专利名称：双层胶原－壳聚糖海绵支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种组织工程支架，尤其是涉及一种用于皮肤组织工程支架材料的双层胶原-壳聚糖海绵支架及其制备方法。
背景技术：
组织工程支架用来模拟细胞外基质的多孔结构，以赋予支架某些细胞外基质的基本功能， 同时支架材料被逐渐降解吸收，从而诱导种子细胞、受损组织或器官部位细胞定向迁移，达 到修复组织或器官的目的。组织工程支架是形成组织工程化组织和器官的关键因素。理想的 组织工程支架应具备(1)良好的生物相容性和生物降解性，无明显的炎症反应、免疫反应 和细胞毒性，在体外以及植入体内后的降解和吸收速度应该与细胞和(或)组织生长的速度相 匹配；(2)具有足够的力学强度，材料不会在患者活动中塌陷、撕裂、破溃；(3)高孔隙率、 高表面积，便于细胞的粘附和导入及营养和代谢产物的交换；(4)表面(包括内表面)亲和性 良好，材料表面的化学结构、亲/疏水性、拓扑结构(粗糙度、孔洞的大小及其分布、沟槽的深 度宽度、纤维的粗细)、电荷状况(电荷的性质、密度)、表面负载的活性因子等有利于细胞 的粘附、铺展、繁殖等；(5)可塑性强，易于加工成各种形状和结构；(6)易于消毒。
从材料的选取方面来讲，当前认为天然高分子物质是一种优良的组织工程生物材料，这 一类物质包括有胶原、壳聚糖、海藻酸(盐)、海底珊瑚和多种高分子的粘多糖。但每种材料 的性能都存在不足之处。其中，胶原是细胞外基质的主要成分，有利于细胞的粘附、增殖和 分化。壳聚糖的结构与人体内的糖胺聚糖极其相似，能促进生长因子及胶原的合成还能减缓 胶原的降解速度([l] Ma Lie ,Gao Changyou ，Mao Zhengwei ,et al . Collagen/ chitosan porous scaffolds with improved biostability for skin tissue engineering [ J ] . Biomaterials， 2003 ， 24 : 4833 -4841)。虽然各国在皮肤组织工程支架方面已有深入探索，但是由于存在生物相容性、细胞 亲和性、免疫原性及力学性能等问题，还没有一种令人十分满意的皮肤支架材料在临床上广 泛推广。目前，组织工程皮肤所使用的支架已报道有不同的制备方法，但大多都是结构均一 的表皮或真皮单层支架。研究表明，模拟皮肤的真、表皮结构制备成的双层皮肤支架比单层 的皮肤支架有更优越的性能致密的表层可以防治细菌的入侵及体液的快速蒸发，多孔的内 层有利于组织的长入([2] Hinrichs WL, Lommen EJ， Wildevuur CR, et al. Fabrication andcharacterization of an asymmetric polyurethane membrane for use as a wound dressing[J]. J Appl Biomater. 1992 ,3(4):287-303)。而已报道的双层皮肤支架大多以聚氨酯或壳聚糖为原料制备， 尚未见有胶原-壳聚糖双层海绵支架的报道([3] Matsuda K, Suzuki S， Isshiki N, et al. Re-freeze dried bilayer artificial skin. Biomaterials[J]. 1993， 14:1030-1035; [4] Fwu-Long Mi, Yu-Bey Wu, Shin-Shing Shyu, et al. Asymmetric chitosan membranes prepared by dry/ wet phase separation : a new type of wound dressing for controlled antibacterial release [J]. Journal of Membrane Science ，2003 ，212 : 237 — 254; [5] Jianbiao Ma, Hongjun Wang, Binglin He, et al. A preliminary in vitro study on the fabrication and tissue engineering applications of a novel chitosan bilayer material as a scaffold of human neofetal dermal fibroblasts [J]. 5z'owafen'a&， 22, 337-336入
鉴于胶原-壳聚糖材料优越的生物学性能，利用其制备出类似于天然皮肤结构的组织工程支架 对于组织工程皮肤的发展和完善具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于组织工程皮肤的双层胶原-壳聚糖海绵支架。 本发明的另一目的在于提供一种上述双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法。 本发明所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架为双层网状结构，下层为胶原与壳聚糖复合膜， 下层胶原与壳聚糖复合膜的孔径为80 12(^m，厚度为2 3mm，下层胶原与壳聚糖复合膜 的孔径呈互相贯穿的层状孔状结构；上层为胶原与壳聚糖复合膜，上层胶原与壳聚糖复合膜 的孔径为30 80pm,厚度为0.5 1.5mm，上层胶原与壳聚糖复合膜的孔径呈互相贯穿的层 状孔状结构。
所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架呈微黄色，柔软有弹性，可随意弯折不断裂，与正常皮 肤的厚度相符，内层表面粗糙，可见大小均一的小孔，外层表面光滑，未见小空洞，支架大 小和形状可根据需要制备。
本发明所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法包括以下步骤
1) 将胶原溶胀液溶解于乙酸中，溶解后，按质量百分比，分别配制浓度为0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的胶原分散液；
2) 将壳聚糖溶解于乙酸中，溶解后，按质量百分比，分别配制浓度为0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的壳聚糖分散液；
3) 按质量比，分别将相同浓度的胶原分散液和壳聚糖分散液以(1 :9) (9: 1)的比 例混合，得按质量百分比，浓度为0.2%~0.5%和0.5%~0.8%的两种胶原-壳聚糖溶液；
4) 按质量百分比，称取浓度为0.5%~0.8%的胶原-壳聚糖溶液置于一60 一80匸冷冻过夜后，冷冻干燥，得到海绵状的白色支架；5) 将冻干的海绵支架用聚四氟乙烯板压膜后，用戊二醛进行交联，清洗后，冷冻过夜， 冷冻干燥，得到颜色接近正常皮肤颜色的单层支架；6) 再向单层支架上倒入按质量百分比浓度为0.2%~0.5%的胶原-壳聚糖溶液，冷冻过夜， 再冷冻干燥，得到含有两层结构的双层支架；7) 将冻干的双层支架再次用戊二醛进行交联，清洗后，冷冻过夜，冷冻干燥，即得所需 的双层胶原-壳聚糖海绵支架。在步骤l)中，乙酸的浓度最好为0.05~1M。 在步骤2)中，乙酸的浓度最好为0.05~1M。 在步骤4)中，所述冷冻干燥的时间最好为24 48h。在步骤5)中，将冻干的海绵支架用聚四氟乙烯板压膜的时间最好为12 24h，所述的清 洗最好依次用蒸馏水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱和NaCI溶液及去离子水浸洗，冷冻过夜 的温度最好为一2(TC，冷冻干燥的时间最好为12 24h。在步骤6)中，冷冻过液的温度最好为一2(TC，冷冻干燥的时间最好为24 48h。在步骤7)中，所述清洗最好依次用蒸熘水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱和NaCI溶液及 去离子水浸洗，冷冻过夜的温度最好为一20°C，冷冻千燥的时间最好为12~24h。本发明采用的制备方法所涉及的技术原理是胶原、壳聚糖不仅各自有许多优良的生物 特性，而且在复合使用时功能上还显示互补性。较高固含量的胶原-壳聚糖溶液制备的海绵孔 径较小，可以减少细胞植入过程中的漏液，增加细胞在支架中的停驻数量。另外，较高固含 量的溶液制备的海绵孔径较小，交联处理的过程中较小的孔之间易发生融合，从而使材料收 缩。24h的压膜则可以显著降低较高固含量的胶原-壳聚糖溶液制备的海绵交联后沿直径方向 的收縮，以较高固含量的胶原-壳聚糖溶液制备的海绵经压膜、交联后作为表皮层，可以避免 内层海绵的巻曲变形并保证复合双层支架有足够的强度，而表层孔径小于0.22nm，可有效防 止外界细菌的入侵。较低固含量的胶原-壳聚糖溶液制备的海绵孔径较大，作为真皮层可在长 时间内提供细胞增殖的空间，促进细胞的增殖。
图1为双层胶原-壳聚糖海绵支架真皮层横截面的SEM照片。图2为双层胶原-壳聚糖海绵支架表皮层横截面的SEM照片。图3为双层胶原-壳聚糖海绵支架表皮层经压膜后表层的SEM照片。图4为0.2%胶原-壳聚糖溶液制备的海绵支架及0.8%胶原-壳聚糖溶液制备的海绵支架SEM照片比较图。图5为双层胶原-壳聚糖海绵支架内层细胞生长情况的SEM照片。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。 实施例1分别将胶原溶胀液及壳聚糖溶于0.05M乙酸水溶液中，得到0.2。/。(wt)的胶原分散液与 壳聚糖分散液及0.8% (wt)的胶原分散液与壳聚糖分散液。将相同浓度的胶原分散液与壳聚 糖分散液按9 : 1的质量比混合得固含量为0.8%及0.2%的胶原-壳聚糖溶液。将15g固含量为 0.8M的胶原-壳聚糖溶液液倒入直径9cm的玻璃培养皿中，保持液面水平置于一6(rC冰箱冷冻 过夜后，迅速将其移入冷冻干燥机冷冻干燥40h。将冻干的海绵置于两块光滑的聚四氟乙烯 板之间，以15kg重物压膜24h。将压膜后的海绵浸入0.2%戊二醛交联液中，4'C反应24h后， 分别用蒸馏水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱和NaCI溶液及去离子水浸洗，一2(TC冷冻过夜 后再进行15h冷冻干燥。在冻干的海绵上倒入60g固含量为0.2%胶原-壳聚糖溶液，保持液 面水平置于一2(TC冷冻过夜。再将其移入冷冻干燥机冷冻干燥4011.冻干的双层海绵支架再次 按上述步骤进行交联、清洗、冻干，即得到厚度为3.8mm的海绵支架。扫描电镜显示真皮层 呈网状结构，平均孔径为80 10(Him (如图l);表皮层呈互相贯穿的层状孔状结构，平均孔 径为30 50prn，(如图2)表层孔直径小于0.22pm (如图3)。实施例2分别将胶原溶胀液及壳聚糖溶于0.5M乙酸水溶液中，得到0.2% (wt)的胶原分散液与 壳聚糖分散液及0.8% (wt)的胶原分散液与壳聚糖分散液。将相同浓度的胶原分散液与壳聚 糖分散液按8 : 2的质量比混合。将10g固含量为0.8%的胶原-壳聚糖溶液倒入直径6cm的玻 璃培养皿中，保持液面水平置于一6(TC冰箱冷冻过夜后，迅速将其移入冷冻干燥机冷冻干燥 24h。将冻干的海绵置于两块光滑的聚四氟乙烯板之间，以15kg重物压膜24h。将压膜后的 海绵浸入0.25%戊二醛交联液中，4t:反应12h,再分别用蒸馏水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱 和NaCI溶液及去离子水浸洗浸洗，一20'C冷冻过夜后再进行24h冷冻干燥。在冻干的海绵 上倒入40g固含量为0.2。/。胶原-壳聚糖溶液，保持液面水平置于一20'C冷冻，再冻干24h。冻 干的双层海绵支架按上述步骤进行交联、清洗、冻干，即得到厚度为3mm的海绵支架。扫描 电镜显示真皮层呈网状结构，平均孔径为80 100pm;表皮层呈互相贯穿的层状孔状结构，平 均孔径为30 50nm，表层孔直径小于0.22pm。实施例3分别将胶原溶胀液及壳聚糖溶于1M乙酸水溶液中，得到0.3% (wt)的胶原分散液与壳 聚糖分散液及0.7% (wt)的胶原分散液与壳聚糖分散液。将相同浓度的胶原分散液与壳聚糖 分散液按7 : 3的质量比混合得固含量为0.7%及0.3%的胶原-壳聚糖复合液。将100g固含量 为0.7%的胶原-壳聚糖复合液倒入大小为28cmX18cm陶瓷托盘中，保持液面水平置于一6(TC 冰箱冷冻过夜后，迅速将其移入冷冻干燥机冷冻干燥42h。将冻干的海绵置于两块光滑的聚 四氟乙烯板之间，以15kg重物压膜24h。将压膜后的海绵浸入0.5%戊二醛交联液中，4。C反 应12h后，分别用蒸馏水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱和NaCI溶液及去离子水浸洗，一20 'C冷冻过夜后再进行24h冷冻干燥。在冻干的海绵上倒入400g固含量为0.3%胶原-壳聚糖复 合液，保持液面水平置于一2(TC冷冻过夜。再将其移入冷冻干燥机冷冻干燥42h。冻干的双 层海绵支架再次按上述步骤进行交联、清洗、冻干，即得到厚度为4mm的海绵支架。扫描电 镜显示真皮层呈网状结构，平均孔径为100 120pm;表皮层呈互相贯穿的层状孔状结构，平 均孔径为50 80pm，表层孔直径小于0.22pm。以下给出实验结果。所得的胶原-壳聚糖双层海绵支架呈微黄色，柔软有弹性，可随意弯折不断裂，厚度在正 常人体皮肤的厚度范围(0.5 4mrn)。傅立叶红外光谱表明胶原、壳聚糖分子之间存在化学作 用；将所得的胶原-壳聚糖双层海绵支架在万能材料试验机上监测其抗拉强度平均为58.7± 1.3KPa表明，改支架具有一定的力学强度，可以用于手术操作和移植需要。将所得的胶原-壳聚糖双层海绵支架进行细胞种植实验及动物移植实验，监测其生物相容 性及皮肤修复活性。细胞实验表明该材料无细胞毒性(如图5)，其中成纤维细胞在材料中的生 长规律表明较高固含量的胶原-壳聚糖溶液制备的海绵可以减少细胞植入过程中的漏夜，增加 细胞在支架中的停驻数量；较低固含量的胶原-壳聚糖溶液制备的海绵可在长时间内提供细胞 增殖的空间，促进细胞的增殖；用该胶原-壳聚糖双层海绵支架构建完整的人工皮肤，通过建 立SD大鼠皮肤缺损模型进行人工皮肤替代物移植实验表明该人工皮肤替代物组织附着性、 吸湿性好，能促进伤口愈合，并具有引导组织形成，促进组织细胞生长的效果。这些实验结 果均表明该胶原-壳聚糖双层海绵支架不仅具有良好的结构稳定性，而且具有良好的生物相容 性和皮肤修复活性，具有较大的实际应用价值。
权利要求
1.双层胶原-壳聚糖海绵支架，其特征在于为双层网状结构，下层为胶原与壳聚糖复合膜，下层胶原与壳聚糖复合膜的孔径为80～120μm，厚度为2～3mm，下层胶原与壳聚糖复合膜的孔径呈互相贯穿的层状孔状结构；上层为胶原与壳聚糖复合膜，上层胶原与壳聚糖复合膜的孔径为30～80μm，厚度为0.5～1.5mm，上层胶原与壳聚糖复合膜的孔径呈互相贯穿的层状孔状结构。
2. 如权利要求1所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤1) 将胶原溶胀液溶解于乙酸中，溶解后，按质量百分比，分别配制浓度为0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的胶原分散液；2) 将壳聚糖溶解于乙酸中，溶解后，按质量百分比，分别配制浓度为0.2%~0.5%和 0.5%~0.8%的壳聚糖分散液；3) 按质量比，分别将相同浓度的胶原分散液和壳聚糖分散液以(1 :9) (9: 1)的比 例混合，得按质量百分比，浓度为0.2%~0.5%和0.5%~0.8%的两种胶原-壳聚糖溶液；4) 按质量百分比，称取浓度为0.5%~0.8%的胶原-壳聚糖溶液置于一60 _80'C冷冻过 夜后，冷冻干燥，得到海绵状的白色支架；5) 将冻干的海绵支架用聚四氟乙烯板压膜后，用戊二醛进行交联，清洗后，冷冻过夜， 冷冻干燥，得到颜色接近正常皮肤颜色的单层支架；6) 再向单层支架上倒入按质量百分比浓度为0.2%~0.5%的胶原-壳聚糖溶液，冷冻过夜， 再冷冻干燥，得到含有两层结构的双层支架；7) 将冻干的双层支架再次用戊二醛进行交联，清洗后，冷冻过夜，冷冻干燥，即得所需 的双层胶原-壳聚糖海绵支架。
3. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤1 )中， 乙酸的浓度为0.05~1M。
4. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤2)中， 乙酸的浓度为0.05~1M。
5. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤4)中， 所述冷冻干燥的时间为24 48h。
6. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤5)中，将冻干的海绵支架用聚四氟乙烯板压膜的时间为12 24h。
7. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤5)中， 所述的清洗依次用蒸馏水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱和NaCI溶液及去离子水浸洗；冷冻 过夜的温度为一20'C，冷冻干燥的时间为12 24h。
8. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤6)中， 冷冻过液的温度为一2(TC，冷冻干燥的时间为24 48h。
9. 如权利要求2所述的双层胶原-壳聚糖海绵支架的制备方法，其特征在于在步骤7)中， 所述清洗依次用蒸馏水、NaBH4的磷酸盐缓冲液、饱和NaCI溶液及去离子水浸洗，冷冻过 夜的温度为一20'C，冷冻干燥的时间为12~24h。
全文摘要
双层胶原-壳聚糖海绵支架及其制备方法，涉及一种组织工程支架。提供一种用于组织工程皮肤的双层胶原-壳聚糖海绵支架及其制备方法。为双层网状结构，上、下层为胶原与壳聚糖复合膜，孔径呈互相贯穿的层状孔状结构。胶原溶胀液溶于乙酸，配浓度为0.2％～0.5％和0.5％～0.8％的胶原分散液；壳聚糖溶于乙酸，配浓度为0.2％～0.5％和0.5％～0.8％的壳聚糖分散液；两种分散液混合，得两种胶原-壳聚糖溶液；浓度为0.5％～0.8％的胶原-壳聚糖溶液冷冻过夜，干燥得海绵状的白色支架，压膜后交联，清洗，冷冻过夜，干燥得单层支架；倒入胶原-壳聚糖溶液，冷冻过夜，干燥得双层支架，交联，清洗，冷冻过夜，冷冻干燥。
文档编号A61L27/40GK101254313SQ20081007086
公开日2008年9月3日 申请日期2008年4月3日 优先权日2008年4月3日
发明者孙莉萍, 张其清, 静 李, 王秀燕 申请人:厦门大学