专利名称：生物制药的模块式自动化生产线的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制药生产的自动化生产工艺路线。
当今，由于生物技术的飞跃发展，基因工程产品、生物治疗、基因治疗正在促使整个医药界经历着一次深刻的技术革命。估计在10-20年后生物技术将与电子技术等高新技术成为下世纪国民经济发展的支柱性产业。目前我国的生物技术还处在迅速发展的起步和培育期，国内从事新生物技术的研究机构虽已有一定实力，但和先进国家相比，特别是我国生物技术产业化方面还存在两个比较大的问题其一，目前我国生物技术的产业化中间有一个断层，即上游的产品开发出来以后，缺少中试阶段。其二，小规模、低水平的重复建设多。根据以上情况，本发明研制开发出计算机控制的全自动生产线，最终可搞成钥匙工程，这才是一种多快好省地开发我国生物技术并使之产业化的捷径。
以下对本发明进行详细描述。一.工艺路线的比较(实例说明)现行生产工艺路线IFN-α2b工程菌→活化→一级种子→二级种子→发酵→离心→悬浮→匀浆破菌→酸化→中和→离心→浓缩→盐析→离心→溶解→离心→除盐→DEAE柱→调PH、过滤、换液→CM柱→调PH、过滤、换液→单抗柱→调PH→S100→半成品检验→配制→分装→冻干→压盖→检验→包装→产成品自动化生产工艺路线菌种→扩增→发酵→离心集菌→匀浆破菌→洗菌→离心→提取包涵体→裂解→稀释复性→反相层析→离子层析→凝胶层析→半成品检验→配制→分装→冻干→压盖→检验→包装→产成品全自动化生产线采用新菌种，此菌种比传统菌种表达高20倍以上，且α2b干扰素蛋白在大肠杆菌中生成包涵体，简化了生产过程，大大降低了生产成本。二.全自动生产线与常规生产方法的比较(实例说明)目前，国内生物制品的生产过程绝大多数按化工单元分步间隙操作，其操作步骤繁琐，中间体在生产过程中需要往返运输，并经常暴露在室内环境中，这既不利于生产管理，也不利于稳定产品质量。减轻劳动强度，提高产品质量，提高设备利用率和生产效率，使生产过程自动化，特别是变生物制品生产按化工单元间隙操作为自动化连续操作必然是今后发展的方向。为了说明自动化生产的优势，现将目前生产状况与全自动生物制品生产线作一比较(以干扰素α2b生产过程为例)
三.全自动生产线新工艺流程简介(干扰素为例)1.全自动高效表达发酵全自动高表达发酵可以用来提高生产率，也可以提供诸如减少发酵规模，降低生产成本，减少设备投资等方面优势。
全自动高表达发酵，关键技术在于菌种的选择，菌种复苏，培养基的配制，工艺条件的控制上。我们目前发酵水平，每升发酵液获得成品干扰素约100单位500-1000支。我们选用新菌种，采用计算机控制高表达发酵技术。320升工作体积发酵罐可以年产300万IU干扰素，1500万支以上，是以前的20倍。
发酵操作及自动控制如下菌种活化，一级种于扩增，在摇床上进行。种子罐、接种、加培养基由人工进行上料，上料完成后，启动计算机，菌种自动在种子罐内进行二级种子扩增，然后转入发酵罐内进行高表达发酵。种子罐、发酵罐自成一个体系，由自带的计算机完成各工艺条件的检测与控制，可完成在线清洗与灭菌。发酵完成后可自动将发酵液转入下道工序(见图一)。2.全自动匀浆破菌包涵体一般采用超声波破菌法获取，超声波破菌很难实现自动化且产量小。采用匀浆破菌全自动化也存在三个问题高压匀浆55兆帕压力的自动控制；自动循环匀浆若干次；均浆菌液的降低温度控制。这三个问题是保证匀浆破菌质量的关键，目前国内匀浆机压力控制一般都是手动，匀浆不能自动循环，只能人工分次进行，温度控制用冰浴或放冷库降温。匀浆周期长，劳动强度大。此次采用全自动匀浆破菌有效地解决了上述三个问题，流程见图二。3.包涵体的洗涤与裂解在同一台离心机上自动完成包涵体的洗涤常规操作是洗一次要离心一次，一般要反复洗涤4-5次。包涵体的洗涤与裂解自动化关键在于要有自动收集包涵体的离心机，近几年美国CARR公司、瑞典阿法-拉伐都推出了可连续自动排渣的离心机。为实现包涵体洗涤与裂解自动化提供硬件保证。包涵体的洗涤与裂解流程如图三。4.采用反相十离子层析取代亲和(单抗)层析包涵体经4次洗涤裂解以后其蛋白纯度已超过70％，采用高压反相十离子层析取代亲和单抗层析这不仅可避免产品中混入异源蛋白，并能有效地除去E.coli类毒素，(主要是亲水性的脂多糖)减少热源，同时还可降低生产成本(见图四)。四.自动化生产线采用关键设备、仪器的说明1.发酵系统种子罐与发酵罐生产联合机组，美国NBS公司、德国贝朗公司、瑞士比欧等公司生产的设备已相当好。发酵系统全部电脑控制可实现多达24种参数的自动控制，详见上述公司发酵系统简介。这些设备可以保证发酵工艺参数100％的上罐，并自动实现CIP.SIP。根据工艺要求发酵系统选用30/42L种子罐和320/450L发酵罐。全自动电脑控制，自动CIP.SIP系统。2.离心集菌连续离心机选用瑞典阿法-拉伐公司的BYPX-205型离心机，它是一种用于液/固分离的固体排放式连续操作离心机。发酵液离心后，湿菌自动收集到固体罐中，经TE缓冲液悬浮可直接输送至高压匀浆机破菌。菌体被密闭在管道和贮罐中，避免了室内环境的污染。离心机的清洗、灭菌在线自动进行，即保证产品质量也减轻了劳动强度。3.高压匀浆机匀浆破菌选用美国APV公司生产的12.38H型高压均质机，生产能力为100L/hr，最高工作压力为1000bar压力可以自动控制。高压匀浆时，因高压释放，机械能转换成热能，匀浆一次料温将升高20℃，若不冷却，进行第二次匀浆，料温会升高至40℃以上。这将会严重影响产品质量，因此匀浆料液出来后，必须强制冷却，冷却到8℃以下再进行第二次匀浆。APV公司可以配备板式或管式换热器，可一次将料温降至8℃以下，可根据工艺要求连续反复匀浆。可绝对保证匀浆温度和破菌质量。操作过程全封闭，无污染。匀浆后，匀浆机可自动清洗和灭菌，无需人工操作，亦不需要冷库和拆装匀浆机。4.包涵体的洗涤与裂解包涵体的洗涤与裂解选用美国ARCC公司P6离心机，此离心机自带打浆罐，另外配备一个中间贮罐，可实现包涵体的自动洗涤与裂解。这是一个重要的技术措施，采用这套新技术，可大大缩短工艺流程，解决了自动化、连续化生产难题。有关设备性能详见P6离心机使用说明书。5.高压反相层析机安法马西亚及密理博公司分别提供了两种反相层析机。安法马西亚提供的反相层析压力最高1兆帕，流量最大60L/hr。密理博公司提供的反相层析最高压力7兆帕，最大流量为125L/hr。采用安法马西亚SouRce 15RPC或30RPC胶，分离效果较好。一次分离产品纯度大于90％，可自动进行CIP及收液罐的SIP。柱子前后配备PH、电导、压力、流量、温度、紫外检测与分析系统。整个层析过程由计算机自动控制，工艺参数都可以随机储存和打印。6.离子层析和凝胶层析离子层析采用Sepharose Q.HP胶(阴离子型)，柱径φ100，高250mm。凝胶层析主要用作换液并可去除多聚体，采用Superdex75胶，柱径φ140，高1000mm。为了充分利用设备使用率，节约投资，我们选用一拖二制备型层析机。设备最大工作压力0.6兆帕，最大流量为30L/hr，可在一台设备上自动完成离子层析与凝胶层析，可自动进行CIP，柱子前后配备PH、电导、紫外、压力、流量、温度检测与分析系统。计算机操作平台为WindowsNT，整个层析过程由计算机控制自动完成，工艺参数可以随机储存与记录。7.100级干热灭菌机洗瓶、分装将采用间隙式。洗瓶机和分装机可用国产设备，为了保证成品质量，瓶干烤灭菌除热源应选用进口100级灭菌设备。中翔公司FOD 5/F 100级灭菌除热源设备内带100级循环过滤器及4个PT 100温度探头可保证箱内温度的均匀性，提高灭菌效果。FOD 5/F一次可干热灭菌1毫升西林瓶7.5万支。干烤温度240℃。干烤灭菌过程全由计算机控制。8.冷冻干燥机冷冻干燥机是保证最后成品质量的关键，一个好的冷冻干燥机，可以保证产品外观及冷冻干燥的合格率，缩短加工时间。根据发酵能力，每批冷冻干燥能力应该大于6万支，每支若按50元计算，若报废一批就将损失300万元，因此干燥机的选择非常重要，选择一台进口冷冻干燥机，容量大于6万支，16m2工作面积，带CIP和SIP，带门中门。全过程由计算机控制。西班牙L10MEGA-150，法国尤斯夫SMH801及爱得华的冻干设备均可。
权利要求
1.一整套有序连贯的生物制药的自动化生产工艺路线。其特征在于生物制品生产实现了自动化连续操作，可应用于包括细胞因子(如IFN-α2b)的所有生物制品的生产，整个自动化生产工艺的具体路线如下菌种→扩增→发酵→离心集菌→匀浆破菌→洗菌→离心→提取包涵体→裂解→稀释复性→反相层析→离子层析→凝胶层析→半成品检验→配制→分装→冻干→压盖→检验→包装→产成品，所有程序实现了CI(Computer Integrated Manufacture电脑整合制造)的操作和运行规范。可以根据具体生物制品的不同工艺流程将其中个别或部分工序省略。
2.根据权利要求1的一种全自动高效表达发酵的生产方法。其特征在于种子罐、发酵罐自成一个体系，由自带的计算机完成各种工艺条件的检测与控制，可完成在线清洗与灭菌。发酵完成后可自动将发酵液转入下道工序。
3.根据权利要求1的一种全自动匀浆破菌的生产方法。其特征在于匀浆过程自动进行，匀浆时菌液温度升高以后，用换热器冷却然后进入均质机后贮罐，均质完成后，再将后贮罐内菌体压入前贮罐，若温度＞10℃可继续在前贮罐冷却。冷却＜10℃可进行第二次匀浆，整个过程由人工设定计算机控制完成。可绝对保证匀浆温度和破菌质量，操作过程全封闭进行，无污染。匀浆后可在线自动清洗和灭菌，无人工操作，亦不需冷库和拆装匀浆设备。
4.据权利要求1的一种全自动的包涵体的洗涤与裂解的生产方法。其特征在于包涵体的洗涤与裂解选用美国ARCC公司P6离心机，此离心机自带打浆罐，外配备一个中间贮罐，可实现包涵体的自动洗涤与裂解。包涵体的洗涤在P6离心机上进行，匀浆离心后粗包涵体被刮入P6打浆罐中，打浆罐自动打浆，洗包涵体。停止打浆后，将包涵体悬浮液用气压送入离心机的中间贮罐，启动离心机自动离心，(离心力12000g)，离心机下来的沉淀再刮入打浆罐中，如此反复进行，所不同的是每离心一次，换一种洗涤液，具体换什么洗涤液，加多少量，洗多少时间，由人工事先设定好，离心，打浆洗涤按程序自动进行。包涵体的裂解也在P6离心机上完成，为了减少包涵体的损失，最后一次用复性液洗完以后，裂解液应从离心进料口加入，离心机低速旋转清洗离心机上的包涵体，然后，将裂解液放入打浆罐内打浆，进行包涵体的裂解。
5.根据权利要求1的一种全自动的连续层析纯化的生产方法。其特征在于层析全自动进行，人工在电脑上设定好操作程序，柱子平衡、上样、洗脱、收集目的蛋白、CIP、SIP全部自动进行。可做到全封闭操作，工艺参数及运行数据可自动记录留档。
6.根据权利要求1，2，3，4，5所选用的仪器设备(或功能类似的仪器设备)的有序串联组合方法，其特征在于发酵系统→连续离心机→高压匀浆机→P6离心机(含打浆罐并配备一个中间贮罐)→复性罐→层析储罐→层析机的串联组合。发酵系统包括美国NBS公司、德国贝朗公司、瑞士比欧等公司的种子罐与发酵罐生产联合机组；连续离心机可选用瑞典阿法-拉伐公司BYPX-205型离心机；高压匀浆机可选用美国APV公司生产的12.38H型高压均质机；包涵体的洗涤与裂解选用美国ARCC公司P6离心机。
全文摘要
随着生物技术的飞跃发展，生物制药正在促使整个医药界发生巨大变化，为造福人类健康发挥重要作用。本发明基于保证产品质量，提高生产效率，减轻劳动强度，优化企业管理，增加经济收入的目的，结合国内已经成熟的干扰素生产线，设计了计算机控制的模块式全自动生产线，解决了人干扰素及其他生物技术产业规模化、自动化生产的问题。
文档编号A61K38/21GK1407085SQ0114205
公开日2003年4月2日 申请日期2001年9月10日 优先权日2001年9月10日
发明者张丽兰, 朱学仁, 金善麟, 侯云德 申请人:北京东康龙病毒生物技术工程研究中心, 病毒生物技术国家工程研究中心