高纯度胶原蛋白海绵的制备方法
【专利摘要】高纯度胶原蛋白海绵的制备方法。它涉及胶原蛋白海绵的制备方法。它要解决现有方法制备的胶原蛋白海绵存在生产周期长、产率低、纯度低以及止血性能差的问题。方法：一、新鲜的牛跟腱预处理；二、胶原蛋白的提取；三、离心；四、盐析；五、溶解；六、梯度透析；七、预冻；八、冷冻干燥；九、灭菌。本发明制备所得最终产品表面光滑平整，海绵孔径分布均一，产品止血性能较好。产品纯度较高（氨基酸总量高达97.73%），止血效果明显，无异味，安全无毒，产率高，时间短，清液无杂质，缩短了生产周期；整个制备过程都是在室温以下进行的，保持了胶原蛋白的生物活性，提高了临床中的应用。
【专利说明】高纯度胶原蛋白海绵的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胶原蛋白海绵的制备方法。
【背景技术】
[0002]13父原蛋白是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25%~30%,相当于体重的6%，存在于几乎所有组织中，是一种细胞外基质蛋白，以不溶纤维形式存在，具高度抗张能力，对动物和人体皮肤、血管、骨骼、筋骨、软骨的形成十分重要，是结缔组织的重要物质，是决定结缔组织韧性的主要因素。胶原蛋白是一类结构上既有共同特点又有差异的蛋白质家族，目前已发现有27种不同类型的胶原，按照被发现的先后顺序分别称为I型胶原、II型胶原、III型胶原等，用大写的罗马数字来进行命名。胶原蛋白和其他蛋白一样也是由氨基酸组成的，但在其组成中甘氨酸几乎占到了 1/3，并且脯氨酸和羟脯氨酸是各类蛋白质中最闻的，正因为氣基酸的组成特点，股原蛋白在空间中以稳定的二螺旋结构存在。胶原蛋白具有诸多优异的生物学性质，如低免疫性:胶原分子结构中的重复性单元大，免疫原性非常低，对机体无排异反应，亲和性好，一般生物机体不会对其产生慢性的排斥现象。
[0003]各种类型的胶原蛋白广泛分布于机体的所有组织中，不同类型的胶原因分布和含量不同在机体中具有不同的功能。I型胶原蛋白是动物体内含量最多的一类胶原，是脊椎动物结缔组织中最重要和最常见的的胶原类型。I型胶原蛋白目前在组织工程中大量使用，使得从动物组织中提取I型胶原蛋白成为了近年来研究的热点。虽然I型胶原蛋白能从动物的许多的组织中提取，但选取适当的组织材料是提取胶原蛋白的首要条件。目前已知动物的跟腱和骨骼的纤维几乎都是I型胶原蛋白，因此选择动物跟腱组织为原料提取并制得的胶原蛋白海绵是I型胶原蛋白为主的，可以减少高纯度胶原蛋白海绵制备过程中的提纯工艺。
[0004]目前从动物组织中提取胶原蛋白一般有两种方法:使用溶剂的化学法和使用酶的生物化学法。选择提取胶原的`组织材料后要进行预处理，去掉上面的非胶原成分，特别是要用有机溶剂抽提出其中的脂肪组织。由于使用溶剂的化学法容易造成肽键的水解，得到的胶原蛋白相对分子质量较低，因此在制备胶原蛋白时通常是使用酶的生物化学法。该法常用于提取胶原蛋白的溶剂有中性盐和酸性溶剂:中性盐主要采用Tris-HCl，氯化钠、柠檬酸盐等，在中性条件下，胶原蛋白不能溶解在低浓度的盐溶液中，当盐的浓度达到一定量时，胶原就会发生溶解，中性盐做溶剂提取胶原蛋白工艺不稳定是其主要缺点；酸性溶剂多采用弱酸如醋酸、柠檬酸等溶液，主要通过低离子浓度及酸性条件破坏胶原蛋白分子间的盐键和Schiff键，引起胶原纤维膨胀、溶解，从而达到提取的目的。酸性溶剂提取胶原蛋白具有水解反应快，无污染，提取的胶原蛋白物理化学性质稳定等优点。一般是在酸性溶剂中，胃蛋白酶催化水解胶原的端肽非螺旋区，对螺旋区无作用，这样溶解的胶原具有完整的三螺旋结构，更降低了胶原蛋白的抗原性，适用于做生物医用材料。每种方法提取的胶原蛋白都有杂质，为了分离非胶原物质，在胶原粗提液中加入较多的粉状盐将全部胶原沉析出来，进行粗提纯，再将沉淀溶解在中性盐溶液中，进行透析，除去小分子的盐类杂质，从而得到纯度较高的胶原蛋白海绵。
[0005]目前市场上已有几种胶原蛋白海绵应用于临床，做为组织工程材料和止血材料使用。该类胶原蛋白产品主要是采用酸性溶剂酶的生物化学法进行提取，最后经过盐析、透析工艺得到胶原蛋白海绵。通过对其产品进行微观孔形貌和氨基酸分析，电镜下能明显看到胶原蛋白产品上吸附一些没有除去的小分子盐类，而且氨基酸分析结果显示，该方法得到的胶原蛋白纯度较低。低纯度的胶原蛋白海绵，做为止血材料，具有一定止血功能，但作用时间较慢，不具有快速止血的效果。目前的工艺得不到高纯度的胶原蛋白海绵主要是由于在透析过程中，采用的是一步透析法，一步法透析过程中小分子盐类杂质不能完全去除干净，影响了最后得到的胶原蛋白海绵产品的纯度。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决现有方法制备的胶原蛋白海绵存在生产周期长、产率低、纯度低以及止血性能差的问题，而提供了高纯度胶原蛋白海绵的制备方法。
[0007]高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，按以下步骤进行:
[0008]一、新鲜的牛跟腱预处理:将100~250g新鲜的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗净切成0.5cmX 0.5cm的小块放入组织捣碎机中,加入300~500ml蒸懼水,开机捣碎，然后用蒸馏水洗涤，再用1000ml质量浓度为0.05%~3%的碳酸钠溶液浸泡10~24h，过滤，将沉淀在自然状态下干燥；
[0009]二、胶原蛋白的提取:将5~50g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入500~1500ml质量浓度为0.1%~5%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取2~4天，获得提取液；
`[0010]三、离心:将提取液进行冷冻离心，离心机温度为-5~5°C，转速为10000~15000转/分，离心20~30min，取离心的上层清液；
[0011]四、盐析:将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为5%~15%的柠檬酸钠溶液调节pH值至6.5~8.0,搅拌均匀，然后加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为1.5~5mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置12~24h，获得胶原混合液；
[0012]五、溶解:将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀3~5次，再向过滤出的胶原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl缓冲溶液，边加边搅拌至胶原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中静置24~48h，获得溶解的胶原溶液；
[0013]六、梯度透析:①将溶解的胶原溶液装入截留分子量为五万的透析袋中，在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.08%~0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液；
[0014]②将透析完的胶原溶液取出装入截留分子量为一万的透析袋中，在磁力搅拌下用蒸馏水做透析外液，每12h换一次蒸馏水，直至透析外液用硝酸银溶液检测没有沉淀产生为止，获得透析好的胶原溶液，整个透析过程都在室温下进行，透析外液的体积为内液的8~12倍；[0015]七、预冻:将透析好的胶原溶液注入不锈钢盘模具中，然后室温下静置脱泡5~IOh,再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°C /h,从常温降温至-50°C~_80°C并预冻12~24h，获得预冻好的胶原溶液；
[0016]八、冷冻干燥:将预冻好的胶原溶液放入冷冻真空干燥机中，真空干燥36~72h，获得冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵；
[0017]九、灭菌:将冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用6tlCo进行辐照灭菌，即完成高纯度胶原蛋白海绵的制备；
[0018]其中步骤二中均匀间歇搅拌为每搅拌IOh后停止0.5~lh。
[0019]本发明中制备的胶原蛋白海绵的特点是针对目前高纯产品制备过程中的工艺不足，采用两步的梯度透析法，并在透析过程中不断搅拌，搅拌下两步梯度透析法的优点是能够高效快速的除去杂质，最终得到高纯度的胶原蛋白海绵。本发明以检验免疫过的新鲜牛跟腱为原料，以溶解胃蛋白酶的低浓度的乙酸溶液为溶剂进行提取胶原，离心粗提液，调节PH进行盐析除杂质，再将沉淀溶解在中性盐溶液中采取两步法的梯度透析并搅拌，最后经静置脱泡冷冻干燥得到高纯度的胶原蛋白海绵。
[0020]本发明的优点是:
[0021]1、新鲜的牛跟腱在使用前要除油脂和除腥，现有方法中采用NaCl溶液浸泡除脂和除腥，而本发明采用的是Na2CO3溶液，它是强碱弱酸盐，不仅具有盐的性质，而且使溶液显碱性，它的一个重要用途是洗涤剂，因此本发明选用Na2CO3溶液，它相比于NaCl溶液能够更好地去除牛腱上残留的脂肪和腥味，使得最终产品的纯度较高，无异味。
[0022]2、本发明在提取过程中使用了胃蛋白酶或者无花果蛋白酶，相比于胃蛋白酶，无花果蛋白酶来源于植物，生`物安全性能更高，避免了从动物组织提取的胃蛋白酶引入的病菌。同时无花果蛋白酶酶的活力较高，胶原蛋白提取产率高。
[0023]3、本发明对提取液进行冷冻离心处理，现有方法采用的是过滤，因为提取液浓度较大，过滤时间长，过滤不完全，易将杂质引入滤液中。因此本发明提出了离心法，采用冷冻离心，不仅保持了胶原的活性，而且时间短，清液无杂质，提高了产品的纯度，缩短了生产周期。
[0024]4、本发明在盐析过程中，选用的是柠檬酸钠溶液来调节pH值，相比于现有方法中采用的NaOH，NaOH碱性强，通过加入NaOH调解pH值，不易控制NaOH加入量，同时容易破坏产品胶原蛋白的生物活性。而柠檬酸钠碱性较弱，通过它调解，容易控制溶液的PH值，其安全无毒，作为食品添加剂使用，不会对胶原的结构产生影响。
[0025]5、在胶原蛋白的溶解过程中，现有方法采用乙酸作溶液，乙酸酸性强，酸味较浓，最终得到的产品中酸味不能够完全出去，细胞毒性大，影响了胶原蛋白作为体内植入材料的使用，本发明中采用的Tris-HCl缓冲溶液是中性盐溶液，是蛋白质的常用溶剂，可以溶解胶原蛋白，相比于乙酸,对胶原溶液的pH值影响较小,使胶原能够最大程度的溶解,对最终产品的性能无影响，产品无酸性味道。
[0026]6、本发明中首次提出了梯度透稀法；胶原的纯度影响它的止血效果，因此纯度很重要。本发明采用梯度透析法，并在透析过程中不断搅拌，搅拌下梯度透析法相比于现有方法中的一步透析法的优点是在透析过程中利用不同分子量的透析袋能够高效的除去胶原中杂质，透析时间快，即缩短了生产周期，最终得到高纯度的胶原蛋白海绵。[0027]7、本发明在海绵冷冻之前，首次采用程序降温工艺，从常温到_80°C的每小时IO0C的降温速度进行预冻，程序降温相比于骤冷，最终得到产品表面光滑平整，海绵孔径分布均一，产品止血性能较好。
[0028]8、本发明所制备的胶原蛋白海绵采用梯度透析法，纯度较高(氨基酸总量高达97.73%)，止血效果明显；制备过程中没有使用有毒的化学试剂，胶原蛋白海绵产品安全性能好；整个制备过程都是在室温以下进行的，保持了胶原蛋白的生物活性，提高了临床中的应用。
【具体实施方式】
[0029]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0030]【具体实施方式】一:本实施方式高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，按以下步骤进行:
[0031]一、新鲜的牛跟腱预处理:将100~250g新鲜的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗净切成0.5cmX 0.5cm的小块放入组织捣碎机中,加入300~500ml蒸懼水,开机捣碎，然后用蒸馏水洗涤，再用1000ml质量浓度为0.05%~3%的碳酸钠溶液浸泡10~24h，过滤，将沉淀在自然状态下干燥；
[0032]二、胶原蛋白的提取:将5~50g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入500~1500ml质量浓度为0.1%~5%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取2~4天，获得提取液；
[0033]三、离心:将提`取液进行冷冻离心，离心机温度为-5~5°C，转速为10000~15000转/分，离心20~30min，取离心的上层清液；
[0034]四、盐析:将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为5%~15%的柠檬酸钠溶液调节pH值至6.5~8.0,搅拌均匀，然后加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为1.5~5mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置12~24h，获得胶原混合液；
[0035]五、溶解:将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀3~5次，再向过滤出的胶原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl缓冲溶液，边加边搅拌至胶原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中静置24~48h，获得溶解的胶原溶液；
[0036]六、梯度透析:①将溶解的胶原溶液装入截留分子量为五万的透析袋中，在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.08%~0.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液；
[0037]②将透析完的胶原溶液取出装入截留分子量为一万的透析袋中，在磁力搅拌下用蒸馏水做透析外液，每12h换一次蒸馏水，直至透析外液用硝酸银溶液检测没有沉淀产生为止，获得透析好的胶原溶液，整个透析过程都在室温下进行，透析外液的体积为内液的8~12倍；
[0038]七、预冻:将透析好的胶原溶液注入不锈钢盘模具中，然后室温下静置脱泡5~IOh,再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°c /h,从常温降温至-50°c~-80°c并预冻12~24h，获得预冻好的胶原溶液；
[0039]八、冷冻干燥:将预冻好的胶原溶液放入冷冻真空干燥机中，真空干燥36~72h，获得冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵；
[0040]九、灭菌:将冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用6tlCo进行辐照灭菌，即完成高纯度胶原蛋白海绵的制备；
[0041]其中步骤二中均匀间歇搅拌为每搅拌IOh后停止0.5~lh。
[0042]本实施方式步骤一中将沉淀在自然状态下干燥目的是除去腥味。
[0043]本实施方式步骤四中NaCl粉末是将NaCl颗粒研磨成粉末。
[0044]本实施方式步骤七中不锈钢盘模具的规格的选取，由实际生产中所需要的胶原蛋白海绵的大小来决定。
[0045]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是步骤一中用1000ml质量浓度为0.8%的碳酸钠溶液浸泡12h。其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0046]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二不同的是步骤二中将25g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入800ml质量浓度为1.2%的乙酸,搅拌使其溶解,然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为1.2%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取3.5天。其它步骤及参数与【具体实施方式】一或二相同。
[0047]【具体实施方式】`四:本实施方式本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是步骤三中将提取液进行冷冻离心，离心机温度为_2°C，转速为13000转/分，离心30min。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至三之一相同。
[0048]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是步骤四中将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为10%的柠檬酸钠溶液调节pH值至7.0。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至四之一相同。
[0049]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一不同的是步骤四中加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为2mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置16h。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至五之一相同。
[0050]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一至六之一不同的是步骤五中将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀4次，再向过滤出的胶原沉淀中加入400ml的Tris-HCl缓冲溶液。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至六之一相同。
[0051]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一至七之一不同的是步骤六中在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.1%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至七之一相同。
[0052]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】一至八之一不同的是步骤六中透析外液的体积为内液的10倍。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至八之一相同。
[0053]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】一至九之一不同的是步骤七中室温下静置脱泡8h，再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°C /h,从常温降温至_70°C并预冻12h。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至九之一相同。[0054]【具体实施方式】十一:本实施方式与【具体实施方式】一至十之一不同的是步骤八中真空干燥48h。其它步骤及参数与【具体实施方式】一至十之一相同。
[0055]采用以下实施例验证本发明的有益效果:
[0056]实施例1:
[0057]高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，按以下步骤进行:
[0058]一、新鲜的牛跟腱预处理:将100g新鲜的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗净切成
0.5cmX0.5cm的小块放入组织捣碎机中，加入300ml蒸馏水，开机捣碎，然后用蒸馏水洗涤，再用1000ml质量浓度为0.8%的碳酸钠溶液浸泡12h，过滤，将沉淀在自然状态下干燥；
[0059]二、胶原蛋白的提取:将25g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入800ml质量浓度为1.2%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶的质量浓度为1.2%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取3.5天，获得提取液；
[0060]三、离心:将提取液进行冷冻离心，离心机温度为-2V，转速为13000转/分，离心30min,取离心的上层清液；
[0061]四、盐析:将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为10%的柠檬酸钠溶液调节pH值至7.0,搅拌均匀，然后加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为2mol/L，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置12h，获得胶原混合液；
[0062]五、溶解:将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀3次，再向过滤出的胶原沉淀中加入500ml的Tris-HCl缓冲溶液，边加边搅拌至胶原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中静置24h，获得溶解的胶`原溶液；
[0063]六、梯度透析:①将溶解的胶原溶液装入截留分子量为五万的透析袋中，在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为
0.1%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液；
[0064]②将透析完的胶原溶液取出装入截留分子量为一万的透析袋中，在磁力搅拌下用蒸馏水做透析外液，每12h换一次蒸馏水，直至透析外液用硝酸银溶液检测没有沉淀产生为止，获得透析好的胶原溶液，整个透析过程都在室温下进行，透析外液的体积为内液的10倍;
[0065]七、预冻:将透析好的胶原溶液注入规格为50X50X20mm的不锈钢盘模具中，然后室温下静置脱泡8h，再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°C /h，从常温降温至-80°C并预冻12h，获得预冻好的胶原溶液；
[0066]八、冷冻干燥:将预冻好的胶原溶液放入冷冻真空干燥机中，真空干燥72h，获得冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵；
[0067]九、灭菌:将冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用6tlCo进行辐照灭菌，即完成高纯度胶原蛋白海绵的制备；
[0068]其中步骤二中均匀间歇搅拌为每搅拌IOh后停止0.5h。
[0069]本实施例步骤一中将沉淀在自然状态下干燥目的是除去腥味。
[0070]本实施例步骤四中NaCl粉末是将NaCl颗粒研磨成粉末。
[0071]本实施例步骤七中每个不锈钢盘模具中注入30ml透析好的胶原溶液。
[0072]本实施例中制备所得高纯度胶原蛋白海绵的氨基酸分析结果如表1所示，可见本实施例中制备的胶原蛋白海绵的纯度比现有商品胶原蛋白海绵的纯度高。
[0073]本实施例中制备所得高纯度胶原蛋白海绵的动物止血实验结果如表2所示，可见
本实施例中制备的胶原蛋白海绵的止血时间比现有商品胶原蛋白海绵的止血时间缩短很
多，止血效果更好。
[0074]表1
【权利要求】
1.高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于它按以下步骤进行: 一、新鲜的牛跟腱预处理:将100~250g新鲜的牛跟腱去除筋膜、油脂后，洗净切成0.5cmX0.5cm的小块放入组织捣碎机中，加入300~500ml蒸馏水，开机捣碎，然后用蒸馏水洗涤，再用1000ml质量浓度为0.05%~3%的碳酸钠溶液浸泡10~24h，过滤，将沉淀在自然状态下干燥； 二、胶原蛋白的提取:将5~50g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入500~1500ml质量浓度为0.1%~5%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入100~500ml含有0.5~5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为0.1%~5%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取2~4天，获得提取液； 三、离心:将提取液进行冷冻离心，离心机温度为-5~5°C，转速为10000~15000转/分,离心20~30min,取离心的上层清液； 四、盐析:将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为5%~15%的柠檬酸钠溶液调节pH值至6.5~8.0，搅拌均匀，然后加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为1.5~5mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置12~24h，获得胶原混合液； 五、溶解:将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀3~5次，再向过滤出的胶原沉淀中加入300~500ml的Tris-HCl缓冲溶液，边加边搅拌至胶原蛋白完全溶解，然后置于4°C冰箱中静置24~48h，获得溶解的胶原溶液； 六、梯度透析:①将溶解的胶原溶液装入截留分子量为五万的透析袋中，在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%~3%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.3%~1.2%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.08%~0.2%的乙酸`做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液； ②将透析完的胶原溶液取出装入截留分子量为一万的透析袋中，在磁力搅拌下用蒸馏水做透析外液，每12h换一次蒸馏水，直至透析外液用硝酸银溶液检测没有沉淀产生为止，获得透析好的胶原溶液，整个透析过程都在室温下进行，透析外液的体积为内液的8~12倍; 七、预冻:将透析好的胶原溶液注入不锈钢盘模具中，然后室温下静置脱泡5~10h，再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°C /h，从常温降温至-50°C~-80°C并预冻12~24h，获得预冻好的胶原溶液； 八、冷冻干燥:将预冻好的胶原溶液放入冷冻真空干燥机中，真空干燥36~72h，获得冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵； 九、灭菌:将冷冻干燥成型的高纯度胶原蛋白海绵装入铝箔袋中，用封口机封口，然后用6tlCo进行辐照灭菌，即完成高纯度胶原蛋白海绵的制备； 其中步骤二中均匀间歇搅拌为每搅拌IOh后停止0.5~lh。
2.根据权利要求1所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤一中用1000ml质量浓度为0.8%的碳酸钠溶液浸泡12h。
3.根据权利要求1或2所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤二中将25g干燥后的牛跟腱置于三口烧瓶中，加入800ml质量浓度为1.2%的乙酸，搅拌使其溶解，然后加入500ml含有3.5g胃蛋白酶或者无花果蛋白酶的质量浓度为1.2%的乙酸，再置于5°C的恒温水槽中均匀间歇搅拌并提取3.5天。
4.根据权利要求3所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤三中将提取液进行冷冻离心，离心机温度为-2V，转速为13000转/分，离心30min。
5.根据权利要求4所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤四中将离心后的清液边搅拌边加入质量浓度为10%的柠檬酸钠溶液调节pH值至7.0。
6.根据权利要求5所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤四中加入NaCl粉末进行盐析，使NaCl的浓度为2mol/l，边加边搅拌，胶原蛋白完全析出后置于4°C冰箱中静置16h。
7.根据权利要求6所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤五中将胶原混合液过滤，然后用蒸馏水清洗沉淀4次，再向过滤出的胶原沉淀中加入400ml的Tris-HCl缓冲溶液。
8.根据权利要求7所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤六中在磁力搅拌下首先用质量浓度为1.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；其次用质量浓度为0.5%的乙酸做透析外液，透析24h，12h后换一次透析外液；最后用质量浓度为0.1%的乙酸做透析外液，透析24h，12h换一次透析外液。
9.根据权利要求8所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤六中透析外液的体积为内液的10倍。
10.根据权利要求9所述的高纯度胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤七中室温下静置脱泡8h，再放入低温冰箱中采用程序降温，降温速度为10°C /h，从常温降温至-70°C并预冻12h。`
【文档编号】C07K14/78GK103772734SQ201410022396
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】黄玉东, 李大龙, 贺金梅, 程玮璐, 吴亚东, 王承旭 申请人:哈尔滨工业大学