段持续时间示于表10。
表10Prosep vA缓冲液组成和阶段持续时间 可以使用可以与平衡缓冲液相同的加载缓冲液将衍生自重组宿主细胞的已收获的细胞培养液(HCCF)加载到经过平衡的固相上。随着含污染物的制备物流过固相，蛋白质被吸附至固定化的蛋白A，而其它污染物(诸如中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)，在CHO细胞中生成的蛋白质)可非特异性地结合至固相。通过在中间清洗步骤(intermediate wash step)中清洗固相，下一个相继实施的步骤需要除去结合至固相、抗体和/或蛋白A的污染物。加载后，可以用平衡缓冲液平衡固相，之后开始中间清洗步骤。中间清洗缓冲液可包含盐和其它化合物，所述其它化合物为(a)去污剂，例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；(b)溶剂，例如己二醇；和(c)聚合物，例如PEG。所采用的盐可以根据感兴趣蛋白质来选择，但是优选是乙酸盐(例如乙酸钠)。组合物中盐和其它化合物的量就是组合后洗脱污染物但基本上不消除感兴趣蛋白质的量。此类清洗缓冲液中的盐浓度的范围可以是约0.1M至约2M，或者约0.2M至约0.6M。有用的去污剂浓度为约0.01％至约5％，或者约0.1％至1％，或者约0.5％，例如其中去污剂是聚山梨醇酯。例示性的溶剂浓度为约1％至40％，或者约5至约25％。若其它化合物是聚合物(例如PEG 400或PEG 8000)，则它们的浓度可以是例如约1％至约20％，优选约5％至约15％。
在另一个实施方案中，中间清洗步骤涉及使用高度浓缩的缓冲溶液，例如浓度大于约0.8M的，例如高至约2M的，和优选在约0.8M至约1.5M范围内的，最优选约1M的缓冲液。在此实施方案中，缓冲液优选是Tris缓冲液，诸如Tris乙酸盐。中间清洗缓冲液的pH可以是约4至约8，或者约4.5至约5.5，或者约5.0。在另一个实施方案中，pH为约7.0。前一段的中间清洗步骤后，自柱回收感兴趣蛋白质。这通常使用合适的洗脱缓冲液来实现。例如可以使用具有低pH(例如在约2至约5的范围内的，而且优选在约2.5至约3.5的范围内的)的洗脱缓冲液自柱洗脱蛋白质。用于此目的的洗脱缓冲液的例子包括柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液。在蛋白A操作的洗脱阶段期间，任何非特异性结合的CHOP可以与感兴趣蛋白质共洗脱，损害产物池的纯度。为了在洗脱阶段之前除去CHOP，例如，可以使用氯化四甲铵(TMAC)进行中间清洗步骤以除去CHOP(US 6870034；US 6127526；US 6333398)。
实施例2SPSFF层析 阳离子交换柱使用SPSFF(SP Sepharose Fast Flow)树脂，而且以结合和洗脱模式及梯度洗脱操作。以150cm/h的流速操作SPSFF柱。在所有情况中，柱高度为30cm。在加工中间层析池(Prosep vA和QSFF池)时，使用0.66cm i.d.柱，而且加载柱至40g/L。在加工HCCF时，使用0.6-2.2cm直径柱，而且加载柱至10-40g/L。在所有情况中，将加载条件化至pH 5.0和约5.5mS/cm的电导率。加载后，用平衡缓冲液清洗柱，接着用清洗缓冲液，然后再次用平衡缓冲液。完成这些清洗步骤后，在15个柱体积里在50mM乙酸盐至350mM乙酸盐的梯度中洗脱rhuMab 2H7。根据280nm处的吸光度(0.5OD)起始和终止合并。用0.5N氢氧化钠再生和清洁柱，并在0.1N氢氧化钠中保存。缓冲液组成和阶段持续时间示于表11。
表11SPSFF缓冲液组成和阶段持续时间 实施例3阴离子交换层析 阴离子交换柱使用QSFF(Q Sepharose Fast Flow)树脂，而且以流通(flowthrough)模式操作。以150cm/h的流速操作QSFF柱。柱直径为0.66cm，而且床高度为20cm。在pH 8.0平衡和加载柱。rhuMab 2H7抗体流过柱，然后用平衡缓冲液清洗柱。根据280nm处的吸光度(0.5OD)起始和终止合并。用0.5N氢氧化钠再生和清洁柱，并在0.1N氢氧化钠中保存。缓冲液组成和阶段持续时间示于表12。
表12QSFF缓冲液组成和阶段持续时间 实施例4a阴离子聚电解质纯化 将抗体池调节至表13中概述的pH和电导率。将HCCF用1M乙酸调节至pH 6，并用WFI(冲洗用水)调节至电导率2.0mS/cm。在20分钟时间段里将PVS管线内添加至条件化HCCF以达到终浓度0.05％w/v。混合时，将PVS添加至条件化池至表13中概述的终浓度。使用Sorval R3-CB离心机将PVS沉淀池以4000rpm(4657g)在10℃离心30分钟。除去上清液，并用25mM MOPS，pH 7.1清洗团粒。将团粒重悬于50mM Tris，50mM乙酸盐，pH 8.0(约6.5mS/cm)随后经过QSFF层析加工重悬浮的团粒。
实施例4b阳离子聚电解质纯化 细胞培养液(CCF)沉淀用分子量110kDa的聚精氨酸实施杂质沉淀。在以100rpm混合的同时，在5分钟时间段里在生物反应器中将聚精氨酸添加至CCF以达到终浓度0.075％w/v。然后将絮凝的CCF以10000g离心，并通过0.2μm滤器无菌过滤。
已收获的细胞培养液(HCCF)沉淀在以100rpm混合的同时，在5分钟时间段里在生物反应物中将聚精氨酸(聚-L-精氨酸)添加至HCCF以达到终浓度0.1％w/v。然后将沉淀的HCCF以5000g离心，并通过0.2μm滤器无菌过滤。通过不同纯化工艺加工过滤后的给料(feed stock)。
表132H7的PVS沉淀条件 实施例5蛋白质浓度测定 使用具有10mm路径长度的流动室的8453分光光度计(Agilent)通过280nm处的吸光度(减去320nm处的吸光度来校正光散射)来测定池中的抗体浓度。采用1.75ml/(mg cm)的消光系数。使用如下方程计算抗体浓度
实施例6大小排阻层析 使用大小排阻层析来监测天然条件下rhuMAb 2H7的大小异质性。该测定法采用TSK-GEL G3000SWXL柱(7.8mm×300mm，Tosohaas)来分离聚集体、单体、和片段。使用0.20M磷酸钾，0.25M氯化钾pH 6.2运行缓冲液以0.3mL/min的流速操作柱。于环境温度操作柱。在运行缓冲液中稀释样品，并且每种样品注射20μg。使用280nm处的吸光度来监测聚集体、单体和片段的水平。
实施例7CHOP ELISA-Y42 通过使用山羊抗CHOP抗体的酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定所有池中的CHOP浓度。为了ELISA，将亲和纯化的山羊抗CHOP抗体固定化在微量滴定板的孔上。在所述孔中温育池样品的稀释液，接着与偶联有过氧化物酶的山羊抗CHOP抗体一起温育。用产生比色信号的邻苯二胺定量辣根过氧化物酶的酶活性。将样品在测定稀释剂中系列稀释，使得吸光度读数落在测定法的范围内(5-320ng/ml)。
实施例8蛋白A ELISA-Y80 通过夹心式蛋白A ELISA测定蛋白A水平。将鸡抗葡萄球菌蛋白A抗体固定化在微量滴定板的孔上。将样品稀释至0.2mg/ml抗体并应用至孔。如果存在于样品中的话，蛋白A结合包被抗体。用偶联有辣根过氧化物酶的抗蛋白A抗体检测所结合的蛋白A。用产生比色信号的邻苯二胺定量辣根过氧化物酶的酶活性。
实施例9胰岛素ELISA-Y64 通过使用豚鼠抗胰岛素多克隆抗体的ELISA来测定所有池中的胰岛素浓度。为了ELISA，将亲和纯化的抗胰岛素抗体固定化在微量滴定板的孔上。在孔中温育池样品的稀释液，接着与偶联有辣根过氧化物酶的豚鼠抗胰岛素抗体一起温育。用四甲基联苯胺定量辣根过氧化物酶的酶活性。将样品在测定稀释剂中系列稀释，使得吸光度读数落在测定法的范围内(0.094-3.000ng/mL)。
实施例10庆大霉素ELISA-Y81 使用竞争性ELISA来测定所有池中的庆大霉素浓度。将针对庆大霉素-BSA的山羊多克隆抗体固定化在微量滴定板的孔上。庆大霉素与生物素化庆大霉素竞争对抗体的结合。添加辣根过氧化物酶-链霉素和邻苯二胺底物来检测所结合的生物素标记的庆大霉素的量。将样品在测定稀释剂中系列稀释，使得吸光度读数落在测定法的范围内(0.37-90ng/ml)。
实施例11CHO DNA PCR测定法-Y77 通过CHO DNA的PCR扩增来定量DNA。首先使用Qiagen的病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen’s Viral RNA Mini kit)自样品和对照提取DNA。然后将提取物和标准曲线与含有引物和探针的PCR Master混合物一起以96孔板格式加载到商业性序列检测系统(Applied Biosystems)上，在那里通过实时PCR定量CHO DNA。
PCR采用设计成对靶CHO DNA序列特异性的引物和探针。使用5’端标记有报道染料但受到3’端的淬灭染料遏制的荧光探针测量产物扩增。Taq聚合酶开始靶DNA的扩增，并且在达到探针时，它的5’核酸酶活性置换探针，释放报道染料。随着报道染料不再接近淬灭染料，报道物发荧光，并且测量发射强度的增加。为标准曲线计算越过阈值(Ct)扩增DNA的循环数，针对该标准曲线定量未知样品浓度。
实施例12rhuMAb 2H7效力 使用补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法测定rhuMAb 2H7效力。此测定法基于测量rhuMAb 2H7在存在人补体的情况中溶解WIL2-S细胞的能力。
实施例13PVS的RNA酶A抑制测定法 PVS是RNA酶的强效抑制剂。该测定法使用一端有荧光标记物、另一端淬灭剂的RNA类似物。一旦RNA类似物受到RNA酶A的切割，荧光标记物自淬灭剂释放，产生发射。PVS的存在会抑制RNA酶A活性，限制荧光发射。然后能通过比较对测试样品观察到的荧光与标准曲线来测定PVS的量。
认为上述描述仅仅是本发明原理的例示。此外，由于众多修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的，因此不希望将本发明限制于如上文所描述的所述精确构建和工艺。因而，可认为所有合适的修改和等同情况落在所附权利要求限定的本发明范围内。
词语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”在用于本说明书和所附权利要求书时旨在说明所述特征、整数、成分、或步骤的存在，但是它们不排除一种或多种其它特征、整数、成分、步骤、或其组合的存在或增加。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种纯化抗体的方法，包括
(a)调节含有抗体的混合物的酸度或盐浓度，其中该抗体来自已收获的细胞培养液且该已收获的细胞培养液来自哺乳动物细胞培养物；
(b)添加带负电荷的聚电解质，由此形成蛋白质-聚电解质沉淀，其中所述带负电荷的聚电解质选自聚乙烯基磺酸、聚乙烯基磺酸盐、聚苯乙烯磺酸、和聚丙烯酸且其中所述带负电荷的聚电解质具有1.2到1,100kDa的分子量；
(c)将蛋白质-聚电解质沉淀与选自下组的杂质分开蛋白质聚集体、蛋白质片段、宿主细胞蛋白质、胰岛素、庆大霉素、DNA、和浸出的蛋白A；
(d)分离蛋白质-聚电解质沉淀；并
(e)在水溶液中重悬浮蛋白质-聚电解质沉淀。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、抗体片段、和融合蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体选自抗CD20抗体、抗DR5抗体、和抗CMET抗体。
4.权利要求3的方法，其中所述抗CD20抗体是2H7。
5.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢细胞培养物。
6.权利要求1的方法，其中所述蛋白质通过该蛋白质在蛋白A吸附剂上的固定化而来自已收获的细胞培养液。
7.权利要求1的方法，其中所述蛋白质通过阳离子交换层析而来自已收获的细胞培养液。
8.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是自已收获的细胞培养液直接捕获的。
9.权利要求1的方法，其中添加超过一种的带负电荷的聚电解质至混合物。
10.权利要求1的方法，其中所述带负电荷的聚电解质在含有蛋白质的混合物中的浓度介于0.01％到1.0％重量/体积之间。
11.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是以分批模式或连续模式形成的。
12.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是通过离心而分离的。
13.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是通过过滤而分离的。
14.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是通过深部过滤而分离的。
15.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是通过使重溶解缓冲液流过滤器一次而重溶解的。
16.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是通过使重溶解缓冲液经过滤器重循环而重悬浮的。
17.权利要求1的方法，其中所述聚电解质是通过阴离子交换纯化而与重悬浮的蛋白质-聚电解质沉淀分开的。
18.一种纯化抗体的方法，包括
(a)调节含有抗体的混合物的酸度或盐浓度，其中该抗体来自细胞培养液且该细胞培养液来自哺乳动物细胞培养物；
(b)添加选自具有42到110kDa的分子量的聚精氨酸和具有2.5到225kDa的分子量的聚赖氨酸的带正电荷的聚阳离子聚电解质至混合物，由此形成包含带正电荷的聚阳离子聚电解质和选自下组的杂质的沉淀蛋白质聚集体、蛋白质片段、宿主细胞蛋白质、胰岛素、庆大霉素和DNA；并
(c)将沉淀与包含抗体的混合物分开。
19.权利要求18的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢细胞培养物。
20.权利要求18的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、抗体片段、和融合蛋白。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体是抗CD20抗体或抗CD22抗体。
22.权利要求21的方法，其中所述抗CD20抗体是2H7。
23.权利要求18的方法，其中添加超过一种的带正电荷的聚阳离子聚电解质至混合物。
24.权利要求18的方法，其中所述带正电荷的聚阳离子聚电解质在含有蛋白质的混合物中的浓度介于0.01％到1％重量/体积之间。
25.权利要求18的方法，其中所述沉淀是以分批模式或连续模式形成的。
26.权利要求18的方法，其中所述沉淀是通过离心而与混合物分开的。
27.权利要求18的方法，其中所述沉淀是通过过滤而与混合物分开的。
权利要求
1.一种纯化抗体的方法，包括
(a)调节含有抗体的混合物的酸度或盐浓度，其中该抗体来自已收获的细胞培养液；
(b)添加带负电荷的聚电解质，由此形成蛋白质-聚电解质沉淀；
(c)将蛋白质-聚电解质沉淀与选自下组的杂质分开蛋白质聚集体、蛋白质片段、宿主细胞蛋白质、胰岛素、庆大霉素、DNA、和浸出的蛋白A；
(d)分离蛋白质-聚电解质沉淀；并
(e)在水溶液中重悬浮蛋白质-聚电解质沉淀。
2.权利要求1的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、抗体片段、和融合蛋白。
3.权利要求2的方法，其中所述抗体选自抗CD20抗体、抗DR5抗体、和抗CMET抗体。
4.权利要求3的方法，其中所述抗CD20抗体是2H7。
5.权利要求1的方法，其中所述已收获的细胞培养液来自哺乳动物细胞培养物。
6.权利要求5的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢细胞培养物。
7.权利要求1的方法，其中所述已收获的细胞培养液来自微生物发酵。
8.权利要求7的方法，其中所述微生物发酵是大肠杆菌发酵。
9.权利要求1的方法，其中所述蛋白质通过该蛋白质在蛋白A吸附剂上的固定化而来自已收获的细胞培养液。
10.权利要求1的方法，其中所述蛋白质通过阳离子交换层析而来自已收获的细胞培养液。
11.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是自已收获的细胞培养液直接捕获的。
12.权利要求1的方法，其中所述带负电荷的聚电解质具有磺酸或羧酸官能度。
13.权利要求1的方法，其中所述带负电荷的聚电解质选自聚乙烯基磺酸、聚乙烯基磺酸盐、聚苯乙烯磺酸、和聚丙烯酸。
14.权利要求1的方法，其中添加超过一种的带负电荷的聚电解质至混合物。
15.权利要求1的方法，其中所述带负电荷的聚电解质具有1200到1,100,000Da的分子量。
16.权利要求1的方法，其中所述带负电荷的聚电解质在含有蛋白质的混合物中的浓度介于0.01％到1.0％重量/体积之间。
17.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是以分批模式或连续模式形成的。
18.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是通过离心而分离的。
19.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是通过过滤而分离的。
20.权利要求1的方法，其中所述蛋白质-聚电解质沉淀是通过深部过滤而分离的。
21.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是通过使重溶解缓冲液流过滤器一次而重溶解的。
22.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是通过使重溶解缓冲液经过滤器重循环而重悬浮的。
23.权利要求1的方法，其中所述聚电解质是通过阴离子交换层析而与重悬浮的蛋白质-聚电解质沉淀分开的。
24.一种纯化抗体的方法，包括
(a)调节含有抗体的混合物的酸度或盐浓度，其中该抗体来自细胞培养液；
(b)添加带正电荷的聚阳离子聚电解质至混合物，由此形成包含带正电荷的聚阳离子聚电解质和选自下组的杂质的沉淀蛋白质聚集体、蛋白质片段、宿主细胞蛋白质、胰岛素、庆大霉素和DNA；并
(c)将沉淀与包含抗体的混合物分开。
25.权利要求24的方法，其中所述细胞培养液来自哺乳动物细胞培养物。
26.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是中国仓鼠卵巢细胞培养物。
27.权利要求24的方法，其中所述细胞培养液来自微生物发酵。
28.权利要求24的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体、抗体片段、和融合蛋白。
29.权利要求28的方法，其中所述抗体是抗CD20抗体或抗CD22抗体。
30.权利要求29的方法，其中所述抗CD20抗体是2H7。
31.权利要求24的方法，其中所述带正电荷的聚阳离子聚电解质具有氨基或胍基官能度。
32.权利要求24的方法，其中所述带正电荷的聚阳离子聚电解质选自聚精氨酸和聚赖氨酸。
33.权利要求24的方法，其中添加超过一种的带正电荷的聚阳离子聚电解质至混合物。
34.权利要求24的方法，其中所述带正电荷的聚阳离子聚电解质具有2500到225000Da的分子量。
35.权利要求24的方法，其中所述带正电荷的聚阳离子聚电解质在含有蛋白质的混合物中的浓度介于0.01％到1％重量/体积之间。
36.权利要求24的方法，其中所述沉淀是以分批模式或连续模式形成的。
37.权利要求26的方法，其中所述沉淀是通过离心而与混合物分开的。
38.权利要求26的方法，其中所述沉淀是通过过滤而与混合物分开的。
全文摘要
本发明提供了用于分离和纯化抗体的方法，其通过添加聚电解质至细胞培养液，诸如已收获的细胞培养液，并沉淀抗体-聚电解质复合物或杂质与聚电解质的复合物。
文档编号A61K31/198GK101646431SQ200880009317
公开日2010年2月10日 申请日期2008年1月10日 优先权日2007年1月22日
发明者罗伯特·L·法尔纳, 杰米·富兰克林, 保罗·J·麦克唐纳, 坦马亚·佩拉姆, 维克拉姆·西索迪亚, 科拉宗·维克塔 申请人:健泰科生物技术公司