包含壳聚糖和植酸的缓释壳聚糖胶囊的制作方法

专利名称：包含壳聚糖和植酸的缓释壳聚糖胶囊的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种壳聚糖胶囊、制备该胶囊的方法以及包含该胶囊的药物、食品和
化妆品组合物，在壳聚糖胶囊中，可溶活性成分被包封在包含壳聚糖和植酸的基质中。由 于本发明的壳聚糖胶囊通过作为生物可降解聚合物的壳聚糖与能够快速并有效地与壳聚
糖聚合物形成交联反应的植酸的离子凝胶化(ionic gelation)反应形成，所以能够包封 90%或更多的可溶活性成分，并且通过防止活性成分在胃的酸性环境中受损并表现出长时 间适当地缓慢释放活性成分的缓释机制来提高活性成分的体内递送效率。
背景技术：
为了可溶活性成分在体内有效的递送、消化和吸收，需要能够在具有低pH的高酸 性条件下的胃中保护被包封的可溶活性成分，并且能够在肠道中缓慢释放需要相对长保留 时间的内含物的控制系统。活性成分的包封对于获得该控制系统十分关键。包封技术是这 样的工艺，即，通过包封技术使固态、液态或气态的可溶活性成分被另一材料或系统涂覆， 或者落入另一材料或系统中，使得可溶活性成分在特定环境下释放。通常来讲，将合成聚合 物或天然聚合物用作胶囊材料。 壳聚糖是一种由甲壳素脱乙酰产生的天然阳离子多糖，具有优异的可生物降解 性和生物相容性以及低毒性的特点[J. Microencapsulation 2000， 17，625 638]。由于 其多价阳离子，壳聚糖具有优良的成胶性和膜形成特性，并且能够易于与阴离子材料结合 [J. Chem. Technol. Biotechnol. 1990， 49， 395 404]，并且壳聚糖表现出对粘膜组织(例 如肠道)的优异的粘膜粘附性(mucoadhesiveness) [J. Pharm. Sci. 2003,92,567 576]。 因此，已经进行了许多关于药物或功能材料通过使用壳聚糖的包封的体内递送有效性的研 允。 乳化交联法[Int. J. Pharm. 1994， 11,217 222]、乳滴聚结法[Pharm. Res. 1999， 16， 1830 1835]、反向胶束方法[J. ControlledRelease 2001， 17， 317 323]、喷雾干燥法 {Int. J. Pharm. ， 1994,217 222] 、0/W/0多重乳化方法[第10-2005-0014831号韩国专利 申请]等已被广泛用于使用壳聚糖来制备胶囊。 由于壳聚糖本身不能被制成胶囊，所以已经开发出离子凝胶化方法以通过多价阳 离子壳聚糖和作为交联剂的阴性反离子之间的快速交联反应来在短时间内形成胶囊。离子 凝胶化可以通过交联反应而在聚合物的表面上形成可溶的膜，并且通过相分离来完成包封 工艺。如上制备的胶囊由包含合成或天然的聚合物组成，并且提供释放可控的内含物。内含 物的释放速率由胶囊膜的化学结构、厚度和尺寸、组成胶囊的成分的浓度、内含物的浓度、 交联剂的浓度、介质pH等控制[Int. J. Pharm. 2004,274， 1 33 ;J. Controlled Release, 2004， 150， 5 28]。 已使用戊二醛和硫酸作为为壳聚糖的离子凝胶化而加入的交联剂 [J. Microencapsulation 1998，15，373 382 ;J. Microencapsulation 2002，19，173 180 ;第10-1998-0056584号和第10-2003-0085599号韩国专利申请]。然而，由于戊二醛
4和硫酸的毒性，所以不能将它们直接应用到食品，它们仅有限地使用在药物领域中。
最近，已经开发出通过使用用于体内药物递送的低毒性交联剂来制备壳聚糖胶 囊的技术。Moliaro等[Biomaterials 2002,23,2717 2722]和EveRuel-Gari印y等 [European J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2004， 57， 53 63]已经开发出通 过加入能够向壳聚糖溶液提供反离子的磷酸甘油而能够通过热处理形成壳聚糖凝胶的药 物递送系统。另外，有多种用于壳聚糖的交联剂，例如海藻酸[第6，365，1S7 B2号美国 专利；第6，534，091 Bl号美国专利]以及例如羧甲基纤维素钠和黄原胶的聚合物[第 2006-0016164号韩国专利公开，第2001-0025930号韩国专利公开]。具体来讲，存在通过使 用三聚磷酸盐(TPP)作为交联剂来制备壳聚糖胶囊的总体趋势[Int. J. Pharm. 2002,249， 165 174 ;J. Pharm. Sci. 2002,91， 1396 1404 ;Int. J. Pharm. 2003,250,215 226 ;Int. J. Pharm. 2006,311， 187 195]。然而，这些方法存在包封产量低、制造工艺复杂、药物在胃 中过度释放和降解、药物释放的过度抑制等问题。因而，尽管将壳聚糖用于可溶活性成分的 包封具有许多上述优点，但是其商业化和应用受到限制。因此，需要使用新型交联剂来制备 壳聚糖胶囊，以获得高包封产量，并且使之在胃中的高酸性环境下受到保护，同时在肠中逐 渐释放活性成分。

发明内容
技术问题 本发明旨在解决现有技术中的上述问题。本发明的目的在于通过使用壳聚糖和作 为交联剂的毒性低的多价阴离子植酸来构建快速且有效的交联系统来提供一种缓释壳聚 糖胶囊，从而壳聚糖胶囊包封率高、防止可溶活性成分受损、在胃中呈现出高稳定性，并且 在肠中缓慢释放被包封的可溶活性成分。 本发明的另一目的在于提供一种通过使用植酸来使生物相容性阳离子聚合物交 联的方法，以及通过使用上述方法制备缓释壳聚糖胶囊的方法。 本发明的又一目的在于提供包含缓释壳聚糖胶囊的药物组合物、食品组合物和化
妆品组合物。 技术方案 本发明提供一种壳聚糖胶囊，其中，可溶活性成分被包封在包含壳聚糖和植酸的 基质中。 本发明还提供一种通过使用植酸而将生物相容性聚合物交联的方法。 此外，本发明提供一种制备壳聚糖胶囊的方法，所述方法包括以下步骤第一步，
制备包含壳聚糖和可溶活性成分的水溶液；第二步，制备包含植酸的水溶液；第三步，使在
第一步中制备的水溶液与在第二步中制备的水溶液接触，以执行离子凝胶化。 另外，本发明提供包含壳聚糖胶囊的药物组合物、食品组合物和化妆品组合物。 有益效果 根据本发明制备的壳聚糖胶囊显示出可溶活性成分的高包封率，并保护可溶活性 成分免于被损坏，由此提高生理活性物质的体内递送效率。此外，壳聚糖胶囊在胃中的酸性 条件下保持被包封的可溶活性成分的高稳定性，并在肠内的中性条件下展现出缓释作用。 因此，能够在消化器官处通过缓释来显著提高被包封的可溶活性成分的体内生物利用率，并能够有效地将壳聚糖胶囊应用于包括医药制剂、食品或化妆品的各个工业领域。


图1是示出根据本发明实施例制备壳聚糖胶囊的工艺的示图。 图2是示出牛血清白蛋白包封率与根据示例1制备的壳聚糖-植酸胶囊中的植酸
的浓度和PH的关系图。 图3是示出当用人工胃液处理根据示例1制备的壳聚糖-植酸胶囊时牛血清白蛋 白的释放量与植酸的浓度和PH的关系图。 图4是示出牛血清白蛋白包封率与根据对比例1制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊 中的三聚磷酸盐的浓度和pH的关系图。 图5是示出当用人工胃液处理根据对比例1制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊时牛 血清白蛋白的释放量与三聚磷酸盐的浓度和PH的关系图。 图6是示出当用人工胃液和肠液处理根据示例2制备的壳聚糖-植酸胶囊和根据 对比例1制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊时牛血清白蛋白的累积释放量与时间的关系图。
图7是根据制备示例2制备的胶囊的扫描电子显微镜(SEM)照片。
图8是根据对比例1制备的胶囊的SEM照片。
图9是将图7的照片放大十倍时的SEM照片。
图10是将图8的照片放大十倍时的SEM照片。 图11是示出胰岛素的包封率与根据示例3制备的壳聚糖-植酸胶囊中的胰岛素 溶液的浓度的关系图表。 图12是示出壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的胰岛素包封率与根据对比例2制备的壳 聚糖-三聚磷酸盐胶囊中的三聚磷酸盐的浓度和PH的关系图表。 图13是示出当用人工胃液处理根据示例4制备的壳聚糖-植酸胶囊时胰岛素的 释放量与植酸的浓度和pH的关系图。 图14是示出当用人工胃液处理根据对比例2制备的壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊时 胰岛素的释放量与三聚磷酸盐的浓度和PH的关系图。 图15是示出当用人工胃液和肠液处理根据示例4通过使用分别具有pHl、 pH 2、 pH 4和pH 6的6%的植酸溶液制备的四种壳聚糖-植酸胶囊时胰岛素的释放量与24小时 的时间的关系图。 图16是示出当用人工胃液和肠液处理根据对比例2通过使用分别具有pH 3、 pH 5和pH 7的6%的三聚磷酸盐溶液制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊时胰岛素的释放量与时 间的关系图。 图17是示出当用人工胃液和肠液处理根据本发明通过使用分别具有pHl和pH 6
的6X的植酸溶液制备的两种壳聚糖-植酸胶囊和通过使用具有pH 7的6%的三聚磷酸盐
溶液制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊时胰岛素的释放量与时间的关系图。 图18是示出当将根据本发明通过使用分别具有pH 1和pH 6的6%的植酸溶液
制备的两种壳聚糖-植酸胶囊和通过使用具有pH 7的6%的三聚磷酸盐溶液制备的壳聚
糖-三聚磷酸盐胶囊分别口服给糖尿病小鼠时测量的血糖水平的曲线图。 图19是用数字示出图18的结果的图表。
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图20是示出在将通过使用具有pH 1的6%的植酸溶液制备的壳聚糖_胰岛素胶囊口服给糖尿病小鼠之后的4个小时内壳聚糖-胰岛素胶囊的降糖作用与其剂量的关系曲线图。 图21是示出当将通过使用具有pH 1的6%的植酸溶液制备的壳聚糖_胰岛素胶囊口服给糖尿病小鼠之后的3小时内壳聚糖-胰岛素胶囊的降糖作用与其剂量的关系图。
图22是示出当将通过使用具有pH 1的6%的植酸溶液制备的壳聚糖_胰岛素胶囊口服给糖尿病小鼠之后的24小时内壳聚糖-胰岛素胶囊的降糖作用与其剂量的关系曲线图。 图23是示出当植酸溶液的浓度为6%时壳聚糖_植酸胶囊的生长激素包封率与植酸溶液的酸度的关系图。 图24是示出在植酸的浓度为6%的情况下在用人工胃液处理壳聚糖_植酸胶囊之后的2个小时内壳聚糖-植酸胶囊中的生长激素的残留量与植酸溶液的酸度的关系图。
图25是示出当用人工胃液和肠液处理在植酸溶液的可变pH条件下通过使用6%的植酸溶液制备的壳聚糖_植酸胶囊之后的24个小时内生长激素的释放量与植酸溶液的酸度的关系图。 图26是示出当用人工胃液和肠液处理在植酸溶液的可变pH条件下通过使用6%的植酸溶液制备的壳聚糖_植酸胶囊时生长激素的释放量与植酸溶液的酸度随时间的关系图。
具体实施例方式
本发明涉及一种包含可溶活性成分的壳聚糖胶囊，所述可溶活性成分被包封在含有壳聚糖和植酸的基质中。本发明的壳聚糖胶囊的特征在于，它显示出对可溶活性成分的高包封率，通过防止活性成分免于被损坏并展现出其依赖pH的缓释作用来提高活性成分的体内递送效率。 在下文中，将详细描述根据本发明的壳聚糖胶囊。 对于将要包封在包封基质中的可溶活性成分的种类没有限制。本发明的可溶活性成分可以包括能够溶于水的所有种类的物质，而不考虑其功能和分子结构，优选地，可以将药物活性成分、食品活性成分和化妆品活性成分中的一种或多种作为例子对本发明的可溶活性成分进行说明。因为包含在基质中的壳聚糖和植酸显示出高生物稳定性，所以壳聚糖胶囊通过防止活性成分免于被损坏来提高活性成分的体内递送效率。另外，壳聚糖胶囊显示出依赖pH的缓释作用，由此将包封的活性成分递送并释放到肠，同时稳定地将其保持在胃中。因此，壳聚糖胶囊能够使活性成分的体内吸收最大化。本发明的壳聚糖胶囊能够有效地应用于食品、医药制剂、化妆品等，从而展现出显著改善的功效。此外，对于所使用的活性成分的种类没有限制，可以不受限制地使用在食品、医药和化妆品领域中传统上使用的所有种类的活性成分。这些活性成分的示例可以包括核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、类脂、糖脂、植物源化合物、动物源化合物或微生物源化合物、植物提取物、合成化合物、维生素、微生物、病毒、它们的混合物等等，但不限于此。肽或蛋白质的示例可以包括血清蛋白、人类生长激素、干扰素、集落剌激因子、白细胞介素、巨噬细胞活化因子、B细胞因子、T细胞因子、蛋白质A、过敏抑制因子、细胞坏死糖蛋白、抗毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转化生长因子、a-l抗胰蛋白酶、白蛋白、阿朴脂蛋白-E、红细胞生成 素、因子VII、因子VIII、因子IX、血纤维蛋白溶酶原活化因子、尿激酶、链激酶、蛋白质C、 c-反应蛋白、超氧化物歧化酶、血小板源生长因子、上表皮生长因子、骨生成促进蛋白质、胰 岛素、心钠素、软骨诱导剂、结缔组织活化因子、促卵泡激素、促黄体激素、神经生长因子、松 弛素、生长调节素、胰岛素样生长因子、縮胆囊素、单克隆或多克隆病毒抗体、单克隆或多克 隆细菌抗体、单克隆或多克隆毒素抗体和病毒源疫苗抗原。上面列出的肽或蛋白质可以包 括天然存在的产品、人工合成的产品和重组工程化的产品。此外，除了上面列出的肽或蛋白 质之外，通过各种方法(例如，氨基酸或结构域的加成、取代或消去或者糖基化)改性的其 类似物或突变异种也包括在本发明内。作为可溶活性成分，维生素的示例可以包括水溶性 维生素，例如维生素B及其衍生物和维生素C及其衍生物；那些植物提取物可以包括野生人 参、人参或红参的皂角苷、异黄酮、类黄酮、白藜芦醇等等；那些微生物源化合物可以包括曲 酸及其衍生物、多聚谷氨酸、果聚糖等等；那些微生物可以包括乳酸菌等等。
对于在本发明中使用的壳聚糖的种类没有限制，但是优选使用包含D-氨基葡萄 糖的线性多糖作为脱乙酰单元，并使用N-乙酰基-D-氨基葡萄糖作为乙酰化单元。这样的 壳聚糖的示例可以包括聚[e-(l-4)-2-氨基-2-氧-D-妣喃葡萄糖]及其衍生物。壳聚糖 衍生物的示例可以包括硫代壳聚糖、三甲基化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、N_(2-羟丙基-3-三 甲基铵)壳聚糖氯化物等。优选地，适合于本发明的壳聚糖的平均分子量范围可以为从 30， 000到1， 000， 000道尔顿，更优选地为80， 000至300， 000道尔顿。在使用平均分子量小 于30， 000道尔顿的壳聚糖的情况下，由于壳聚糖溶液的粘性太低，所以理解到包封产率降 低。另一方面，当壳聚糖的平均分子量超过1， 000， 000道尔顿时，壳聚糖溶液展现出过高的 粘性，这会给继续进行包封带来困难。 根据本发明的壳聚糖胶囊的基质包括除了壳聚糖以外的植酸，其作用是作为壳聚 糖交联的交联剂。植酸包含在所有种类的植物(具体为种子和谷类)中，植酸具有通过与碱 结合形成中性盐的性质。还称作肌醇六磷酸的植酸由通过酯键结合到肌醇环的六分子磷酸 盐的组成，其中，磷酸盐对称地结合到肌醇环上，如式1所示。将植酸的结构与式2表示的 已经广泛地用作生物相容性聚合物(例如壳聚糖)的交联剂的三聚磷酸盐的结构相比，已
经发现，植酸中的能够与壳聚糖的阳离子反应的阴离子是三聚磷酸盐中的两倍或更多倍。
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<formula>formula see original document page 9</formula> 因为本发明的壳聚糖胶囊使用植酸(植酸作为生物活性成分是安全的)，并包含 能够与壳聚糖反应的许多阴离子，所以能够显示出与壳聚糖的改善的反应性，并提供体内 稳定性。根据壳聚糖与植酸的刚性结合，本发明的壳聚糖胶囊具有孔较少的稳固结构。壳聚 糖胶囊的这种结构不仅能够提高活性成分的包封率，而且能够防止消化酶(其能够降解消 化道黏膜和/或分布于其上部的粘液层中的生理活性物质)接近活性成分，由此能够防止 活性成分被消化液损坏。具体地说，当要递送的活性成分是蛋白质时，本发明的壳聚糖胶囊 防止蛋白质与存在于消化道中的蛋白酶接触，由此保护活性成分。如上所述，本发明的胶囊 提高了活性成分的包封率，并防止活性成分被损坏，进而提高了活性成分的体内递送效率。 此外，本发明的壳聚糖胶囊具有依赖pH的缓释特性。具体地说，因为本发明的壳 聚糖胶囊在酸性条件下非常稳定，所以当口服时，它在低PH条件下(例如在胃中)不释放
被包封的可溶活性成分，但是在中性条件下(例如在小肠内)逐渐释放被包封的可溶活性 成分。 另外，本发明提供了一种通过使用植酸来使生物相容性聚合物交联的方法。生物 相容性聚合物优选是阳离子聚合物，在本发明中将用作生物相容性聚合物的壳聚糖作为例 子进行说明。 如上所述，植酸的阴离子是通常用作传统的生物相容性阳离子聚合物的交联剂的 三聚磷酸盐的两倍或更多倍。因此，植酸能够有效地用在与阳性反离子的交联反应(例如， 离子凝胶反应等)中。当通过使用生物相容性聚合物(例如，壳聚糖)来制备胶囊时，通常 采用这种离子凝胶反应，这种离子凝胶反应是一种通过阳离子生物相容性聚合物与具有与 其相反的离子的交联剂的快速反应在短时间内形成胶囊的方法。过去，植酸被认为是与各
<formula>formula see original document page 9</formula>种有用矿物螯合的抗营养成分，进而抑制有用矿物的吸收和使用。近来，植酸的这种螯合效 应已经用于中和、解毒或释放有害物质、辐射污染物或致癌物质。然而，没有在诸如离子凝 胶反应的交联反应中使用植酸的尝试。本发明使用植酸作为用于阳离子生物相容性聚合物 (例如，壳聚糖)的交联剂，当将这种用途应用于根据本发明的制备壳聚糖胶囊的以下方法 时，能够比现有技术更快速地且稳定地形成胶囊。 此外，本发明提供了一种制备壳聚糖胶囊的方法，所述方法包括第一步骤，制备 包含壳聚糖和可溶活性成分的水溶液；第二步骤，制备包含植酸的水溶液；第三步骤，将在 第一步骤中制备的水溶液与在第二步骤中制备的水溶液相接触，以执行壳聚糖与植酸的离 子凝胶反应。 在下文中，将更详细地描述根据本发明的制备壳聚糖胶囊的方法的每个步骤。 在根据本发明的制备壳聚糖胶囊的方法中，第一步骤优选包括 (a)通过将壳聚糖添加到水溶液中来制备壳聚糖水溶液； (b)制备可溶活性成分水溶液； (c)将壳聚糖水溶液与可溶活性成分水溶液混合。 在步骤(a)中，壳聚糖水溶液优选包含弱酸。这时，优选的是，包含浓度范围为 0.01% (w/v)至20% (w/v)、更优选为1% (w/v)至3% (w/v)的弱酸，但不限于此。如果壳 聚糖水溶液中的弱酸的浓度低于0.01% (w/v)，则难以溶解足够量的壳聚糖。另一方面，如 果其超过20% (w/v)，则壳聚糖水溶液的酸性变得太高，这对将要包封的活性成分产生坏 影响。对于弱酸的种类没有限制，可以使用诸如醋酸、乳酸、柠檬酸、蚁酸、乳酸、抗坏血酸、 草酸等的有机酸和诸如稀盐酸、稀硫酸等的无机酸。在本发明中，更优选的是使用醋酸。在 这种情况下，优选的是制备具有pH 6或以下的醋酸溶液。 此外，步骤(a)的壳聚糖水溶液优选包含浓度范围为0. 01% -50% (w/v)、更优选 为1%-5% (w/v)的壳聚糖。如果壳聚糖水溶液中的壳聚糖的浓度低于0.01% (w/v)，则 壳聚糖水溶液的粘性太低，并且壳聚糖的量太小以至于不能形成胶囊，因此难以制成胶囊。 相反，如果其超过50% (w/v)，则由于壳聚糖水溶液的粘性太高，所以难以执行包封工艺。
步骤(b)的可溶活性成分水溶液可以如下制备将活性成分溶于诸如蒸馏水之类 的水相中；如果需要，通过将所得的溶液静置来去除气泡。在可溶活性成分水溶液中，可溶 活性成分的含量优选为0.01% (w/v)或更多，更优选为1% (w/v)或更多。如果可溶活性 成分水溶液中的可溶活性成分的浓度在0. 01% (w/v)以下，则将要体内递送的活性成分的 量太低，因而即便包封的活性成分被吸收，被包封的活性成分仍可能不能发挥其期望的功 能。然而，以上描述仅仅是本发明的示例，并根据在本发明中使用的活性成分的种类和胶囊 的用途，可以修改活性成分的含量。因此，对于活性成分的含量的上限没有限制，但是优选 的是使用溶液饱含活性成分的饱和溶液。例如，活性成分水溶液可以包含3% -40% (w/v) 的可溶活性成分。 通过传统的混合方法执行步骤(c)中的壳聚糖水溶液与可溶活性成分水溶液的 混合。即，将可溶活性成分水溶液添加到壳聚糖水溶液中，然后通过搅拌器来分散可溶活性 成分。然后，如果需要，将所得的溶液静置片刻，以去除气泡。 在根据本发明制备壳聚糖胶囊的方法中，第二步骤是制备含植酸的水溶液。
第二步骤的植酸水溶液优选具有pH 0. 5至pH 7，更优选具有pH 1至pH6，最优选具有pH 1至pH 2。如果植酸水溶液的pH在0. 5以下，则其酸性太强，从而对包封的活性成 分产生坏影响。另一方面，如果其pH超过7，则存在降低包封产率的问题。
此外，对于第二步骤的植酸水溶液中的植酸的含量没有限制，但优选的是O. 1% (w/v)或更高，更有选的是2% (w/v)或更高。这时，对于植酸的含量的上限没有限制，但优 选的是使用水溶液饱含植酸的饱和溶液。更优选地，植酸水溶液中的植酸的含量为8% (w/ v)或以下。如果植酸水溶液中的植酸的含量低于0_1% (w/v)，则交联剂太少，胶囊的包封 率和在胃液中的稳定性出现降低。如果与植酸的饱和状态相比过量地添加植酸，则植酸溶 液的酸性太高，从而对将要包封的活性成分产生坏影响。 对于控制植酸水溶液的浓度和pH的方法没有限制，其可以通过在本领域中公知 的传统方法来实现。例如，将植酸溶液添加到蒸馏水，并搅拌，以调节植酸对水的浓度，然后 通过使用诸如5N氢氧化钠溶液之类的碱来调整其pH。 在根据本发明制备壳聚糖胶囊的方法中，第三步骤是通过将在第一步骤中制备的 水溶液与在第二步骤中制备的水溶液相接触来执行壳聚糖和植酸之间的离子凝胶反应的 步骤。这时，对于水溶液之间的接触方法没有限制，其可以通过在本领域中公知的传统方法 来实现。接触方法的示例可以包括在搅拌下将在第一步骤中制备的水溶液与在第二步骤 中制备的水溶液混合的方法；将在第二步骤中制备的水溶液滴到在第一步骤中制备的水溶 液的方法；将在第一步骤中制备的水溶液滴到在第二步骤中制备的水溶液的方法。就诸如 反应时间之类的效率而言，优选的是将在第一步骤中制备的水溶液滴到在第二步骤中制备 的水溶液。上述的滴水溶液的方法如下执行通过诸如压力输送泵、离心泵、级联泵、水力隔 膜泵、螺旋泵等的计量泵来递送特定量的待滴水溶液；通过诸如注射器、空气喷嘴、压力喷 嘴、超声波喷嘴、旋转喷雾器等的装置以滴的方式添加递送的水溶液。对于凝胶反应没有限 制，但优选的是，以0°C -S(TC的温度范围执行凝胶反应达10秒至60分钟，更优选的是，以 2°C _401:的温度范围执行凝胶反应达1分钟至30分钟。 根据本发明的制备壳聚糖胶囊的方法还可以选自于由以下步骤组成的组中的至 少一个步骤将第三步中制备的壳聚糖胶囊分离，洗涤壳聚糖胶囊和干燥壳聚糖胶囊。
可以使用现有技术中的传统方法(例如过滤等)来执行壳聚糖胶囊的分离，可以 使用蒸馏水等来执行壳聚糖胶囊的洗涤，并且同样可以使用传统的干燥方法(优选为冷冻 干燥)来执行壳聚糖胶囊的干燥。 在实施例中，本发明的壳聚糖胶囊可以按照如下制备。将用作胶囊的主要成分的 壳聚糖溶解在1%的醋酸水溶液中，以制备壳聚糖溶液。将可溶活性成分溶解在水溶液(例 如蒸馏水)中，以制备可溶活性成分水溶液。将制备的两种水溶液混合并搅拌，以制备壳聚 糖_可溶活性成分溶液，之后将该壳聚糖_可溶活性成分溶液逐滴加入植酸水溶液中，以制 备胶囊。此时，通过在落入交联剂溶液中的壳聚糖-可溶活性成分溶液液滴的表面上形成 膜，同时使壳聚糖的多价阳离子结合到植酸的多价阴离子来使胶囊成型。此外，植酸颗粒具 有渗入胶囊的高扩散性，并结合胶囊内部和胶囊表面的壳聚糖分子，致使形成非常坚硬、稳 定和不溶解的胶囊。使制备的胶囊从水溶液中分离，并且通过冷冻干燥等方法将其洗涤并 干燥，从而获得球形胶囊。上述方法的每个步骤将在图1中示出。 在本发明的方法中，优选使用这样的方法，即，将壳聚糖和可溶活性成分的混合溶 液以滴加的方式加入植酸水溶液中，但是同样可以使用这样的方法，即，将可溶活性成分与作为交联剂的植酸水溶液混合，然后将所得的溶液以滴加的方式加入到壳聚糖水溶液中。 然而，在后一种情形中，由于壳聚糖的分子量通常大于植酸的分子量，并且壳聚糖扩散进入 植酸和可溶活性成分的混合物中，所以需要长时间来执行壳聚糖与植酸的交联反应。因而， 问题在于，与将第一步制备的水溶液以滴加的方式加入到在第二步制备的水溶液中的方法 相比包封产量低。 此外，本发明涉及包含本发明的壳聚糖胶囊和药物可接受载体的药物组合物。
此时，对于使用的载体的种类没有限制，并且能够非限制地使用在药物领域传统 使用的载体和媒介。载体的示例可以包括离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋 白(例如，人血清白蛋白)、缓冲材料(例如多种磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和蔬 菜脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、盐或电解质(例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸 氢钾、氯化钠和锌盐)、胶原硅石、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基板、聚乙二醇、羧甲 基纤维素钠，多芳基化合物(polyarylate)、蜡、聚乙二醇、羊毛脂等，但不局限于此。本发明 的药物组合物还可以包括润滑剂、保湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂，以及上述成分以外的成 分。可以使用本发明的壳聚糖胶囊和药物可接受的载体通过现有技术中已知的传统方法来 制备本发明的药物组合物，并且对方法没有限制。 此外，本发明提供一种包含本发明的壳聚糖胶囊和食品添加剂的食品组合物。
本发明的食品组合物可以包括功能食品(例如健康补充食品和健康食品)，并且 还包括食品添加剂(例如可发挥效力(sitologically)的载体、赋形剂和/或稀释剂)。 上述载体、赋形剂和/或稀释剂的示例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖 醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤 维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸 镁、矿物油等，但并不局限于此。可以使用本发明的壳聚糖胶囊和食品添加剂通过现有技术 中已知的传统方法来制备本发明的食品组合物。 本发明提供了一种包含本发明的壳聚糖胶囊和化妆品添加剂的化妆品组合物。
化妆品添加剂的示例可以包括乳化剂、增稠剂(例如金属硅酸盐、黄原胶、纤维素 和卡波姆)、水相物(例如蒸馏水、丙二醇、l，3-丁二醇、甘油、甜菜碱或山梨醇)、防腐剂、香 料和染料，但并不局限于此。可以使用本发明的壳聚糖胶囊和化妆品添加剂通过现有技术 中已知的传统方法来制备本发明的化妆品组合物。
实施例 在下文中，现在将参照下面的示例来详细描述本发明。示例仅出于举例说明的目
的，并且本发明并不局限于此。 制备例1 :壳聚糖溶液的制备 将壳聚糖加入到具有1 % (v/v)酸度的醋酸溶液中，使其终浓度变为3% (w/v)， 并且使用磁力搅拌器以300rpm搅拌该混合物10分钟，从而获得壳聚糖溶液。此时，用作生 物可降解聚合物的壳聚糖的平均分子量为85， 000道尔顿，并且当所述壳聚糖溶解在0. 5% (w/v)的醋酸溶液中而使其浓度变为0.5% (w/v)时，表现出大约5.6cps的粘度和大约 98%的脱乙酰率。 制备例2 :牛血清白蛋白_壳聚糖水溶液的制备 将用作可溶活性成分的牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)溶解在去离子水中，以获得15% (w/v)的浓度。将该水溶液加入到制备例1中制备的壳聚糖水溶液中，使用磁力搅 拌器以500rpm搅拌10分钟以使牛血清白蛋白分散，然后将牛血清白蛋白静置一会儿以去 除壳聚糖溶液中的气泡，从而获得牛血清白蛋白_壳聚糖水溶液。
示例1 :包含牛血清白蛋白的壳聚糖_植酸胶囊的制备 将植酸水溶液的溶度分别调整至3%、4%和5%，并且有差别地调整每种水溶液 的pH为1、2、4和6，从而制备胶囊。具体来讲，向蒸馏水中加入植酸溶液，并进行搅拌以调 节植酸在水中的浓度，然后使用5. ON的氢氧化钠溶液调节其pH。利用计量泵将在制备例 2中制备的牛血清白蛋白-壳聚糖水溶液逐滴加入到所得的溶液中，并且使所得的混合物 反应30分钟以引发壳聚糖和植酸之间的键合，从而制备胶囊。将所制备的胶囊与混合物分 离，用蒸馏水洗涤两次或三次，然后通过冻干法干燥。此时，在_401:执行4小时初始的冷冻 工艺，然后使胶囊在-3(TC干燥3小时，在-l(TC干燥2小时，在Ot:干燥1小时，在2(TC干 燥2小时，并在3(TC干燥5小时。 实验例1 :壳聚糖-植酸胶囊的牛血清白蛋白包封率 为了测定植酸的浓度和pH对包封程度的影响，对示例1中制备的每种胶囊的牛血 清白蛋白包封率进行计算。通过Bradford法对胶囊形成之后留在植酸溶液中的未包封白 蛋白的量进行测定，并且使用该数据对胶囊的牛血清白蛋白包封率进行计算。该结果在图2 中示出。如图2所示，当植酸溶液具有pH 1和pH 2时，无论植酸的浓度如何，胶囊表现出 100X的包封率，在pH 4和pH 6的情况，取决于植酸的浓度，胶囊表现出60%至80%的包 封率。 实验例2 :包含牛血清白蛋白的壳聚糖-植酸胶囊在人工胃液中的稳定性
将示例1中制备的每种胶囊放到pH 1. 2的人工胃液(HC1浓度为0. 7% (v/v)且 NaCl浓度为0. 2% (w/v)的水溶液)中，并且在37°C的培养振荡器中以100rpm振荡2小 时。此后，通过Bradford法对释放到人工胃液中的牛血清白蛋白的量进行测定。使用用人 工胃液处理2小时之后的数据对释放到人工胃液的牛血清白蛋白的量进行计算，结果在图 3中示出。如图3所示，当植酸溶液具有pH l或pH 2时，在2小时之后牛血清白蛋白的量 (0-30%)最低，并且植酸的浓度越高，牛血清白蛋白的释放量越低。通过这些结果证实，使 用具有高酸度(PH 1-2)且浓度高(5% )的植酸的植酸溶液制备的壳聚糖-植酸胶囊在酸 性环境下(例如胃液)更稳定。 示例2 :包含牛血清白蛋白的壳聚糖_植酸胶囊的制备 将通过与制备例1中描述的方法相同的方法制备的壳聚糖溶液和通过与制备例2 中描述的方法相同的方法制备的牛血清白蛋白溶液按照重量比9 : l混合，并且使用搅拌 器将所得的混合物以100rpm搅拌10分钟，从而制备包含牛血清白蛋白的壳聚糖溶液。将 58% (w/w)植酸溶液加入到蒸馏水中，使得植酸的终浓度为5% (w/V)，并且使用5N NaOH 溶液将其pH调整为pHl，从而制备植酸溶液。将制备的牛血清白蛋白_壳聚糖溶液通过压 力输送泵装置递送到注射器，并且将该溶液以滴加的方式加入到制备的植酸溶液，从而通 过壳聚糖和植酸之间的结合形成球形的胶囊。通过过滤将胶囊与剩余的植酸溶液分离。用 蒸馏水洗涤分离的胶囊，以去除残留在其表面的植酸，并且将胶囊进行冷冻干燥，从而形成 根据本发明的胶囊。 对比例1 :包含牛血清白蛋白的壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊的制备
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在通过使用三聚磷酸盐(被广泛地用作制备壳聚糖胶囊的交联剂)制备壳聚糖胶 囊之后，对可溶活性成分的包封率及其在胃液中的稳定性进行测定，并且与根据本发明制 备的壳聚糖_植酸胶囊的包封率和稳定性进行比较。首先，使用与示例2描述的方法相同 的方法来制备牛血清白蛋白-壳聚糖溶液。为了选择适合制备胶囊的三聚磷酸盐的浓度和 pH，将三聚磷酸盐水溶液的浓度调整为2X (w/v)、4% (w/v)和6% (w/v)，并且将每种水溶 液调整为pH 3、pH 5和pH 7。使用与示例2描述的方法相同的方法来制备壳聚糖-三聚 磷酸盐胶囊。
比较实验例1 :壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊的牛血清白蛋白包封率 用与在实验例1中描述的方法相同的方法测定在对比例中制备的壳聚糖-三聚磷
酸盐胶囊的牛血清白蛋白包封率，结果在图4中示出。如图4所示，当壳聚糖-三聚磷酸盐
胶囊的pH为7且三聚磷酸盐浓度为4% (w/v)和6% (w/v)时，对比例1中的壳聚糖_三
聚磷酸盐胶囊表现出最高的包封率，但是仅为85%，低于根据本发明的示例的包封率。 比较实验例2 :包含牛血清白蛋白的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊在人工胃液中的稳
定性 通过与在实验例2中描述的方法相同的方法测定在对比例1中制备的壳聚糖-三 聚磷酸盐胶囊在人工胃液中的稳定性，结果在图5中示出。如图5所示，在对比例中制备的 壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊中，其在人工胃液中最稳定的pH为pH7。此外，即使三聚磷酸盐的 浓度是6 % (w/v)，也会有55 %或更多的牛血清白蛋白释放到人工胃液中，仅有45 %或更少 的牛血清白蛋白留在胶囊中。因此证实，壳聚糖和三聚磷酸盐之间的结合亲和力比壳聚糖 和植酸之间的结合亲和力弱，并且这样的结合容易在胃液的强酸性条件下破坏，从而使胶 囊对包封的可溶活性成分的保护效果劣化。 实验例3 :对壳聚糖-植酸胶囊和壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的牛血清白蛋白在肠 中的缓释的测定 在包封的可溶活性成分通过肠壁吸收的情况下，如果胶囊的外壁在肠中没有破 裂，则包封在胶囊内部的可溶活性成分的生物利用率就会被劣化。因而，为了检测制备的胶 囊的生物利用率，制备人工胃液(pH 1. 2)和人工肠液(0. 2M含25X (v/v) KH2P04和0. 2N含 11.8% (v/v)NaOH的水溶液，pH 6. 8)。然后，测定在根据本发明示例2中制备的壳聚糖-植 酸胶囊的牛血清白蛋白的释放量，以及在对比例1中通过使用pH 7且三聚磷酸盐浓度为 6% (w/v)的溶液而制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的牛血清白蛋白的释放量。结果，根据 本发明制备的壳聚糖-植酸胶囊表现出对可溶活性成分100%的包封率。当将胶囊放在与 实验例2的人工胃液相同的人工胃液中且在37t:的培养振荡器中以100rpm振荡2小时时， 其显示20%或低于20%的量的被包封的可溶活性成分被释放。另一方面，在相同的条件 下，壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊显示50%或更高的量的牛血清白蛋白被释放。当将在人工胃 液中振荡的胶囊放入人工肠液中并在37t:以100rpm振荡时，如图6所示，从壳聚糖-植酸 胶囊释放的可溶活性成分的累积的量在4小时后为10%，在10小时后为40%，这意味着可 溶活性成分被逐渐释放。然而，在壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的情况下，显示在4小时内牛血 清白蛋白的累积释放量为100%。从这些结果可以看出，根据本发明制备的胶囊表现出依赖 于PH的缓释特性。从这些结果可以预计，80 %或更多的包封的可溶活性成分从壳聚糖_植 酸胶囊释放，并在肠内被吸收；而50%或低于50%的包封的可溶活性成分从壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊释放，并在肠内被吸收。 实验例4 :壳聚糖_植酸胶囊和壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊的照片分析
使用电子显微镜对示例2中制备的壳聚糖-植酸胶囊的表面和对比例1中使用pH 为7且三聚磷酸盐浓度为6% (w/v)制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的表面进行照相，这些 表面示出在图7和图8中。如图7和图8所示，使用电子显微镜观察到两种胶囊具有相对 意义上的球形形状。然而，示例2的胶囊表现出更稳定的形状(其表面平滑且坚实)，如图 7中所示，而对比例1的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊具有非常粗糙且有裂缝的表面，如图8中 所示。当在更高的放大倍率下观察时，这样的差异更加显著(见图9和图10)。这些结果表 明植酸更加有力地键合到壳聚糖，从而形成具有少许裂缝的平滑的膜表面，这提高了胶囊 在酸性条件下对可溶活性成分的保护作用。
制备例3 :胰岛素-壳聚糖水溶液的制备 将作为可溶活性成分的胰岛素(Sigma-Aldrich)溶解在0. IN的HC1溶液中，终浓 度为3% (w/v)、5% (w/v)、10% (w/v)和15% (w/v)。将每种胰岛素溶液加入到制备例1 中制备的壳聚糖水溶液中，利用磁力搅拌器以500rpm搅拌10分钟以分散胰岛素，然后静置 一会儿以去除壳聚糖溶液中的气泡，从而获得胰岛素_壳聚糖水溶液。
示例3 :包含胰岛素的壳聚糖_植酸胶囊的制备 制备浓度为5%的植酸水溶液，将它的pH调整到l，从而制得胶囊。具体地讲，将 植酸溶液加入到蒸馏水中，并搅拌以调节植酸在水中的浓度，然后用2. ON的氢氧化钠溶液 调节它的PH。使用计量泵将制备例3中制备的胰岛素_壳聚糖溶液逐滴加入到所得的溶 液中，使所得的混合物反应，以引发壳聚糖和植酸之间的键合，从而制得胶囊。将制备的胶 囊与混合物分离，用蒸馏水洗涤两次或三次，然后用冻干法干燥。此时，在-4(TC执行4小 时的初始冷冻工艺，然后将胶囊在_301:干燥3小时，在-l(TC干燥2小时，在Ot:干燥1小 时，在2(TC干燥2小时，在3(TC干燥5小时。
实验例5 :壳聚糖-植酸胶囊的胰岛素包封率 为了测量根据胰岛素浓度的包封程度，计算示例3中制备的每种胶囊的胰岛素包 封率。利用HPLC测量胶囊形成之后植酸溶液中剩余的未包封胰岛素的量，并利用数据计算 胶囊的胰岛素包封率。结果示出在图ll中。如图ll中所示，当植酸溶液的pH为l时，胰 岛素的浓度越低，包封率越高。具体地讲，在胰岛素的浓度为3%的情况下，表现出100%的 包封率。 对比例2 :包含胰岛素的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的制备 在使用三聚磷酸盐制备壳聚糖胶囊之后(其中，三聚磷酸盐已广泛地用作制备壳 聚糖胶囊的交联剂)，测量它对可溶活性成分的包封率和其在胃液中的稳定性，并将其与根 据本发明制备的壳聚糖-植酸胶囊做比较。首先，在制备例3中制备胰岛素浓度为3% (w/ v)的胰岛素溶液，并且通过制备例3中所述的相同的方法制备胰岛素-壳聚糖溶液。为了 选择适于制备胶囊的三聚磷酸盐的浓度和pH，将三聚磷酸盐水溶液的浓度分别调整至4% (w/v)、5% (w/v)、6% (w/v)和7% (w/v)，并将每种水溶液的pH调整至3、5和7。通过示 例3中描述的相同的方法来制备胶囊。 对比实验例3 :壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的胰岛素包封率 通过实验例5中所述的相同的方法来测量对比例2中制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊的胰岛素包封率，结果示出在图12中。如图12所示，在对比例的壳聚糖胶囊的情况 下，当三聚磷酸盐的浓度为4%或者更高时，胰岛素包封率受三聚磷酸盐的浓度的影响不明 显，三聚磷酸盐水溶液的pH变化对胰岛素包封率有显著影响。当pH为7且三聚磷酸盐的 浓度为4% (w/v)、5% (w/v)和6% (w/v)时，壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊表现出最高的包封 率，但它是大约90%，这低于本发明的示例的包封率。
示例4 :包含胰岛素的壳聚糖_植酸胶囊的制备 为了测量根据用作交联剂的植酸的浓度和pH的胰岛素包封程度，根据制备例3的 胰岛素_壳聚糖水溶液中表现出最高胰岛素包封率的方法来制备包含胰岛素的壳聚糖溶 液。也就是说，将胰岛素浓度为3% (w/v)的胰岛素水溶液和通过制备例1中所述的相同 的方法制备的壳聚糖溶液混合，使得壳聚糖溶液与胰岛素溶液的重量比为9 : l，并用搅拌 器以100rpm搅拌IO分钟，从而制得包含胰岛素的壳聚糖溶液。用蒸馏水稀释58% (w/w) 的植酸溶液，使植酸溶液的植酸浓度为4% (w/w)、5% (w/w)、6% (w/w)和7% (w/w)，利用 5N的NaOH溶液将每种溶液的pH调整至1、2、4和6，从而制得植酸溶液。通过压力输送泵 将制备的胰岛素_壳聚糖溶液输送到注射器，并以滴加的方式将制备的胰岛素_壳聚糖溶 液加入到制备的植酸溶液中，从而通过壳聚糖和植酸之间的键合来形成球状胶囊。通过过 滤将胶囊与剩余的植酸溶液分离。用蒸馏水洗涤分离的胶囊，以去除胶囊表面上残余的植 酸，并对制备的胶囊进行冻干，从而形成根据本发明的胶囊。
实验例6 :包含胰岛素的壳聚糖-植酸胶囊在人工胃液中的稳定性
将示例4中制备的每种胶囊放到pH为1. 2的人工胃液(HCl浓度为O. 7% (v/v)且 NaCl浓度为0.2X (w/v)的水溶液)中，并在37°C的振荡培养器中以100rpm振荡2小时。 然后，通过HPLC测量释放到人工胃液中的胰岛素的量。使用用人工胃液处理2小时之后获 得的数据来计算释放到人工胃液中的胰岛素的量，结果示出在图13中。如图13中所示，可 以看出当植酸溶液的pH为l或6时，2小时之后胰岛素的释放量(40% 70%)最低，并 且当植酸的浓度为6%时，胰岛素的释放量最低。从这些结果确定了 使用植酸浓度高(为 6% )的植酸溶液在酸性(pH为1)条件或弱酸性(pH为6)条件下制备的壳聚糖_植酸胶 囊在诸如胃液的酸性条件下更为稳定。 对比实验例4 :包含胰岛素的壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊在人工胃液中的稳定性
通过实验例6中所述的相同的方法来测量对比例2中制备的壳聚糖-三聚磷酸盐 胶囊在人工胃液中的稳定性，结果示出在图14中。如图14所示，在对比例中制备的壳聚 糖-三聚磷酸盐胶囊中，80%或更多的胰岛素释放到人工胃液中，而与三聚磷酸盐的浓度 和pH无关。因此，确定了壳聚糖和三聚磷酸盐之间的键合亲合力比壳聚糖和植酸之间的键 合亲合力弱，这样的键合在胃液的强酸条件下容易被破坏，从而降低了胶囊对包封的可溶 活性成分的保护作用。 实验例7 :胰岛素从壳聚糖_植酸胶囊向肠的缓释的测量 在包封的可溶活性成分通过肠壁被吸收的情况下，如果胶囊的外壁在肠内没有破 裂，则降低了包封在胶囊内部的可溶活性成分的生物利用率。因此，为了检查所制备的胶 囊的生物利用率，制备人工胃液和人工肠液，人工胃液的pH为1. 2，人工肠液是用0. 2M的 KH2P04、0. 2N的NaOH、水配制的溶液，0. 2M的KH2P04为25% (v/v) ，0. 2N的NaOH为11. 8% (v/v) ，pH为6. 8。然后，用人工胃液和人工肠液相继处理在示例4中用浓度为6%且pH为
161、2、4和6的植酸溶液分别制备的四种壳聚糖-植酸胶囊，并测量每种胶囊的胰岛素的释放 量。通过HPLC测量从胶囊释放的胰岛素的量，将从胶囊释放的胰岛素的量表示为相对于胶 囊内部包封的胰岛素的量的百分数(％)。这些结果示出在图15中。当将胶囊放在与实验 例6中的人工胃液相同的人工胃液中，并在37t:的振荡培养器中以100rpm振荡2小时时， 示出了包封胰岛素的释放量的范围为40%至85%。当将用人工胃液处理的胶囊放在人工 肠液中并在37t:以100rpm振荡时，如图15中所示，发现胰岛素逐渐地从壳聚糖-植酸胶囊 释放。在实验例6中在酸性条件下最稳定的壳聚糖_植酸胶囊，即利用pH为1和6的植酸 溶液制备的壳聚糖-植酸胶囊，在以上实验中表现出最合意的结果。然而，还确定了 在使 用pH为2或4的植酸溶液制备壳聚糖_植酸胶囊的情况下，胰岛素从胶囊逐渐地释放到人 工肠液中。从这些结果可以看出，根据本发明制备的胶囊表现出依赖于PH的缓释效果。从 这些结果可以预计，55%或更多的包封的可溶活性成分从壳聚糖-植酸胶囊释放，并在肠 内被吸收。 对比实验例5 :胰岛素在肠内从壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊的受控释放的测量
为了将根据本发明制备的胶囊的生物利用率与使用传统交联剂制备的胶囊的生 物利用率做比较，对在对比例2中在三聚磷酸盐浓度为6%且pH为3、5和7的酸度的条件 下制备的胶囊进行了实验例7中所述的相同的实验。根据实验例7测量从胶囊释放的胰岛 素的量。当将胶囊放在与实验例6中的人工胃液相同的人工胃液中，并在37t:的振荡培养 器中以100rpm振荡2小时时，在根据对比例2制备的所有种类的胶囊中，释放了 75%或更 多的包封的可溶活性成分。当将放在人工胃液中并振荡的胶囊放在人工肠液中并在37°C 以100rpm振荡时，如图16中所示，可溶活性成分在12小时内从壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊 完全释放。在对比实验例4中在中性条件下最稳定的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊(即，使用 pH为7的三聚磷酸盐溶液制备的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊)中，70%或更多的胰岛素释放 到人工胃液中，然后100%的胰岛素在IO小时内完全释放。因此，可以看出，它的生物利用 率明显低于根据本发明制备的壳聚糖_植酸胶囊的生物利用率。 实验例8 :壳聚糖-植酸胶囊与壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊之间的生物利用率的比 较 分别从实验例7和对比实验例5选择表现出最合意的结果的胶囊，并对它们进 行比较。结果示出在图17中。在实验例7中选择用浓度为6X且pH为l(PA-l)和pH为 6(PA-2)的植酸溶液分别制备的壳聚糖-植酸胶囊，它们的结果示出在图17中。在对比实 验例5中选择用浓度为6%且pH为7的三聚磷酸盐溶液制备的壳聚糖_三聚磷酸盐胶囊， 它的结果示出在图17中。已经确定壳聚糖-植酸胶囊与壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊相比向 人工胃液中释放了更少量的胰岛素，并且壳聚糖-植酸胶囊向人工肠液中逐渐地释放胰岛 素。 制备例4 :糖尿病小鼠的建立 使用六周大的Balb-c系雄性小鼠。以30mg/mL的浓度将链脲霉素溶解在0. lmM的 氯化钠缓冲液中，然后以65mg/kg的剂量将其皮下注射到雄鼠中，以引发糖尿病。选择在连 续的两天表现出470 Omg/dL的血糖水平的雄性小鼠，对其进行实验。在开始实验之前， 使糖尿病小鼠饥饿12小时。 实验例9 :包含胰岛素的壳聚糖胶囊的体内生物利用率的比较
在从实验例7和对比实验例5分别选择表现出最合意的结果的胶囊之后，将每种 胶囊口服给制备例4中建立的糖尿病小鼠，并测量血糖水平。结果示出在图18中。组(l) 是口服盐水的正常对照鼠；组(2)是以40IU/kg的剂量口服用浓度为6X且pH为1的植酸 溶液制备的包含胰岛素的壳聚糖-植酸胶囊(实验例7)的小鼠；组(3)是以40IU/kg的剂 量口服用浓度为6%且pH为6的植酸溶液制备的包含胰岛素的壳聚糖_植酸胶囊(实验 例7)的小鼠；组(4)是以40IU/kg的剂量口服用浓度为6X且pH为7的三聚磷酸盐溶液 制备的包含胰岛素的壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊(对比实验例5)的小鼠；组(5)是以1IU/ kg的剂量皮下注射胰岛素的小鼠，用来将根据本发明的胰岛素的给服方法与其传统方法做 比较。从图18可以看出，在经皮下注射给服胰岛素的情况下，血糖水平快速下降。类似地， 当将壳聚糖-植酸胶囊口服给小鼠时，血糖水平快速下降。此外，在使用壳聚糖-植酸胶 囊口服胰岛素的情况下，血糖水平在恒定的低水平保持25小时，不存在突然的和过度的降 低。在使用壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊口服胰岛素的情况下，血糖水平也稍微有些降低，但并 不显著。因此，从实验结果可以确定壳聚糖_植酸胶囊作为口服胰岛素制剂的递送介导物 (delivery intermediator)的可用性禾口可會g性。 图19用数值示出了上述实验的结果。AAC(血糖水平-时间曲线上面积)是用线 性梯形法则在数值上表示的血糖水平-时间曲线上面积。AAC值越大，药物就越有效。Cmax 以百分数表示血糖水平的降低的最大值，Cmax越高，未引发低血糖性休克的血糖水平的范 围越好。Tmax是达到Cmax所需的时间，Tmax值越低，药物就越有效。F是药物的相对生物 利用率，通过以下步骤来计算F : 口服胰岛素情况下的AAC值乘以皮下注射的胰岛素的量， 所得值除以皮下注射胰岛素情况下的AAC值，然后所得值除以口服的胰岛素的量。因此，当 F值越接近于100X时，药物的作用越强。如图19所示，在利用壳聚糖-植酸胶囊口服胰岛 素的情况下测量的AAC值是在皮下注射胰岛素的情况下测量的AAC值的大约2. 6倍高，它 的生物利用率是在使用壳聚糖-三聚磷酸盐胶囊口服胰岛素的情况下的生物利用率的大 约6倍高。因此，可以再次确定使用壳聚糖-植酸胶囊来口服胰岛素的可能性。
制备例5 :胰岛素-壳聚糖水溶液的制备 将作为可溶活性成分的胰岛素(Sigma-Aldrich)溶解在0. 1N的HC1溶液中，终浓 度分别为4. 4% (w/v)和8. 5% (w/v)。将每种胰岛素溶液加入到制备例1中制备的壳聚糖 水溶液中，利用磁力搅拌器以500rpm搅拌10分钟以分散胰岛素，然后静置一会儿以去除壳 聚糖溶液中的气泡，从而获得胰岛素-壳聚糖水溶液。
示例5 :包含胰岛素的壳聚糖_植酸胶囊的制备 制备浓度为6%的植酸水溶液，将它的pH调整到l，从而制得胶囊。具体地讲，将 植酸溶液加入到蒸馏水中，并搅拌以调节植酸在水中的浓度，然后用5. ON的氢氧化钠溶液 调节它的pH。使用计量泵将制备例5中制备的胰岛素-壳聚糖水溶液逐滴加入到所得的溶 液中，使所得的混合物反应，以引发壳聚糖和植酸之间的键合，从而制得胶囊。将制备的胶 囊与混合物分离，用蒸馏水洗涤两次或三次，然后用冻干法干燥。此时，在-4(TC执行4小 时的初始冷冻工艺，然后将胶囊在_301:干燥3小时，在-l(TC干燥2小时，在Ot:干燥1小 时，在2(TC干燥2小时，在3(TC干燥5小时。
制备例6 :糖尿病大鼠的建立 使用250g至280g的雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠。以50mg/mL的浓度将链脲
18霉素溶解在pH为4. 5的柠檬酸中，并以50mg/kg重量的剂量对大鼠进行2天的给服。五天 之后，选择表现出250mg/dL或更高的血糖水平的大鼠作为糖尿病大鼠。
实验例10 :根据壳聚糖_胰岛素胶囊的剂量的降低血糖水平的体内作用的比较
因为在实验例9中在以40IU/kg的剂量给服胰岛素的情况下获得了最合意的结 果，所以根据壳聚糖_胰岛素胶囊的剂量在4小时内检查壳聚糖胶囊对降低血糖水平的作 用，其中，使用pH为1的植酸溶液制备壳聚糖-胰岛素胶囊。分别以10IU/kg(L)、20IU/ kg(M)和40IU/kg(H)的剂量将示例5中制备的胶囊口服给制备例6中建立的糖尿病大鼠。 分别以10IU/kg(L)和20IU/kg(M)的剂量对大鼠给服在示例5中用4. 4% (w/w)的胰岛素 溶液制备的胶囊，以40IU/kg(H)的剂量对大鼠给服用8.5% (w/w)的胰岛素溶液制备的胶 囊。 如图20和图21中所示，在皮下注射胰岛素(PC，阳性对照)的情况下，血糖水平 快速下降得最多。然而，可以确定在使用壳聚糖-植酸胶囊口服40IU/kg的胰岛素(H)的 情况下，在口服壳聚糖胶囊3小时之后，血糖水平低于皮下注射胰岛素的血糖水平。另一方 面，在口服不含胰岛素的壳聚糖-植酸胶囊(NC，阴性对照)的情况下，确定了血糖水平不降 低。此外，确定了使用壳聚糖-植酸胶囊口服胰岛素不引起血糖水平的突然的和过度的降 低。此外，这样的结果在统计学上是有意义的，这表明使用植酸作为交联剂的胶囊可以被有 效地使用。 制备例7 :胰岛素-壳聚糖水溶液的制备 将作为可溶活性成分的胰岛素(Sigma-Aldrich)溶解在0. IN的HC1溶液中，终浓 度分别为3. 7% (w/v)和2. 1% (w/v)。将每种胰岛素溶液加入到制备例1中制备的壳聚糖 水溶液中，利用磁力搅拌器以500rpm搅拌10分钟以分散胰岛素，然后静置一会儿以去除壳 聚糖溶液中的气泡，从而获得胰岛素_壳聚糖水溶液。
示例6 :包含胰岛素的壳聚糖胶囊的制备 制备浓度为6%的植酸水溶液，将它的pH调整到l，从而制得胶囊。具体地讲，将 植酸溶液加入到蒸馏水中，并搅拌以调节植酸在水中的浓度，然后用5. ON的氢氧化钠溶液 调节它的pH。使用计量泵将制备例7中制备的胰岛素-壳聚糖水溶液逐滴加入到所得的溶 液中，使所得的混合物反应，以引发壳聚糖和植酸之间的键合，从而制得胶囊。将制备的胶 囊与混合物分离，用蒸馏水洗涤两次或三次，然后用冻干法干燥。此时，在-4(TC执行4小 时的初始冷冻工艺，然后将胶囊在_301:干燥3小时，在-l(TC干燥2小时，在Ot:干燥1小 时，在2(TC干燥2小时，在3(TC干燥5小时。
制备例8 :糖尿病大鼠的建立 使用200g至250g的雄性Wistar大鼠。以50mg/mL的浓度将链脲霉素溶解在pH 为4. 5的柠檬酸中，并以50mg/kg重量的剂量对大鼠进行2天的给服。 一周之后，选择表现 出250mg/dL或更高的血糖水平的大鼠作为糖尿病大鼠。 实验例11 :根据壳聚糖-胰岛素胶囊的剂量的降低血糖水平的体内作用的比较
因为在实验例10中在以40IU/kg的剂量给服胰岛素的情况下获得了最合意的结 果，所以根据壳聚糖-胰岛素胶囊的剂量在24小时内检查壳聚糖胶囊对降低血糖水平的作 用，其中，使用pH为1的植酸溶液制备壳聚糖-胰岛素胶囊。分别以10IU/kg、20IU/kg和 40IU/kg的剂量将示例6中制备的胶囊口服给制备例8中建立的糖尿病大鼠，结果示出在图22中。分别以10IU/kg(L)和20IU/kg(M)的剂量对大鼠口服在示例6中用2. 1% (w/w)的 胰岛素溶液制备的胶囊，以40IU/kg(H)的剂量对大鼠口服用3.7% (w/w)的胰岛素溶液制 备的胶囊。 如图22中所示，可以确定在分别用10IU/kg、20IU/kg和40IU/kg的剂量给服壳 聚糖-胰岛素胶囊的情况下，血糖水平根据浓度的降低是快速的且有效的。还确定了，血糖 水平的这种降低的效果保持至少8小时，并且在统计学上是有意义的。
制备例9 :生长激素_壳聚糖水溶液的制备 将作为可溶活性成分的人生长激素(Vexxon)溶解在去离子水中，浓度为2% (w/ v)。将该溶液加入到制备例1中制备的壳聚糖水溶液中，利用磁力搅拌器以500rpm搅拌 IO分钟以分散生长激素，然后静置一会儿以去除壳聚糖溶液中的气泡，从而获得生长激 素-壳聚糖水溶液。 示例7 :包含生长激素的壳聚糖_植酸胶囊的制备 制备浓度为6 %的植酸水溶液，将它的pH分别调整到1 、2、3、4、5、6和7，从而制得 七种胶囊。具体地讲，将植酸溶液加入到蒸馏水中，并搅拌以调节植酸在水中的浓度，然后 用5. ON的氢氧化钠溶液调节它的pH。使用计量泵将制备例9中制备的生长激素-壳聚糖 水溶液逐滴加入到所得的溶液中，使所得的混合物反应，以引发壳聚糖和植酸之间的键合， 从而制得胶囊。将制备的胶囊与混合物分离，用蒸馏水洗涤两次或三次，然后用冻干法干 燥。此时，在_401:执行4小时的初始冷冻工艺，然后将胶囊在_301:干燥3小时，在-10°C 干燥2小时，在Ot:干燥1小时，在2(TC干燥2小时，在3(TC干燥5小时。
实验例12 :壳聚糖-植酸胶囊的生长激素包封率 为了测量植酸水溶液的pH对包封程度的影响，计算示例7中制备的每种胶囊的生 长激素包封率。通过HPLC测量胶囊形成之后植酸溶液中剩余的未包封生长激素的量，并利 用数据计算胶囊的生长激素包封率。结果示出在图23中。如图23中所示，可以确定生长 激素完全包封在胶囊内部，而与植酸水溶液的PH无关。 实验例13 :包含生长激素的壳聚糖_植酸胶囊在人工胃液中的稳定性 将示例7中制备的每种胶囊放到pH为1. 2的人工胃液(HC1浓度为0. 7% (v/v)
且NaCl浓度为0. 2% (w/v)的水溶液)中，并在37°C的振荡培养器中以100rpm振荡2小
时。然后，通过HPLC测量释放到人工胃液中的生长激素的量。使用用人工胃液处理2小时
之后获得的数据来计算释放到人工胃液中的生长激素的量，结果示出在图24中。如图24
中所示，观察到当植酸溶液的pH为1时，生长激素几乎不释放到人工胃液中，并且酸度越
高，生长激素释放得就越多。然而，确定了 即使在使用pH为7的植酸水溶液制备的胶囊
中，也仅有低于30%的生长激素释放到人工胃液中。从这些结果确定了 ，在较低pH条件下
制备的壳聚糖_植酸胶囊在酸性条件下的胃液中更为稳定。 实验例14 :壳聚糖-植酸胶囊向肠内缓释的生长激素的测定 在包封的可溶活性成分通过肠壁被吸收的情况下，如果胶囊的外壁不能在肠中破 裂，包封在胶囊内的可溶活性成分的生物利用率就会被劣化。因而，为了检测制备的胶囊 的生物利用率，制备人工胃液(pH 1. 2)和人工肠液，人工肠液是用0. 2M的KH2P04、0. 2N的 NaOH、水配制的溶液，0. 2M的KH2P04为25% (v/v) ， 0. 2N的NaOH为11. 8% (v/v) ，pH为6. 8。 然后，测定在根据本发明示例7中制备的壳聚糖-植酸胶囊的生长激素的释放量。当将胶
20囊放在与实验例2的人工胃液相同的胃液中且在37t:的培养振荡器中以100rpm振荡2小 时时，30%或低于30%的被包封的可溶活性成分被释放。将放在人工胃液中并振荡的胶囊 放入人工肠液中并在37°C以100rpm振荡。如图25所示，在壳聚糖-植酸胶囊的情况下，24 小时后测定的可溶活性成分的累积释放量为5% -35%。可以证实的是，使用pH越高的植 酸，从制备的胶囊释放的生长激素就越多。 为了测定生长激素根据时间的释放量，在使胶囊在人工胃液中经受振荡孵育2小 时后，对人工肠液中的生长激素释放量进行总计24小时的测定。如图26所示，在使用具有 pH l至pH 4的植酸制备的壳聚糖-植酸胶囊中，低于10%的生长激素被释放到人工胃液 中。此外，当胶囊被运送到人工肠液并进一步孵育时，最多20%的生长激素被释放到人工肠 液中。
权利要求
一种壳聚糖胶囊，包含可溶活性成分，其中，所述可溶活性成分包封在含有壳聚糖和植酸的基质中。
2. 如权利要求1所述的壳聚糖胶囊，其中，所述可溶活性成分是一种或多种选自由药物活性成分、食品活性成分和化妆品活性成分组成的组中的成分。
3. 如权利要求2所述的壳聚糖胶囊，其中，所述可溶活性成分是一种或多种选自于由核酸、氨基酸、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、类脂、糖脂、植物源化合物、动物源化合物或微生物源化合物、植物提取物、合成化合物、维生素、微生物和病毒组成的组中的成分。
4. 如权利要求l所述的壳聚糖胶囊，其中，所述壳聚糖是一种或多种选于自由聚[13 -(1-4)-2-氨基-2- 二氧-D-吡喃葡萄糖]、硫代壳聚糖、三甲基化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、N-(2-羟丙基-3-三甲基铵)壳聚糖氯化物组成的组中的组分。
5. 如权利要求1所述的壳聚糖胶囊，其中，壳聚糖的平均分子量在30， 000道尔顿至1， 000， 000道尔顿的范围内。
6. —种使用植酸的使生物相容性聚合物交联的方法。
7. 如权利要求6所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物是阳离子。
8. 如权利要求7所述的方法，其中，所述生物相容性聚合物是壳聚糖。
9. 一种制备壳聚糖胶囊的方法，所述方法包括以下步骤第一步，制备包含壳聚糖和可溶活性成分的水溶液；第二步，制备包含植酸的水溶液；第三步，使第一步中制备的水溶液与第二步中制备的水溶液接触，以执行离子凝胶化。
10. 如权利要求9所述的方法，其中，所述第一步包括(a) 通过向水溶液中加入壳聚糖来制备壳聚糖水溶液；(b) 制备可溶活性成分水溶液；(c) 将壳聚糖水溶液与可溶活性成分水溶液混合。
11. 如权利要求10所述的方法，其中，所述步骤(a)中的壳聚糖水溶液包含浓度在0.01% (w/v)至20% (w/v)的范围的弱酸。
12. 如权利要求11所述的方法，其中，所述弱酸是一种或多种选自于由乙酸、乳酸、柠檬酸、甲酸、抗坏血酸、草酸、稀盐酸和稀硫酸组成的组中的酸。
13. 如权利要求10所述的方法，其中，所述步骤(a)中的壳聚糖水溶液包含浓度在0.01% (w/v)至50% (w/v)的范围的壳聚糖。
14. 如权利要求10所述的方法，其中，所述步骤(b)中的可溶活性成分水溶液包含浓度在0.01% (w/v)或高于0.01% (w/v)的范围的可溶活性成分。
15. 如权利要求9所述的方法，其中，所述第二步中的植酸水溶液的pH在0. 5至7的范围。
16. 如权利要求15所述的方法，其中，所述第二步中的植酸水溶液的pH在1至6的范围。
17. 如权利要求9所述的方法，其中，所述第二步的植酸水溶液包含浓度为0. 1% (w/v)或高于O. 1% (w/v)的植酸。
18. 如权利要求17所述的方法，其中，所述第二步的植酸水溶液包含浓度为2% (w/v)或高于2% (w/v)的植酸。
19. 如权利要求9所述的方法，其中，通过将所述第一步的水溶液以滴加的方式加入到 所述第二步的水溶液中来执行第三步中的接触步骤。
20. 如权利要求9所述的方法，其中，所述方法还包括选自于由以下步骤组成的组中的 至少一个步骤将第三步中制备的壳聚糖胶囊分离，洗涤所述壳聚糖胶囊和干燥所述壳聚糖胶囊。
21. 如权利要求20所述的方法，其中，所述干燥步骤通过冻干法执行。
22. —种包含如权利要求1至7中任一项所述的壳聚糖胶囊和药物可接受载体的药物 组合物。
23. 如权利要求22所述的药物组合物，其中，所述壳聚糖胶囊包含用作可溶活性成分 的白蛋白、胰岛素或生长激素。
24. —种包含如权利要求1至7中任一项所述的壳聚糖胶囊和食品添加剂的食品组合物。
25. —种包含如权利要求1至7中任一项所述的壳聚糖胶囊和化妆品添加剂的化妆品 组合物。
全文摘要
本发明涉及一种可溶活性成分包封在含有壳聚糖和植酸的基质中的壳聚糖胶囊；一种交联方法和能够用在制备胶囊中的物质以及包含该胶囊的药物组合物、食品组合物和化妆品组合物。根据本发明的壳聚糖胶囊通过作为生物可降解聚合物的壳聚糖与能够快速并有效地与壳聚糖聚合物形成交联反应的植酸的离子凝胶化反应来制备。本发明的胶囊显示出对可溶活性成分的高包封率，并且保护可溶活性成分免于在消化道中受损，从而提高生理活性材料的体内递送效率。此外，由于本发明的胶囊具有pH依赖缓释机制，其可以使可溶活性成分在胃中的释放最小化，而逐渐在肠中释放，所以能够调节可溶活性成分的缓释。
文档编号A61K9/48GK101784267SQ200880103896
公开日2010年7月21日 申请日期2008年5月29日 优先权日2007年6月18日
发明者崔成远, 朴之镛, 李敏暻, 赵英熙, 郑勋玉, 郑赞民 申请人:延世大学校产学协力团