巨噬细胞刺激蛋白质受体(ron)的抑制及其治疗方法

专利名称：巨噬细胞刺激蛋白质受体(ron)的抑制及其治疗方法
技术领域：
本发明涉及用于抑制人巨噬细胞-刺激蛋白质受体(“Macrophage-Stimulating Protein Receptor,MSPR"^"R0N"(receptord'origine nantais))的方法和组合物。本发 明还提供了用于治疗哺乳动物中肿瘤和其他疾病的方法，其包括施用抑制RON活化的RON 特异性抗体或抗体片段。
背景技术：
巨噬细胞-刺激蛋白质受体在下文也称为“R0N”，其属于受体酪氨酸激酶的c-met 家族。RON是由细胞外α链和跨膜β链构成的异二聚化蛋白质。RON首先表达为单链前 体，然后切割为α和β链(1)。认为β链是其配体，巨噬细胞-刺激蛋白质(“MSP”;a/ k/a HGF-样蛋白质)与所述受体结合所必需的，MSP的2和3的三环域是R0N/MSP相互作 用必需的。参见美国专利公开No. 2003/0073656。认为RON的细胞外结构域与c-met家族 受体的对应结构域几乎没有同源性。事实上，激活c-met家族中其他受体的肝细胞生长因 子(“HGF”)与RON受体的结合不刺激酪氨酸激酶活性(W0 02/083,047)。认为RON在肿瘤的细胞迁移、形状改变和组织侵袭中具有作用(1)。但是，早先的 公开报道了 RON对诱导转化的有限作用，但是记载了 RON活化对侵袭性生长的促进(16)。突变、缺失、基因重排和选择性mRNA剪接可造成在没有任何配体结合的情况下的 RON活化(1)。RON的酪氨酸激酶结构域中的变化可能在RON的活化中起到重要作用(1)。 从多种癌细胞系中克隆RON显示由于编码RON的mRNA中多种缺陷导致的RON活化。MSP是三环域纤溶酶原-相关蛋白质家族的成员(1)。如其名字所暗示的，MSP最 初发现通过多种方式激活巨噬细胞(综述参见2，3)。例如，将MSP添加到某些RON表达巨 噬细胞，则诱导形状改变、趋化作用、大胞饮、吞噬作用以及免疫介体产生(4，5，6)。还发现 RON在上皮细胞中表达，例如角质形成细胞，其中MSP显示磷酸化RON并活化多个信号发放 通路，其引起细胞粘附/运动、抗凋亡和增殖性应答(7，8)。在最近几年中，已经在多种上皮 细胞瘤和细胞系(例如，结肠(9，10，11)，肺(12)，乳腺(13))中观察到RON过表达。在最 近的研究中，在经改造其肺中过表达RON的转基因小鼠中产生肺肿瘤(14，15)。RON在多种人癌细胞系中表达。在许多这些癌细胞系中，RON的抗体可抑制受体 (磷酸化的RON)的活化以及下游信号发放分子的活化磷酸化MAPK和磷酸化AKT。下文举 例的抗RON抗体(R0N6和R0N8)都显示显著阻碍了多种癌来源细胞系(HT-29结肠，H-292 肺，BxPC3胰腺，JIMT-I乳腺)在注射到裸鼠中时形成肿瘤的能力。这证实了 RON受体酪氨 酸激酶的抑制消极地影响这些癌细胞的增殖，强调了抑制RON在例如结肠癌、肺癌、胰腺癌 和乳腺癌中的应用。使用常规蛋白质印迹和流式细胞术方法，RON显示在许多来自多种癌症的人细胞系中表达结肠(HT-29、Colo205、HCT-116、DLD-I、Sw480、Sw620)、胰腺(BXPC-3、 CAPAN-2、ASPC-I、HPAF-II、L3. 7pl#7、Hs766T)、前列腺(DU_145、PC_3)、胃(AGS、NCI_N87)、 肺(A549、H596)、肝脏(HepG2, SNU-182)以及乳腺(JIMT1，DU4475，AU565)。本领域中对基于包括特异性RON表位在内的RON靶标开发多种疾病特别是癌症的 治疗有着持续的需要。

发明内容
因此，本发明提供了抗RON抗体，相比之前可得到的抗RON抗体，已知其具有基本上更高特异性的结合。可分离和/或纯化所述抗体。本发明的抗体可用于结合RON，不论 是由人群中通常存在的野生型RON等位基因编码的，还是变体RON蛋白质，例如具有小的变 化或突变但是保留RON活性的那些。在一个实施方案中，本发明的抗体是RON特异性的，并 且具有约IXliT9M-1或更低的Kd(即抗原与抗体解离的平衡常数)。在另一些实施方案中， 本发明纯化的抗体显示约IX ICTkT1或者约IX IiT11M-1或者更低的Kd。在另一些实施方案 中，本发明的抗体或其功能性片段本质上完全是人的。本发明提供了例如特异性结合RON蛋白质的抗体，所述蛋白质包含来自于一种或 多种选自下列的抗体可变结构域的互补决定区(CDR) :R0N6 VH,R0N6 VL,R0N8 VH,R0N8 VL 及其组合，其中 R0N6 VHCDR 是 SEQ ID NO 17, SEQ ID N0:19 禾口 SEQ ID NO 21 ；R0N6 VL CDR 是 SEQ ID NO 23, SEQ ID N0:25 禾口 SEQ ID NO 27 ；R0N8 VH CDR 是 SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31 和 SEQ ID NO 33 ；以及 R0N8 VL CDR 是 SEQ ID NO :35，SEQ ID NO 37 和 SEQ ID N0:39。所包含的可变结构域中的每一个可贡献三个CDR。所述抗体可以是例如单克隆抗 体、单链、Fab、Fv、双抗体(diabody)或三抗体(triabody)。在一些实施方案中，所述抗体可包含来自于选自R0N6 VH、R0N6VL、R0N8 VH、R0N8 VL及其组合的至少两个抗体可变结构域的⑶R。更优选地，本发明的抗体包含来自于选自 R0N6 VH、R0N6 VL、R0N8VH、R0N8 VL及其组合的至少三种抗体可变结构域的CDR。在一些 实施方案中，所述抗体是R0N6或R0N8。本发明还提供了编码所述抗体的分离的核酸，以及包含有效连接一个或多个调控 序列的所述核酸的重组载体，所述调控序列允许所述核酸在所选宿主细胞中表达。还提供 了包含所述重组载体的宿主细胞。本发明还提供了产生本发明RON抗体的方法，其包括在允许所述抗体表达的情况 下培养宿主细胞，以及任选地纯化所产生的抗体。本发明还提供了包含本发明抗体以及可药用载体的药物组合物。所述药物组合物 还可包含一种或多种其他治疗有效物质。本文计划包含本发明RON抗体的试剂盒，其中所述RON抗体单独或者与其他物质 (例如化疗剂)组合。还提供了使用本发明抗体的方法，其包括，例如治疗癌症、抑制血管发生、肿瘤生 长、表达RON的肿瘤细胞的迁移、增殖或侵袭的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本发 明抗体或其片段以抑制RON的活化。所述肿瘤细胞是例如来源于结肠、胰腺、前列腺、胃、 肺、肝脏、卵巢、肾、乳腺和脑或者上皮或神经内分泌来源的肿瘤细胞。本发明的方法还包括与抗体一起施用其他物质，例如小有机分子，其中所述其他物质可包括但不限于化疗剂、抗血管发生物质或者抑制RON活化的物质。任选地，所述抗体可以与所述其他物质缀合，例如与小有机分子。本发明抗体可以与至少一种其他抗癌治疗一起施用，例如抗血管发生剂、FGFR3拮 抗剂、化疗剂、放射线、抗肿瘤形成剂，小分子或其他抗体。例如，本发明抗体可以与至少一 种抑制肿瘤的另外的抗体一起施用，例如抗EGFR抗体，例如ErbitUX (Imclone Systems, Inc. NY, NY)。本发明的抗体可靶向或结合野生型RON或者变体RON。本发明的方法还包括检测样品中RON的方法，其包括将所述样品与本发明的抗体 相接触，以获得特异性结合，以及检测此结合。本发明还提供了在需要的哺乳动物中预防或治疗炎症的方法，其包括将有效量的 本发明抗体施用给哺乳动物。本发明还提供了在需要的哺乳动物中预防或治疗疾病的方法，例如肝脏、胆道、胆 管和胆囊疾病，其包括将有效量的本发明抗体施用给哺乳动物。本发明还提供了在需要的哺乳动物中抑制R0N、MAPK和/或Akt磷酸化的方法，其 包括将有效量的本发明抗体施用给哺乳动物。关于上述方法，在一些实施方案中，本发明抗体或其片段可以约1至约10mg/kg的 剂量施用给哺乳动物。在另一些实施方案中，所述抗体或其片段可以约3至约8mg/kg的剂 量施用。附图简述图 IA 显示了 R0N6 VH 区的 DNA(SEQ ID NO 1)和翻译的序列(SEQID N0:2)，其 CDR以单下划线显示。图 IB 显示了 R0N6 VL 区的 DNA(SEQ ID NO :3)和翻译的序列(SEQID N0:4)，其 CDR以单下划线显示。图 IC 显示了 R0N8 VH 区的 DNA(SEQ ID NO :5)和翻译的序列(SEQID N0:6)，其 CDR以单下划线显示。图 ID 显示了 R0N8 VL 区的 DNA(SEQ ID NO :7)和翻译的序列(SEQID N0:8)，其 CDR以单下划线显示。图2A，2B和2C，共同显示完整的R0N6-H(人IgGl亚类I)DNA(SEQID NO :9)和氨 基酸序列(SEQ ID N0:10)。分泌信号序列f翔娘、；可变区(双下划线,除了 CDR结构域
之外)；⑶R结构域(单下划线)；Y恒定区(未修饰)。星号Γ)表示终止密码子。图2D-2E共同显示完整的R0N6-L (人κ轻链亚类III)，DNA (SEQ ID NO 11)和氨
基酸序列(SEQ ID N0:12)。R0N6-L分泌信号序列；可变区(双下划线,除了 CDR 结构域之外):CDR(单下划线)；κ恒定区(未修饰)。图3A-3C共同显示完整的R0N8-H DNA (SEQ ID NO 13)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。分泌信号序列；具有CDR结构域(单下划线)的可变区(双下划线Y恒 定区(未修饰)。星号Γ)表示终止密码子。图 3D-3E 显示完整的 R0N8-L DNA (SEQ ID N0:15)和氨基酸序列(SEQ ID N0:16)。 分泌信号序列可变区(双下戈〗线,除了 CDR结构域之外)，CDR(单下划线)；K恒定区(来修饰)。星号Γ)表示终止密码子。
图4Α和4Β显示在Η-292小鼠异种移植模型中在施用抗RON抗体R0N6 (FIG. 4A) 和R0N8(FIG. 4B)之后肿瘤大小相对于时间的图。该图显示在小鼠异种移植系统中R0N6和 R0N8抗体抑制H-292肿瘤细胞的生长。图4C和4D显示在HT-29小鼠异种移植模型中肿瘤大小相对于时间的图。该图显 示在小鼠异种移植系统中R0N6(图4C)和R0N8(图4C)抗体抑制HT-29肿瘤细胞的生长。图4E显示在BxPC3小鼠异种移植模型中使用单独R0N8抗体、R0N8抗体加 Erbitux (ERB)，单独Erbitux 以及Erbitux 与对照IgGOmigG抗体)的组合的肿 瘤大小相对于时间的图。该图显示在小鼠异种移植系统中单独的R0N8抗体(图4E)抑制 BXPC3肿瘤细胞的生长。该图还显示与Erbitux 组合时，有肿瘤压制或抑制的倾向。图4F显示R0N8抗体在裸鼠中抑制乳腺癌异种移植物的生长。将JIMT-I乳腺癌 细胞皮下注射到裸鼠体内，使之生长至约250mm3。在使用对照(盐水)、R0N8抗体(60mg/ kg, 2x/周)，或者多西他赛或者多西他赛+R0N8抗体的组合治疗过程中对R0N8肿瘤体积作 图。图5A，5B和5C显示蛋白质印迹，其证实了抗RON抗体R0N6和R0N8对MSP诱导磷 酸化的抑制。分别证实R0N6和R0N8抗体抑制RON受体的MSP依赖性活化以及RON受体下游的 信号转导通路的活化。对于图5A，使NIH3T3-R0N细胞饥饿过夜，用所示抗体浓度处理2小 时，然后用IOnM MSP激活10分钟。激活之后，裂解细胞，通过SDS-PAGE分离总细胞裂解物， 用所示抗体进行检测。对于图5B，使H-292细胞饥饿过夜，用所示抗体浓度处理2小时，然 后用IOnM MSP激活10分钟。激活之后，裂解细胞，通过SDS-PAGE分离总细胞裂解物，用所 示抗体进行检测。对于图5C，使HT-29细胞饥饿过夜，用所示抗体浓度处理2小时，然后用 IOnM MSP激活10分钟。激活之后，裂解细胞，通过SDS-PAGE分离总细胞裂解物，用所示抗 体进行检测。图6A显示R0N8抗体的固相阻断特征。使用ELISA来确定阻断重组人RON蛋白质 与固定化重组人MSP相互作用所需的R0N8抗体的IC50值。图6B显示R0N8抗体抑制H596肺癌细胞迁移的能力。图6C显示在BXPC3胰腺癌细胞中R0N8抗体对MSP诱导的DNA合成的抑制。图6C⑴显示测量DNA合成的[3H]胸苷掺入的MSP激活。图6C(2)显示其中在加入MSP之前用R0N8抗体将细胞预处理1小时的体系。发明详述本发明提供了具有用途的抗RON抗体，所述用途例如在诊断目的的用于检测RON 蛋白质的测定中，以及在治疗的目的的抑制RON活性的方法中。另外，本发明抗RON抗体可 以以治疗有效量(例如有效抑制任何和所有表达RON肿瘤细胞生长、增殖、转移活性(即迁 移和/或侵袭)的量)施用给动物，例如哺乳动物如人。本发明还提供包含所公开的抗RON 抗体或其片段的药物组合物。另外，本发明提供了结合人RON受体酪氨酸激酶的完全人抗 体。这些抗体包括但是不局限于举例的R0N6和R0N8以及其活性或功能性片段和衍生物。为清楚说明起见，应理解将靶标蛋白质称为R0N，如上文背景技术部分所详细提供 的，本文中举例的优选抗RON抗体分别称为“R0N6”和“R0N8”。使用筛选过程，从数百个候选抗RON抗体中选择本发明的抗RON抗体。如下文实施例中详细描述地，相对于之前可得到的抗RON抗体，本发明的抗体显示出出人意料地期望的RON结合特征。特别是，新型R0N6 和R0N8抗体具有比之前从噬菌体文库系统中产生的人抗RON抗体RONl高100倍的RON受 体亲和性。特别地，R0N6和R0N8分别以4. 1 X ICT11和3. 2 X IiT11M的Kd结合RON,而RONl 以7. 7X IO-9M的Kd结合RON。RONl是本领域已知抗体的目前名称，其描述于国际专利申请 No. W02005120557，其通过参考并入本文。如本文所提及的，用于本发明方法的本文所公开的CDR序列信息可以“来自于”， 即基于、产生于或者来源于任何和所有可能的抗体可变结构域来源的序列信息，其可包括 野生型或变体形式以及根据本领域技术人员熟悉的方法天然或合成产生的。除非另作说明，本文所指的“肿瘤”一般性旨在包括癌症，以及恶性和非恶性疾病。 如本文所设想的，恶性肿瘤包括原发和继发性肿瘤。原发肿瘤直接在其所发现的组织中出 现。继发性肿瘤或者转移是在身体中别处起源但是目前扩散到远端器官的肿瘤。转移的一 般途径是直接生长进入邻近结构，通过血液或淋巴系统扩散，以及沿着组织平面和身体空 间(腹水、脑脊液等)行进。可包括在可能使用本发明方法治疗的具体癌症或恶性肿瘤类型(原发或继发) 包括但不限于白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰 腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管 癌、肾基底细胞癌、溃疡型和乳突型鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨瘤、尤因肉瘤、网状细胞 肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急 性和慢性淋巴细胞和粒细胞癌、毛状细胞癌、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、 肠神经节瘤、增生性角膜神经癌、马方样体型肿瘤(marfanoid habitus tumor)、胚胎性癌 肉瘤(Wilm' s tumor)、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌瘤、子宫颈非典型增生和原位恶性肿 瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部的皮肤损伤、蕈 样霉菌病、横纹肌肉瘤、皮肤多发性出血性肉瘤、成骨性及其他肉瘤、恶性高血钙症、肾细胞 瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、淋巴瘤、恶性黑色素瘤、表皮样癌以及 其他恶性肿瘤和肉瘤。为清楚起见，还规定在描述中为方便起见使用单数术语不以任何方式作为这样的 限制。因此，例如，提及“抗体”或“肿瘤”包括一个或多个这样的抗体或肿瘤。除非另作说 明，复数术语的使用也不作为限制。本发明的RON特异性抗体或其片段中和RON受体的活化。如本文所使用的，中和 受体表示使所述受体的固有激酶活性灭活以传导信号。对RON中和的可靠测定是受体磷酸 化的抑制。本发明不受到任何特定RON中和机制的限制。例如这些中和可通过抗体阻断某些 表位与配体的接近来进行，或者通过以特定方式改变RON的构象来进行，其中所述配体特 别是MSP即使可结合所述受体，也不能活化所述受体。USP 6，165，464列出了此类中和的多 种可能机制，包括抗体与配体本身结合，抗体下调所述受体，抗体抑制所述受体的酪氨酸激 酶活性，或者抗体引起细胞毒性应答。在表达RON特别是过表达(包括差异表达)RON的细 胞其表面RON受体酪氨酸激酶数目降低时，可发生下调。因此，中和具有多种作用，包括抑 制、减少、灭活和/或破坏生长(增殖和分化)、血管发生(血管募集、侵入和转移)以及细胞运动性和转移(细胞粘附和侵入性)。通过抗RON抗体进行的RON的中和还可包括在没有配体结合时有活性或者结合配体并且并不因此而灭活的变体RON受体酪氨酸激酶的中和。因此，RON中和可包括野生型 和/或变体R0N(点突变、缺失、选择性剪接等)的中和。如本文使用的，术语RON的“变体”任选地包括比野生型RON短或长的RON蛋白质， 任选地包括含有氨基酸取代的类似物。RON变体还可由选择性mRNA剪接或者启示和/或一 个或多个点突变产生。抗RON抗体对RON中和程度的一种可用度量是所述受体酪氨酸激酶活性的抑制。 酪氨酸激酶抑制可以使用公知的方法来确定；例如，通过测定重组激酶受体的自磷酸化水 平，和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，在本发明背景中磷酸化测定可用于测定中和 抗体。例如，可在ELISA测定中或者蛋白质印迹中使用磷酸化酪氨酸特异性的抗体检测磷 酸化。用于酪氨酸激酶活性的一些测定描述于Panek等人，J. Pharmacol. Exp. Thera. 283 1433-44 (1997)和 Batley 等人，Life Sci. 62 143-50 (1998)。RON中和的另一种度量是RON下游底物的磷酸化的抑制。因此，例如可测量MAPK 或Akt的磷酸化水平。天然抗体通常具有两个相同的重链和两个相同的轻链，每个轻链通过链间二硫键 与重链相连，多个二硫键进一步将两条重链彼此连接。各个链可折叠成具有类似尺寸的结 构域(110-125个氨基酸)和结构，但是具有不同功能。轻链可包含一个可变结构域(VL) 和/或一个恒定结构域(CL)。重链也可包含一个可变结构域(VH)和/或根据抗体的类别 或同种型，三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和CH4)。在人中，所述同种型是IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM, IgA和IgG进一步又分为亚类或亚型(IgAl-2和IgG 1-4)。通常，所述可变结构域在不同抗体之间显示相当多的氨基酸顺序可变性，特别是 在抗原结合位点处。在每个VL和VH中发现称为高可变区或者互补决定区(CDR)的三个区 域，其由称为骨架可变区的较少可变的区域所组成(support)。如示例本发明抗体包括IgG单克隆抗体。还设想根据本发明的“抗体”可包括抗 体片段或经改造的形式。例如，这些是Fv片段，或者为了提供替代性结构形式的新发明抗 体优点，其中举例抗体的CDR和/或可变结构域改造为单链抗原结合蛋白，双抗体和/或三 抗体的蛋白质。简言之，由VL和VH结构域组成的抗体的部分称为Fv(可变片段(Fragment variable))并构成抗原结合部位。单链Fv(scFv或SCA)是在一个多肽链上含有VL结构 域和VH结构域的抗体片段，其中一个结构域的N端和另一个结构域的C端通过柔性接头相 连(参见,例如美国专利 No. 4，946，778 (Ladner 等人，)；WO 88/09344，(Huston 等人)。WO 92/01047 (McCafferty等人)描述了 scFv片段在可溶性重组遗传展示包装表面上的展示， 比如噬菌体。用于产生单链抗体的肽接头可以是柔性肽，其选择确保VL和VH结构域发生正确 的三维折叠。所述接头一般为10至50个氨基酸残基。优选地，所述接头为10至30个氨 基酸残基。更优选地，所述接头为12至30个氨基酸残基。最优选的是15至25氨基酸残 基的接头。这些接头肽的实例包括四个甘氨酸的重复之后是丝氨酸。单链抗体缺少其所来源的整个抗体的一些或所有恒定结构域。因此，它们可避免与使用整个抗体相关的一些问题。例如，单链抗体倾向于没有重链恒定区与其他生物分子 之间某些非预期的相互作用。另外，单链抗体显著地小于整个抗体，并且可具有比整个抗体 更强的渗透性，允许单链抗体更有效地定位并结合到靶标抗原结合位点。此外，单链抗体相 对小的尺寸使得它们相比于整个抗体更不容易在接受者中引起非预期的免疫应答。
可通过至少一个或多个肽接头共价连接多个单链抗体，形成可以为单特异性或多 特异性的多价单链抗体，每个单链具有通过第一肽接头共价连接的一个VH和一个VL结构 域。多价单链抗体的每个链包括可变轻链片段和可变重链片段，其通过肽接头与至少一个 其他链相连。肽接头由至少十五个氨基酸残基构成。氨基酸残基的最大个数约为一百。两个单链抗体可以组合形成双抗体，也称为二价二聚体。双抗体具有两条链和两 个结合位点，可以是单特异性或双特异性。双抗体的每条链都包括与VL结构域相连的VH 结构域。所述结构域与接头相连，所述接头短到足以防止相同链上的结构域配对，因此驱动 不同链上的互补结构域之间的配对，产生两个抗原结合位点。简单地举例来说，根据本发明 的双抗体可以是双特异性的，其包含R0N6和R0N8结合结构域。三个单链抗体可以组合形成三抗体，也称为三价的二聚体。使用VL或VH结构域 的氨基端直接与VL或VH结构域的羧基端相融合来构建三抗体，即没有任何接头序列。所 述三抗体具有三个Fv头，其多肽以环状头尾相连形式排列。所述三抗体的可能构象是平面 的，其具有三个位于平面上彼此成120度角度的结合位点。三抗体可以是单特异性、双特异 性或三特异性的。Fab (抗原结合片段(抗原结合段))指由VL、CL、VH、CH1结构域组成的抗体片段。 在简单地用木瓜蛋白酶消化后产生的这些被称为Fab，其没有保留重链绞链区。在用胃蛋白 酶消化后，产生保留重链铰链的多个Fab。具有完整链间二硫键的片段被称为F(ab' )2，而 在不保留二硫键时得到单链Fab'。F(ab' ) 2片段具有比单价Fab片段更高的抗体亲抗原 性。Fc (结晶片段)是包含成对重链恒定结构域的抗体部分或片段的名称。在IgG抗 体中，例如，Fc包含CH2和CH3结构域。IgA或IgM抗体的Fc还包含CH4结构域。Fc与Fc 受体结合、补体介导的细胞毒作用和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的活化相关联。对于作 为多个IgG样蛋白质复合物的例如IgA和IgM的抗体，复合物形成需要Fc恒定结构域。最后，绞链区将抗体的Fab和Fc部分分开，提供了 Fab彼此之间以及相对于Fc的 可动性，以及包括多个二硫键用以两个重链的共价连接。因此，RON特异性抗体包括但不限于天然抗体及其片段。这些片段包括，简单地 举例来说，特异性结合RON的二价片段例如(FaV) 2，单价片段例如Fab，单链抗体，单链 Fv (seFv)，单结构域抗体。优选地，这些片段包括本文所举例的R0N6和/或R0N8抗体的一 个或多个CDR。根据本发明的抗体定义任选地还包括特异性结合RON的经改造抗体，例如特 异性结合所述抗原的多价单链抗体、双抗体、三抗体等。优选地，这些多价经改造抗体包括 本文所举例的R0N6和/或R0N8抗体的一个或多个CDR。本发明抗体的每个结构域可以是具有重链或轻链可变结构域的完整抗体，或者可 以是功能上相同的或者天然结构域的突变体或衍生物，或者构建的合成结构域，例如体外 使用例如WO 93/11236 (Griffiths等人)所述的技术构建。例如，可能将缺少至少一个氨 基酸的对应于抗体可变结构域的结构域连接在一起。重要特征性特点是每个结构域与互补结构域相关联形成抗原结合位点的能力。因此，术语可变重链和轻链片段不应解释为排除不具有对特异性有作用的物质的变体。如本文所使用的，术语“抗体”和“抗体片段”包括保留RON受体特异性的修饰。这 些修饰包括但不限于，与效应分子比如化疗剂(例如顺钼、紫杉醇(taxol)、多柔比星)或细 胞毒素(例如蛋白质或非蛋白质有机化疗剂)缀合。所述抗体可以通过与可检出报告物部 分缀合而修饰。还包括具有下述改变的抗体，所述改变影响了非结合特征比如半衰期(例 如与聚乙二醇聚合物缀合)。蛋白质和非蛋白质物质可以通过本领域已知的方法与所述抗体缀合。缀合方法 包括直接连接、通过共价连接的接头进行连接，以及特异性结合对成员(例如亲和素_生 物素)。这些方法包括，例如，Greenfield 等人，Cancer Research 50，6600-6607 (1990) 所描述的针对多柔比星的缀合，以及Arnon等人，Adv. Exp. Med. Biol. 303，79-90 (1991)和 Kiseleva等人，MolBiol. (USSR) 25，508-514 (1991)所描述的针对钼化合物的缀合。抗体“特异性”指抗体选择性识别抗原的特定表位。术语“表位”包括能够特异性 结合免疫球蛋白或T细胞受体或者与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇一般 由化学活性表面分子组组成，所述分子例如氨基酸或糖类或糖侧链，其一般具有特异性三 维结构特征以及特异性电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，所述 蛋白质与所述相互作用分子(比如抗体)之间所有相互作用点沿着蛋白质的一级氨基酸序 列线性出现。在构象表位中，相互作用点沿着彼此分离的蛋白质上的氨基酸残基出现，即蛋 白质的三级折叠并列的非邻接氨基酸。邻接氨基酸形成的表位通常保持与变性溶剂接触， 而三级折叠形成的表位通常对变性溶剂的处理不起作用。在独特空间构象中表位通常包括至少3个，更通常至少5或8-10个氨基酸。可以 在简单的免疫测定中验证识别相同表位的抗体，其显示一种抗体阻断另一种抗体结合靶抗 原的能力。一旦确定了抗原上的所需表位，就可能产生针对该表位的抗体，例如使用本发明 所述的方法。作为替代地，在发现过程中，抗体的产生和表征可阐明与预期表位有关的信 息。从该信息出发，可能竞争性地筛选结合相同表位的抗体。实现此目的的一种方法是进 行交叉竞争研究，以寻找彼此竞争性结合的抗体，例如竞争结合所述抗原的抗体。表位作图和相关技术为了筛选结合特定表位(例如阻断IgE与其高亲和力受体结合的那些)的 抗体，可进行常规的交叉阻断测定，例如Harlow and Lane, ANTIBODIES (1990) Cold Spring Harbor Laboratory Press中所记载的。其他方法包括丙氨酸扫描突变体，肽 印迹(Reineke，2004Methods Mol Biol248 :443_63)(通过参考以整体并入本文)或 者肽切割分析。另外，可利用比如表位切除、表位提取和抗原化学修饰的方法(Tomer， 2000ProteinScience 9 :487_496，其通过引用以整体并入本文)。功能性分析修饰辅助特征分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也称为基于抗原 结构的抗体特征分析(Antigen Structure-based AntibodyProfiling, ASAP)是根据每 种抗体对化学或酶修饰的抗原表面的结合特征相似性，对抗相同抗原的大量单克隆抗体 (mAb)进行分类的方法(美国专利公开No. 2004/0101920，其通过参考以整体并入本文)。每个类型可反映明显不同于另一种类型所代表的表位，或者与其部分重叠的独特表位。此技术允许快速过滤遗传上相同的抗体，使得表征可集中于遗传上不同的抗体。当应用于杂 交瘤筛选时，MAP可便于鉴定产生具有所需特征的mAb的稀有杂交瘤克隆。MAP可用于将本 发明的R0N6和R0N8抗体分为能够结合不同表位的抗体组。本发明的抗体或其片段可以为单特异性或双特异性。双特异性抗体(BsAb)是具 有两种不同抗原结合特异性或位点的抗体(参见美国专利公开No. 2004/0259156，提交于 2004年2月13日)。在抗体具有超过一种的特异性时，所识别的表位可以与单个抗原或者 与多于一个的抗原相关联。因此，本发明提供了结合两种不同抗原的双特异性抗体或其片 段，其具有至少一种对RON的特异性。可以根据亲和性和/或抗体亲抗原性确定抗体或其片段对RON的特异性。由抗原 与抗体解离的平衡常数(“Kd”)代表的亲和性度量抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合 强度。抗体亲抗原性是抗体和其抗原之间结合强度的度量。抗体亲抗原性涉及表位与所述 抗体上其抗原结合位点之间的亲和性以及所述抗体的价态，所述价态指特定表位的抗原结 合位点的数目。抗体通常以约10_5至约IO-11LAioI (例如KD < IOOnM)的解离常数(Kd)结 合。一般认为任何小于约IO-4LAioI的Kd表示非特异性结合。Kd的值越小，抗原决定簇与 所述抗体结合位点之间的结合强度就越强。RON可分离自多种来源，以产生免疫应答，例如从表达RON的细胞中结肠、胰腺、 前列腺、胃、肺、肝、卵巢、肾、乳腺和脑，以及一般来说在上皮和神经内分泌细胞中。另外，可 使用市售机器以及相应的氨基酸序列获得合成的受体肽。另一种可选方案是可以克隆并表 达编码RON蛋白质的DNA例如cDNA或其片段，回收所得的多肽并用作免疫原来产生本发明 抗体。为了制备对抗抗体的RON蛋白质或其片段，可以将编码RON或其部分尤其细胞外部 分(特别是α和β部份)的核酸分子插入到已知载体，用以使用标准重组DNA方法在宿 主细胞中表达。类似地，可制备抗RON配体特别是MSP的抗体。RON及其配体MSP的序列在GenBank数据库中可公开获取(RON登录号X70040，MSP 登录号NM 020998，其两个引用通过参考并入本文)，并且其可容易地用于抗体制备。还可 产生针对RON或MSP变体/突变体的抗体。对于针对变体和突变体细胞外结构域上存在的 表位的抗体很感兴趣。差别在于细胞外结构域框内(inframe)缺失109个氨基酸的改变的 RON受体已显示为组成型活化(1)。例如可以产生抗这些改变的RON受体的抗体。可以通过用RON免疫哺乳动物来制备RON特异性抗体。所述可溶性受体自身可用 作免疫原，或者与载体蛋白或其他物体比如珠即s印harose珠相连接。在所述哺乳动物产 生抗体之后，分离抗体产生细胞的混合物，例如脾细胞。可通过从所述混合物中分离单独的 抗体产生细胞并通过例如将其与肿瘤细胞比如骨髓瘤细胞融合使之永生化来产生单克隆 抗体。在培养物中保存所得杂交瘤，表达单克隆抗体，所述抗体从培养基中收获。另外，通过标准杂交瘤技术，使用产生人免疫球蛋白重链和轻链的转基因小鼠获 得本发明的抗体和抗体片段(Harlow & Lane，ed. , ANTIBODIES :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor，211-213 (1998)，其通过参考并入本文)在一个优选实施方案中，将产 生人抗体的基因组的实质部分插入小鼠基因组，使得内源小鼠抗体的生产不足。可以使用 完全弗氏佐剂中的RON皮下(s. c.)免疫这些小鼠。本发明的抗体可以与另外的氨基酸残 基融合。这些氨基酸残基可以是肽标签，可能便于分离。还可考虑其他使得所述抗体归巢到具体器官或组织的氨基酸残基。
根据本发明的抗RON抗体可以从噬菌体展示文库中分离，例如从人重链和轻链可 变区基因构建的文库。例如，本发明的可变结构域可获得自外周血淋巴细胞，其含有重排的 可变区基因。作为替代地，可变结构域部分，例如CDR和FW区域，可获得自不同的人序列。RON特异性抗体以优选约1 X IO-9M-1或更低，更优选约1 X ICTkT1或更低，最优选 约1 X IO-11M-1或更低的Kd结合RON。RON特异性的抗体或其片段抑制所述受体的活化。抑制受体表示阻止所述受体固 有激酶活性的活化从而传导信号。对RON的可靠测定是受体磷酸化的抑制。本发明不受到任何特定RON抑制机制的限制。例如这些抑制可通过抗体阻断某 些表位与配体的接近来进行，或者通过以下述方式改变RON的构象来进行，所述方式使得 所述配体特别是MSP即使可结合所述受体，也不能活化所述受体。USP6，165，464列出了此 类抑制的多种可能机制，包括与配体本身结合，调所述受体，抑制所述受体的酪氨酸激酶活 性，或者引起细胞毒性应答。在表达RON特别是过表达(包括差异表达)RON的细胞其表面 RON受体酪氨酸激酶数目降低时，可发生下调。本发明的抗体还可下调在肿瘤细胞侵袭和转 移中具有功能的基质金属蛋白酶。RON抑制具有多种作用，包括抑制、减少、灭活和/或破坏生长(增殖和分化)、血 管发生(血管募集、侵入和转移)以及细胞运动性和转移(细胞粘附和侵入性)。本发明还设想结合并灭活变体或突变体RON受体酪氨酸激酶的抗体，所述受体酪 氨酸激酶在没有配体结合时有活性。患有RON相关疾病的哺乳动物可以，例如，同时表达野 生型和变体R0N，具有不成比例的所表达变体受体量。对差别在于细胞外结构域的变体/突 变体序列感兴趣，例如具有细胞外结构域内缺失的那些，如Wang所公开的(1)(9)。因此， RON抑制可包括野生型和/或变体R0N(点突变、缺失、选择性剪接等)。RON活化可通过二聚化和使用其他RTK例如c-met或EGFR的活化进行。因此，RON 抑制还可包括RON及其他受体酪氨酸激酶(RTK)例如EGFR或c-met之间的异二聚化的抑 制。这些抑制还可包括通过例如形成RON和EGF或c-met的异二聚体抑制信号发放。这些 二聚化还可以配体依赖性方式诱导，例如通过MSP、HGF或EGF与其受体结合并诱导二聚化。抗RON抗体对RON中和程度的一种可用度量是所述受体酪氨酸激酶活性的抑制。 酪氨酸激酶抑制可以使用公知的方法来确定；例如，通过测定重组激酶受体的自磷酸化水 平和/或天然或合成底物的磷酸化。因此，在本发明背景中磷酸化测定可用于测定抑制抗 体。例如，可在ELISA测定中或者蛋白质印迹中使用磷酸化酪氨酸特异性的抗体检测磷 酸化。用于酪氨酸激酶活性的一些测定描述于Panek等人，J. Pharmacol. Exp. Them. 283 1433-44(1997)和 Batley 等人，Life Sd. 62 143-50 (1998) [52]。另外，可利用检测蛋白质 表达的方法来确定RON抑制。这些方法包括用以检测蛋白质表达的免疫组织化学(IHC)、用 于检测基因扩增的荧光原位杂交(FISH)、竞争性放射性配体结合测定、固体基质印迹方法 例如Northern和Southern印迹、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)和ELISA。RON抑制的另一种度量包括RON下游底物的磷酸化水平。因此，例如可测量MAPK 或Akt的磷酸化水平。在一个实施方案中，将具有本发明抗体的一个、两个、三个、四个、五个或全部六个 互补决定区(CDR)的RON特异性抗体施用给哺乳动物。在另一个实施方案中，所施用的抗体具有本发明抗体的可变区。图2A-2E提供了本发明抗体的序列。不受理论的限制，认为 R0N6和R0N8结合RON的β细胞外结构域，但是此特异性也可通过结合RON的其他结构域 或者通过结合相同结构域中的不同表位产生。根据本发明分离的R0N6和R0N8抗体的CDR 包括R0N6VH CDRl GGTFSSDAIT (SEQ ID NO 17)GGA GGC ACC TTC AGC AGC GAT GCT ATC ACC (SEQ ID NO 18)CDR2 GIIPILGMANYAGGG ATC ATC CCT ATC CTT GGT ATG GCA AAC TAC GCAQKFQG(SEQ ID NO 19)CAG AAG TTC CAG GGC(SEQ ID NO 20)CDR3 VADYYGLGTGTG GCC GAT TAC TAT GGT TTG GGG ACTYYffYFDL(SEQ ID NO 21)TAC TAC TGG TAC TTC GAT CTC(SEQ ID NO 22)R0N6VLCDRl RASQSVSAGG GCC AGT CAG AGT GTT AGCSSYLA(SEQ ID NO 23)AGC AGC TAC TTA GCC(SEQ ID NO 24)CDR2 GASSffAT(SEQ ID NO 25)GGT GCA TCC AGC TGG GCC ACT(SEQ ID NO 26)CDR3 QQYGSSPLT(SEQ ID NO 27)CAG CAA TAT GGT AGC TCA CCT CTC ACT(SEQ ID NO 28)R0N8VHCDRl GFTFSSYLMT (SEQ ID NO 29)GGA TTC ACC TTT AGT AGT TAT TTA ATG ACC (SEQ ID NO 30)CDR2 NIKQDGSEKYAAC ATA AAG CAA GAT GGA AGT GAG AAA TACYVDSVKG(SEQ ID NO 31)TAT GTG GAC TCT GTG AAG GGC(SEQ ID NO 32)CDR3 DGYSSGRGAT GGC TAT AGT TCG GGG AGAHYGMDV(SEQ ID NO 33)CAC TAC GGT ATG GAC GTC(SEQ ID NO 34)R0N8VLCDRl RASQSVSAGG GCC AGT CAG AGT GTT AGCRYLA(SEQ ID NO 35)
AGA TAC TTA GCC(SEQ ID NO 36)CDR2 DASNRAT(SEQ ID NO 37)GAT GCA TCC AAC AGG GCC ACT(SEQ ID NO 38)
CDR3 QQRSNffPRT (SEQ ID NO 39)CAG CAG CGT AGC AAC TGG CCT CGG ACG (SEQ ID NO 40)RON特异性抗体和抗体片段的功能性变体还包括具有基本类似于本发明抗体可变 区或高可变区氨基酸序列的氨基酸序列的多肽。基本上相同的氨基酸序列在本文中定义 为与所比较氨基酸序列有至少70%，优选至少约80%，更优选至少约90%同源性，如根据 Pearson 和 Lipman，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，2444-2448 (1988)的 FASTA 检索方法所 确定的，包括至少约70 %，优选至少约80 %，更优选至少约90 %，95 %或99 %以及其中所有 子范围相同的序列。这些抗体会具有与具有基本上相同CDR的本发明抗体相同或类似的结 合、配体阻断和受体抑制活性。RON特异性抗体和抗体片段的变体还包括具有一个或多个保守氨基酸取代的抗 体。保守氨基酸取代定义为通过改变肽、多肽或蛋白质或其片段的一个、两个或更多氨基酸 对氨基酸组成的改变。所述取代是具有一般性类似性能的氨基酸(例如酸性、碱性、芳香 族、尺寸、带正电或带负电、极性、非极性)的取代，使得所述取代基本上不改变肽、多肽或 蛋白质的特征(例如电荷、等电点、亲和性、抗体亲抗原性、构象、溶解度)或活性。对于保 守氨基酸取代可进行的典型取代可以是如下所述氨基酸组中的甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、 缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；丙氨酸(A)、丝氨酸 (S)和苏氨酸(T)；组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)；天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；苯 丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。保守的氨基酸取代可以在例如主要负责所述分子选择性和/或特异性结合特征 的高可变区侧翼区域中，以及所述分子的其他部分例如可变重链盒中进行。抗体或其片段还包括通过正突变、亲和性成熟方法、噬菌体展示或者链更替 (chain shuffling)改善结合特征的那些。可通过突变CDR和/或FW残基并筛选具有所需特征的抗原结合位点来修饰或改 善亲和性和特异性(参见，例如Yang等人，J. Mol. Biol.，(1995) 254 :392_403)。一种方式 是将各个残基或残基组合随机化，使得在其他相同的抗原结合位点的群体中，二至二十个 氨基酸的子集存在于特定位置上。作为替代地，可以通过易错PCR方法在残基范围内诱导 突变(参见例如Hawkins等人，J. Mol. Biol, (1992)226:889-96)。在另一个实施例中，含 有重链和轻链可变区基因的噬菌体展示载体可以在大肠杆菌突变体菌株中扩增(参见，例 如Low等人，J. Mol. Biol.，(1996) 250 :359_68)。这些诱变方法是本领域技术人员已知的 许多方法的示例。增加本发明抗体亲和性的另一种方式是进行链更替，其中重链或轻链与其他重链 或轻链随机配对，产生具有更高亲和性的抗体。所述抗体的多个CDR也可由其他抗体中的 对应CDR更替。另外，本发明提供了编码本发明抗体或其片段的分离多核苷酸，以及包含与表达 序列有效连接的这些多核苷酸序列的表达载体。这些核苷酸列于

图1A-1D，2A-2E和3A-3E。 还提供了包含一个或多个表达本发明抗体或其片段的表达载体的重组宿主细胞。还提供了产生抗体或其片段的方法，其包括在允许所述抗体或其片段表达的条件下培养这些细胞。然后，可从所述细胞或细胞培养基中纯化所述抗体或其片段。所述核苷酸的变体列于图1A-1D，2A_2E和3A-3E，包括编码具有与本发明抗体相 同功能的抗体或抗体片段的那些，即阻断或抑制RON活化。这些变体具有与野生型RON至 少约70%、优选至少约80%，更优选至少约90%相同。本发明还提供了抗体融合蛋白质。 这些融合蛋白质可以由图1A-1D，2A-2E和3A-3E的核苷酸序列编码，其已有效连接编码酶、 荧光蛋白质、多肽标签或发光标记物和/或其组合的核苷酸序列。本发明的核苷酸序列还包括(a)图1A-1D，2A-2E和3A-3E所示的抗体DNA序列； (b)任何(i)与(a)中所示核苷酸序列的互补序列在严格条件下杂交的核苷酸序列，例如在 65摄氏度下0. 5M NaHP04、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、lmM EDTA中的滤器结合DNA杂交，并 在 68 摄氏度下 0. lxSSC/0. SDS 中洗涤(Ausubel F. M.等人编，1989，CURRENIPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY，第 I 卷，Green PublishingAssociates, Inc. ， and John Wiley & sons, Inc.，New York，在第2. 10. 3页)和(ii)编码具有基本上相同功能的抗体或抗体片 段的核苷酸序列；以及(c)任何在较低严格条件下与编码图2A-2E和3A-3E中所示抗体序 列的DNA序列杂交的核苷酸序列，例如中度严格的条件下，如在42摄氏度下0. 2xSSC/0. 1 % SDS中洗涤(Ausubel等人，1989见上文)，但其仍编码具有基本上相同功能的抗体或抗体片 段。本发明抗体的功能是阻断RON活化。本发明还提供了含有与调控序列有效连接的编码本发明抗体或其片段之核酸的 表达载体，以及含有此表达载体的宿主细胞。这些宿主细胞可以在允许本发明抗体或其片 段表达的特定条件下培养，然后可从所述宿主细胞中纯化所述抗体。使用标准重组方法和已知表达载体表达本发明抗体。在细菌尤其是大肠杆菌中 表达蛋白质的载体是已知的。这些载体包括PATH载体，其由Dieckmarm and Tzagoloff 在J. Biol. Chem. 260,1513-1520(1985)中描述。这些载体含有编码邻氨基苯甲酸合成 酶(TrpE)随后是位于羧基端的多接头的DNA序列。其他表达载体系统基于β半乳糖苷 酶(ρΕΧ) ； λ PL;麦芽糖结合蛋白(pMAL)；和谷胱甘肽S转移酶(pGST)。参见Gene 67， 31(1988)和 P印tide Research 3，167 (1990)。有可用于酵母中的载体。合适的例子有2D质粒。在哺乳动物细胞中表达的合适 载体也是已知的。这些载体包括公知的SV40衍生物、腺病毒、逆转录病毒来源的DNA序列， 以及来源于功能性哺乳动物载体的组合的穿梭载体，例如上文所述的那些，以及功能性质 粒和噬菌体DNA。其他的真核表达载体是本领域已知的H^0nP.J.Southern*P.Berg，J.Mol Appl. Genet. 1,327-341(1982) ；S. Subramani 等人，Mol. Cell. Biol. 1,854-864(1981)； R. J. Kaufmann 禾口 P.A.Sharp, “ Amplification andExpression Of Sequences Cotransfected with A Modular DihydrofolateReductase Complementary DNA Gene，〃 J. Mol. Biol. 159，601-621 (1982) ；R. J. Kaufmann 和 P. A. Sharp，〃 Amplification and Expression OfSequences Cotransfected with A Modular Dihydrofolate ReductaseComplementary DNA Gene, “ J. Mol. Biol. 159，601-664 (1982) ;S. I. Scahill 等人’ "Expression and Characterization Of the Product Of A HumanImmune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells, " Proc. Natl. Acad. Sci. USA80，4654-4659(1983) ；G. Urlaub 和 L. A. Chasin, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 77，4216-4220， (1980))。可用于本发明的表达载体含有至少一个表达调控序列，其与待表达的DNA序列或 片段有效连接。在所述载体中插入所述调控序列是为了调控和调节所克隆的DNA序列的表 达。可用表达调控序列的实例有Iac体系、trp体系、tac体系、trc体系、λ噬菌体的主 要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区域、酵母的糖酵解启动子，例如3-磷酸甘油酯 激酶启动子、酵母酸性磷酸酶启动子，例如Pho5，酵母α接合因子(alphamating factor) 启动子，以及来源于多瘤(Ployoma)、腺病毒、逆转录病毒和猿病毒的启动子，例如SV40早 期和晚期启动子，以及已知控制原核或真核细胞以及其病毒或其组合的基因表达的其他序 列。考虑载体(重组和表达载体)用于本文所提供的用途。例如，将含有调控信号和待表达DNA的表达载体，例如编码本发明抗体或其抗体片段的那些，插入到宿主细胞用以表 达。一些可用表达宿主细胞包括公知的原核和真核细胞。一些合适的原核宿主包括，例如 大肠杆菌，如大肠杆菌SG-936，大肠杆菌HB 101，大肠杆菌W3110，大肠杆菌X1776，大肠杆 菌X2282，大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRCl，假单胞菌(Pseudomonas)，芽孢杆菌(Bacillus) 例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及链霉菌(Str印tomyces)。合适的真核细胞包 括酵母及其他真菌、昆虫、动物细胞，例如COS细胞，淋巴系统来源的细胞系例如淋巴瘤、骨 髓瘤(例如NS0)和CHO细胞，人细胞和组织培养物中的植物细胞。提供了产生抗体的方法。该方法包括在允许所包含多肽表达的条件下培养包含合 适表达载体的所述宿主细胞，其中所述表达载体包含一个或多个编码多肽的核酸分子，所 述多肽例如此类抗体的重链或轻链，或者其片段或经改造变体。在合适培养基中维持的宿 主细胞中表达后，可从所述培养基中分离所表达的多肽，通过本领域已知的方法纯化。如果 所述多肽或肽不是分泌进培养基的话，则在分离和纯化前先裂解所述宿主细胞。纯化的抗 体是已经鉴定并从其天然环境组成中分离和/或回收的抗体。其天然环境的杂质组分是干 扰所述抗体诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质溶质，一般 已经被除去。因此，例如，根据本发明的单克隆抗体由通过常规免疫球蛋白纯化步骤分离 或纯化自培养基或腹水的亚克隆分泌，所述步骤例如A蛋白-S印harose、羟基磷灰石 (hydrolyapatite)层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析。在另一个实施方案中，本发明的RON特异性抗体通过表达一种或多种编码轻链和 /或重链的核酸来产生，或者通过在转基因动物中包含所述抗体使得抗体表达并可回收的 类似方式产生。例如，所述抗体可以有助于回收和纯化的组织特异性方式表达。在一个这样 的实施方案中，本发明的抗体在乳腺中表达，从而在泌乳时分泌。转基因动物包括但不限于 小鼠、山羊和兔。也可使用任何其他本领域已知的转基因体系，例如在鸟类卵(例如鸡蛋) 的卵清中表达。本发明提供了包含本发明抗RON抗体的药物组合物。在一个实施方案中，所述组 合物可包含一种或多种本文举例的R0N6和/或R0N8抗RON抗体。应理解本发明的抗RON 抗体在以预防或治疗目的用于哺乳动物时以另外包含可药用载体的组合物的形式施用。合 适的可药用载体包括例如下列一种或多种水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等以及其组合。可药用载体还可包含少量的辅助物质例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲 齐IJ，其提高了结合蛋白质的保存期限或有效性。注射用组合物可以如本领域中所公知的配 制成在施用到哺乳动物后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。本文使用的“载体”包括可药用载体、赋形剂或稳定剂，其在所使用的剂量和浓度 下对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理可接受载体是水性PH缓冲溶液。生 理可接受载体的实例包括缓冲液例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括维生 素C;低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲 水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸； 单糖、二糖及其他糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA ；糖醇例如甘露醇或山 梨醇；成盐平衡离子例如钠；和/或非离子型表面活性剂例如吐温，聚乙二醇(PEG)和普罗 尼克。所述活性成分还可装入制备的微胶囊中，例如通过界面聚合制备，如羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶体药物递送体系(例如脂质 体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或者在大乳剂中。用于体内施用的制剂 必须是无菌的。这易于通过滤过除菌膜的过滤来实现。也可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有所述抗体的固体疏水 聚合物半透性基质，所述基质是成型制品的形式，例如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包 括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利 No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸、乙酯的共聚物，非降解乙烯-醋酸乙烯酯，可降 解乳酸-乙醇酸共聚物例如IAJPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙 瑞林构成的可注射微球)，以及聚-D- (-) -3"羟基丁酸。例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸乙醇 酸的聚合物实现超过100天的分子释放，而某些水凝胶以更长的时期释放蛋白质。当包装的抗体在体内长时间保持时，它们可能由于在37摄氏度下暴露于潮湿而 变性或聚集，导致生物活性损失以及免疫原性可能发生变化。可以根据所涉及机制来设计 合理的策略使其稳定。例如，如果发现聚集机制在分子间的话。通过巯基-二硫互换形成S-S键，可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含 水量、使用合适添加剂以及开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。本发明提供了治疗方法，包括将有效量的RON特异性抗体或其片段作为单独治疗 或者与其他治疗选择组合地施用给所需哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。 这些抗体可包括由多种方法获得的嵌合、人源化、鼠、兔和人抗体。在另一个实施方案中，所 施用的抗体是人抗体。在另一个实施方案中，所述抗体包括R0N6或R0N8的至少单个CDR 序列。可使用这些方法的疾病包括表达RON的肿瘤、炎症疾病、增生疾病以及肝脏、胆道、胆 管、胆囊和相关肝胆系统的疾病。如本文所讨论的，设想本发明抗RON抗体可用于作为单独治疗和/或与其他治疗 剂联合治疗任何病理状况，包括但不限于肿瘤或非肿瘤病症。还设想，在针对某些病症的治 疗中，例如癌症，所述抗体可作为第一线治疗策略(例如作为在新诊断的癌症患者中的第 一阶段治疗)或者作为第二线治疗策略(例如治疗之前已经使用其他物质进行了治疗但是 没有对所述第一物质产生反应或者已对其产生抗性的癌症患者)单独或联合其他治疗剂 一起使用。
治疗意为任何对哺乳动物中疾病的治疗，包括(1)在倾向于发生但未发生或显 示所述疾病症状的哺乳动物中预防疾病发生；例如预防临床症状的发作；(2)抑制所述疾 病，例如停止其发展；或者(3)减轻所述疾病，例如造成所述疾病症状的减轻。在本发明的方法中，将治疗有效量的本发明抗体施用给所需哺乳动物。如本文所 使用的术语“施用”意为通过可实现所要结果的任何方法将本发明抗体递送至哺乳动物。它 们可以例如静脉内或肌内注射施用。尽管本发明的人抗体特别可用于施用给人，但是它们 也可施用给其他哺乳动物。本文使用的术语“哺乳动物”旨在包括但不限于人、实验动物、 家庭宠物和家畜。“治疗有效量”指在施用给哺乳动物时有效产生所需治疗作用例如抑制激 酶活性或抑制肿瘤生长的本发明抗体的量。 本发明抗RON抗体可以足以防止、抑制或减少肿瘤或病症状况发展的量施用以治 疗患有肿瘤或血管发生相关病理状况的患者。发展包括，例如肿瘤或病理状况的生长、侵 袭、转移和/或复发。足以实现此的量被称为治疗有效剂量。对于该用途有效的量取决于 所述疾病的严重程度以及患者自身免疫系统的综合状态。剂量时间表也会随着疾病状态和 病人状况的变化而变化，通常的范围为从单剂快速浓注或连续输注到每天多次施用(例如 每4-6小时)，或者由治疗的医生和患者状况所指示。但是，应指出本发明不限于任何特定 的剂量。本发明抗体的合适剂量可以根据本发明显示的体内数据来确定。体内实验使用约 每隔两天lmg/20g的剂量。平均小鼠为约0. 02Kg，其体积为约0. 008m2。平均人为约70Kg，其 体积为约1. 85m2。约200mg/m2的剂量对应于约40mg/Kg进入小鼠，在人中大致为约2. 6mg/ Kg。为了显示该剂量，以每周一剂施用另一种抗体ErbitUX ，约250mg/m2，其在人中为约 6. 5mg/Kg。根据这些计算和实验，施用给人的剂量为优选约1至约10mg/Kg，更优选约3至 8mg/Kg (每周一剂)。所述剂量可以类似于Erbitux ,例如约6至约7mg/Kg。本发明的一个实施方案设想使用本发明抗体对RON的体内抑制肿瘤生长。如图4D 所示，RON抗体抑制裸鼠皮下生长的HT-29细胞。在多个实施方案中，肿瘤生长抑制至少约 20%或者至少约40%。图4D显示在40天的时间段中HT-29肿瘤生长减少50-60%。根据本发明的抗RON抗体可在多个实施方案中阻断至少约60 %、约80 %或约 100% 的 MSP 诱导的 RON、MAPK 和 AKT 的磷酸化(例如 HT-29，Colo205, AGS 和 DU145)。在 图5A中，泳道1和3的条带几乎相同，显示这些完全的磷酸化阻断。MAPK和AKT的磷酸化 被认为对于细胞增殖(细胞个数随时间增加)、迁移(细胞朝向物质，特别是MSP，的运动， 即化学_吸引)、侵袭(穿过新组织移动的能力)以及存活来说非常重要。在RON抗体和 10%血清存在下可以抑制约20%至约30%或者约25%的贴壁HT-29和Colo205细胞的增 殖。另外，当HT-29和Colo205在RON抗体和10%血清存在下在软琼脂中生长时，可以抑 制对于HT-29约60%至约80%更常见为约75%的集落形成，对于Colo205为约50%至约 70 %更常见约60 %的集落形成。本发明基于下列观测结果RON特异性抗体可抑制软琼脂中癌细胞的生长，并且 抑制在细胞培养条件下作为贴壁细胞生长时的增殖。RON抗体可显著地阻碍癌细胞系在注 射到裸鼠中时形成肿瘤的能力，其证明RON受体酪氨酸激酶的抑制消极影响结肠癌细胞的增殖。使用常规蛋白质印迹和流式细胞术方法，已经发现RON在许多人肿瘤细胞系中表达结肠(HT-29、Colo205、HCT-116、DLD-I、Sw480、Sw620)、胰腺(BXPC-3、CAPAN_2、ASPC_I、 HPAF-II、L3. 7pl#7、Hs766T)、前列腺(DU-145、PC-3)、胃(AGS、NCI-N87)、肺(A549、H596)、 肝脏0fepG2、SNU-182)和乳腺(JIMT1、DU4475、AU565)。因此，来源于多种细胞类型的肿瘤 是RON抗体的治疗靶标。 待治疗的肿瘤包括原发肿瘤和转移肿瘤，以及难治肿瘤。难治肿瘤包括对使用单 独的化疗剂、单独的抗体、单独的放射或其组合的治疗没有反应或者有抗性的肿瘤。难治肿 瘤还涵盖了使用这些物质的治疗似乎对其抑制但是停止治疗后至多五年，有时至多十年或 更长时间复发的肿瘤。可治疗的肿瘤包括非血管化或者基本上尚未血管化以及血管化的肿瘤。可治疗的 实体肿瘤的实例包括乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤和淋巴瘤。这些肿瘤 的一些实例包括表皮样肿瘤、鳞状肿瘤，例如头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌 包括小细胞和非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌和肝癌。其他实例包括卡波西肉瘤 (Kaposi' s sarcoma)、CNS肿瘤、神经母细胞瘤、毛细管成血管细胞瘤、脑脊膜瘤和脑转移、 黑素瘤、胃肠和肾癌及肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性胶质瘤，优选多形性成胶质细胞瘤和平滑肌 肉瘤。特定治疗关注的有结肠、胰腺、前列腺、胃、肺和肝癌，但是本文设想任何和所有在 其中施用本发明抗体可得到治疗益处的病理状况形式，包括肿瘤和非肿瘤疾病，都包括在 本发明的范围内。所述病理状况可容易地由本领域技术人员在本文提供的教导下确定。因此，人抗RON抗体可以有效治疗患有血管化肿瘤或赘生物或者血管发生疾病的 对象。这些肿瘤和赘生物包括，例如，恶性肿瘤和赘生物，比如胚细胞瘤、癌或肉瘤，以及高 度血管化的肿瘤和赘生物。可通过本发明方法治疗的癌症包括，例如，膀胱、肾上腺、睾丸、 CNS和外周神经系统、脑、泌尿生殖道、淋巴系统、胃、肾系统、结肠、喉、肺和骨的癌症。这些 肿瘤的非限制性实例包括表皮样肿瘤、鳞状肿瘤，例如头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺 癌、肺癌包括肺腺癌和小细胞和非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、卵巢癌和肝癌。所述方法 还可用于治疗血管化皮肤癌，包括鳞状细胞癌、基底细胞癌和可通过抑制恶性角质形成细 胞(例如人恶性角质形成细胞)生长来治疗的皮肤癌。其他可治疗的癌症包括上皮细胞 间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)、卡波西肉瘤、CNS 月中瘤(神 经母细胞瘤、毛细管成血管细胞瘤、脑脊膜瘤和脑转移)、黑素瘤、胃肠和肾癌包括肾乳头状 癌，及肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性胶质瘤包括多形性成胶质细胞瘤和平滑肌肉瘤。在本发明的另一个方面中，所述抗RON抗体抑制肿瘤相关的血管发生。受体酪氨 酸激酶对血管内皮细胞的刺激与肿瘤血管化相关。通常，以旁分泌形式刺激血管内皮。施用抗RON抗体包括单一治疗。在其他一些考虑的实施方案中，可包括组合治疗， 其中所述抗RON抗体与抗肿瘤剂或其他对抗给定病理状况的活性物质组合施用。抗肿瘤剂可以与RON抗体分开施用或者作为缀合物施用。目前在本领域中已知或 者正在评价的所述抗肿瘤剂可分为多个类型，包括例如有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢 齐U、嵌入型抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生 体应答修饰物质、抗激素剂和抗血管发生剂。根据本发明的“小有机分子”定义为常规抗肿瘤剂，例如不是相对大的生物分子， 例如抗体或核酸。例如，许多已知的抗肿瘤剂是小有机分子，比如所述拓扑异构酶抑制剂等等。因此，本发明的实施方案任选地包括其中拓扑异构酶抑制剂与结合RON的抗体联合施用的方法。所述抑制剂可以是拓扑异构酶I或拓扑异构酶II的抑制剂。拓扑异构酶I抑 制剂包括伊立替康(CPT-II)、氨基喜树碱、喜树碱、DX-8951f、拓扑替康。拓扑异构酶II抑 制剂包括依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)。其他物质目前正在评价作为抗肿瘤剂的 拓扑异构酶抑制活性和有效性。任选地与本发明抗体共施用的其他小有机分子抗肿瘤剂或 化疗剂，可以是烷化剂或抗代谢剂。烷化剂的实例包括但不限于顺钼、环磷酰胺、美法仑和 达卡巴嗪。另外的小有机分子包括细胞毒剂和/或化疗剂比如紫杉醇、多柔比星、放线菌 素D、甲氨蝶呤、吉西他滨、奥钼(oxyplatin)、氟尿嘧啶(5-FU)、leucourin (LU)、顺钼、伊立 替康(CPT-II)、紫杉酚(paclitaxel)、多西他赛、长春碱、埃博霉素、顺钼/卡钼和聚乙二 醇化的阿霉素。小有机分子可以组合施用，比如(CPT-II ；5-FU ；LU)；(紫杉酚；5-FU)；和 (CPT-II ；5-FU ；LU)。所述抗肿瘤剂也包括放射线。当所述抗肿瘤剂是放射线时，所述放射线的来源可 以是在待治疗患者的外部(外粒子束放射疗法(external beamradiation therapy-EBRT)) 或者内部(近距离放射治疗(brachytherapy-BT))。所施用的抗肿瘤剂的剂量取决于多个 因素，包括例如药剂类型、待治疗肿瘤类型和严重程度以及所述药剂的施用途径。然而应强 调本发明不限于任何特定的剂量。放射线可以与其他抗肿瘤剂联用。在本发明的另一个方面中，抗RON抗体或抗体片段可以与抗肿瘤剂或可检出信号 产生物质化学地或生物合成地相连，特别是在所述抗体被内化时。与抗体相连的抗肿瘤剂 包括任何破坏或损伤所述抗体已结合或者在所述抗体已结合的细胞环境中的肿瘤的药剂。 例如，抗肿瘤剂是毒剂，比如化疗剂或放射性同位素。合适的化疗剂是本领域技术人员已 知的，包括蒽环类(例如道诺霉素和多柔比星)、甲氨蝶呤、长春地辛、新制癌菌素、顺钼、苯 丁酸氮芥、阿糖胞苷、5-氟尿苷、美法仑、篦麻毒素和卡奇霉素(calicheamicin)。所述化 疗剂使用常规方法与所述抗体缀合(参见例如，Hermentin and Seller, Behring Inst. Mitt. 82 197-215(1988))οRON抗体还可与放射性同位素一起施用给癌症患者。用作抗肿瘤剂的合适放射性 同位素也是本领域技术人员已知的。例如，可使用1311或21IAt。这些同位素使用常规方 法与所述抗体连接(参见例如Pedley等人，Br. J. Cancer 68，69_73 (1993))。作为替代地， 与所述抗体相连的抗肿瘤剂是酶，其活化前药，这样一旦施用所述抗体复合物，施用的前药 保持非活性形式直至它到达肿瘤部位，在那里它转变为细胞毒性形式。实践中，将抗体-酶 缀合物施用给患者，使之定位于待治疗组织的区域。然后，将前药物施用给患者，使得在待 治疗组织的区域转变为细胞毒性药物。作为替代地，与所述抗体缀合的所述抗肿瘤剂是细 胞因子例如白细胞介素_2 (IL-2)、白细胞介素-4 (IL-4)或者肿瘤坏死因子α (TNF- α )。所 述抗体使得细胞因子靶向到所述肿瘤，以致所述细胞因子介导所述肿瘤的损伤或破坏，而 不影响其他组织。使用常规重组DNA方法将所述细胞因子在DNA水平上与所述抗体融合。 也可使用干扰素。本发明还提供了在哺乳动物中治疗非癌症增生性疾病的方法，其包括向所述哺乳 动物施用有效量的本发明抗体。如本文所公开的，“增生性疾病”定义为由表达RON家族受 体成员的非癌症细胞过度长大引起的病症。由增生性疾病产生的过量细胞表达正常水平的 RON,或者它们可过表达RON。
可根据本发明治疗的增生性疾病的类型为任何由RON配体或此类配体突变体激 活的增生性疾病。增生性疾病的实例包括银屑病、光化性角化病和皮脂溢角化病、疣、瘢痕 和湿疹。还包括由病毒感染例如乳头状瘤病毒感染造成的增生性疾病。例如，银屑病有许 多不同的变化和不同的严重程度。不同类型的银屑病显示例如脓样水泡(脓疱性银屑病)、 严重皮肤掉皮(红皮病型银屑病)、滴样斑点(滴型银屑病)以及平滑炎症病变(反向银屑 病)。本发明设想治疗所有类型的银屑病(例如寻常银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑 病、关节病性银屑病、类银屑病、掌跖脓疱病)。 对于增生性疾病的治疗，如上所述的本发明抗体的施用可与任何常规治疗剂的施 用组合。例如，当所述增生性疾病是银屑病时，有多种常规全身性和局部药剂可用。银屑病 的全身性药剂包括甲氨蝶呤和口服类视黄醇例如阿维A、阿维A酯和异维A酸。银屑病的 其他全身性治疗包括羟基脲、NSAIDS、柳氮磺吡啶和6-巯基鸟嘌呤。抗生素和抗菌剂可用 于治疗或预防可造成银屑病爆发和恶化的感染。银屑病的局部性药剂包括地蒽酚、卡泊三 醇、煤焦油、皮质留类、类视黄醇、溶角蛋白剂和他扎罗汀。局部类固醇是为轻度至中度银 屑病开出处方的最常见疗法。局部类固醇应用于皮肤表面，但是一些是注射到银屑病病变 (lesion)内。增生性疾病治疗还包括施用与光照疗法联合的抗RON抗体。光照疗法包括施用减 少增生性疾病症状的任何波长的光以及化疗剂的光活化(光化疗)。有关增生性疾病治疗 的其他讨论，参见WO 02/11677 (Teufel等人，描述了使用表皮生长因子受体拮抗剂治疗增 生性疾病)。在本发明中，可使用任何合适的方法或途径来施用本发明的抗RON抗体，任选地 与其他物质共施用，例如抗肿瘤剂和/或其他受体拮抗剂。根据本发明使用的所述抗肿瘤 剂方案包括任何被认为最适合于治疗患者肿瘤病症的任何方案。不同恶性肿瘤可需要使用 特异性抗肿瘤抗体和特异性抗肿瘤剂，其取决于患者。施用途径包括例如注射、胃肠外、输 注、经口、静脉内、腹膜内、皮下或肌内施用。所施用拮抗剂的剂量取决于多个因素，包括例 如拮抗剂类型、待治疗肿瘤的类型和严重程度以及拮抗剂的施用途径。但是，应强调本发明 不限于任何特定的方法或给药途径。抗RON抗体，特别是为治疗癌症的，还可与抑制参与肿瘤生长或肿瘤相关血管发 生的RTK或其相关下游信号元件活性的细胞内RTK拮抗剂一起施用。细胞内RTK拮抗剂优 选是小分子。小分子的一些实例包括有机化合物、有机金属化合物、有机化合物和有机金属 化合物的盐，以及无机化合物。小分子中的原子通过共价键和离子键相连；对于小有机化 合物例如小分子酪氨酸激酶抑制剂通常为前者，对于小无机化合物通常为后者。小有机分 子中原子的排列可表示为链，例如碳_碳链或碳_杂原子链或者可表示为含碳原子的环，例 如苯或多环体系，或者碳原子和杂原子的组合，即杂环例如嘧啶或喹唑啉。尽管小分子可具 有任何分子量，但是它们一般包括除非被认为是生物分子的分子，分子量不大于650D的除 夕卜。小分子包括天然存在的化合物以及合成制备的化合物，所述天然存在的化合物例如激 素、神经递质、核苷酸、氨基酸、糖、脂类及其衍生物，所述合成制备的化合物是通过传统有 机合成、生物介导的合成或其组合制备的。参见例如Ganesan，Drug Discov. Today 7(1) 47-55(2002 年 1 月)；Lou，DrugDiscov. Today, 6(24) 1288-1294(2001 年 12 月)。在一个实施方案中，根据本发明用作细胞内RTK拮抗剂的小分子是细胞内RON拮抗剂，其与ATP竞争结合具有激酶结构域的EGFR细胞内结合区域，或者结合参与EGFR活化的信号转导通路的蛋白质。这些信号转导通路的实例包括ras-丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)通路，磷脂酰肌醇_3激酶(P13K)-Akt通路，胁迫活化蛋白激酶(SAPK)通路以及转 录的信号转导子和活化子(STAT)通路。涉及这些通路的蛋白质的非限制性实例(根据本 发明的小分子RON拮抗剂可与之结合的)包括GRB-2、S0S、Ras、Raf、MEK、MAPK和基质金属 蛋白酶(MMP)。本文所述的治疗方法，特别是针对癌症的，也可与其他抗体的施用联用。例如， 也可施用抗egfr的抗体，例如Erbitux (西妥昔单抗)，特别是在治疗结肠癌时。 Erbitux(S)mab是重组人/小鼠嵌合单克隆抗体，其特异性结合人egfr的细胞外结构域。 Erbitux 是egfr拮抗剂，其阻断egfr的配体结合，防止受体活化，抑制表达egfr的肿瘤 细胞生长。Erbitux 已经被批准联用伊立替康或者不联用伊立替康地用于治疗患有难治 性的或者无法容许基于伊立替康的化学治疗的表达表皮生长因子的转移性结肠直肠癌的 患者。i^bitux 还显示有效治疗银屑病。除了Erbitux 之夕卜，可使用其他抗体，例如 vegfr抗体，igf-ir抗体、pdgfr α抗体和pdgfr β抗体。组合使用的其他抗体包括赫赛汀(曲妥珠单抗)(抗表达HER2的乳腺癌细胞，或 者其他癌细胞上表达的HER2)以及阿瓦斯汀 (贝伐单抗)(抑制血管发生的抗体)。联用 的其他抗体有特异性结合人胰岛素样生长因子-1 (IGFR)的抗体，包括抗体2F8和Α12，例 如2005年2月24目提交的公开的国际专利申请W02005/016970所述(参见例如18页，表 1)，其具有下列⑶r序列重链(2F8/A12)CDRlSYAIS (SEQ ID NO 41)；CDR2GIIPIFGTANYAQKFQG(SEQ ID NO 42)；CDR3APLRFLEffSTQDHYYYYYMDV(SEQ ID NO 43)；轻链(2F8)CDRlQGDSLRSYYAS(SEQ ID NO 44)；CDR2GKNNRPS(SEQ ID NO 45)；CDR3NSRDNSDNRLI(SEQ ID NO 46)；轻链(Al2)CDRlQGDSLRSYYAT(SEQ ID NO 47)；CDR2GENKRPS(SEQ ID NO 48)；cdr3ksrdgsgohlv (seq id ν0:49)._本文所述的治疗方法也可与其他肽的施用联用。例如，在MSP变体结合RON但 是不活化RON或者至少竞争性抑制MSP时，可施用MSP变体。参见例如，美国专利公开 No.2003/0073656。RON抗体与其他抗体和/或小有机分子的施用可同时或者分别通过相同或不同的 途径进行。本发明的抗RON抗体可以与RON拮抗剂和/或其他RTK的拮抗剂一起施用，例如 阻断RTK配体或者以其他方式抑制RTK的抗体。其他此类RTK的实例包括EGFR、c-met和VEGFR0 在本发明的一个实施方案中，抗RON抗体与VEGFR拮抗剂联合使用。例如，VEGFR 拮抗剂 IMC-18F1，如 Wu 等人，Clin Cancer Res ； 12 (21) 6573-6584 (2006)所述。在本发明 的一个实施方案中，抗RON抗体与特异性结合VEGFR-2/KDR受体的受体拮抗剂联用(PCT/ US92/01300，1992 年 2 月 20 日提交，Terman 等人，Oncogene 6 :1677_1683 (1991))。在另一 个实施方案中，抗RON抗体与特异性结合VEGFR-I/Fit-Ι受体的受体拮抗剂联用(Shibuya M.等人，Oncogene 5，519-524 (1990))。特别优选的是结合VEGFRl或VEGFR2细胞外结构域 并阻断配体(VEGF或P1GF)结合，和/或抑制VEGF诱导或PlGF诱导的活化的抗原结合蛋 白。例如，Mab IMC-1121结合可溶性的细胞表面表达的KDR。Mab IMC-1121包含获得自人 Fab噬菌体展示文库的VH和VL结构域。(参见WO 03/075840)。在另一个实施例中，ScFv 6. 12结合可溶性的细胞表面表达的Fit-I。ScFv6. 12包含小鼠单克隆抗体MAb 6. 12的VH 和VL结构域。产生MAb 6. 12的杂交瘤细胞系是已知的并已经由Wang等人Blood 104(9)， 2893-2902(2004)报道。这些RTK的另一个实例是胰岛素样生长因子受体(IGFR)。在某些肿瘤细胞中，RTK 功能的抑制可以由其他生长因子受体信号通路的上调补偿，特别地由RON激活补偿。另外， IGFR信号的抑制导致肿瘤细胞对某些治疗剂的敏感性增加。RON或IGFR的激活导致普遍 的下游转导分子磷酸化，包括Akt和P44/42，尽管程度不同。因此，在本发明的一个实施方 案中，IGFR拮抗剂(例如结合IGF或IGFR并抑制所述受体的抗体)与本发明的抗体共施 用，由此阻断第二输入进入普遍下游信号发放通路(例如抑制Akt和/或p44/42的活化)。 IGFR特异性人抗体的一个实例是IMC-A12 (参见WO 2005/016970)。可与RON组合靶向的另一个受体是EGFR。EGFR可以由如上所述例如ErbitUX 的抗体或者小有机分子靶向。小分子RTK拮抗剂的一个实例是IRESS A (ZD 1939)，其是用 作ATP模拟物抑制EGFR的喹唑啉衍生物。参见美国专利No. 5，616，582 (Zeneca Limited)； WO 96/33980 (ZenecaLimited)，第4页；也参见Rowinsky等人，在ASCO的第37届年会上发 布的摘要5，San Francisco, CA, 2001年5月12-15日；Anido等人，在ASCO的第37届年会 上发布的摘要1712，San Francisco，CA，2001年5月12-15日。小分子EGFR拮抗剂的另一 个实例是TARCEVA (0SI-774)，其为4-(取代的苯基氨基)喹唑啉衍生物[6，7_双(2 甲 氧基-乙氧基)_喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)胺盐酸化物]EGFR抑制剂。参见WO 96/30347 (Pfizer Inc.)，例如在第2页第12行至第4页第34行，以及第19页14-17页。 另外参见 Moyer 等人，Cancer Res. ,57 4838-48 (1997) ；Pollack 等人，J. Pharmacol, 291 739-48 (1999)。TARCEVA 可通过抑制EGFR及其下游P13/Akt和MAP (丝裂原活化蛋白质) 激酶信号转导通路的磷酸化作用发挥功能，导致P27-介导的细胞周期停滞。参见Hidalgo 等人，ASCO的第37届年会发布的摘要281，San Francisco, CA, 2001年5月12-15日。上 述小有机分子还可抑制RON。涉及肿瘤发生的生长因子受体的其他例子有血小板来源生长因子(PDGF)、神经生 长因子(NGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)的受体。这些受体可以与RON联合靶向。在另一个实施方案中，所述抗RON抗体可以与一种或多种合适的佐剂联合施用， 例如细胞因子(如IL-10和IL-13)或者其他免疫激活物，例如但不限于趋化因子、肿瘤相 关抗原和肽。
在组合治疗中，所述抗RON抗体在另一种药剂治疗之前、期间、基本上同时或者之 后施用，以及其组合，即开始所述抗肿瘤药剂治疗的之前和期间，之前和之后，期间和之后， 或者之前、期间和之后。例如，所述抗RON抗体可以在开始放射治疗之前1-30天，或者3-20 天，或者5-12天施用。在本发明的一个实施方案中，化学治疗与抗体治疗同时或在其之后 施用。本发明还设想与靶标或报告物部分相连的本发明的RON抗体或抗体片段。靶标部 分是结合对的第一成员。例如，抗肿瘤剂与此对的第二成员缀合，由此引导至所述抗原结合 蛋白质结合的部位。此类结合对的常见例子是亲和素和生物素。在一个优选实施方案中，生 物素与本发明的抗原结合蛋白质缀合，由此提供了与亲和素或链霉亲和素缀合的抗肿瘤剂 或其他部分的靶标。作为替代地，生物素或另一种此类部分与本发明的抗原结合蛋白质相 连，并用作报告物，例如在可检出信号产生物质与亲和素或链霉亲和素缀合的诊断系统中。可检出信号产生物质可在体内和体外用于诊断目的。所述信号产生物质产生可通 过外部手段检出的可测量信号，通常测量电磁辐射。多半的情况，所述信号产生物质是酶或 生色团，或者通过荧光、磷光或化学发光发射光线。生色团包括吸收紫外线或可见光谱区的 光，可以是酶催化反应的底物或降解产物。此外，本发明范围内包括本发明抗体在体内和体外用于研究或诊断方法的用途， 其在本领域中是公知的。所述诊断方法包括试剂盒(kit)，其含有本发明抗体。此类试剂 盒可能可用于通过检测个体细胞上RON的过表达鉴定处于某种类型癌症风险中的个体。此 夕卜，由于其鉴定RON的能力，本发明的抗体可用于实验室研究。本发明还包括药盒(kit)，例如抑制肿瘤生长和/或肿瘤相关血管发生的药盒，其 包含治疗有效量的人抗EGFR抗体。所述药盒还可含有任何例如涉及肿瘤发生或血管发生 的另一种生长因子受体(例如 VEGFR-l/Flt-1、VEGFR-2、PDGFR、IGFR、NGFR、EGFR、FGFR 等 等，如上所述)的合适拮抗剂。作为替代地或者另外地，本发明的药盒还可包含抗肿瘤剂。 本发明背景中的合适抗肿瘤剂的实例在本文已有描述。本发明的药盒还可包含佐剂；其实 例也已在上文有描述。本发明还提供了鉴定和分离具有与R0N6或R0N8或其片段相同功能的抗体的方 法，其中对文库的筛选包括提供与固定支持物结合的具有含RON配体结合功能的亲和基 质，将所述亲和基质与抗体片段文库相接触，以及将所述亲和基质结合的抗体片段与不结 合所述亲和基质的抗体片段分离。固体支持物意为RON可附着于其上的非水性基质。本文涵盖的固相的实例包括部 分或全部由玻璃(例如受控有孔玻璃)、多糖(例如琼脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙 烯醇和硅氧烷形成的那些。在某些实施方案中，根据上下文，所述固相可包含测定板的孔； 在另一些实施方案中，它是纯化柱(例如亲和层析柱)。该术语还包括离散微粒的不连续固 相，例如美国专利No. 4，275，149中所描述的那些。本发明还提供了在使用本发明所提供之外的RON抗体时的治疗方法。 本文详细描述本发明的具体实施 方案。当连带这些具体实施方案描述本发明时， 应理解不打算将本发明限于这些具体实施方案。相反地，旨在覆盖如所附权利要求定义的 本发明的精神和范围内包含的替代方案、修饰和等同方案。在接下来的描述中，阐述了许多 具体细节，以提供对本发明的彻底了解。本发明可以在没有这些细节中一些或全部的情况下实施。在另一些情况下，没有详细描述公知的过程操作，从而不使本发明不必要地变得模糊。在本说明书中提到的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请以及 外国专利、外国专利申请通过引用以整体并入本文。本说明书中引用的所有出版物表现出本发明所属技术领域中技术人员的技术水平。所有这些出版物通过引用以整体并入本文，其程度为各个出版物明确地且单独地指明 通过引用并入。
实施例仅仅为说明目的提供下列实施例，不意为以任何方式对本发明的范围进行限制。 所述实施例不包括常规方法的详细说明，例如构建载体和质粒，将编码多肽的基因插入此 类载体和质粒或者将质粒引入宿主细胞中利用的那些方法。此类方法是本领域技术人员公 知的，并且在许多出版物中有述，包括Sambrook, J.，Fritsch, E. F.和Maniatis, T. (1989) Molecular CloninR :A laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。材料和方法两种抗RON抗体R0N6和R0N8的开发和表征。实施例1 抗RON抗体的产生通过标准杂交瘤技术产生人抗RON单克隆抗体(本文称为R0N6和R0N8) (Harlow & Lane 编，Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor, 211-213 (1998),其通 过引用并入本文)，其使用HuMAb小鼠(Medarex，San Jose, Calif.)，该小鼠产生人免疫球 蛋白、重链和κ轻链。用完全弗氏佐剂中RON细胞外结构域片段，过表达人RON受体的 RE7细胞和MDCK细胞皮下(s. c.)免疫HuMAb小鼠。在融合之前，用弗氏不完全佐剂中的相 同RON蛋白质对动物腹膜内(i.p.)加强三次。在动物接受最后的磷酸盐缓冲液(PBS)中 25微克RON蛋白质的腹膜内加强之前，使其休息一个月。四天后，从免疫的小鼠收获脾细 胞，使用聚乙二醇(PEG，MW :1450KD)将其与P3_X63_Ag8. 653Bcl_2转染子浆细胞瘤细胞融 合。融合后，在添加了 10%胎牛血清(FBS)的HAT(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)培养基中重 悬细胞，以200微升/孔的密度分配到96孔板，以建立杂交瘤细胞。在融合后第6天，吸出 100微升培养基，替换为100微升新鲜培养基。应注意，从一个融合鉴定到180个杂交瘤克隆为产生具有rhu-RON蛋白质反应性 之抗体的阳性克隆。180个结合阳性中，仅有5个克隆鉴定为具有阻断活性。在这五个中， 根据其优秀的结合特异性，仅选择2个，R0N6和R0N8，进行进一步的开发。这些证明了阻断活性的杂交瘤克隆进行三次亚克隆，以建立产生抗RON的mAb的 单克隆杂交瘤细胞系。进一步验证具有阻断活性的克隆，以选择较强的阻断活性。命名为R0N6和R0N8 的克隆具有较强的阻断活性，如ELISA所测得的，具有2-3nM的IC50，并具有高亲和力(KD 值分别为45和23pM)。选择这两个克隆进行进一步开发。R0N6和R0N8抗体是IgG抗体，已经对其各个重链和轻链进行了测序。如下所示， 每个抗体的结构易于从所提供的图和相应序列中得知。
R0N6 的结构R0N6抗体包括两条重链，其每个如图2A、2B和2C中所示，合起来如SEQ ID NO :10， 其由SEQ ID NO 9的DNA序列编码。应注意，图2A的前19个残基/密码三联子代表分泌 信号序列，不在成熟抗体链中存在。R0N6抗体还包括两条轻链，其由图2D-2E所示，合起来如SEQ IDNO :12，其由SEQ ID NO 11的DNA序列编码。应注意，图2D的前19个残基/密码三联子代表分泌信号序列， 不在成熟抗体链中存在。
R0N8 的结构R0N8抗体包括两条重链，其每个如图3A、3B和3C中所示，合起来如SEQ ID NO: 14，其由SEQ ID NO: 13的DNA序列编码。应注意，图3A的前19个残基/密码三联子代表 分泌信号序列，不在成熟抗体链中存在。R0N8抗体还包括两条轻链，其由图3D-3E所示，合起来如SEQ IDNO :16，其由SEQ ID NO 15的DNA序列编码。应注意，图3D的前19个残基/密码三联子代表分泌信号序列， 不在成熟抗体链中存在。实施例2 来自实施例1的抗RON抗体结合RON并抑制RON与其配体(MSP)的结
合结合ELISA 在融合后第10_12天，筛选杂交瘤的抗体产生以及在基于ELISA 的结合和阻断测定中筛选培养物上清与rhRON蛋白质的特异性结合活性。用(lyg/ ml X 100 μ DrhRON蛋白质(R&D系统)在室温下包被Maxi_sorp96孔微量滴定板(Nunc)L 5 小时。洗涤孔后，用3% PBS/牛奶对它们进行封闭。然后，将来源于杂交瘤上清的抗RON 抗体添加到包被孔并使之在室温下孵育1.5小时。洗涤数次后，将1 1000稀释的抗人 IgG-HRP缀合抗体添加到所述板，在室温下保持1. 5小时，以检测阳性结合。通过有限稀释 培养物将阳性杂交瘤亚克隆三次，以建立单克隆杂交瘤。检测阻断MSP/R0N 相互作用的抗体的 ELISA 用(1 μ r/πιΙ X 100 μ 1) MSP (R&D Systems)在室温下包被Maxi-sorp 96-孔微滴定板(Nunc) 1. 5小时。洗涤孔后，用3% PBS/牛奶对它们进行封闭。首先，将来源于杂交瘤上清的抗RON抗体与rhRON在室温下孵 育1小时，然后将其添加到MSP-包被的孔。在室温下孵育1. 5小时，之后洗涤数次，然后将 1 1000稀释的抗人IgG-HRP缀合抗体添加到所述板，在室温下保持1.5小时，以检测哪个 抗RON可阻断MSP/R0N相互作用。检测R0N8阻断MSP与RON结合的ELISA 在摇床上用IOOng/孔的无载体MSP (R&D Systems)在4摄氏度下过夜包被ELISA平板。用0. 2% PBS/T洗涤平板一次，在37摄氏度 下用150 μ 1/孔的3%牛奶封闭2小时。制备15μ g/ml稀释的R0N8，连续稀释到另一个 ELISA平板。向R0N8添加IOOng/孔重组人MSPR (R&D Systems)。在摇床上室温下使R0N8/ rhMSPR复合物形成2小时。接下来，用0. 2% PBS/T洗涤MSP包被的ELISA平板一次，向 每个孔添加100 μ 1的R0N8/rhMSra复合物。在室温下孵育1. 5小时候，用0. 2% PBS/T将 所述平板洗涤5次，在室温下与1 2000稀释的抗His-标签HRP抗体(Sigma) —起孵育 1小时，所述抗His-标签HRP抗体识别重组人MSra蛋白质上的His标签。用0. 2% PBS/T 洗涤所述平板5次，每孔添加100-AL底物直至出现黄色。使用50 μ IlN H2SO4停止反应，使 用标准平板读数器测定450nm的吸光度。图6A显示的结果描述了 R0N8的固相阻断特征。ELISA数据确定阻断重组人RON蛋白质与固定化重组人MSP相互作用所需的R0N8IC50值。细胞迁移。为了确定R0N8是否可阻断MSP诱导的H596肺癌细胞(ATCC，Manassas，VA)的迁移，我们使用24孔细胞培养小室(cell cultureinsert)，其含有多孔半透明聚对 苯二甲酸乙二酉享酉旨径迹蚀刻膜(polyethylene terephthalate track etched membrane, 8. OAm孔径；Becton Dickinson Falcon)。在进行测定之前，通过将所述多孔膜置入充满700 微升 Vitrogen-IOO 纯化的胶原溶液(25 μ g/mL ;Cohesion，Palo Alto, CA)的 24 孔 Falcon 平板用胶原包被所述多孔膜的底面。在4摄氏度下将所述插入物留置1小时，然后将其放 入新的24孔板。接下来，用PBS将已经血清饥饿24小时的6X IO5活细胞漂洗一次，然后 将其接种于300 μ L无血清培养基中的细胞培养小室的上室。将MSP添加到700微升无血 清培养基中的下室，在37摄氏度下保持24小时，以诱导细胞穿过胶原包被的多孔膜迁移。 使用0%的血清作为阴性对照，使用10%的血清作为细胞迁移的阳性对照。在添加MSP之 前，将R0N8添加到上室中的一些，保持1小时，以确定它是否可抑制MSP诱导的Η596细胞迁 移。在测定结束时，用 Hoechst 染料(2 μ g/ml ；Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA)对附着于胶原包被膜的底面的迁移细胞染色，以IOOx的倍率由荧光显微镜拍照，使用 Image-Pro Plus软件进行计数。图6B显示R0N8抑制H596肺癌细胞迁移的能力。在体外伤口愈合测定中R0N8抑制迁移的能力。在H292肺癌细胞单层中制备刮伤。 添加R0N8，以确定它是否可抑制MSP诱导细胞迁移填充该伤口的能力。将H292肺癌细胞 以2. 5 X IO5细胞/孔接种于BectonDickinson Falcon 6孔细胞培养板，使之过夜生长至 汇合。使细胞血清饥饿48小时。在添加MSP之前，产生伤口前用R0N8抗体对一些孔进行 预孵育1小时。在开始测定时，用200 μ 1塑料枪头产生小的伤口。接下来，在有和没有无 血清培养基中MSP+R0N8抗体存在下将细胞孵育24小时。使用0%的血清作为阴性对照，使 用10%的血清作为细胞迁移到伤口中的阳性对照。孵育24小时候，通过亮场显微镜以40χ 的倍率对细胞进行拍照。观察到IOOnM的R0N8抑制细胞迁移填充伤口，由此显示R0N8在 体外模型中抑制细胞迁移的能力。R0N8抑制增殖的能力。图6C显示在BXPC3胰腺癌细胞中R0N8抑制MSP诱导的 DNA合成。图6C(1)显示度量DNA合成的[3H]-胸苷掺入的MSP刺激。将肿瘤细胞(10000/ 孔)铺板于96孔组织培养板并使之静息。用MSP将细胞刺激20小时。[将[3H]胸苷 (0.25mCi)添加到各孔，再孵育4小时。使用闪烁计数器测定DNA掺入的放射性。点，一式 两份样品的平均值；条，SD。图6C(2)显示下述体系细胞预先用R0N8处理1小时，然后加 入 MSP。BIAcore 分析。通过使用 BIAC0RE 3000 (BIAcore，Piscataway，NJ)测定所述抗 体与RON蛋白质的结合动力学。将重组RON-Fc固定于传感器芯片上，以多种浓度注射抗 体。获得传感图，使用BIA Evaluation 2. O软件进行评价，确定速率常数。从速率常数的 比K。ff/K。n计算亲和常数KD。相互作用的速率〃 K^M—.S—1"和“K。ff，S—1”用于确定抗体/ 受体相互作用的亲和性(Kd，Μ)。R0N6的速率Kd，1( 和1(。 为4. le_ll，2. 2e6和8. 6e_5。 对于 R0N8，它们是3. 2e-ll，6. Ie6 和 2. 0e_4。RON细胞表面表达的流式细胞术分析。在4摄氏度下，将来自贴壁癌细胞系的 一百万个细胞在PBS+5% FCS中与5微克R0N8 —起孵育30分钟。在PBS+5% FCS中洗涤 后，在4摄氏度下将细胞与抗人IgG藻红蛋白缀合的二抗(Jackson Immuno Research) —起孵育30分钟。用PBS+5% FCS洗涤后，通过流式细胞术使用FACSvantage SE流式细胞计 (BectonDickinson)分析细胞。蛋白质印迹和免疫沉淀。将细胞铺板于IOcm或6孔培养皿，培养至70-80%汇合。在PBS洗涤单层两次，在无血清培养基中培养过夜。然后，添加抗体，在37摄氏度下孵育 60-120分钟。用MSP配体刺激细胞10分钟，然后将其置于冰上，用冰冷的PBS洗涤。在冰 上 50mM Tris-HCl (pH7. 4) U50mM NaClU % Triton X-IOOUmM EDTA、ImM 苯甲基磺酰氟、 0. 5mM Na3VO4Uu g/ml亮抑酶肽、1 μ g/ml抑胃酶肽和1 μ g/ml抑蛋白酶肽中裂解细胞10 分钟。通过4摄氏度下离心澄清所述裂解液。然后，将溶液化的RON从裂解液中免疫沉淀 下来。在 4 摄氏度下，将抗体 RON，克隆 C-20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 或R0N6和R0N8与400微升4微克/毫升的裂解液一起孵育过夜。通过添加A蛋白-琼脂 糖珠使得免疫复合物沉淀，在4摄氏度下保持2小时，沉淀，用裂解缓冲液洗涤三次。将与A 蛋白-琼脂糖珠结合的免疫沉淀浸入变性凝胶样品缓冲液中。对裂解液或免疫沉淀进行变 性凝胶电泳，在4-12%的丙烯酰胺凝胶上进行，并通过蛋白质印迹转印至硝酸纤维素膜。使 用抗磷酸化RON抗体(Biosource)和抗小鼠辣根过氧化物酶二抗在印迹上检测酪氨酸-磷 酸化的蛋白质。使用单克隆抗体RON C-20 (Santa Cruz Biotechnology)检测RON。磷酸 化-Akt 和总 Akt 抗体获得自 PharMingen (BD Biosciences, SanDiego, CA)。对于 MAPK 磷 酸化，磷酸化-P44/42和总p44/42抗体购自CellSignaling Technology。使用增强化学发 jfei式齐[J (Amersham PharmaciaBiotech) ^t X 身寸_月交>t (Eastman Kodak, Rochester, NY) ± 使条带显影。用于测定IC50和ED50倌的ELISA使用ELISA测定抗RON抗体、R0N6和R0N8结合重组人RON受体并阻断MSP/R0N相 互作用的能力。使用固定于ELISA板的受体，R0N6和R0N8结合RON的ED50值分别为4. 2pM 和2.1pM。使用相同的ELISA形式，检测两种抗体阻断MSP/R0N相互作用的能力。测得的 IC50 值为 R0N6 :46pM 和 R0N8 :62pM。人月中瘤异禾中移植模胡。通过各MatriRel (Collaborative ResearchBiochemicals, Bedford, ΜΑ)中混合的5 X IO6个细胞皮下注射到5_6周龄雌性无胸腺(nu/nu)小鼠 (Charles River Laboratories，Wilmington，ΜΑ)建立肿瘤异种移植体。使肿瘤达到 150-300mm3的大小，然后将小鼠随机分到各有12个动物的组。通过每三天腹膜内注射对照 抗体(人IgG)或R0N6和R0N8抗体处理小鼠。在研究进行过程中持续对动物进行处理。每 周使用游标卡尺测量肿瘤两次，通过下列公式计算肿瘤体积(η /6(wlx w2xw2))，其中wl 表示最大肿瘤直径，《2表示最小肿瘤直径。使用Marm-Whitney U检验分析肿瘤体积，使用 SigmaStat (2. 03 版 JandelScientific, San Rafeal, CA)中的统计包进行计算。实施例3 在人肿瘤异种移植模型中证实肿瘤抑制。在四种不同肿瘤细胞中通过使用上文实施例2中所述小鼠异种移植方法证实 R0N6和R0N8抗体抑制肿瘤生长的体内有效性。肿瘤细胞如下。H-292细胞，来源于肺肿瘤， 获得自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection) (Manassas，VA)。 HT-29细胞，来源于结肠肿瘤，获得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。BxPC3细 胞，来源于胰腺肿瘤，获得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。JIMT细胞，来源于 乳腺癌，获得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。
使用上文所述异种移植方法，将H-292细胞注射到总共24只小鼠。用60mg/kg的 R0N6抗体处理12只小鼠，用盐水处理12只作为对照。如图4A所示，相对于对照，观察到 肿瘤体积的显著抑制。另外用40只小鼠进行了实验，分为四组，分别用盐水以及60mg/kg、 20mg/kg和2mg/kg的R0N8抗体进行处理。如图4B所示，相对于对照，观察到肿瘤体积的显 著抑制。如图4B所见的，该实验也证实了应答随着抗体剂量增加而增加。使用上文所述异种移植方法，将HT-29细胞注射到总共24只小鼠。用60mg/kg的 R0N6抗体处理12只小鼠，用盐水处理12只。如图4C所示，相对于对照，观察到肿瘤体积的 显著抑制。另外用另一组40只小鼠进行了相同的实验，分为四组，分别用盐水或者60mg/ kg、20mg/kg或2mg/kg的R0N8抗体进行处理。如图4D所示，相对于对照，观察到肿瘤体积 的显著抑制。如图4D所见的，该实验也证实了应答随着抗体剂量增加而增加。使用上述异种移植方法，将BxPC3细胞注射进总共60只小鼠。小鼠分为五组(12/ 组)，处理如下盐水，60mg/kg 的 R0N8，60mg/kg 的ErbitUX (获得自 ImClone Systems, Inc.)，60mg/kg 的 R0N8 和 60mg/kg 的ErbitllX ，以及 60mg/kg 的ErbitUX 和 60mg/kg 的 hulgG(对照IgG获得自MeridianLife Sciences)。结果如图4E所示，证实了 R0N-8在胰 腺BxPC-3模型中增加了西妥昔单抗(cetuximab)的抗肿瘤作用(使用单侧重复测量ANOVA 的P值为0. 06)。使用上述异种移植方法，将JIMT-I乳腺癌细胞皮下注射进裸鼠，使 之生长到约 250mm3。在使用对照(盐水)、R0N8 (60mg/kg, 2x/周)、多西他赛或者多西他赛+R0N8的组 合的处理过程中对肿瘤体积作图。对平均值+/-SEM作图。图4F所示的结果证实了在乳腺 JIMT-I模型中R0N-8抑制裸鼠中乳腺癌异种移植物的生长。参考文献Dffang, M. H. ， Kurtz, A. L. ， Chen, Y. (2000b). Identification of a novel splicing product of the RONreceptor tyrosine kinase in human colorectal carcinomacells. Carcinogenesis 21,1507—1512.2)Leonard, E.J.，Danilkovitch, A. (2000). Macrophagestimulating protein. Adv. Cancer Res. 77,139-167.3)Skeel, A. , Leonard, E. J. (1994). Action and target cellspecificity of human macrophage-stimulating protein(MSP). J. Immunol. 152,4618-4623.4) Leonard, E.J·, Skeel, A. (1976). A serum protein thatstimulates macrophage movement, chemotaxis and spreading. Exp. Cell Res. 102,434-438.5) Iwama, A. , Wang, Μ. H. , Yamaguchi, N. , Ohno, N. , Okano, K. , Sudo, Τ. , Takeya, Μ. , Gervais, F. , Morissette, C. , Leonard, E. J. (1995). Terminal differentiation of murineresident peritoneal macrophages is characterized byexpression of the STK protein tyrosine kinase,a receptorfor macrophage-stimulating protein. Blood 86, 3394-3403.6) Wang, Μ. H. , Cox, G. W. , Yoshimura, Τ. , SheffIer, L. A. , Skeel, A. , Leonard, E. J. (1994a). Macrophage-stimulatingprotein inhibits induction of nitric oxide production byendotoxin-or cytokine-stimulated mouse macrophages. J. Biol. Chem. 269，14027-14031.
7) Wang, Μ. H. ,DlugosziA. A. ,Sun, Y.，Suda，T. ,SkeeliA.，Leonard，Ε· J. (1996a). Macrophage—stimulating proteininduces proliferation and migration of murinekeratinocytes. Exp. Cell Res. 226，39-46.8) Wang, M. H.，Montero-Jul ian，F. A.，Dauny, I.，Leonard，E.J. (1996b). Requirement of phosphatidyl inositol-3 kinasefor epithelial cell migration activated by humanmacrophage stimulating protein. Oncogene 13，2167—2175·9) Okino，T.，Egami，H.，Ohmachi，H.，Takai，E.，Tamori，Y. , Nakagawa, K.，Nakano， S.，Akagi, J.，Sakamoto, 0.，Suda, Τ.，Ogawa, Μ. (1999). presence of RON receptor tyrosinekinase and its splicing variant in malignant andnon-malignant human colonic mucosa. Int. J. Oncol. 15，709—714·10) Chen, Y. Q. ， Zhou, Y. Q. ， Angeloni, D. ， Kurtz, A. L. ， Qiang, X. Z. ， Wang, M.H. (2000). Overexpression andactivation of the RON receptor tyrosine kinase in a panelof human colorectal carcinoma cell lines.Exp. Cell Res. 261,229-238.11)Wang, M. H. ， Kurtz, A. L. ， Chen, Y. (2000b). Identification of a novel splicing product of the RONreceptor tyrosine kinase in human colorectal carcinomacells. Carcinogenesis 21，1507-1512.12)Willett, C. G. ， Wang, M. H. ， Emanuel, R. L. ， Graham, S. A. ， Smith， D. I.， Shridhar，V.，Sugarbaker, D. J.，Sunday, Μ. E. (1998). Macrophage-stimulating protein and itsreceptor in non-small-cell lung tumors induction ofreceptor tyrosine phosphorylation and cell migration. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 18,489-496.13)Maggiora, p. ， Marchio, S. ， Stella, Μ. C. ， Giai, Μ. ， Belfiore, Α. ， De Bortoli，Μ.，Di Renzo, Μ. F.，Costantino，Α.，Sismondi，P.，Comoglio，P. Μ. (1998). Overexpressionof the RON gene in human breast carcinoma. Oncogene 16，2927—2933·14) Chen, YQ, Zhou, YQ, Fisher, JH, Wang M-H. (2002). Targeted expression of the receptor tyrosine kinase RON indistal lung epithelial cells results in multiple tumorformation :oncogenic potential of RON in vivo. 0ncogene21， 6382-6386.15) Chen YQ，Zhou YQ, Fu LH，Wang D，Wang MH. (2002). Multiple pulmonary adenomas in the lung of transgenic miceoverexpressing the RON receptor tyrosine kinase. Carcinogenesis 23,1811-1819.16)Santoro MM, Collesi C, Grisendi S, Gaudino G， Comoglio P (1996). Constitutive Activation of the RON Gene PromotesInvasive Growth but Not Transformation. Molecular andCellular Biology, Dec.，p.7072-7083.17)0 ! Toole J. Μ. , Rabenau K. Ε. , Burns K.，Lu D. , MangalampalIiV., Balderes P.，Covino N.，Bassi R.，Prewett Μ.，Gottfredsen K. J.，Thobe Μ. η.，Cheng Y.，Li Y.，HicklinD. J.，Zhu Ζ.，Waltz S. Ε.，Hayman Μ. J.，Ludwig D. L andPereira， D.S. (2006)Therapeutic Implications of a HumanNeutralizing Antibody to the Macrophage-StimulatingProtein Receptor Tyrosine Kinase (RON)，a c-MET FamilyMember. Cancer Research 66 :(18)，9162-9170.
18) Patton KT，Tretiakova MS，Yao 几，papavero V，Huo L，AdleyBP，Wu G， Huang J,pins MR，Teh BTiYang XJ. (2004)Expression of RON proto-oncogene in Renal Oncocytoma andChromophobe Renal Cell Carcinoma. Am J Surg Pathol.，Aug28 (8) 1045-50. 19) Suzuki Y, Funakoshi H, Machide M, Matsumoto K, Nakamura T. (2008) Regulation of cell migration and cytokineproduction by HGF-Iike protein(HLP)/ macrophagestimulating protein (MSp) in primary microglia. BiomedRes. Apr ；29 (2) 77-84.20)Gaudino G， Avantaggiato V， Follenzi A， Acampora D， SimeoneA， Comoglio PM(1995)The proto-oncogene RON is involvedin development of epithelial，bone and neuro-endocrinetissues. Oncogene. Dec 21 ；11 (12) :2627_37·
权利要求
特异性结合RON蛋白质的抗体或其片段，其包含选自下列的CDRSEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23、SEQ IDNO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37和SEQ ID NO39。
2.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQIDN0:29、SEQ ID NO 31 禾口 SEQ ID NO :33。
3.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQIDNO35,SEQ ID NO 37 禾口 SEQ ID NO :39。
4.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQIDN029,SEQ ID NO :31、SEQ ID NO 33 ；SEQ ID NO :35、SEQ ID NO 37 和 SEQ ID NO :39。
5.根据权利要求2的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与SEQID N0:6有至 少75%相同的可变区。
6.根据权利要求3的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与SEQID N0:8有至 少75%相同的可变区。
7.根据权利要求4的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQIDNO :6和SEQ ID NO :8。
8.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQIDN0:17、SEQ ID NO 19 禾口 SEQ ID NO :21。
9.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQIDN023,SEQ ID NO 25 禾口 SEQ ID NO :27。
10.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQID N0 17, SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 21 ；SEQ ID NO :23、SEQID NO 25 和 SEQ ID NO :27。
11.根据权利要求9的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与SEQID N0:2有 至少75%相同的可变区。
12.根据权利要求10的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与SEQID N0:4有 至少75%相同的可变区。
13.根据权利要求11的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含SEQID NO :2和SEQ ID NO :4。
14.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是RON特异性的，其Kd为 约IX icnr1或更低。
15.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是RON特异性的，其Kd为 约IXlO-10M-1或更低。
16.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是RON特异性的，其Kd为 约IXlO-11M-1或更低。
17.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含选自下列的结构单 克隆抗体、单链、Fab、Fv、双抗体和三抗体。
18.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含来源于至少两个抗 体可变结构域的CDR，所述抗体可变结构域选自R0N6VH、R0N6VL、R0N8VH、R0N8VL及其组口 O
19.根据权利要求1的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含来源于至少三个抗体可变结构域的CDR，所述抗体可变结构域选自R0N6VH、R0N6VL、R0N8VH、R0N8VL及其组
20.根据权利要求2的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含IgG结构。
21.根据权利要求20的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含RON6或RON8。
22.编码权利要求1的抗体或其片段的分离核酸。
23.包含权利要求22的所述分离核酸的重组载体。
24.根据权利要求23的重组载体，其中所述核酸有效连接允许所述核酸表达的调控序列。
25.包含权利要求24的重组载体的宿主细胞。
26.产生RON抗体的方法，其包括在允许所述抗体表达的条件下培养权利要求25的宿 主细胞。
27.根据权利要求26的方法，其中所述方法还包括纯化所述抗体。
28.包含可药用载体和权利要求1的抗体或其片段的药物组合物。
29.根据权利要求28的药物组合物，其还包括另一种治疗有效化合物。
30.包含权利要求1抗体或其片段以及化疗剂的药盒。
31.根据权利要求30的药盒，其中所述化疗剂选自紫杉酚、多柔比星、放线菌素D、甲 氨蝶呤、伊立替康(CPT-II)、吉西他滨、奥钼、氟尿嘧啶(5-FU)、leuCOurin(LU)、顺钼、紫杉 酚、多西他赛、长春碱、埃博霉素、顺钼/卡钼和聚乙二醇化的阿霉素。
32.在哺乳动物中抑制血管发生、肿瘤生长、肿瘤细胞增殖、肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞侵 袭、RON活化或者RON、MAPK和/或Akt磷酸化的方法，其包括向所需哺乳动物施用有效量 的权利要求1抗体或其片段。
33.在哺乳动物中治疗癌症的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求1 抗体或其片段。
34.根据权利要求33的方法，其还包括将另一种抗癌治疗施用给所述哺乳动物。
35.根据权利要求34的方法，其中所述抗癌治疗选自抗血管发生剂、另一种FGFR-3 拮抗剂、化疗剂、放射、另一种抗体、抗肿瘤剂和小分子。
36.根据权利要求35的方法，其中所述抗癌治疗是化疗剂。
37.根据权利要求36的方法，其中所述化疗剂选自紫杉醇、多柔比星、放线菌素D、甲 氨蝶呤、伊立替康(CPT-II)、吉西他滨、奥钼、氟尿嘧啶(5-FU)、leuCOurin(LU)、顺钼、紫杉 酚、多西他赛、长春碱、埃博霉素、顺钼/卡钼和聚乙二醇化的阿霉素。
38.根据权利要求35的方法，其中所述抗癌治疗是放射。
39.根据权利要求35的方法，其中所述抗癌治疗是另一种抗体。
40.根据权利要求39的方法，其中所述抗体选自EGFR抗体、VEGFR抗体、IGFIR抗体、 PDGFR α抗体和PDGFR β抗体。
41.根据权利要求39的方法，其中所述抗体与另一个分子缀合。
42.根据权利要求33的方法，其中所述癌症选自起源于结肠、胰腺、前列腺、胃、肺、肝 脏、卵巢、肾、乳腺和脑的肿瘤细胞。
43.根据权利要求42的方法，其中所述肿瘤细胞来自结肠。
44.根据权利要求32的方法，其中所述肿瘤细胞是上皮或神经内分泌来源的。
45.根据权利要求32的方法，其中所述RON是野生型RON或变体RON。
46.根据权利要求32的方法，其中所述RON是变体。
47.检测样品中RON的方法，其包括将所述样品与权利要求1的抗体或其片段相接触， 以获得特异性结合，以及检测此结合。
48.在哺乳动物中预防或治疗炎症的方法，其包括向所需哺乳动物施用有效量的权利 要求1的抗体或其片段。
49.在哺乳动物中预防或治疗选自肝脏、胆道、胆管和胆囊疾病的病症的方法，其包括 向所需哺乳动物施用有效量的权利要求1的抗体或其片段。
50.根据权利要求32的方法，其中所述抗体或其片段通过注射、输注、经口、胃肠外、皮 下、肌内或静脉内施用。
51.根据权利要求32的方法，其中所述抗体或其片段以约1至约10mg/kg的剂量施用 给哺乳动物。
52.根据权利要求51的方法，其中所述抗体或其片段以约3至约8mg/kg的剂量施用。
全文摘要
本发明提供了巨噬细胞刺激蛋白受体(MSP-R或RON)特异性的抗体(包括人抗体)或其片段，其抑制RON活化。本发明还提供了抑制RON的方法，特别是使用RON抗体以治疗诸如癌症的疾病。
文档编号A61P35/00GK101868478SQ200880117231
公开日2010年10月20日 申请日期2008年11月21日 优先权日2007年11月21日
发明者D·佩雷拉, J·奥图尔 申请人:伊姆克罗尼责任有限公司