专利名称：胶原蛋白基复合海绵及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医用级的材料及其制备方法，特别是涉及一种胶原蛋白基复合海绵及其制备方法。
以胶原蛋白为基础的医用产品的研究与开发，已经获得了很多成果，主要是将胶原蛋白做成不同剂型，如溶液、凝胶、粉末、海绵、纤维、薄膜等，或进行各种各样的改性，使其具有不同的医用或医疗功能。但市场上现有的胶原蛋白海绵柔韧度较差，使其在软组织创面(如脑外科创面的止血填充修复)的应用上受到很大限制。另外，价格因素也是制约胶原蛋白类产品规模进入市场的条件之一。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种胶原蛋白基复合海绵，它由以下重量份数比的物质组成胶原蛋白 50-90壳聚糖8-48甘油 0.5-5所述胶原蛋白可以是市售胶原蛋白初级产品(主要是I型胶原蛋白)，也可以是采用以下方法制备的1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂，其中稀碱溶液优选氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9，醇类物质水溶液优选乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中，其中优选甲酸、乙酸、丙酸或盐酸；4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量份数比为100-1000∶1，30-35℃下搅拌培养10-15小时；5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/L，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到目的产物。
为了使胶原蛋白基复合海绵的质量更优，所述壳聚糖选用脱己酰度为70-90％，粘均分子量为(1.0-4.0)×105的产品。
本发明的第二个目的是提供一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法。
一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，包括以下步骤1)将胶原蛋白溶于0.01-0.1％乙酸溶液中，制成1-3％胶原蛋白溶液；2)将壳聚糖溶于0.01-0.1％乙酸溶液中，制成1-3％壳聚糖溶液；3)将上述得到的胶原蛋白溶液、壳聚糖溶液以及甘油按重量份数比50-90∶8-48∶0.5-5的比例混合均匀，在-10℃--80℃下冷冻1-5天，冻干得到海绵状材料；4)将上述海绵状材料置于气体发生器中，40-50℃下用醛类物质交联剂固定20-100分钟；5)用甘油水溶液清洗后，真空干燥得到胶原蛋白基复合海绵。
为了使得到的胶原蛋白基复合海绵性质更为优良，所用的胶原蛋白可以采用以下方法进行精制1)将市售胶原蛋白初级产品溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中，其中优选甲酸、乙酸、丙酸或盐酸；2)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量份数比为100-1000∶1，30-35℃下搅拌培养10-15小时；3)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/L，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；4)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；5)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到目的产物。
所用的胶原蛋白还可以采用以下方法自原始动物组织中获得1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂，其中稀碱溶液优选氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9，醇类物质水溶液优选乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中，其中优选甲酸、乙酸、丙酸或盐酸；4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为100-1000∶1，30-35℃下搅拌培养10-15小时；5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/L，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到目的产物。
在上述胶原蛋白的精制过程中，所用的复合蛋白酶由活性比为胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成。
在生产过程中，所述壳聚糖选用脱己酰度为70-90％，粘均分子量为(1.0-4.0)×105的产品为好；所述醛类物质交联剂可以是甲醛、甲基乙二醛或戊二醛；所述用甘油水溶液清洗步骤中，甘油水溶液的配方为甘油∶水＝0.1-10∶90-99.9。
得到的胶原蛋白基复合海绵经包装、60Co照射灭菌后为成品。
本发明巧妙地将胶原蛋白、壳聚糖与甘油联合运用，使产品的性能明显增强。壳聚糖的混入，不仅增加胶原蛋白基复合海绵的分子极性，而且使止血产生协同作用，使本发明的海绵应用于止血急救场合成为可能。戊二醛的交联，使本发明的复合海绵具有较强的生物和化学稳定性。甘油的处理，提高复合海绵的柔韧度，大大减轻操作时硬度刺激对创面和病人造成的损伤和痛苦，产品完全可以适用于软组织创面的止血、填充与修复。实验证明，本产品的效果明显优于目前临床上常使用的创面止血与修复材料，如明胶海绵，羧甲基纤维素等，且生产工艺简单、价格低廉。
稀碱和醇类物质水溶液的脱脂处理，使最终产品的脂肪含量降至最低。鉴于胶原蛋白产品抗原性主要来自胶原蛋白的N和C终端肽链，本发明创造性地用复合酶处理胶原蛋白，进一步切掉终端肽链，使产品的抗原性降至最低。
在气体发生器中对材料进行交联固定，可以避免交联剂溶液中的杂质(如戊二醛溶液中的环半化合物)引入材料中，从而使本发明的生物学性能优异。
通过戊二醛和来源丰富的壳聚糖的化学改性，不仅降低成本，而且优化其性能，并可模拟细胞外基质用于组织或细胞培养。
本发明的胶原蛋白基复合海绵止血时间短，粘附创面组织的能力强，且具有促进成纤维细胞活性，诱发各种生长因子等特点，可用作止血急救、创面修复与填充材料。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
用上述方法制得的胶原蛋白基复合海绵中，胶原蛋白与壳聚糖、甘油的比例约70∶28∶0.8。
实施例2、用市售胶原蛋白初级产品生产本发明的胶原蛋白基复合海绵，具体步骤如下1、将市售胶原蛋白溶解在pH5.8的稀盐酸溶液中；2、向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为500∶1，复合蛋白酶由活性比为胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成，34℃下搅拌培养11小时；3、离心，并收集上清液，在上清液中加入NaCl，使浓度达到2mol/L，8℃下搅拌12小时，收集得到的沉淀物；4、将沉淀物溶于0.2％乙酸溶液中，离心收集上清；5、上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作4次，收集沉淀物；6、将沉淀物溶于0.08％乙酸溶液中，制成1.8％胶原蛋白溶液；7、将市售脱己酰度75％，粘均分子量2.0×105的壳聚糖溶于0.08％乙酸溶液中，制成1.8％壳聚糖溶液；8、将上述得到的胶原蛋白溶液、壳聚糖溶液以及甘油按重量份数比80∶1 8∶4的比例混合均匀，在-30℃下冷冻4天，冻干得到海绵状材料；9、将上述海绵状材料置于气体发生器中，48℃下用戊二醛交联剂固定30分钟；10、用甘油水溶液清洗，甘油水溶液的配方为甘油∶水＝7∶93；11、真空干燥得到胶原蛋白基复合海绵；12、胶原蛋白基复合海绵经包装、60Co照射灭菌后入库。
用上述方法制得的胶原蛋白基复合海绵中，胶原蛋白与壳聚糖的比例约80∶18∶3。
权利要求
1.一种胶原蛋白基复合海绵，它由以下重量份数比的物质组成胶原蛋白50-90壳聚糖 8-48甘油0.5-5
2.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白基复合海绵，其特征在于所述胶原蛋白为市售胶原蛋白初级产品。
3.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白基复合海绵，其特征在于所述胶原蛋白是采用以下方法制备的1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂，其中稀碱溶液优选氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9，醇类物质水溶液优选乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中，其中优选甲酸、乙酸、丙酸或盐酸；4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量份数比为100-1000∶1，30-35℃下搅拌培养10-15小时；5)在离心收集的上清中加NaCl，使浓度达到2mol/L，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到目的产物。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种胶原蛋白基复合海绵，其特征在于所述壳聚糖的脱己酰度为70-90％，粘均分子量为(1.0-4.0)×105。
5.一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，包括以下步骤1)将胶原蛋白溶于0.01-0.1％乙酸溶液中，制成1-3％胶原蛋白溶液；2)将壳聚糖溶于0.01-0.1％乙酸溶液中，制成1-3％壳聚糖溶液；3)将上述得到的胶原蛋白溶液、壳聚糖溶液以及甘油按重量份数比50-90∶8-48∶0.5-5的比例混合均匀，在-10℃-80℃下冷冻1-5天，冻干得到海绵状材料；4)将上述海绵状材料置于气体发生器中，40-50℃下用醛类物质交联剂固定20-100分钟；5)用甘油水溶液清洗后，真空干燥得到胶原蛋白基复合海绵。
6.根据权利要求5所述的一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，其特征在于所用的胶原蛋白是采用以下方法制备的1)将市售胶原蛋白初级产品溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中，其中优选甲酸、乙酸、丙酸或盐酸；2)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量份数比为100-1000∶1，30-35℃下搅拌培养10-15小时；3)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/L，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；4)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；5)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到目的产物。
7.根据权利要求5所述的一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，其特征在于所用的胶原蛋白是采用以下方法制备的1)将富含胶原蛋白的动物组织机械去除表皮层、肌肉和脂肪等杂质，粉碎后清洗干净；2)用pH8.5-10.5的稀碱溶液和醇类物质水溶液洗涤脱脂，其中稀碱溶液优选氢氧化钠∶碳酸氢钠∶水＝0.1-1∶5-10∶89-94.9，醇类物质水溶液优选乙醇∶异丙醇∶水＝5-10∶2-5∶85-93；3)溶解在pH5.5-6.5的稀酸溶液中，其中优选甲酸、乙酸、丙酸或盐酸；4)向上述溶液中加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶的重量比为100-1000∶1，30-35℃下搅拌培养10-15小时；5)在离心收集的上清中加入NaCl，使浓度达到2mol/L，0-10℃下搅拌10-20小时，收集得到的沉淀物；6)将沉淀物溶于0.1-0.5％乙酸溶液中，离心收集上清；7)上清中再加入NaCl，使浓度达到1mol/L，搅拌得到沉淀物；重复操作3-4次，得到目的产物。
8.根据权利要求5或6或7所述的一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，其特征在于所述复合蛋白酶由活性比为胃酶∶胰酶∶木瓜酶＝1∶1∶0.5的三种蛋白酶组成。
9.根据权利要求5或6或7所述的一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，其特征在于所述壳聚糖的脱己酰度为70-90％，粘均分子量为(1.0-4.0)×105。
10.根据权利要求5或6或7所述的一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，其特征在于所述醛类物质交联剂为甲醛、甲基乙二醛或戊二醛；所述用甘油水溶液清洗步骤中，甘油水溶液的配方为甘油∶水＝0.1-10∶90-99.9。
11.根据权利要求5或6或7所述的一种胶原蛋白基复合海绵的制备方法，其特征在于得到的胶原蛋白基复合海绵经包装、60Co照射灭菌后为成品。
全文摘要
本发明为胶原蛋白基复合海绵及其制备方法，涉及医用材料及其制备方法领域。本发明的目的是提供创面止血与修复效果优良，价格较低的胶原蛋白基复合海绵及其制备方法。本发明的胶原蛋白基复合海绵，它由以下重量分数比的物质组成胶原蛋白50－90；壳聚糖8－48；甘油0.5－5。胶原蛋白基复合海绵的制备方法，包括以下步骤1)将胶原蛋白溶于0.01－0.1％乙酸溶液中，制成1－3％胶原蛋白溶液；2)将壳聚糖溶于0.01－0.1％乙酸溶液中，制成1－3％壳聚糖溶液；3)将上述得到的胶原蛋白溶液、壳聚糖溶液以及甘油按重量份数比50－90∶8－48∶0.5－5的比例混合均匀，在－10℃－80℃下冷冻1－5天，冻干得到海绵状材料；4)将上述海绵状材料置于气体发生器中，40－50℃下用醛类物质交联剂固定20－100分钟；5)用甘油水溶液清洗后，真空干燥得到胶原蛋白基复合海绵。
文档编号A61L15/32GK1406632SQ01142070
公开日2003年4月2日 申请日期2001年9月10日 优先权日2001年9月10日
发明者武继民, 高怀生, 关静, 张西正, 李瑞欣, 叶萍, 陈世谦 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所