延迟的自胶凝藻酸盐体系及其应用的制作方法

专利名称：延迟的自胶凝藻酸盐体系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有延迟的胶凝过程的藻酸盐体系，并涉及制备和使用所述体系的组 合物、装置、试剂盒和方法。
背景技术：
本申请要求2007年8月28日提交的美国临时专利申请60/966，437的优先权，该 申请的内容被纳入本文作为参考。藻酸盐是亲水性海洋生物聚合物，具有在生理学相关温度下发展和固化形成热 稳定凝胶的独特能力。藻酸盐是1-4糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛 糖醛酸(G)残基的非支化二元共聚物家族。两种糖醛酸单体的相对量及其沿聚合物链的 顺序排列可广泛变化，取决于藻酸盐的来源。藻酸盐是海洋褐藻类的结构聚合物，例如 丰及；!匕·带(Laminaria hyperborean) > IeL^ (Macrocystis pyrifera) > HHi^ (Lessonia nigrescens)和球型褐藻(Ascophyllumnodosum)。藻酸盐也可以由某些细菌产生，例如绿 脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)和焚光假 单胞菌(Pseudomonasfluorescens) (W004011628A1)。当二价阳离子与来自两种不同藻酸盐聚合物各自的G残基的负电荷基团形成离 子键，从而使两种聚合物发生交联时，制备藻酸盐凝胶。许多藻酸盐聚合物间多重交联键的 形成导致藻酸盐凝胶结构的基质。藻酸盐凝胶可以是水凝胶，即包含大量水而不溶解的交联的藻酸盐聚合物。生物 聚合物凝胶，例如藻酸盐水凝胶是组织工程改造及其他生物医学应用中有吸引力的候选物 质。由于这个原因以及在生理学条件下形成凝胶的能力，藻酸盐被广泛使用和研究用于包 封目的和用作生物结构材料。将细胞包封到藻酸盐珠中是一种常用的技术。而且，已经证 明藻酸盐是其他类型的生物结构的有用材料，包括组织工程改造应用和用作神经再生的支
^K O存在不同的制备藻酸盐水凝胶的方法。最常见的方法是透析/扩散法，其中藻酸 盐溶液由于外部储库中的胶凝离子的扩散而发生胶凝。该方法在制备藻酸盐凝胶珠和食品 应用中最常用。藻酸盐微珠的制备是受到凝胶离子扩散进入凝胶网络限制的快速过程。虽 然该过程非常适合将细胞包裹到微珠内，但较少用于制备其他形状或结构。扩散胶凝体系 对于制造较大尺寸的凝胶结构的应用有限。这是因为快速胶凝过程限制的形成凝胶结构的 时间。可利用胶凝过程的延迟在凝胶形成之前将溶液注入主体和/或混合细胞或其他 生物材料而形成凝胶介质。因此，开发了另一种方法来制造其他类型的生物相容性藻酸盐 凝胶结构。采用胶凝离子在形成的凝胶内更慢释放的内部胶凝体系可降低胶凝速度。这可 以描述为凝胶的内部设置。填充，在内部胶凝体系中，溶解度有限的钙盐或络合Ca2+离子与 藻酸盐溶液混合，钙离子缓慢释放到藻酸盐溶液中。已经在用于组织工程改造的基于藻酸 盐的细胞递送载体中使用硫酸钙。也可采用具有PH依赖性溶解度的钙盐和加入缓慢起效的酸如D-葡萄糖酸-δ -内酯(GDL)来控制钙的释放和凝胶动力学。随着ρΗ的变化，钙离 子释放。也已使用含钙的脂质体作为可控制的藻酸盐胶凝体系。与扩散体系相反，基于内 部凝胶作用的藻酸盐凝胶体系具有更加限定和有限的胶凝离子供应，在扩散体系中钙离子 扩散进入藻酸盐溶液而形成钙饱和的凝胶。目前各种制备藻酸盐凝胶结构的方法存在缺陷。一些技术仅仅适用于制备尺寸和 形状有限的凝胶。根据应用，存在与凝动力学控制有关的问题。在一些情况下，凝胶中可能 存在不希望的材料，因为这些材料是化学受控凝胶机制的残留物和副产物。在一些情况下， 可能需要在非生理学PH值发生胶凝，这种条件对于所述方法的应用可能存在限制。因此， 需要其他胶凝体系和制剂。

发明内容
本发明涉及在藻酸盐溶液中包含不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的分散体，所述分 散体在不加入非胶凝阳离子的情况下1分钟后的最终凝胶储能模量小于10%。本发明还涉及用于制备所述藻酸盐凝胶的试剂盒。该试剂盒包括第一容器和第二 容器，第一容器包含可溶性藻酸盐，第二容器包含不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。本发明还涉及用于制备藻酸盐凝胶的组合物。该组合物包含速溶藻酸盐和不溶性 藻酸盐/胶凝离子颗粒。本发明还涉及用于分散延迟的自胶凝藻酸盐分散体的方法。该方法包括形成不 溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在可溶性藻酸盐中的分散体，和分散该分散体而使分散体形成 藻酸盐凝胶基质。本发明还涉及将延迟的自胶凝藻酸盐分散体分散到个体内的方法。该方法包括 形成不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在可溶性藻酸盐中的分散体，和将该分散体分散到个体 内而使所述分散体在个体内形成藻酸盐凝胶基质。本发明还涉及将延迟的自胶凝藻酸盐分散体分散到个体内用作组织本体材料、用 于血管栓塞形成手术、用于防止术后粘连形成、用于伤口处理过程、用于糖尿病治疗和用于 治疗关节炎的方法。本发明还涉及使用可植入的藻酸盐凝胶的方法。该方法包括通过分散延迟的自 胶凝藻酸盐分散体形成延迟的自胶凝藻酸盐，凝胶形成后，将可植入的藻酸盐凝胶植入个 体。本发明还涉及制备可植入装置的方法。本发明还涉及包括均勻的藻酸盐凝胶涂层的可植入装置及其涂覆方法。本发明还涉及填充或修复骨关节炎导致的骨软骨缺损的方法，该方法包括将包含 软骨细胞的延迟的自胶凝藻酸盐分散体分散到个体体内或者将包含软骨细胞的生物相容 性基质植入个体体内。本发明还涉及治疗糖尿病的方法，该方法包括将包含胰岛素产生细胞或多细胞聚 集体的延迟的自胶凝藻酸盐分散体分散到个体体内或者将包含胰岛素产生细胞或多细胞 聚集体的生物相容性基质植入个体体内。本发明还涉及在分离后以及储存和运输期间改善胰岛、或其他细胞聚集体或组织 活力的方法，该方法包括将所述胰岛、或细胞聚集体或组织掺入延迟的自胶凝藻酸盐分散
7体内。本发明还涉及不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒及其制备方法。附图简要说明

图1显示了制剂3、17和19凝胶结构的形成。在图中，开始混合两组分的时间为零。图2显示了在不存在或存在各种浓度的NaCl的情况下，由2. 0%钙G-嵌段颗粒和 2. 0% PR0N0VA LVG藻酸盐溶液构成的制剂的储能模量随时间的变化。图3显示了在不存在或存在作为混合物的一部分或者在混合后1小时外部施加 (置于胶凝表面上)的浓度0. 9的NaCl的情况下，由2. 0%钙G-嵌段颗粒和2. 0% PR0N0VA LVG藻酸盐溶液构成的制剂的储能模量随时间的变化。图4显示了在不存在或存在氯化钠的情况下，由2. 5%钙VLVG颗粒(批号 J101-005)和2. 5% PR0N0VA LVG(FP-408-02)藻酸盐溶液构成的制剂的储能模量随时间的 变化。在一次测试中，混合后40分钟外部施加MEM细胞培养液(含0. 9 % NaCl)(置于胶凝 表面上)。优选实施方式的详述提供了可选的藻酸盐胶凝体系，称为“延迟的自胶凝体系”。该体系可用于许多生 物医学应用以及其他应用，尤其是在需要或要求胶凝延迟一段时间使得能够在高度胶凝之 前递送材料。该体系可包含具有高度生物相容性的藻酸盐和胶凝离子。该体系可提供胶凝 时间延迟，这种延迟可维持相当长的时间。而且，该体系可提供通过加入另一来源的非胶凝 阳离子启动或加速胶凝的能力。延迟的自胶凝藻酸盐技术使得对制剂凝胶性质的控制提高，尤其是对胶凝作用开 始发生的控制。本发明的藻酸盐体系可用于生物医学过程，用于包含入生物医学装置以及 其他要求精确控制胶凝性质的生物相容性应用，具体是胶凝作用开始时间延迟和/或控制 胶凝作用完成半衰期和/或胶凝作用完成时间。对胶凝过程的开始、持续时间和完成的控 制提高可用于优化要求精确控制的应用的组合物和性质，这些应用包括但不限于包括体内 和体外医疗器械的生物医学应用。医学应用的例子可包括但不限于提供药物或肽递送装 置；分散细胞、蛋白质、多细胞聚集体或可检测的标记用于组织过程改造；和涂覆、沉积或 修复组织或器官中的缺损。可与这些组合物联用或由这些组合物形成的可植入装置的例子 包括装置涂层、心脏起搏器、导管、可植入假体、组织填充植入物、食管反流抑制性植入物、 肾反流抑制性植入物、失禁抑制性植入物、乳房植入物、颏骨植入物、颊植入物、牙植入物、 胸植入物和成形的藻酸盐基质植入物如固体装置或含或不含包封细胞的微囊。体系包括两种组分可溶性藻酸盐；和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。当组分在溶 剂的存在下组合形成不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在藻酸盐溶液中的分散体时，藻酸盐凝 胶的形成显著延迟，使得分散体在1分钟或更长时间后最终凝胶储能模量为10%或更低。 在一些实施方式中，在不存在额外的非胶凝阳离子的情况下在显著更长的时间范围后，例 如2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、 30分钟、40分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、240分钟、300分钟或更长时 间后，最终凝胶储能模量为10%或更低。在这些各种时间范围内，颗粒的胶凝离子可能有足 够量不会从不溶性颗粒上解离下来，使得最终凝胶储能模量为10%或更低。凝胶形成延迟至最终凝胶储能模量为10%或更低为使用者提供了足够的时间在凝胶形成之前操纵和使 用该分散体。延迟使得该体系尤其适用于凝胶时间较快可能增加材料使用困难的应用。如本文所用，术语“不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒”中使用的符号“/”表示所述颗 粒同时包含藻酸盐分子和胶凝离子。如本文所用，术语“储能模量”可与术语“G”、“弹性”和“弹性模量”互换使用。本 领域技术人员可容易地根据公知方法测定储能模量。如本文所用，“最终凝胶储能模量”中 使用的术语“最终凝胶”表示储能模量不再随时间增加时的凝胶，该凝胶是通过在20°C加入 足量氯化钠以使溶液中的钠离子最终浓度升高17mM或更多，或者达到最终浓度0.9%或者 更高，由不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在藻酸盐溶液中的分散体形成的。在一些实施方式中，在分散体中加入非胶凝阳离子可加速凝胶形成速率。加入提 供的非胶凝阳离子可置换不溶性颗粒中的胶凝离子，从而提高胶凝离子在分散体中的含 量，以形成包含来自在分散体中可溶性藻酸盐的藻酸盐聚合物的交联键。延迟的自凝胶制剂胶凝作用的开始和控制在很大程度取决于制剂中不溶性颗粒 所采用的藻酸盐类型。具体说，胶凝离子从不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒解离从而能够与 藻酸盐溶液的藻酸盐形成交联键的程度对延迟的自胶凝藻酸盐制剂开始凝胶的延迟时间 具有直接影响。当用于制备分散体的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒由短的寡聚G嵌段制 备，或者由等于或大于50%的相对高的G-含量(“高G藻酸盐”)的藻酸盐制备时，可实现 延迟的自胶凝作用。并且，当用于制备分散体的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在原料制备 中采用低搅拌/互换速率的过程制备时，或者当这种不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在原料 制备中采用非水极性溶剂的过程制备时，可实现延迟的自胶凝作用。胶凝阳离子在分散体 中以游离离子形式可得的速度控制了胶凝速率。因此，在非胶凝离子的存在下不溶性藻酸 盐/胶凝离子颗粒保留胶凝离子的程度，或者在非胶凝离子存在下不溶性藻酸盐/胶凝离 子颗粒交换胶凝离子的程度，决定了分散体胶凝的速率。在一些实施方式中，通过搅拌或者通过采用合适的混合装置混合该体系的可溶性 藻酸盐和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。可通过以下方式进一步控制制剂的胶凝动力学 调节溶液中的可溶性藻酸盐浓度相对于分散体中的不溶性藻酸盐颗粒的浓度；胶凝离子相 对于藻酸盐的含量；存在非胶凝离子或其他糖、温度、不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒大小、 需要包封到凝胶内或者在胶凝期间存在的细胞、多细胞聚集体、组织或其他生物材料的含 量、(存在杂质)和所用藻酸盐的类型、以及不溶性藻酸盐颗粒的生产方法和藻酸盐原料的 生产后处理。因此，藻酸盐体系可广泛适用于每一种特定的应用。为将细胞、多细胞聚集 体、组织或其他生物材料包封到成形凝胶内，可将溶剂、藻酸盐溶液或分散体与需要包封的 这些材料预先混合。分散体可作为液体/浆液分配到个体内需要藻酸盐凝胶基质的部位。可溶性藻酸 盐和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在溶剂存在下混合之后，分散体分散到个体内，与生理 学条件(包括非胶凝离子的存在)相接触。分散体发生胶凝，藻酸盐凝胶原位固化。如本文所述，术语“延迟的自胶凝”表示当可溶性藻酸盐和不溶性藻酸盐/胶凝离 子颗粒在溶剂存在下混合时以非常受限的方式发生的胶凝过程。“延迟的自胶凝藻酸盐”是 一种藻酸盐分散体或凝胶，包含在溶剂中的可溶性藻酸盐和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒 或者由其形成，不添加非胶凝阳离子的情况下在超过1分钟的时间后最终凝胶储能模量等
9于或小于10%。在一些延迟的自胶凝藻酸盐中，在不存在额外的非胶凝阳离子的情况下在 显著更长的时间范围后，例如2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、 10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、 240分钟、300分钟或更长时间后，最终凝胶储能模量为10%或更低。该体系中使用的组分在使用前可以以几种形式中的任一种进行保存。例如，可溶 性藻酸盐可以溶液或者以粉末形式保存。在一些实施方式中，可溶性藻酸盐可以以例如在 冻干时立即溶解的粉末形式保存。类似地，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒可以以分散体或 者粉末形式保存。提供试剂盒和组合物，其包含用于制备具有本文所述性质的分散体的组分和成 分。而且，提供了可用于制备这种分散体的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒，以及使用该分 散体和制备由该分散体形成的凝胶的方法。在一些医学和生产方法中这些方法可以进行改 良，也提供了用延迟的自胶凝技术制备的凝胶和用该凝胶涂覆的装置。在一些实施方式中，提供了在含有可溶性藻酸盐的水性溶液中包含不溶性藻酸盐 /胶凝离子颗粒的分散体，该分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下2分钟后最终凝胶储 能模量小于10%。在一些实施方式中，分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下3分钟后最 终凝胶储能模量小于10%。在一些实施方式中，分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下4 分钟后最终凝胶储能模量小于10%。在一些实施方式中，分散体在不添加非胶凝阳离子的 情况下5分钟后最终凝胶储能模量小于10%。在一些实施方式中，分散体在不添加非胶凝 阳离子的情况下10分钟后最终凝胶储能模量小于10%。在一些实施方式中，分散体在不添 加非胶凝阳离子的情况下15分钟后最终凝胶储能模量小于10%。在一些实施方式中，分散 体在不添加非胶凝阳离子的情况下20分钟后最终凝胶储能模量小于10%。在一些实施方 式中，分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下30分钟后最终凝胶储能模量小于10%。在一 些实施方式中，分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下45分钟后最终凝胶储能模量小于 10%。在一些实施方式中，分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下60分钟后最终凝胶储能 模量小于10%。在一些实施方式中，分散体显示如上所述延迟的自胶凝作用，但是在加入非胶凝 阳离子之后，加入非胶凝阳离子1分钟或更长时间后最终凝胶储能模量大于10%。在一 些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后2分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于 10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后2分钟或更长时间最终凝胶储能 模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后3分钟或更长时间最终 凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后4分钟或更长 时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后5分 钟或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离 子后10分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非 胶凝阳离子后15分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体 在加入非胶凝阳离子后20分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式 中，分散体在加入非胶凝阳离子后30分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一 些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后40分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于 10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后60分钟或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后90分钟或更长时间最终 凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后120分钟或更 长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳离子后3 小时或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入非胶凝阳 离子后4小时或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散体在加入 非胶凝阳离子后5小时或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，分散 体在加入非胶凝阳离子后6小时或更长时间最终凝胶储能模量大于10%。在一些实施方式中，在加入描述以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分 散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大于20%或更高。在一些实施方式中，在加入描述 以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大 于30%。在一些实施方式中，在加入描述以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分 散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大于40%或更高。在一些实施方式中，在加入描述 以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大 于50%。在一些实施方式中，在加入描述以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分 散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大于60%或更高。在一些实施方式中，在加入描述 以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大 于70%。在一些实施方式中，在加入描述以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分 散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大于80%或更高。在一些实施方式中，在加入描述 以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大 于90%。在一些实施方式中，在加入描述以上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分散 体显示一定时限内最终凝胶储能模量大于95%或更高。在一些实施方式中，在加入描述以 上各实施方式中提及的非胶凝阳离子之后，分散体显示一定时限内最终凝胶储能模量大于 99%。如本文所用，“加入非胶凝阳离子”表示加入浓度足以将分散体中非胶凝离子的总 浓度提高至少0.01%或更高的非胶凝离子。在一些实施方式中，加入非胶凝阳离子能够将 分散体中非胶凝离子的总浓度提高至少0. 05%、至少0. 1%、至少0. 2%、至少0. 3%、至少 0. 4%、至少0. 5%、至少0. 6%、至少0. 7%、至少0. 8%、至少0. 9%、至少1. 0%或更高。可 加入以加速延迟的自胶凝分散体的胶凝过程的非胶凝阳离子的例子包括Na+、Li+、K+、Fe+ 和/或H+(即各种酸)。在一些实施方式中，加入的非胶凝阳离子以由溶液加入和混合入分 散体的添加剂形式提供。在一些实施方式中，加入的非胶凝阳离子能够在分散体分散到生 理学空间内时提供一定量的非胶凝阳离子。在一些实施方式中，可溶性藻酸盐中使用的藻酸盐聚合物或其组合可以与不溶性 藻酸盐/胶凝离子颗粒相同或不同。分散体中的藻酸盐(可溶性藻酸盐和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐) 浓度相对于溶剂的量能影响胶凝时间、孔隙率、稳定性和生物可降解性、凝胶强度和凝胶弹 性，采用可溶性藻酸盐和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒与溶剂的特定比例可制备具有特定 性质的凝胶。通常，藻酸盐浓度越低(对于给定比例的可溶性藻酸盐和不溶性藻酸盐)，胶 凝的生物可降解性越高。在一些实施方式中，可采用约0. 5%、0. 75%、1%、1. 25%、1. 5%、 2%、2. 5%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多藻酸盐(可溶性藻酸盐和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐)。分散体中可溶性藻酸盐相对于不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐的浓度 能影响胶凝时间、孔径、凝胶强度和凝胶弹性以及稳定性和生物可降解性，采用特定比例的 可溶性藻酸盐与不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒可制备具有特定性质的凝胶。在一些实施方 式中，可溶性藻酸盐的浓度约等于不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐浓度(1 1)。 在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐浓度是可溶性藻酸盐的两倍 (2 1)。在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐浓度是可溶性藻酸 盐的一半(1 2)。在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中的藻酸盐浓度相对 于可溶性藻酸盐是1比7(1 7)。通常，存在的胶凝离子越少，凝胶的生物可降解性越高。 降低体系中不溶性藻酸盐/胶凝离子的浓度制备的凝胶稳定性较低而生物可降解性较高， 因为凝胶网络中交联离子饱和度较低。延迟的自胶凝作用能够制备胶凝离子浓度较低的 凝胶，以制备尤其适用于生物可降解用途的凝胶。在一些优选的实施方式中，不溶性藻酸盐 /胶凝离子颗粒相对于可溶性藻酸盐的藻酸盐比例为5 1、4 1、3 1、2 1、1 1、 1 2、1 3、1 4 或 1 5。藻酸盐聚合物中G和M单体的相对含量能影响孔径、稳定性和生物可降解性、凝 胶强度和凝胶弹性。藻酸盐聚合物中M和G的总含量广泛变化，序列结构的相对含量也显 著变化(G-嵌段，M-嵌段和MG交替序列)，沿聚合物链的序列长度也是如此。通常，使用 的藻酸盐聚合物中G含量相对于M含量越低，凝胶的生物可降解性越高。相对于高M的藻 酸盐(其孔径较小且凝胶强度较低)，具有高G含量的藻酸盐的凝胶通常孔径较大且凝胶 强度较高。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含超过50% α -L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含超过 60% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包 含60%-80% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐 聚合物包含65%-75% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多 种藻酸盐聚合物包含超过70% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一 种或多种藻酸盐聚合物不包含70% a-L-古洛糖醛酸，或60% a-L-古洛糖醛酸，或50% a-L-古洛糖醛酸或更低，或60%-80% a-L-古洛糖醛酸或65%-75% a-L-古洛糖醛酸。 在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物不包含70% a-L-古洛糖醛 酸，或60% a-L-古洛糖醛酸，或50% a-L-古洛糖醛酸或更低，或60%-80% a-L-古洛 糖醛酸或65%-75% a -L-古洛糖醛酸，其中藻酸盐的平均MW为2_20kDa，在一些实施方式 中为2-10kDa，在一些实施方式中为2-5kDa，在一些实施方式中为3_5kDa，在一些实施方式 中，藻酸盐聚合物包含10-25个单体，或主要是具有15-19个单体的低聚物，或平均16-18 个单体的低聚物。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少 超过85% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合 物包含至少超过88% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种 藻酸盐聚合物包含至少超过89% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的 一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过90% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸 盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过91% a -L-古洛糖醛酸。在一些实施方 式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过92% a-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过93% α-L-古洛 糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过94% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至 少超过95% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚 合物包含至少超过96% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多 种藻酸盐聚合物包含至少超过97% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中 的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过98% α-L-古洛糖醛酸。在一些实施方式中，藻 酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含至少超过85% a -L-古洛糖醛酸到至少超过 99% a -L-古洛糖醛酸，分子量为2_20kDa，在一些实施方式中为2_10kDa，在一些实施方式 中为2-5kDa，在一些实施方式中为3-5kDa。在一些实施方式中，藻酸盐聚合物包含10-25 个单体。在一些实施方式中，藻酸盐聚合物主要包含具有15-19个单体的低聚物。在一些 实施方式中，藻酸盐聚合物包含平均具有16-18个单体的低聚物。在一些实施方式中，藻 酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含超过50% C-5差向异构体β -D-甘露糖醛酸。 在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含超过60% C-5差向异构 体β-D-甘露糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含 60%-80% C-5差向异构体β-D-甘露糖醛酸。在一些实施方式中，藻酸盐基质中的一种 或多种藻酸盐聚合物包含65% -75% C-5差向异构体β -D-甘露糖醛酸。在一些实施方式 中，藻酸盐基质中的一种或多种藻酸盐聚合物包含超过70% C-5差向异构体β -D-甘露糖 醛酸。制备糖醛酸嵌段的方法参见US 6，121，441，其内容被纳入本文作为参考。G-嵌段藻 酸盐聚合物及其作为藻酸盐凝胶性质调节剂的应用参见美国专利6，407，226，其内容被纳 入本文作为参考。一些优选的实施方式中，30% G,35% G,40% G,45% G,50% G,55% G、 60% G,65% G,70% G,75%,80% G或85% G。一些优选的实施方式中是大于85% G。
藻酸盐聚合物的平均分子量能影响胶凝时间、孔径、凝胶强度和凝胶弹性。藻酸盐 聚合物的平均分子量可为2-1000kD。藻酸盐的分子量可影响凝胶形成和最终的凝胶性质。 通常，所用藻酸盐的分子量越低，凝胶的生物可降解性越高。可溶性藻酸盐组分中使用的藻 酸盐聚合物或其组合可以与不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中使用的聚合物或其组合相同 或不同。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为5-350kD。在一些 实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为2-100kD。在一些实施方式中，藻 酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为50-500kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻 酸盐聚合物的平均分子量为100-1000kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物 的平均分子量为2-50kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为 2-40kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为2-30kD。在一些 实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为2-20kD。在一些实施方式中，藻 酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为2-15kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸 盐聚合物的平均分子量为2-10kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均 分子量为2-5kD。在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为3-15kD。 在一些实施方式中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为3-10kD。在一些实施方式 中，藻酸盐基质中藻酸盐聚合物的平均分子量为3-5kD。在一些实施方式中，藻酸盐低聚物 中单体的平均数量为 15-20、16-19、17-18、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
1320,21 或 22。在一些实施方式中，凝胶设计成具有高度生物可降解性。因此，采用一种或多种本 文所述参数的下限来制备具有高度生物可降解性的凝胶时，可制备藻酸盐较少、胶凝离子 较少、G含量较低且藻酸盐分子量较低的凝胶。藻酸盐在20°C测定的溶液中的粘度为25-lOOOmPas，在一些实施方式中，优选 50-1000mPas (1 %溶液，20°C )。在一些实施方式中，藻酸盐无菌。在一些实施方式中，藻酸盐是无菌超纯藻酸盐。 在一些实施方式中，利用除菌滤器制备无菌藻酸盐。当本文所用藻酸盐用于医疗植入应用时优选是超纯的；例如内毒素含量低于 400eu/g，在一些实施方式中低于300eu/g，在一些实施方式中低于200eu/g，在一些实施方 式中低于lOOeu/g，在一些实施方式中低于75eu/g，在一些实施方式中低于50eu/g。在一些 实施方式中，藻酸盐中的内毒素含量<25EU/克。在一些实施方式中，优选生产不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法能提供具有化 学计量(100%饱和)胶凝离子的产物。使用这种化学计量的盐能赋予延迟的自胶凝藻酸盐 体系更大的重现性。在一些实施方式中，优选生产不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法能 提供具有亚化学计量(< 100%饱和)所述胶凝离子的产物。使用这种亚化学计量的盐能 赋予延迟的自胶凝藻酸盐体系生物可降解性。在一些实施方式中，用于制备不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的藻酸盐是G嵌段低 聚物，G含量等于或大于约60%，等于或大于约70%，等于或大于约80%，等于或大于约 85 %，等于或大于约90 %，等于或大于95 %，约99 %。G-block藻酸盐的分子量通常低于 IOkDa,对应于平均DPn为57单位，通常MW约为3kDa，对应于DPn为17。在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒是标准高G藻酸盐的颗粒，在一 些实施方式中是Ca，具有几分钟的延迟。在一些实施方式中，这些藻酸盐的分子量通常为 50kDa(286 单位)和 350kDa(2000 单位)。在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒是标准高M藻酸盐或MG藻酸盐 的颗粒。G嵌段藻酸盐低聚物表示每个低聚物包含平均约17个G单体的分离的低聚物部 分，其主要部分是每个低聚物15-19个单体。这些低聚物部分可通过加工天然来源的高G 藻酸盐并通过诸如分馏等各种方式分离G嵌段藻酸盐进行制备。在一些实施方式中，藻酸盐是超纯藻酸盐。超纯藻酸盐市售可得，例如从极北海带 等海藻的不同来源。市售藻酸钙盐通常通过以下方式制备在固相中将钙加入藻酸中，通过 简单混合使各组分捏合在一起。市售藻酸钙盐的例子是Protaweld(来自FMC生物聚合物 公司(FMC BioPolymer))和 Kelset (来自 ISP 公司)。在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒可采用藻酸盐和/或G嵌段低 聚物制备，制备过程包括用藻酸盐和/或G嵌段低聚物和胶凝离子制备藻酸盐凝胶，洗出 藻酸盐和/或G嵌段低聚物中存在的钠或其他离子，干燥凝胶除水并由干燥的凝胶制备颗 粒。在一些实施方式中，使用藻酸盐和/或G嵌段低聚物制备的不溶性藻酸盐/胶凝离子 颗粒是化学计量盐。用藻酸盐和/或G嵌段低聚物制备的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒优 选具有高纯度和特定、一致且通常均一的胶凝离子含量，例如钙或锶、钡、锌、铁、锰、铜、铅、钴、镍或其组合，使得凝胶形成速度和凝胶强度具有更精确的可预测性。可通过由溶液沉淀 制备具有已知且预定含量的碱土金属离子的不溶性藻酸的碱土金属盐如藻酸钙或藻酸锶 (取决于所用胶凝离子)或不溶性藻酸的过渡金属盐(如使用铜、镍、锌、铅、铁、锰或钴等胶 凝离子形成的盐)。在一些实施方式中，使用藻酸盐和/或G嵌段低聚物制备藻酸钠溶液。 任选地，藻酸钠溶液中可包含钠盐如碳酸钠。可使用包含不溶性藻酸盐/胶凝离子的所需 胶凝离子的盐，例如钙盐或锶盐如氯化钙或氯化锶来制备溶液。藻酸钠溶液与胶凝离子溶 液合并，优选缓慢混合。优选地，在混合工艺期间连续搅拌合并的溶液。不溶性藻酸盐颗粒， 例如藻酸钙或藻酸锶(取决于所用胶凝离子)从合并的溶液沉淀出来。然后从溶液取出沉 淀的不溶性藻酸盐，用纯水反复洗涤(例如2-10次)以去除所有可溶性离子。通过测定纯 水中不溶性藻酸盐的导电性与纯水的导电性进行比较，验证可溶性离子的去除。洗涤后，干 燥不溶性藻酸盐，例如真空干燥。研磨干燥的藻酸盐，在一些实施方式中，筛选粒度。在一些实施方式中，可通过以下方法制备不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒使用非 水溶剂制备藻酸盐溶液，由该溶液形成凝胶，制备颗粒。通过以下方法用藻酸盐制备不溶性 藻酸盐/胶凝离子颗粒用藻酸盐、胶凝离子和除水以外的溶剂制备藻酸盐凝胶，从凝胶洗 出藻酸盐中存在的钠或其他离子，干燥凝胶以去除溶剂，由干燥的凝胶制备颗粒。研磨干燥 的藻酸盐，在一些实施方式中，筛选粒度。非水溶剂的例子是极性溶剂，例如醇，包括甲醇、 乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等。在一些实施方式中，不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒是化学计量 盐。不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒优选具有高纯度和特定、一致且通常均一的胶凝离子含 量，例如钙或锶、钡、锌、铁、锰、铜、铅、钴、镍或其组合，使得凝胶形成速度和凝胶强度具有 更精确的可预测性。可通过由溶液沉淀制备具有已知且预定含量的碱土金属离子的不溶性 藻酸的碱土金属盐如藻酸钙或藻酸锶(取决于所用胶凝离子)或不溶性藻酸的过渡金属 盐(如使用铜、镍、锌、铅、铁、锰或钴等胶凝离子形成的盐)。在一些实施方式中，采用非水 溶剂，先用市售藻酸钠制备藻酸钠溶液。非水溶剂的例子是极性溶剂，例如醇，包括甲醇、乙 醇、丙醇、异丙醇、丁醇等。任选地，藻酸钠溶液中可包含钠盐如碳酸钠。可使用包含不溶性 藻酸盐/胶凝离子的所需胶凝离子的盐，例如钙盐或锶盐如氯化钙或氯化锶来制备溶液。 藻酸钠非水溶液与胶凝离子非水溶液合并，优选缓慢混合。优选地，在混合工艺期间连续搅 拌合并的非水溶液。不溶性藻酸盐颗粒，例如藻酸钙或藻酸锶(取决于所用胶凝离子)从 合并的溶液沉淀出来。然后从溶液取出沉淀的不溶性藻酸盐，用纯水反复洗涤(例如2-10 次)以去除所有可溶性离子。通过测定纯水中不溶性藻酸盐的导电性与纯水的导电性进行 比较，验证可溶性离子的去除。洗涤后，干燥不溶性藻酸盐，例如真空干燥。研磨干燥的藻 酸盐，在一些实施方式中，筛选粒度。在一些实施方式中，形成凝胶基质后用聚阳离子聚合物如聚氨基酸或壳聚糖涂覆 藻酸盐基质。在一些实施方式中，聚赖氨酸是聚阳离子聚合物。在一些实施方式中，聚赖氨 酸连接于另一部分，因而聚赖氨酸用于促进该部分与凝胶的缔合。利用聚阳离子聚合物连 接于凝胶的部分的例子包括例如药物、肽、造影剂、受体结合性配体或其他可检测的标记。 一些具体例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF) 和骨形态发生蛋白(BMP)。药物可包括癌症化疗药，例如紫杉醇、顺钼和/或其他含钼衍生 物。糖聚合物可包括乙酰透明质酸、壳聚糖、肝素、昆布多糖、墨角藻聚糖、硫酸软骨素。在 一些实施方式中，所用藻酸盐是修饰的藻酸盐聚合物，例如其中一种或多种聚合物连接于不同的藻酸盐聚合物的化学修饰的藻酸盐。这种修饰的藻酸盐聚合物的例子可参见美国专 利6，642，363，其内容被纳入本文作为参考。在一些实施方式中，藻酸盐聚合物可包括非藻酸盐部分，例如药物、肽、造影剂、 受体结合性配体或其他可检测的标记。在一个实施方式中，藻酸盐聚合物包括RDG肽 (Arg-Asp-Gly)，放射性部分(如131I)或不透射线的物质。连接于藻酸盐聚合物的部分的 其他例子包括例如药物、肽、造影剂、受体结合性配体或其他可检测的标记。一些具体例子 包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)和骨形态发生 蛋白(BMP)。药物可包括癌症化疗药，例如紫杉醇、顺钼和/或其他含钼衍生物。糖聚合物 可包括乙酰透明质酸、壳聚糖、肝素、昆布多糖、墨角藻聚糖、硫酸软骨素。在一些实施方式中，藻酸盐可共价连接于包含一个或多个细胞粘附序列的至少一 种肽。例如，修饰的藻酸盐参见US 6，642，363 (Mooney)，其内容被纳入本文作为参考。在一 些实施方式中，连接肽的藻酸盐与未修饰藻酸盐混合。肽-偶联的藻酸盐可用于(例如) 固定化细胞以促进细胞增殖和细胞分化。肽_偶联的藻酸盐也可与其他肽_偶联的多糖和 /或未修饰多糖联用。美国专利4，988，621、4，792，525、5，965，997、4，879，237、4，789，734 和 6，642，363(其内容被纳入本文作为参考)揭示了许多细胞粘附序列肽的例子。合适的肽包 括但不限于等于或少于约10个氨基酸的肽。在一些实施方式中，细胞粘附肽包括RGD， YIGSR(SEQ ID NO 1), IKVAV(SEQ ID NO 2), REDV(SEQ ID NO 3), DGEA(SEQ ID NO 4), VGVAPG(SEQ ID NO5)，GRGDS(SEQ ID NO6)，LDV，RGDV(SEQ ID NO 7),PDSGR(SEQ IDNO 8), RYVVLPR(SEQ ID NO :9)，LGTIPG(SEQ ID NO 10),LAG,RGDS(SEQ ID NO 11)，RGDF(SEQ ID NO: 12)，HHLGGALQA ⑶ V (SEQ IDNO 13)，VTCG (SEQ ID NO: 14)，SDGD (SEQ ID NO: 15)， GREDVY(SEQ IDNO 16)，GRGDY(SEQ ID NO 17)，GRGDSP(SEQ ID NO 18)，VAPG(SEQID NO 19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO 20)和 GGGGRGDY(SEQ ID NO 21)和 FTLCFD(SEQ ID NO :22)。 在一些实施方式中，细胞粘附肽包括RGD，YIGSR(SEQ ID NO :1)，IKVAV(SEQ ID NO :2)， REDV(SEQ ID NO 3)，DGEA(SEQ ID NO 4)，VGVAPG(SEQ ID NO 5)，GRGDS(SEQ ID NO 6)， LDV, RGDV(SEQ ID NO :7)，PDSGR(SEQ ID NO :8)，RYVVLPR(SEQ IDNO :9)，LGTIPG(SEQ ID NO : 10)，LAG，RGDS(SEQ ID NO : 11)，RGDF(SEQ ID NO : 12)，HHLGGALQAGDV(SEQ ID NO: 13)，VTCG(SEQ IDNO : 14)，SDGD (SEQ ID NO : 15)，GREDVY(SEQ ID NO : 16)，GRGDY(SEQID NO : 17)，GRGDSP(SEQ ID NO : 18)，VAPG(SEQ ID NO : 19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO 20)和 GGGGRGDY (SEQ ID NO 21)和 FTLCFD(SEQ ID NO :22)，进一步包含额外的氨基酸，例如，1-10 个额外的氨基酸，包括但不限于N或C末端的1-10G残基。例如，合适的肽可具有式(Xaa) n-SEQ-(Xaa)n，其中Xaa各自独立地是任何氨基酸，η = 0-7, SEQ =选自下组的肽序列RGD， YIGSR(SEQ ID NO 1), IKVAV(SEQ ID NO 2), REDV(SEQID NO 3)，DGEA(SEQ ID NO :4)， VGVAPG (SEQ ID NO 5), GRGDS (SEQID NO : 6)，LDV，RGDV (SEQ ID NO : 7)，PDSGR (SEQ ID NO: 8)，RYVVLPR (SEQ ID NO 9)，LGTIPG (SEQ ID NO 10)，LAG, RGDS (SEQ IDNO :11)，RGDF (SEQ ID NO 12)，HHLGGALQA⑶V(SEQ ID NO 13)，VTCG(SEQ ID NO 14)，SDGD(SEQ ID NO 15)， GREDVY(SEQ IDNO 16)，GRGDY(SEQ ID NO 17)，GRGDSP(SEQ ID NO 18)，VAPG(SEQID NO 19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO 20)和 GGGGRGDY(SEQ ID NO 21)和 FTLCFD(SEQ ID NO :22)， 氨基酸总数小于22，优选小于20，优选小于18，优选小于16，优选小于14，优选小于12，优选小于10。在一些实施方式中，细胞粘附肽包括RGD，YIGSR(SEQ ID NO 1), IKVAV(SEQ IDNO 2)，REDV(SEQ ID NO 3)，DGEA(SEQ ID NO 4)，VGVAPG(SEQ IDNO 5)，GRGDS (SEQ ID NO 6), LDV, RGDV (SEQ ID NO 7), PDSGR (SEQID NO 8)，RYWLPR (SEQ ID NO 9), LGTIPG (SEQ ID NO: 10)，LAG, RGDS (SEQ ID NO: 11)，RGDF (SEQ ID NO: 12)，HHLGGALQA ⑶ V (SEQ IDNO 13)，VTCG (SEQ ID NO: 14)，SDGD (SEQ ID NO: 15)，GREDVY (SEQ IDNO : 16)，GRGDY (SEQ ID NO 17)，GRGDSP(SEQ ID NO 18)，VAPG (SEQID NO 19)，GGGGRGDSP(SEQ ID NO 20)禾口 GGGGR⑶Y(SEQ ID NO 21) ^P FTLCFD (SEQ ID NO :22)。细胞粘附或其他细胞相互作用的生 物活性分子包括EGF、VEGF、b-FGF、FGF、TGF、TGF-β或蛋白聚糖。在一些实施方式中，包含 RGD的细胞粘附肽可以是3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的长度。例子包括但不限于RGD， GRGDS (SEQ ID NO 6), RGDV (SEQ IDNO 7)，RGDS (SEQ ID NO: 11)，RGDF (SEQ ID NO: 12)， GRGDY (SEQ IDNO : 17)，GRGDSP (SEQ ID NO 18), GGGGRGDSP (SEQ ID NO :20)和 GGGGRGDY(SEQ ID NO :21)。合适的包含R⑶的细胞粘附肽包括但不限于N0VATACH RGD (NovaMatrix，挪威 奥斯陆的FMC生物聚合物公司(FMC BioPolymer,Oslo, Norway))和美国专利6，642，363所 述的肽，其内容被纳入本文作为参考。肽合成服务可以从许多公司获得，包括美国维吉尼亚 州里士满的公共健康生物技术有限公司(Commonwealth Biotechnologies, Inc. Richmond, Virginia, USA)。将肽偶联于藻酸盐主链的化学技术可参见美国专利6，642，363。本文所用术语“RGD修饰的藻酸盐”表示共价连接于含RGD的肽的藻酸盐。合适的 RGD肽偶联的藻酸盐包括但不限于N0VATACH RGD (NovaMatrix,挪威奥斯陆的FMC生物聚 合物公司)和美国专利号6，642，363所述的那些，其内容被纳入本文作为参考。可溶性藻酸盐可以是盐，例如Na+-藻酸盐、K+-藻酸盐、PEG-藻酸盐(聚乙二醇-藻 酸盐)、NH4-藻酸盐或其组合。在一些实施方式中，冻干或以其他方式干燥可溶性藻酸盐。冻干的可溶性藻酸盐 是“速溶的”。“速溶”藻酸盐不到1分钟，优选不到30秒，更优选不到15秒即溶解在水中。 “易溶”藻酸盐的溶解需要超过1分钟，通常超过几分钟。不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中使用的胶凝离子影响胶凝动力学、凝胶强度和弹 性。胶凝离子也可能影响细胞生长。不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中使用的胶凝离子可以 是 Ca++、Sr++、Ba++、Zn++、Fe++、Mn++、Cu++、Pb、Co、Ni 或其组合。不溶性藻酸盐胶凝离子复合物是颗粒。颗粒通常是基于L/D比例的非纤维状，其 中颗粒形状由最大维度(L)和最小维度(D)表征。非纤维状L/D小于10，优选小于5，优选 小于2。L/D等于或大于10是短纤维。不溶性藻酸盐胶凝离子可以分散体或者干燥形式保 存。如果是分散体，分散体可与包含可溶性藻酸盐的溶液或者与速溶藻酸盐混合以形成不 溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒在包含可溶性藻酸盐的溶液中的分散体。如果不溶性藻酸盐胶 凝离子颗粒是干燥颗粒，它们可与干燥速溶藻酸盐混合然后与溶液混合以形成不溶性藻酸 盐/胶凝离子颗粒在包含可溶性藻酸盐的分散体，或者干燥不溶性藻酸盐胶凝离子颗粒可 与包含可溶性藻酸盐的溶液合并以形成不溶性藻酸盐胶凝离子颗粒在包含可溶性藻酸盐 的溶液中的分散体。混合各组分以形成分散体时进行搅拌可导致固体颗粒在溶液中的分布。所制备的 分散体可以是能够倾倒、注射到模具或空腔内的浆液和其他延迟的自胶凝形式，以形成这 种模具或空腔的形状。
形成不溶性藻酸盐胶凝离子颗粒在包含可溶性藻酸盐的溶液中的分散体，将其分 配至一定部位，在该部位发生延迟的胶凝作用而形成藻酸盐凝胶。在一些实施方式中，将分 散体分配至体内部位。在一些实施方式中，将分散体分配至个体身体上的部位。在一些实 施方式中，将分散体分配至模具或其他容器或表面。不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒中使用的胶凝离子的浓度影响胶凝动力学、凝胶强 度和凝胶弹性。胶凝离子浓度越高，凝胶强度越高。当凝胶被胶凝离子饱和时，凝胶强度最 高。相反，胶凝离子浓度越低，凝胶强度越低，生物可降解性越高。不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的粒度可能影响胶凝动力学和最终的凝胶性质。粒 度越小，凝胶形成完成越快。粒度较大产生较强的凝胶。粒度可通过以下方式进行控制， 例如筛分不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒通过各种不同大小的滤器，使得颗粒大致都在预定 的大小范围内。在一些实施方式中，粒度为< 254111，25-454111，45-754111，75-1254111或> 125 μ m。在一些实施方式中，粒度为< 125ym，< 135ym, < 145 μ m, < 155ym, < 165 μ m 或< 175 μ m。所用溶剂可以是例如水、盐水、糖溶液、细胞培养液、溶液如药物溶液、蛋白质或核 酸溶液、悬液如细胞悬液、脂质体、或造影剂悬液。不添加非胶凝离子的情况下，溶剂必须 包含足量非胶凝阳离子以加速胶凝过程。就是说，溶剂必须包含能够启动从不溶性藻酸盐 /胶凝离子颗粒置换胶凝阳离子的非胶凝阳离子，置换速率足以导致凝胶形成，使得如本文 所述在指定时间内最终凝胶储能模量大于10%。因此，例如，溶剂中的任何非胶凝阳离子必 须与反荷离子或其他分子实体缔合，使得非胶凝阳离子即使存在也不可得。藻酸钠溶液中 的钠不可得，即钠离子数量等于藻酸盐反荷离子分子中存在的阴离子电荷的数量。通过加 入盐(例如氯化钠)增加可得钠离子数量，如果存在的钠离子足够，即加入足够的盐，由于 可得非胶凝钠离子的存在，能够加速胶凝过程，氯化钠中钠离子不像钠离子与藻酸盐中的 藻酸盐抗衡离子缔合那样与氯抗衡离子缔合。用于制备分散体中使用的可溶性藻酸盐溶液 的溶剂包含的非胶凝离子含量必然不足，使得分散体形成的凝胶在不添加非胶凝离子的情 况下，在指定时间内最终凝胶储能模量没能大于10 %。形成的藻酸盐水凝胶可包含例如药物核酸分子、细胞、多细胞聚集体、组织、蛋白 质、酶、脂质体、造影剂或生物活性材料。生物活性材料的离子是透明质酸和壳聚糖。造 影剂包括钽和钆。蛋白质的一些具体例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子 (EGF)、转化生长因子(TGF)和骨形态发生蛋白(BMP)。药物可包括癌症化疗药，例如紫杉 醇、顺钼和/或其他含钼衍生物。糖聚合物可包括乙酰透明质酸、壳聚糖、肝素、昆布多糖、 墨角藻聚糖、硫酸软骨素。凝胶中可使用的细胞包括非重组和重组细胞。在细胞被包封在藻酸盐基质中的一 些实施方式中，包封的细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。在包封细胞是非增殖性细胞的一 些实施方式中，非增殖性细胞可选自下组胰岛、肝细胞、神经细胞、肾皮质细胞、血管内皮 细胞、甲状腺和甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、卵巢细胞和软骨细胞。在包封细胞 是增殖性细胞的一些实施方式中，增殖性细胞可以是干细胞，祖细胞，特定器官的增殖性细 胞，成纤维细胞和角质形成细胞，或源自已建立的细胞系的细胞，例如293、MDCK和C2C12细 胞系。在一些实施方式中，包封细胞包含编码细胞培养时表达的一种或多种蛋白质的表达 载体。在一些实施方式中，蛋白质是细胞因子，生长因子，胰岛素或血管新生抑制剂如血管他汀或内皮他汀，其他治疗性蛋白质或其他治疗性分子如药物。因为凝胶网络的孔隙率，小 于约60_70kD的较低分子量的蛋白质是尤其优良的候选物。在一些实施方式中，细胞以多 细胞聚集体或组织形式存在。延迟的自胶凝藻酸盐存在许多应用。在一些实施方式中，延迟的自胶凝藻酸盐用 于食品。延迟的自胶凝藻酸盐尤其适用于和其他食物成分形成液体/浆液混合物并分配到 容器内制备的食品。容器优选是模具，凝胶/食品固化在模具中形成模具形状的固体或半 固体。可制备糖果、食用装饰料、布丁和其他模具形状的食品。加入非胶凝阳离子可启动胶 凝过程。在一些实施方式中，延迟的自胶凝藻酸盐用于生物医学应用。生物相容性延迟的 胶凝藻酸盐可外用。生物相容性延迟的自胶凝藻酸盐尤其适用于希望凝胶基质符合原位空 腔的生物医学应用，使得延迟的自胶凝藻酸盐可作为分散体分配到需要基质的部位。液体 或浆液形式的分散体填充空腔或空间，在空腔或空间内与生理学非胶凝阳离子接触后固化 形成固体。或者，分散体可以在固化前外用分配至需要铺展的部位。在一些实施方式中，延 迟的自胶凝藻酸盐用于制备具有特定形状的基质，该制备过程包括制备能够分配到模具内 固化形成具有模具形状的固体的液体/浆液混合物，和/或制备具有用作组织或器官置换 的包封细胞的基质。加入非胶凝阳离子可启动胶凝过程。提供了可控、生物相容且具体设计用于原位凝胶形成植入目的的藻酸盐延迟的自 胶凝体系，该体系具有延迟的自胶凝性质，便于使用和操纵而没有其他体系相关的时间限 制。提供了便于注射或以其他方式施用于体内或体外的溶液，在一些情况下，加入非胶凝阳 离子和/或暴露于生理学非胶凝阳离子后，该溶液固化形成固体凝胶基质。通过混合可溶 性藻酸盐、溶剂和胶凝离子源，即结合在不溶性颗粒的凝胶网络内的胶凝离子，凝胶形成材 料可以以液体形式分配并以所需模式和时间框架固化。溶液在预定时间硬化并形成凝胶， 或者加入或暴露于非胶凝阳离子源可加速胶凝。制剂是生物相容的，略去PH变化和毒性化 合物的存在。距离生物学PH的显著差异是不必要的。在一些实施方式中，在生物应用中使用延迟的自胶凝藻酸盐，这些应用包括组织 填充，例如用于治疗反流问题(即治疗失禁、肾反流或食管反流问题)，栓塞形成，例如治疗 良性和恶性蒸馏，抗粘连治疗，如术后处理和伤口治疗。在一些应用中可使用目前的技术， 包括离体或体内组织构建物，例如细胞或其他生物材料可混合到胶凝体系中，形成支持细 胞或组织的生物人造胞外基质。根据一些应用，可植入生物相容性固体储器，随时间释放活 性成分如蛋白质和药物。延迟的自胶凝藻酸盐尤其适合用作组织填充材料，因为它能够引入远程到达部 位，以液体浆液形式分配而相对于其他类型的植物体能够更完全地符合空腔。分散体可以 足量分配以置换和支持体内其他组织或器官，原位形成凝胶后提供维持和支持其他组织或 器官的结构。延迟的自胶凝藻酸盐可包含使其很好地适应组织填充应用的组分。例如，使 用锶作为胶凝剂形成的凝胶能够抑制细胞过度生长和不希望的组织形成。可长时间操纵延 迟的自胶凝藻酸盐以实现植入，而不会在导管等装置中发生胶凝。延迟的自胶凝藻酸盐尤其施用于心脏应用，心脏应用中尤其不希望因为导管中的 胶凝作用而必须使用和设置多根导管。延迟的自胶凝作用给予使用者时间以适当设置和递 送分散体。
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延迟的自胶凝藻酸盐尤其施用于栓塞形成手术，因为能够将其引入远程到达的血 管，以液体浆液形式分配以完全符合内部或血管，并且相对于其他类型的闭合如缝合能够 更完全和有效地实现阻塞。分散体可以足量分配，原位形成凝胶后阻塞循环。延迟的自胶 凝藻酸盐可包含使其很好地适应栓塞形成应用的组分。例如，选择能够相对快速固化和高 强度的组分。栓塞形成应用中使用的延迟的自胶凝藻酸盐可包含造影剂以监测其存在和定 位。延迟的自胶凝藻酸盐尤其施用于抗粘连治疗作为术后处理，因为能够将其以液体 浆液的形式引入整个外科手术干预区以完全覆盖暴露的表面，特别是切口处或其附近。延 迟的自胶凝藻酸盐可包含使其很好地适应抗粘连应用的组分。例如，使用锶作为胶凝剂形 成的凝胶能够抑制细胞过度生长和不希望的组织形成。延迟的自胶凝藻酸盐是尤其有用的伤口处理，因为能够将其以液体浆液的形式引 入整个伤口区域以完全覆盖暴露的表面。此外，延迟的自胶凝藻酸盐例如可以以液体浆液 的形式内部分配通过伤口部位。分散体可以足量分配，以在原位形成凝胶后填充内部空腔， 凝胶将阻塞任何内部伤口并防止血液通过内衄流失。延迟的自胶凝藻酸盐可包含使其很好 地适应伤口处理应用的组分。例如，可包含凝血组分以及抗菌防腐和抗生素组合物。延迟的自胶凝藻酸盐尤其适用于制备离体或体内组织构建物。可将细胞或其他生 物材料混合到凝胶体系中，从而形成支持细胞或组织的生物人造胞外基质。分散体可以液 体浆液形式原位引入一定部位，在该部位组织/细胞发挥作用以实现治疗效果。组织构建 物的例子包括骨、软骨、结缔组织、肌肉、肝、心脏、胰和皮肤。例子可以是治疗糖尿病的包 含胰岛素分泌细胞的制剂，用于修复缺损关节的包含软骨细胞的制剂，和用于治疗帕金森 病的细胞。这些细胞可掺入液体浆液中并分配至一定部位，在该部位形成凝胶后能够在生 物相容性藻酸盐基质内存在和发挥功能。凝胶也可用作保护包封细胞免于接触宿主免疫系 统的免疫阻挡物。也可使用延迟的自胶凝藻酸盐包封离体细胞，由此凝胶能够形成与其指 定用途相适应的形状。在一些实施方式中，可使用延迟的自胶凝藻酸盐包封细胞，例如皮肤 细胞，制备人造皮肤，用于治疗烧伤患者和其他需要皮肤移植或大面积伤口治愈的患者。在 一些实施方式中，可使用延迟的自胶凝藻酸盐包封细胞并形成能够植入的基质。糖尿病的治疗可包括制备包含胰岛素产生细胞的生物相容性基质，该生物相容性 基质的制备包括制备包含不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒和胰岛素产生细胞在可溶性藻酸 盐溶液中的分散体，并将该分散体分配至个体体内部位，在该部位形成生物相容性基质。个 体体内部位可以是植入个体内的空腔或结构。分散体可分配到模具、结构或容器内，在其中 形成生物相容性基质后植入个体体内。基质中的细胞产生的胰岛素由细胞分泌并从基质释 放到个体体内，其体内发挥作用以减轻糖尿病症状。在一些实施方式中，胰岛素产生细胞是 胰岛细胞。在一些实施方式中，胰岛素产生细胞是制备后表达和分泌胰岛素的重组细胞。延迟的自胶凝藻酸盐尤其适用于制备涂覆装置如可植入装置。在一些实施方式 中，所述装置选自支架、心脏起搏器、导管、可植入假体、外科螺钉、外科导线、组织填充性 植物体、食管反流抑制性植物体、失禁抑制性植物体、肾反流、适用于容纳沉积到藻酸盐基 质表面外侧和/或用藻酸盐基质包封的细胞的容器，例如实心装置或巨囊、乳房植物体、颏 骨植物体、颊植物体、胸植入体、臀肌植入体和牙科植入体。用延迟的自胶凝藻酸盐涂覆产 生与形状无关的有效涂层。使用锶作为胶凝离子尤其适用于抑制植物后细胞过度生长。
延迟的自胶凝藻酸盐可用于制备能够植入的基质。这些基质可具有特定形状，制 备过程包括将液体/浆液混合物分配到模具内，混合物在模具内固化形成具有模具形状的 固体。制备用于植入的基质可包含生物活性试剂和/或细胞。可制备凝胶并经外科植入， 外用或通过外部开口应用于器官内。根据一些实施方式，提供了用于制备藻酸盐凝胶的试剂盒。该试剂盒可包含第一 容器和第二容器，第一容器包含可溶性藻酸盐，第二容器包含不溶性藻酸盐/胶凝离子颗 粒。各个容器可以是整合的容器系统的分离容器组件。在一些实施方式中，试剂盒可包含溶液形式的可溶性藻酸盐。在一些实施方式中， 试剂盒可包含无溶剂的可溶性藻酸盐。在一些实施方式中，试剂盒包含含有溶剂的额外容
ο在一些实施方式中，试剂盒包含粉末形式的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。在一 些实施方式中，试剂盒包含分散体形式的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。在一些实施方式中，试剂盒包含额外的容器，该容器含有药物、肽、蛋白质、细胞、 可检测的标记或造影剂。在一些实施方式中，试剂盒包含药物、肽、蛋白质、细胞、可检测的 标记或造影剂，这些物质装载在含有可溶性藻酸盐溶液或粉末中和/或包含在含有不溶性 藻酸盐/胶凝离子粉末或分散体中的容器中。根据一些实施方式，提供了用于制备凝胶的组合物。该组合物包含速溶藻酸盐和 不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。组合物可还包含药物、肽、蛋白质、可检测的标记或造影剂。 组合物可以是试剂盒中的组分。这种试剂盒可进一步包含装载溶剂的容器。试剂盒优选包含使用说明。在一些实施方式中，试剂盒包含混合装置。混合装置可整合形成容器或容器系统 的一部分。在一些实施方式中，混合装置可包含阀门系统，允许分散体从一个容器进入其他 容器以便混合。在一些实施方式中，试剂盒包含分配装置。分配装置可以是与混合装置连通的施 加器和/或适合包含分散体的容器。在一些实施方式中，分配装置包括导管。在一些实施 方式中，分配装置包括注射器。
实施例实施例1 具有高G含量的藻酸钙颗粒(CaG)的组合物的胶凝性能制备了四种不同的制剂(表1)并在相同条件下进行测定。使用两个连接的注射 器混合各组分(4毫升样品，混合20秒，开始混合后约1分钟开始测量)后立即用Bohlin CVO 120HR流变计测定凝胶的固化(采用锯齿状板的测量系统，200C，间隙1mm，频率1. OHz, 应变0.005)。开始混合时的时间为零。使用高含量甘露糖醛酸制备的藻酸钙颗粒时，胶凝 过程几乎在混合后立即开始(表1中的制剂1和3，图1中的制剂3)。高M不溶性藻酸盐 颗粒(CaM)采用古洛糖醛酸含量小于约50%的藻酸盐。相反，使用包含高含量古洛糖醛酸 的藻酸钙颗粒的本发明组合物时，观察到胶凝之前存在显著的起始延迟时间(见图1 制剂 17、19和21，不溶性高G藻酸盐颗粒CaG采用含有约70 %具有长G-嵌段的古洛糖醛酸的藻 酸盐)。根据参考文献0. Skaugrud, A. Hagen, B. Borgersen和M. Dornish.，“藻酸盐和壳聚 Hl^LBIfgl^flSiM，，(Biomedical and pharmaceutical applications of alginate
21and chitosan). Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16 :23_40，1999 测定 G 嵌段长度。制剂 1、3 和 10是对比例，制剂17、19和21是本发明的实施例。表1组合物 图1所示弹性模量(G')的数据拟合成双动力学方程G' = A(l_f exp(-kl(t-c))-(l-f)exp(-k2(t_c)))，其中A是最终凝胶强度，f是相对贡献因子，kl和k2是速率常数，c是延迟常数 (=延迟时间)，t是混合后的时间。由拟合数据获得总的胶凝半衰期和最终的凝胶强度(表 2)。拟合方程不能用于描述制剂17和19观察数据所示曲线的开始部分(延迟)。表2显 示了由拟合曲线计算的数据(最终凝胶强度和胶凝时间)。延迟的自胶凝时间(c)等于拟 合方程达到零时的时间。由数据可见，与CaM制剂相比，制剂19 (CaG制剂)需要约5分钟 的额外时间以达到类似的弹性模量(半衰期)。对于这种较高浓度的CaG制剂来说，最终的 弹性模量较高。在相等浓度条件下，与CaM颗粒相比(比较制剂3和17) CaG颗粒的胶凝半 衰期从约2分钟提高至20分钟。通过测试采用藻酸盐溶液中高G含量的可溶性藻酸钠的 延迟的自胶凝组合物(制剂21)验证，含CaG颗粒的制剂的胶凝速率较慢。表2 源自图1拟合曲线的胶凝参数 含CaG颗粒的组合物的胶凝时间保留了开发应用具有改良性质的特定制剂的可 能性。采用不溶性藻酸盐颗粒的其他胶凝制剂显示几小时胶凝开始的延迟以及至少1天或 几天胶凝开始之前的延迟。将钠离子加入制剂中可以启动制剂胶凝作用的快速开始。在生 理学水平的钠存在下，胶凝作用快速开始。例如，注射延迟的自凝胶溶液在注入组织或者将 包含生理学水平的钠和钙的细胞培养液加入延迟的自凝胶制剂后立即开始形成凝胶。实施例2和3显示了采用低分子量G嵌段藻酸盐制备的不溶性藻酸盐颗粒。实施例2.制备具有化学计量钙(100%饱和)的藻酸钙和具有高古洛糖醛酸含量 的藻酸钠低聚物将75克藻酸盐低聚物(批号FP-702-01，古洛糖醛酸含量73%，4000克/摩尔重 量)溶解于4. 5升纯水中。持续搅拌的同时将207克CaCl2 · 2H20溶于450毫升纯水构成 的钙溶液小心加入藻酸盐溶液中。得到细微沉淀。沉淀静置30-40分钟。然后用纯水洗涤 沉淀直到悬液导电性小于0. lmS/cm。产品最终冻干，研磨并分馏。实施例3 制备具有化学计量钙(100%饱和)的藻酸钙和溶液中G含量> 85%的 藻酸钠低聚物将151. 8克CaCl2 · 2H20和330毫升纯水组成的钙溶液小心加入1升藻酸盐低聚 物溶液中(G含量>85%，pH 7，平均DPn 16，干物质5%)。得到细微沉淀，静置过夜。用 纯水洗涤产物直到悬液导电性小于0. lmS/cm。沉淀产物冻干，用敲击桶(beating vat)粉 碎并分馏。实施例4 制备具有化学计量钙(100%饱和)的藻酸钙和悬浮在醇中的高古洛糖 醛酸含量的藻酸钠将10克PR0N0VA VLVG藻酸钠、批号BP0709-02(68%古洛糖醛酸含量30000克/ 摩尔重量)悬浮在420毫升异丙醇(IPA)中。将27. 6克CaCl2 ·2Η20和240毫升纯水组成 的钙溶液小心加入溶液中。悬液搅拌过夜，然后用65% IPA洗涤。产物在干燥药柜中干燥 过夜，用敲击桶研磨并分馏。
实施例5.制备具有化学计量钙(100%饱和)的藻酸钙和悬浮在醇中的高甘露糖 醛酸含量的藻酸盐60克PR0N0VA LVM (54%甘露糖醛酸含量，20 700克/摩尔重量)悬浮在2574毫 升IPA中。将165. 6克CaCl2 ·2Η20和1386毫升纯水组成的钙溶液小心加入溶液中。悬液 搅拌过夜。沉淀分成三份，分别用水、65% IPA和100% IPA洗涤。三部分在干燥药柜中干 燥约66小时，用敲击桶粉碎。实施例6 由具有各种DPruG-和M含量的不同类型的藻酸钠制备的产物的其他例 子表3 在表3中，G含量表示存在的G的百分数，M含量表示存在的M的百分数，平均DPn 对应于每个低聚物中的单体数量。实施例7 具有钙G-嵌段颗粒的延迟的自胶凝在该实施例中，制备了各种延迟的自凝胶制剂并在相等条件下进行测定凝胶制剂 中使用NovaMatrix生产的钙G-嵌段藻酸盐(批号BU-0711_01，45_75 μ m)作为钙源。在 该制剂中，将2. 5%钙G-嵌段藻酸盐分散体与2. 5% PR0N0VA LVG藻酸钠的溶液(Batch FP-206-01)混合。藻酸钠溶液中加入或不加氯化钠制备三种不同的制剂，使得混合后最终氯化钠浓度为0. 45或0. 9%。用实施例1所述的Bohlin CVO 120HR流变计测定凝胶固化。 使用两个相连的注射器(3毫升样品，混合约20秒，开始混合后1分钟开始测量)混合后立 即将制剂置于流变计上。混合开始时的时间为零，数据如图2所示。虽然在氯化钠的存在 下不到1分钟即开始胶凝过程，没有钠的情况下流变计数据显示最长至约5小时没有发生 胶凝。此后，储能模量仅发生非常小的改变，表明一定程度的结构建成。然而，随着时间推 移(天)该制剂也形成凝胶，最终弹性值相当于加入钠的制剂。测量开始后1小时在凝胶顶上加入0. 9%氯化钠溶液进一步测试钠对凝胶形成的 影响(图3)。显然，加入氯化钠导致快速胶凝开始和较快的凝胶形成。实施例8 具有PR0N0VA VLVG藻酸盐组成的钙颗粒的延迟的自凝胶制剂在该实施例中，制备了各种延迟的自凝胶制剂并在相等条件下进行测定。凝胶制 剂中使用NovaMatrix生产的特殊加工的藻酸钙(批号J101-005)作为钙源。在该制剂中， 将2. 5%钙VLVG藻酸盐分散体与2. 5% PR0N0VALVG藻酸钠的溶液(批号FP-408_02)混 合。藻酸钠溶液中加入或不加氯化钠制备两种不同的制剂，使得混合后最终氯化钠浓度为 0.9%。用实施例1所述的Bohlin CVO 120HR流变仪测定凝胶固化。使用两个相连的注射 器(3毫升样品，混合约20秒，开始混合后1分钟开始测量)混合各组分后立即置于流变计 上。混合开始时的时间为零，数据如图4所示。虽然在氯化钠的存在下立即开始胶凝过程， 但在没有钠的情况下整个测量过程(超过9小时)中流变计未显示发生胶凝。一些胶凝 作用在1天或几天后开始。测量开始后1小时藻酸盐溶液中加入MEM培养液(包含0. 9% NaCl)进一步测试钠对凝胶形成的影响(图3)。显然，加入培养液后立即发生加入生理溶 液启动的凝胶形成。实施例9:控释系统已阐述了在控释系统中使用藻酸盐递送药物或其他治疗分子。也可类似地使用这 里所述的凝胶制剂的类型并在不同制剂中具有优势。一个例子是使用生物可降解性凝胶， 即使用低浓度的胶凝离子以限制治疗期。在癌症患者的治疗过程中，外科手术期间可以采 用含有药物或放射性同位素的空腔填充性凝胶以防止疾病复发。活性物质释放或者放射性 衰减后，可能希望凝胶溶解并从体内排泄。当然也可将延迟的自胶凝藻酸盐受控递送制剂 直接注入体内而不需要任何外科手术，凝胶/藻酸盐溶液也可用于口服药物递送。对于口 服应用，目前众所周知的是在制剂中使用藻酸盐作为抗反流补救措施。因此，藻酸盐延迟的 自胶凝制剂可能具有类似的应用。实施例10 组织工程改造应用可采用将细胞包埋到本文所述的藻酸盐凝胶内来制备分泌活性物质以治疗各种 疾病的可植入“生物工厂”。然而，将细胞包埋到藻酸盐凝胶也可用于组织工程改造应用。 对于组织工程改造，需要在三维构建物内或构建物上的细胞生长，因此需要适合这种应用 的优良生物材料。交联离子时间延迟的自释放能使胶凝离子藻酸盐悬浮液在胶凝作用发生 之前模塑形成复杂几何形状。在离体条件下，这种藻酸盐结构可用作开发组织或人造器官 的生长基质。细胞在藻酸盐凝胶珠表面上生长，凝胶表面可能是细胞的生长基质。发现藻 酸盐凝胶上细胞的生长取决于使用的藻酸盐和胶凝离子。本发明延迟的自胶凝制剂可用于 产生细胞在藻酸盐片材或其他成形凝胶结构内部或者其表面上生长的多层。而且，随后用 柠檬酸盐、磷酸盐或其他胶凝离子螯合剂处理可去除藻酸盐。这给出了将一些细胞层在组
25织或器官结构中进行组合的可能性。如果开发构建物需要，凝胶结构内部或者其表面上的 一些细胞类型可以组合。神经再生是组织工程改造内使用藻酸盐的一个感兴趣例子。用延迟的自胶凝藻酸 盐填充人造神经导管适用于产生具有改良的导向性并且对于神经再生长具有生物相容性 的构建物。与其他技术相比，该系统对于模塑复发和结构限制具有更好的灵活性和更佳的 控制。即使没有外科干预，也可将可注射藻酸盐/细胞悬液递送至缺损或损伤组织部 位。对于这种应用，关键在于在胶凝之前具有一定操作时间使材料成形。然而，也要求胶凝 速率合理地快速，从而避免与应用凝胶/溶液相关的延长的患者等待时间或问题。如本文 所示和先前所述，延迟的自胶凝系统可适配成具有不同的凝胶时间曲线以及不同的强度和 稳定性。因此，可利用这种可变性以适应每一种类型的注射过程。例如，修复软骨缺损能够 使用延迟的自胶凝藻酸盐结构。发现藻酸盐是有用的生物材料，可用于软骨组织工程改造， 并且发现藻酸盐可刺激软骨形成。因此，在关节缺损的治疗中可直接注入含有或不含软骨 细胞或其他细胞的延迟的自胶凝藻酸盐溶液。现在已经在用“关节液疗法”治疗骨关节炎 患者，市场上存在两种产品，透明质酸钠(Hyalgan)和hylan G-F 20 (Synvisc)，据信通过 补充透明质酸作为润滑剂，透明质酸能给予关节液以粘度。在一些人中，疼痛缓解持续长达 6-13个月。已证明该疗法对于轻度到中度膝关节炎患者最有效。然而，已知透明质酸是体 内降解，使用生物可降解性较差而生物相容性较好的其他生物聚合物如藻酸盐具有优势。藻酸盐水凝胶可以冻干或者以其他方式部分或完全除水，以产生生物相容性结构 如海绵或纤维。采用延迟的自胶凝藻酸盐体系，利用本发明的技术，也可用作生产适用于组 织工程改造或其他应用的生物相容性海绵或其他结构的一个步骤。延迟的自胶凝藻酸盐可用于涂覆支架或移植物或其他植入装置。根据藻酸盐制剂 的类型，涂层的生物可降解性可高可低，或多或少地提供宿主细胞向内生长或加入装置的 细胞生长的支持。实施例11 组织填充可将藻酸盐递送至尿括约肌近侧的粘膜下层内，以提供填充用于治疗膀胱失禁， 临床中已经进行手术。另一个例子是将藻酸盐制剂递送至食管和胃之间的连接处以助于治 疗胃-食管反流疾病。藻酸盐的高度相容性使其用作美容手术中的可注射溶液成为代替其 他材料的具有吸引力的可选方式。基于延迟的自胶凝藻酸盐体系的制剂可用于产生具有预定硬化时间的可注射溶 液或糊剂，以填充预定的体积。如先前所述，胶凝制剂或多或少具有生物可降解性，使填充 制剂具有理想性质。实施例12 血管栓塞形成可使用形成血管内闭塞的方法来治疗疾病，例如动静脉畸形、动脉瘤、过度肿瘤血 供、控制大量血管出血以及需要栓塞形成以缓解疾病的其他疾病。一些血栓系统包括使用 聚合物溶液，这些聚合物溶液在接触血液或其他体液时开始固化或沉淀。然而，因为导致固 体聚合物形成或沉淀所需的时间延迟，这些系统存在聚合物溶液迁移进入体内不希望部位 的问题。这些聚合物溶液系统的迁移在将溶液注射到“高流量”区域如血管系统内时尤其 成问题。由聚合物溶液系统形成的纤维也倾向于存在其他问题，例如不能栓塞细胞，过度脆性，或者不具有生物相容性。发现PVA(聚乙烯醇)颗粒或珠或明胶珠可用于栓塞，并且目 前临床已使用。还提出基于藻酸盐的制剂用于栓塞形成术。建议采用藻酸钙来诱导血管内闭塞， 该方法通过控制藻酸盐液体和氯化钙溶液的注射以符合需要栓塞的血管系统内的部位并 在该部位聚合。相对于该系统，使用本发明延迟的自胶凝藻酸盐制剂具有优势。治疗可以 是单次注射，由于该系统更好的控制可调节延迟的自硬化制剂的强度。具体说，如果需要控 制胶凝前的时间和生物可降解性，则延迟的自胶凝藻酸盐是有用的。实施例13:抗-粘连制剂形成粘连是因为外科手术、创伤、感染等原因。腹部手术后粘连频发，是导致肠梗 阻、不孕和疼痛的主要临床问题。防止或减少粘连的努力大多没能成功；然而，近来开发的 采用不同生物聚合物的机械阻挡层在粘连预防领域取得了临床进展。已提出基于藻酸盐的制剂作为抗粘连阻挡层。采用本发明延迟的自胶凝藻酸盐系 统可形成抗粘连阻挡层。刚好在使用前将溶液/凝胶制剂预先混合，制成具有合适的生物 可降解性。这种类型的制剂也可包含其他聚合物、药物或其他支持性化合物。其他聚合物 可用于改善凝胶性质，提高凝胶结构与组织间的粘连。实施例14:伤口愈合制剂藻酸盐敷料常用于治疗渗出伤口。目前用于伤口愈合的藻酸盐产品由软的无纺纤 维或垫组成。藻酸盐可吸收几倍于其自身的重量，在伤口内形成凝胶以填充无效腔和维持 湿润环境。也提出，藻酸盐可能通过更多未知机制影响伤口治愈过程，推测藻酸盐伤口敷料 中存在的钙可能通过影响某些细胞而影响伤口治愈过程。延迟的自胶凝藻酸盐结构能够符合治愈过程期间组织表面的三维结构。在可控性 更强的其他制剂中，可实现限定的钙含量以及高度重吸收的结构。实施例15 心脏组织填充制剂延迟的自胶凝藻酸盐体系可用于组织填充术，组织填充术包括将延迟的自凝胶分 散体引入心前间隙以改善血流和效率。在一些个体中，例如含有心脏病的个体或者由于心 肌梗死相关性缺血导致心脏损失的患者，引入能够原位胶凝的延迟的自凝胶分散体能够改 善受损心脏的血流和效率。将导管置于个体体内，导管一端包括针或其他穿刺装置以从其 内部刺穿心脏。然后递送延迟的自凝胶藻酸盐，生理学钠的存在或引入额外的钠可加速延 迟的自胶凝作用，在心脏中形成凝胶。延迟的自胶凝技术延迟的自胶凝性质在导致导管阻 塞和需要使用进一步的导管插入术的胶凝作用发生之前，提供了适度控制将导管适当定位 和设置及递送分散体的时间。延迟的自胶凝性质通过赋予一定程度的控制和实现较少时间 的临界操作(critical action)的时间框架而具有显著优势。
2权利要求
一种在含有可溶性藻酸盐的水性溶液中包含不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的分散体，其中，所述分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下1分钟后最终凝胶储能模量小于10％，且其中a)不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒包含分离的G嵌段低聚物，该低聚物的G含量大于85％且平均单体数量为每个低聚物15 20个单体，或者b)不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒包含通过包括以下步骤的方法制备的不溶性藻酸盐i)使用藻酸盐、胶凝离子和除水之外的极性溶剂制备藻酸盐凝胶，ii)从凝胶洗出藻酸盐中存在的钠或其他离子，iii)干燥凝胶以去除溶剂，和iv)由干燥凝胶制备颗粒；或者，i)组合藻酸盐、胶凝离子和除水之外的溶剂以形成藻酸盐 胶凝离子复合物沉淀，ii)收集该沉淀，iii)洗出藻酸盐中存在的钠或其他离子，iv)干燥沉淀以去除溶剂，和v)由干燥沉淀制备颗粒。
2.如权利要求1所述的分散体，其特征在于，所述分散体在不添加非胶凝阳离子的情 况下5分钟后最终凝胶储能模量小于10%。
3.如权利要求1所述的分散体，其特征在于，所述分散体在不添加非胶凝阳离子的情 况下20分钟后最终凝胶储能模量小于10%。
4.如权利要求1所述的分散体，其特征在于，所述分散体在不添加非胶凝阳离子的情 况下40分钟后最终凝胶储能模量小于10%。
5.如权利要求1所述的分散体，其特征在于，所述分散体在不添加非胶凝阳离子的情 况下超过60分钟后最终凝胶储能模量小于10%。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后5小时内最终凝胶储能模量超过10%。
7.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后5小时内最终凝胶储能模量超过25%。
8.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后5小时内最终凝胶储能模量超过50%。
9.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后5小时内最终凝胶储能模量超过75%。
10.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后5小时内最终凝胶储能模量超过90%。
11.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后1小时内最终凝胶储能模量超过10%。
12.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后1小时内最终凝胶储能模量超过25%。
13.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳离子后1小时内最终凝胶储能模量超过50%。
14.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后1小时内最终凝胶储能模量超过75%。
15.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后1小时内最终凝胶储能模量超过90%。
16.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过10%。
17.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过25%。
18.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过50%。
19.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过75%。
20.如权利要求1-5中任一项所述的分散体，其特征在于，所述分散体在加入非胶凝阳 离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过90%。
21.如权利要求6-20中任一项所述的分散体，其特征在于，加入非胶凝阳离子足以将 非胶凝阳离子的最终浓度提高17mM或更多，或者足以实现最终浓度约0.9%。
22.如权利要求1-21中任一项所述的分散体，其特征在于，所述不溶性藻酸盐/胶凝离 子颗粒包含分离的G嵌段低聚物，该低聚物的G含量大于85%且平均单体数量为每个低聚 物15-20个单体。
23.如权利要求1-21中任一项所述分散体，其特征在于，所述不溶性藻酸盐/胶凝离子 颗粒包含通过包括以下步骤的方法制备的不溶性藻酸盐使用藻酸盐、胶凝离子和除水之 外的溶剂制备藻酸盐凝胶，从凝胶洗出藻酸盐中存在的钠或其他离子，干燥凝胶以去除溶 剂，由干燥凝胶制备颗粒；或者组合藻酸盐、胶凝离子和除水之外的溶剂以形成藻酸盐_胶 凝离子复合物沉淀，收集该沉淀，洗出藻酸盐中存在的钠或其他离子，干燥沉淀以去除溶 剂，由干燥沉淀制备颗粒。
24.如权利要求23所述的分散体，其特征在于，所述极性溶剂是醇。
25.如权利要求1-24中任一项所述的分散体，其特征在于，所述不溶性藻酸盐/胶凝离 子颗粒包含钙。
26.如权利要求1-25中任一项所述的分散体，其特征在于，所述不溶性藻酸盐/胶凝离 子颗粒小于175微米。
27.一种用于制备权利要求1-25中任一项所述分散体的试剂盒，其包含a)含有不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的容器；和b)含有可溶性藻酸盐的容器。
28.一种用于制备权利要求1-25中任一项所述分散体的组合物，其包含速溶藻酸盐和 不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。
29.一种用于分配延迟的自胶凝藻酸盐分散体的方法，该方法包括通过以下步骤形成权利要求1-25中任一项所述的分散体，该步骤是混合i)含有可溶 性藻酸盐的溶液和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒，或ii)速溶藻酸盐、不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒和溶剂。
30.一种用于制备藻酸盐凝胶的方法，该方法包括通过以下步骤形成权利要求1-25中任一项所述的分散体，这些步骤是a)混合i)含有 可溶性藻酸盐的溶液和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒，或ii)速溶藻酸盐、不溶性藻酸盐/ 胶凝离子颗粒和溶剂；b)将所述分散体与非胶凝阳离子组合或者使所述分散体接触非胶凝阳离子。
31.一种用于在个体中原位制备藻酸盐凝胶的方法，该方法包括通过以下步骤形成权利要求1-25中任一项所述的分散体，这些步骤是a)混合i)含有 可溶性藻酸盐的溶液和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒，或ii)速溶藻酸盐、不溶性藻酸盐/ 胶凝离子颗粒和溶剂；b)将所述分散体分配至个体体内部位，其中在该部位形成藻酸盐。
32.—种制备不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法，该方法包括以下步骤a)将藻酸盐或其盐溶解在非水极性溶剂中以制备藻酸盐溶液；b)将胶凝离子盐加入藻酸盐溶液中并将pH调节至中性；以及c)收集沉淀的不溶性藻酸盐；d)洗涤沉淀的不溶性藻酸盐；e)干燥经洗涤的不溶性藻酸盐；和f)形成所述干燥的不溶性藻酸盐的颗粒； 或者c)将所述藻酸盐溶液与添加的胶凝离子盐维持足以形成凝胶的时间；d)洗涤凝胶；e)干燥凝胶；和f)形成所述干燥的不溶性藻酸盐的颗粒。
33.一种制备不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的方法，该方法包括以下步骤 溶解G含量大于85%或更高的藻酸盐，将胶凝离子溶解在水中并将PH调节至中性；连续搅拌的同时将藻酸盐溶液与氯化钙溶液组合；收集沉淀的不溶性藻酸盐并用水洗涤直到导电性降至类似纯水的水平；干燥经洗涤的不溶性藻酸盐；和形成所述干燥的不溶性藻酸盐的颗粒。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述藻酸盐是平均分子量约为2-lOkDa的 低聚物。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述藻酸盐是平均单体数量为15-19个单 体的低聚物。
36.如权利要求32-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒通过研磨形成。
37.如权利要求32-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述胶凝离子是钙或锶。
38.如权利要求32-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述颗粒小于175微米。
39.如权利要求32-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述藻酸盐是超纯藻酸盐。
40.通过权利要求39所述方法制备的超纯不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。4
41.通过权利要求32-40中任一项所述方法制备的不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒。
42.一种用于制备藻酸盐凝胶的方法，该方法包括a)通过以下步骤形成在包含可溶性藻酸盐的水性溶液中包含不溶性藻酸盐/胶凝离 子颗粒的分散体，所述分散体在不添加非胶凝阳离子的情况下1分钟后最终凝胶储能模量 小于10%，这些步骤是混合i)包含可溶性藻酸盐的溶液和不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒或 )速溶藻酸盐、不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒和溶剂；b)在所述分散体中加入一定量的非胶凝阳离子，加入的量足以使所述分散体在加入非 胶凝阳离子后5小时内最终凝胶储能模量超过10%。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后1小时内最终凝胶储能模量超过10%。
44.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后30分钟内最终凝胶储能模量超过10%。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过10%。
46.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后1小时内最终凝胶储能模量超过50%。
47.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后30分钟内最终凝胶储能模量超过50%。
48.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过50%。
49.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后1小时内最终凝胶储能模量超过90%。
50.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后30分钟内最终凝胶储能模量超过90%。
51.如权利要求42所述的方法，其特征在于，加入所述分散体中的非胶凝阳离子的量 足以使所述分散体在加入非胶凝阳离子后10分钟内最终凝胶储能模量超过90%。
全文摘要
描述了在藻酸盐溶液中包含不溶性藻酸盐/胶凝离子颗粒的分散体，所述分散体在不加入非胶凝阳离子的情况下1分钟后最终凝胶的储存模量小于10％。描述了用于制备所述分散体的试剂盒和组合物，用于制备和使用所述分散体的方法，以及所述分散体中使用的组分。
文档编号A61K31/729GK101918007SQ200880110505
公开日2010年12月15日 申请日期2008年8月28日 优先权日2007年8月28日
发明者J·E·梅尔维克, J·E·比约斯塔德, T·斯文德森 申请人:Fmc有限公司