一种胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵及制备方法
【专利说明】一种胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵及制备方 法 1技术领域
[0001] 本发明涉及局部外伤止血敷料技术领域，具体涉及一种止血用生物材料-胶原蛋 白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵及制备方法。 2【背景技术】
[0002] 随着社会的发展，临床与战伤救治对局部外伤止血的要求越来越高。生物医用材 料被认为局部外伤止血最有效的材料之一，具有可吸收、高效、经济和无毒害等优点，生物 医用材料是一种新型的止血材料，它主要是通过自身材料特征与优势，吸附血液，凝聚血小 板，堵塞血管，促进凝血酶产生，从而达到止血作用。
[0003] 目前应用生物医用材料作为局部外伤止血的优势得到了广泛认可，其应用前景看 好，正受到世界各国的普遍重视，相关研究也十分活跃。生物医用材料的止血过程一般包括 两个方面：①材料自身的吸液性能够迅速有效的吸收渗血，溶胀并贴合在伤口上，堵塞血管 并产生一定压力，对伤口起到压迫止血作用；②材料自身能够吸附血小板，使其黏附聚集于 伤口，堵塞血管；③促进凝血酶的产生达到止血的最终目的。
[0004] 目前较为成熟的生物止血材料主要有海藻酸盐海绵、壳聚糖海绵及胶原蛋白海 绵。这些材料由于成分单一，止血机制、止血效果和生物相容性等各有特点。壳聚糖是来源 广泛的甲壳素脱乙酰化的天然高分子，生物相容性好，通过作用于红细胞，使其发生聚集从 而使血液凝固，其止血作用有限。胶原蛋白海绵利用大面积结构破坏血小板促进凝血，胶原 蛋白海绵在创面的溶解和降解，使创面局部黏度变化发生变化，从而促进凝血过程，但一般 动物源性胶原蛋白的生物相容性较差。海藻酸钙海绵是一种具有高吸湿性能的功能性伤口 敷料，与伤口渗出液接触后，通过离子交换海藻酸钙转换为海藻酸钠，大量的水分进入海绵 结构而吸湿膨胀，形成水凝胶，海藻酸盐敷料的止血作用不但由于其凝血效应，也因为其对 血小板活性具有显著的刺激作用，但其生物相容性不如壳聚糖海绵。
[0005] 本发明采用胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚糖，在乙酸盐水溶液中按一定比例混合形 成三者的复合溶液，通过冷冻干燥方法制备复合止血海绵，发挥胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚 糖各自优势，达到强效止血效果。该止血海绵与创面接触后，能够使血小板迅速黏附并聚集 于创面，堵塞血管；同时，复合止血海绵吸收大量渗液，溶胀后对伤口产生一定压力，起到一 定程度的压迫止血作用；此外，复合止血海绵中的Ca +可与血液中的Na+互换，促进凝血酶的 生成，参与内源性与外源性凝血，可以显著提高止血效果。 3
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种局部创伤止血的复合生物海绵及制备方法。该复合海绵与创 面接触后，能够使血小板迅速聚集，形成血痂，而良好的吸液性使得复合海绵能吸收大量渗 出液对伤口产生一定的压力，进而起到一定按压止血的作用，并且复合海绵中的Ca +在与创 面接触后能迅速与血液里的Na+发生交换，从而促进凝血酶的产生，加快创面自身凝血，进 一步提高止血效果。采用对人体无危害的胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚糖，具备良好的安全 性，不会对伤口造成污染与毒害。
[0007] 本发明提供一种胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵及制备方法。该复合 海绵的胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚糖的含量如下：
[0008] 胶原蛋白含量：20mg/ml
[0009] 海藻酸钙含量：0· 4mg/ml
[0010] 壳聚糖含量：〇· lmg/ml
[0011] 所述的胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵，其特征是所述的胶原蛋白是 陆生胶原或海生胶原，与人体有较好的生物相容性。
[0012] 所述的胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵，其特征是所述的海藻酸钙是 从海藻中提取而来，具备原料广泛的特点。
[0013] 所述的胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵，其特征是所述的壳聚糖是指 脱乙酰度在80. 0~95. 0的壳聚糖。
[0014] 本发明制备上述胶原蛋白/海藻酸钙/壳聚糖复合止血海绵的方法步骤如下：
[0015] 通过体外单因素凝血实验确定胶原蛋白、海藻酸钙以及壳聚糖各自的较优凝血浓 度，再设计L9(3 3)正交实验（如表1与表2所示）。根据正交实验设计配制不同浓度的复 合溶液，经冷冻干燥成海绵。利用BCI (Blood Clotting Index)法测定正交实验中各复合 海绵的体外凝血指数，通过直观分析法（表3)与方差分析法（表4)，进而筛选出最佳的组 方，即胶原蛋白：海藻酸f丐：壳聚糖=20(mg/ml) : 0. 4(mg/ml) : 0. l(mg/ml)。
[0016] 按照上述最佳组方，将胶原蛋白在室温下加入乙酸生理盐水中，室温搅拌溶解，配 制成终浓度为20mg/ml的溶液，再加入海藻酸|丐，使其浓度为0. 4mg/ml，最后加入壳聚糖， 使其浓度为〇. lmg/ml，室温下涡旋15min混合均匀，然后静置30min左右后倒入塑料平皿， 常规冷冻干燥后，密封保存即得产品。
[0017] 本发明与已有技术相比，具有如下显著特征：
[0018] (1)复合止血海绵的组分采用的是对人体无毒害，具有良好相容性与安全性的生 物材料。
[0019] (2)复合止血海绵的主要成分均为具有良好止血性能且止血机理各不相同的生物 材料，能够协同作用促进止血。
[0020] (3)复合止血海绵既能使血小板黏附，形成血痂，又能促进凝血酶的产生，促进伤 口自身凝血；复合海绵还具备高吸液性，能迅速有效地吸收血液，对伤口产生一定压力，起 到按压止血作用，同时保持伤口的湿润环境。
[0021] (4)复合止血海绵制备方法简单，原料广泛。
[0022] (5) -系列动物实验表明复合止血海绵具有显著优于常规止血敷料的止血性能。 4【附图说明】
[0023] 图1复合止血海绵的直观图
[0024] 图2复合止血海绵的电镜图（A :复合止血海绵横截面，B :复合止血海绵纵截面）
[0025] 图3复合止血海绵与各组分红外光谱
[0026] 图4复合止血海绵体外凝血指数（Blood Clotting Index)
[0027] 图5复合止血海绵体表全皮层止血效果（A :复合止血海绵止血时间测定，B :复合 止血海绵出血量测定）
[0028] 图6复合止血海绵耳动脉止血效果（A :复合止血海绵止血时间测定，B :复合止血 海绵出血量测定）
[0029] 图7复合止血海绵细胞毒性评价 5【具体实施方式】
[0030] 以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件。
[0031] 实施例1 :胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚糖溶液体外单因素凝血实验
[0032] 配制 5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml 的胶原蛋白溶液（0· lmol/L 乙 酸生理盐水溶液为溶剂）。各0. 5ml加入试管，37°C水浴lh，Lee-White全血凝血法测定其 凝血时间，选取凝血时间最短的为最优胶原蛋白止血浓度，每样平行三次。测定结果胶原蛋 白的最优凝血浓度为15mg/ml。
[0033] 配制 0· Omg/ml，0· 4mg/ml，2. Omg/ml，10mg/ml 海藻酸钙溶液（0· lmol/L 乙酸生理 盐水溶液为溶剂）。各〇. 5ml加入试管，37°C水浴lh，Lee-White全血凝血法测定其凝血时 间，选取凝血时间最短的为最优海藻酸钙止血浓度，每样平行三次。测定结果海藻酸钙的最 优凝血浓度为0. 4mg/ml。
[0034] 配制 0mg/ml，0· lmg/ml，0· 2mg/ml，0· 3mg/ml，0· 4mg/ml，0· 5mg/ml 壳聚糖溶液 (0· lmol/L乙酸生理盐水溶液为溶剂）。各0· 5ml加入试管，37°C水浴lh，Lee-White全血 凝血法测定其凝血时间，选取凝血时间最短的为最优壳聚糖止血浓度，每样平行三次。测定 结果壳聚糖的最优凝血浓度为〇. 2mg/ml。
[0035] 实施例2 L9 (33)正交实验筛选最佳组方
[0036] 根据实施例1获得的胶原蛋白、海藻酸钙与壳聚糖的最优浓度，设计L9(33)正交 实验（表1、表2)，配制不同浓度三者复合溶液，经冷冻干燥制