一种鱼鳞胶原止血海绵的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鱼鳞胶原止血海绵的制备方法，属于医疗材料制备领域。
【背景技术】
[0002]胶原作为细胞外基质的纤维支架，存在于绝大多数薄壁器官间质组织中，起着支撑和保护器官、组织完整性的作用。同时，胶原与人体血管、皮肤、骨骼和软骨的形成关系密切，也是维持各器官、组织弹性和韧性的重要保障。胶原具有优越的止血特性和生物相容性，与出血创面接触时，能引起血小板聚集，缩短血栓形成的时间。同时，胶原能够刺激血小板释放亚细胞颗粒和凝血因子，凝血因子会主动附着、填塞受损血管，从而促进凝血过程。此外，胶原还能在接触面形成稳定的凝胶，确保创面新生组织顺利地长出，修复受损创面，大幅缩短伤口愈合时间。结构决定性质，性质决定用途，胶原特殊的三螺旋结构赋予胶原良好的生物相容性、可降解性、低抗原性及止血性能等优良特性。
[0003]鱼鳞主要由有机物和矿物质构成，分别占总重的41%?55%和38%?46%，有机物中以胶原蛋白和角蛋白为主，占有机物总含量的90%以上；矿物质则以磷酸钙为主，还含有少量的碳酸钙、磷酸镁、磷酸钙等无机盐。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前胶原止血材料机械性能弱，止血所需时间长，促进伤口愈合慢的缺陷，提供了一种鱼鳞胶原止血海绵的制备方法，该方法是以鱼鳞为原材料，通过清洗粉碎，用酸浸泡脱除钙质，之后加入胃蛋白酶酶解，将酶解液高速离心并盐析得到鱼鳞胶原蛋白，再将胶原与壳聚糖进行交联最终制得一种鱼鳞胶原止血海绵。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)取100?200g鱼鳞，用去离子水冲洗3?5遍后晾干，放入反应罐，加入400?500mL蒸馏水和50?10mL质量浓度为80%的柠檬酸溶液，之后将反应罐放置在磁力搅拌机上，以300?400r/min的转速搅拌反应8?10h，过滤去除酸水，用蒸馈水冲洗5?15min，得到去灰鱼鳞；
(2)将上述去灰鱼鳞放入500mL烧杯中，加入200?300mL浓度为30%的碳酸氢钠溶液，搅拌反应20?30min，使鱼鳞脱脂；
(3)将脱脂后的鱼鳞放入100?200mL蒸馏水中，用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节pH至7?8，再用去离子水冲洗，连同鱼鳞质量2?10倍的蒸馏水一起放入砂锅，之后油浴升温至150?160°C，煮沸30?40min后冷却至室温继续加入鱼鳞质量0.1?1%的胃蛋白酶，密封酶解I?4h，过滤分离得到酶解液；
(4)将酶解液放入卧式高速离心机，以8000?9000r/min的转速离心处理10?20min，分离收集上清液，沉淀物继续提取2?3次后合并上清液，向上清液中缓慢加入质量分数为5%的氯化钠溶液，同时用玻璃棒沿顺时针方向轻微搅拌，防止过于激烈的搅拌导致蛋白质变性，之后静置于10?12°C的恒温箱中12?15h，使鱼鳞胶原逐渐盐析出来； (5)之后对鱼鳞胶原盐析液进行高速离心处理，离心转速为6000?7000r/min，分离得到沉淀物，将其装入截留分子量为12000?16000的透析袋中，以蒸馏水作透析液，于10?12°C的恒温箱中透析3?5天，透析液每隔12h更换一次，透析完成后将透析袋埋于聚乙二醇中浓缩5?10h，得到鱼鳞胶原浓缩液，对其进行喷雾干燥，控制进风温度为160?230 0C，出口温度控制为40?85°C，干燥后得到鱼鳞胶原蛋白；
(6)将上述制得的鱼鳞胶原和壳聚糖按质量比为2:3加到质量浓度为0.2?0.5%的乙酸溶液中，再滴加2?3滴质量浓度为80%的戊二醛溶液作交联剂，用低速搅拌机以100?200r/min的转速搅拌5?1min混合均勾，之后倒入5cmX 3cmX Icm的娃胶模具中，放入恒温箱在4?6°C下静置交联24?36h，之后用液氮在_70°C下冻结5?6h，最后通过真空冷冻干燥机冷冻干燥I?2天，得到多孔隙海绵状固体，即一种鱼鳞胶原止血海绵。
[0006]本发明的具体应用方法:取本发明制得的止血海绵，覆盖在伤口表面，用手轻按施压5?10s，之后取下海绵，伤口即可止血，本发明制得的止血海绵所需的止血时间比一般止血材料所需的止血时间少30%?40%。
[0007]本发明的有益效果:
(1)发明所需的原材料来源丰富，成本低廉，实现了废物再利用的目标；
(2)本发明制得的止血材料机械性能优异，不易破损，结实耐用。
【具体实施方式】
[0008]取100?200g鱼鳞，用去离子水冲洗3?5遍后晾干，放入反应罐，加入400?500mL蒸馏水和50?10mL质量浓度为80%的柠檬酸溶液，之后将反应罐放置在磁力搅拌机上，以300?400r/min的转速搅拌反应8?10h，过滤去除酸水，用蒸馈水冲洗5?15min，得到去灰鱼鳞；将上述去灰鱼鳞放入500mL烧杯中，加入200?3OOmL浓度为30%的碳酸氢钠溶液，搅拌反应20?30min，使鱼鳞脱脂；将脱脂后的鱼鳞放入100?200mL蒸馏水中，用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节pH至7?8，再用去离子水冲洗，连同鱼鳞质量2?10倍的蒸馏水一起放入砂锅，之后油浴升温至150?160°C，煮沸30?40min后冷却至室温继续加入鱼鳞质量0.1?1%的胃蛋白酶，密封酶解I?4h，过滤分离得到酶解液；将酶解液放入卧式高速离心机，以8000?9000r/min的转速离心处理10?20min，分离收集上清液，沉淀物继续提取2?3次后合并上清液，向上清液中缓慢加入质量分数为5%的氯化钠溶液，同时用玻璃棒沿顺时针方向轻微搅拌，防止过于激烈的搅拌导致蛋白质变性，之后静置于10?12°C的恒温箱中12?15h，使鱼鳞胶原逐渐盐析出来；之后对鱼鳞胶原盐析液进行高速离心处理，离心转速为6000?7000r/min，分离得到沉淀物，将其装入截留分子量为12000?16000的透析袋中，以蒸馏水作透析液，于10?12°C的恒温箱中透析3?5天，透析液每隔12h更换一次，透析完成后将透析袋埋于聚乙二醇中浓缩5?10h，得到鱼鳞胶原浓缩液，对其进行喷雾干燥，控制进风温度为160?230°C，出口温度控制为40?85°C，干燥后得到鱼鳞胶原蛋白；将上述制得的鱼鳞胶原和壳聚糖按质量比为2:3加到质量浓度为0.2?0.5%的乙酸溶液中，再滴加2?3滴质量浓度为80%的戊二醛溶液作交联剂，用低速搅拌机以100?200r/min的转速搅拌5?1min混合均勾，之后倒入5cmX 3cmX Icm的娃胶模具中，放入恒温箱在4?6°C下静置交联24?36h，之后用液氮在_70°C下冻结5?6h，最后通过真空冷冻干燥机冷冻干燥I?2天，得到多孔隙海绵状固体，即一种鱼鳞胶原止血海绵。
[0009]本发明的具体应用方法:取本发明制得的止血海绵，覆盖在伤口表面，用手轻按施压5?10s，之后取下海绵，伤口即可止血，本发明制得的止血海绵所需的止血时间比一般止血材料所需的止血时间缩短30%?40%。
[0010]实例I
取10g鱼鳞，用去离子水冲洗3遍后晾干，放入反应罐，加入400mL蒸馏水和5OmL质量浓度为80%的柠檬酸溶液，之后将反应罐放置在磁力搅拌机上，以300r/min的转速搅拌反应8h，过滤去除酸水，用蒸馏水冲洗5min，得到去灰鱼鳞；将上述去灰鱼鳞放入500mL烧杯中，加入200mL浓度为30%的碳酸氢钠溶液，搅拌反应20min，使鱼鳞脱脂；将脱脂后的鱼鳞放入10mL蒸馏水中，用质量浓度为20%的氢氧化钠溶液调节pH至7，再用去离子水冲洗，连同鱼鳞质量2倍的蒸馏水一起放入砂锅，之后油浴升温至150°C，煮沸30min后冷却至室温继续加入鱼鳞质量0.1%的胃蛋白酶，密封酶解lh，过滤分离得到酶解液；将酶解液放入卧式高速离心机，以8000r/min的转速离心处理lOmin，分离收集上清液，沉淀物继续提取2次后合并上清液，向上清液中缓慢加入质量分数为5%的氯化钠溶液，同时用玻璃棒沿顺时针方向轻微搅拌，防止过于激烈的搅拌导致蛋白质变性，之后静置于10°C的恒温箱中12h，使鱼鳞胶原逐渐盐析出来；之后对鱼鳞胶原盐析液进行高速离心处理，离心转速为6000r/min，分离得到沉淀物，将其装入截留分子量为12000的透析袋中，以蒸馏水作透析液，于10°C的恒温箱中透析3天，透析液每隔12h更换一次，透析完成后将透析袋埋于聚乙二醇中浓缩5h，得到鱼鳞胶原浓缩液，对其进