专利名称：N端缺失型p43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及缺失型重组人P43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用。
技术背景
恶性肿瘤是威胁人类健康的大敌，医学界对恶性肿瘤的治疗主要采取杀死癌细胞 为主的方法，即手术、化疗、放疗等。这些方法在杀死癌细胞的同时也损伤正常细胞，并且 容易使肿瘤细胞产生耐药性。因而，人们一直在探索一种能专一性地杀死肿瘤细胞且不损 伤正常细胞，同时又不易使肿瘤产生耐药性的治癌方法。目前用于治疗肿瘤的新药层出不 穷。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，人们逐渐关注运用基因工程药物治疗恶性肿 瘤的方法。传统的肿瘤化疗大多使用细胞毒性药物，在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞 造成损害，削弱人的体质。所以很多癌症晚期患者最后多因为无法承受治疗而致死亡。恶 性肿瘤有一个共同的特性，那就是局部的细胞疯狂地、不受遏制地增殖，而维持这种增殖就 意味着需要大量营养供应。在肿瘤形成的同时，瘤体的内部及周围会形成大量供应养分的 血管。那么如果能切断这些供养“管道”，阻断肿瘤的营养来源，肿瘤也就会衰竭而死。当前兴起的新生血管抑制疗法为彻底治疗肿瘤带来了曙光。研究发现肿瘤特别 是实体瘤的生长需要大量的营养供应，在肿瘤周围会形成大量的新生血管。抗血管生成疗 法主要是通过抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增 殖，从而达到阻止肿瘤血管生成，使肿瘤毛细血管发生萎缩，切断肿瘤的营养供应，使肿瘤 细胞凋亡或退化到最初的休眠状态，从而达到治疗癌症的目的。经过近十年的不断努力，现在已发现了多种有希望成为肿瘤治疗药物的新生血管 抑制剂。其中最具代表性的是人血管内皮抑制素(human endostatin) 0有关人血管内皮 抑制素(Endostatin)国际上首先报道是1997年1月Cell杂志上刊登的美国哈佛医学 院福尔克曼(Folkman)研究小组的鼠内皮抑素基因的论文，该研究发现Angiostatin和 Endostatin可以消除小鼠体内恶性肿瘤，而且未再复发。这两种药物是以阻止为肿瘤提 供营养的血管的生长从而治疗肿瘤的。当时引起了国际轰动，Endostatin迅速成为肿瘤 治疗领域的研究热点。美国FDA在没有完成临床前研究的情况下特批30例对其它药物 已无反应的晚期癌症病人于99年初用人血管内皮抑制素(Angiostatin)和鼠内皮抑素 (Endostatin)混合基因工程针剂进行临床试验。。目前，Endostatin已经通过了 FDA的一 期临床，目前正处于二期临床阶段。但由于Endostatin的溶解性较差，使得它的制备成本 升高，同时在使用上也只能采用水针剂型，这使它的应用受到了很大的限制。p43蛋白是哺乳类动物氨酰tRNA合成酶的辅助因子，一方面直接调节内皮细胞形 成毛细血管的生理过程，另一方面通过改变微环境来抑制肿瘤血管的生成。P43蛋白的抗血 管生成活性及抑制肿瘤生长作用已经在体外及动物实验获得证实。人基因重组P43蛋白显 示出其被开发成新型治疗癌症药物的潜力，对抗多种原发性和转移性实体肿瘤均有效，并 可与化疗和放疗协同治疗。p43蛋白作为人体氨酰tRNA合成酶系的家族成员并且是内皮单核细胞激活肽的前体于1997年被Sophie Q等人发现。p43蛋白为单链蛋白，全长312个氨基酸，二级结构含有11个β片层。韩国Imagene公司(W001/95927)对人ρ43蛋白的结构、生物活性进行 了深入的研究，结果显示人Ρ43蛋白可以抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长，以及 抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成，这说明Ρ43蛋白具有潜在的抗肿瘤作用。但是，目前仍需要对ρ43蛋白进一步改进，得到抗肿瘤效果更好的药物。
发明内容
本发明的发明人经过大量研究发现，将ρ43蛋白的312个氨基酸的一部分切除得 到的缺失型Ρ43蛋白具有更高的抗肿瘤活性。因此，本发明的一个目的是提供缺失型ρ43蛋白，其具有更高的抗肿瘤活性。本发明的另一个目的是提供缺失型ρ43蛋白在治疗抗肿瘤药物中的用途。本发明的还有一个目的是提供一种用于抗肿瘤的药物组合物，它包含缺失型ρ43 蛋白。本发明一方面提供了一种缺失型ρ43蛋白，它包括SEQ ID Ν0:1所示氨基酸序列 中缺失第1-100位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括SEQ ID NO=I所示氨基酸 序列中缺失第1-80位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括SEQ ID NO=I所示氨基酸 序列中缺失第5-80位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括SEQ ID NO=I所示氨基酸 序列中缺失第5-72位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白包括下列所示的蛋白(I)SEQ ID NO :2 序列(2) SEQ ID NO 3 序列(3) SEQ ID NO 4 序列(4) SEQ ID NO 5 序列(5) SEQ ID NO 6 序列。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型ρ43蛋白与BSA、PEG和/或人血白蛋白 的等分子偶联，形成多肽偶联物。在本发明的一个优选实例中，所述的偶联物由多肽、交联剂和BSA构成，其中所述 的交联剂戊二醛或EDAC。本发明还还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，它包含(a)安全有效量的本发明所 述的缺失型P43蛋白、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还提供了本发明所述的缺失型p43蛋白在制备治疗肿瘤药物中的用途。本发明还提供了编码本发明所述缺失型p43蛋白的核苷酸序列。通过构建缺失型p43蛋白，能确定特异性抑制新生血管生成的结构域从而减少副 作用，此外缺失型P43蛋白的分子量更小，从而易于吸收、具有更高的疗效。
图1表示p43系列缺失体目的片断的PCR扩增结果。图2A表示目的蛋白诱导的结果。图2B表示表达形式分析。图3表示p43系列缺失体纯化图谱。图4表示p43系列缺失体纯化流程图。图5表示p43缺失体对HUVEC管腔形成的作用。
图6表示p43缺失体对HUVEC迁移抑制结果。
具体实施例方式本发明涉及的药物组合物包含安全有效量的本发明涉及的化合物和药物上可接 受的载体。“安全有效量”系指在普遍认同的医学判定范畴内，化合物的用量足以改善待治 病情，且治疗时并未出现严重的副作用。某化合物的安全有效量应根据具体的待治病情、接 受治疗的病人的年龄和生理状况、病情严重程度、疗程长短、药用载体及给药途径等因素而 确定。此时组合物中包含按重量计约0. 至约99. 9%的化合物。在本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％ )或者份都指相对于纯的树脂的重 量百分数或者重量份。在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合 形成新的技术方案。在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方 式可以相互组合形成新的技术方案。在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100%。在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的 缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了 “0-5” 之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组 合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“ 1-N”表示1、2……N，其中N是 整数。在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两 种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个 或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限 定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限 可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了 60-120和80-110的范围， 理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如 果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、和2-5。在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，p43蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1所示。在本文中，除非另有说明，缺失型p43蛋白表示截短的SEQ ID NO :1所示的蛋白或 其保守性变体。在本文中，除非另有说明，缺失第N位氨基酸表示缺失SEQ ID NO :1氨基酸序列中 第I-N位氨基酸，其中N表示1-312的整数。例如，缺失第1-10位氨基酸表示SEQID NO=I 氨基酸序列中分别缺失第1位氨基酸、第1-2位氨 基酸、第1-3位氨基酸……第1-10位氨 基酸所得到的氨基酸序列的组合。本发明一方面提供了一种缺失型p43蛋白，它包括SEQ ID N0:1所示氨基酸序列 中缺失第1-100位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括SEQ ID NO=I所示氨基酸 序列中缺失第1-80位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的另一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括SEQ ID NO=I所示氨基 酸序列中缺失第5-80位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的另一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括SEQ ID NO=I所示氨基 酸序列中缺失第5-72位氨基酸所得到的蛋白。在本发明的还有一个优选实例中，所述缺失型p43蛋白包括下列所示的蛋白(I)SEQ ID NO 2 序列(p43_l)(2) SEQ ID NO 3 序列(p43_2)(3) SEQ ID NO 4 序列(p43_3)(4) SEQ ID NO 5 序列(p43_4)(5) SEQ ID NO :6 序列(p43_5)在本发明中，所述p43蛋白是常规的，现有技术中已经公开了其制备方法和序列， 具体参见US5641867和W00195927，上述专利文献的所有内容以引用的方式全文插入于此。 在本发明的一个优选实例中，所述P43蛋白由信谊药厂提供。 在本发明中，所述形成缺失型p43蛋白的方法是常规的，本领域的普通技术人员 根据本发明的描述可以直接得到所述缺失型P43蛋白。在本领域中，所述形成缺失型p43 蛋白的方法一般包括宿主表达方法、直接合成方法和全长蛋白质切割方法等。在本发明中，所述缺失型p43蛋白也可用于与例如BSA、PEG和/或人血白蛋白的 等分子偶联，从而形成多肽偶联物。通常，所述的偶联物由多肽、交联剂和BSA构成，其中所 述的交联剂优选为戊二醛或EDAC。此外，本发明的缺失型p43蛋白及其偶联物还可用于制备抗肿瘤的药物组合物。因此，本发明另一方面提供了一种抗肿瘤的药物组合物，它包含(a)安全有效量 的本发明缺失型P43蛋白、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发 明缺失型P43蛋白的数量通常为10微克到100毫克/剂，较好为100微克到50毫克/剂， 更好1000微克到10毫克/剂，最好3000到5000微克/剂。本发明所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或 是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型 和健康状况、疾病的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约1微克到100毫克/千克体重/天，较好为100微克到50毫克/千克体重/天本发明的蛋白。药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样的一些药剂载体它们本身不诱导产生对接受该组合物 的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的， 在 Remington，s Pharmaceutical Sciences (Mark Pub. Co. ,N. J. 1991)中可找到关于药学 上可接受的赋形剂(载体)的充分讨论。这类载体包括(但不限于)盐水、缓冲液、葡萄 糖、水、甘油、乙醇、佐剂、及其组合。治疗或预防性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙 醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。通常，可将治疗或预防性组合物制成可注射剂型，例如液体溶液或悬液，还可制成 在注射前适合混入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。—旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动 物，尤其是人。本发明的含本发明多肽的治疗或预防性药物组合物，可以经口服、皮下、皮内、静 脉注射、肌内注射等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。实施例实施例1 制备SEQ ID NO 2氨基酸序列的缺失型p43蛋白(p43_l)目的片断的PCR扩增以中国专利申请CN101225371A中公开的p43蛋白的表达质粒为模版，以表1所示 的引物组(引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)，采用K0D-plUS(T0Y0B0)反应体系分 别PCR扩增SEQ ID N0:7的核苷酸序列(表2)，琼脂糖凝胶电泳结果表明，扩增得到了 大小与预期相符合的目的条带(图1)。表1_产物名称_ 引物组 ._ 产物(bp)
SEQ ID NO 2 PrimerOl&Primer06945
SEQ ID NO 3 Primer02&Primer06918
SEQ ID NO 4 Primer03&Primer06909
SEQ ID NO 5 Primer04&Primer06744
SEQ ID NO 6 Primer05&Primer06720_
、，’； ；< :.引物序列 tν
PrimerOl5'- CGGAATTCTAATGGATGCTGTTCTG -3' Primer025 ‘ - CGGAATTCTAATGAAGGGTGCAGAG -3 ‘
Primer035'- CGGAATTCTAATGGAGGCAGATCAA -3'
Primer045'- CGGAATTCTAATGCAAAATGGAGTG -3'
Primer055'- CGGAATTCTAATGTTTCCATCTGGT -3'
Primer065'- CGCTCGAGTTTGATTCCACT -3'表2
___— -PCR 反应体系(50μ$~"
KOD plus 缓冲液 5μ1，2mM dNTP 5μ1, 25mM MgSO4 2μ1,模板—0.5μ1，25ρΜ 上— 下游引物各 Ιμ ，KOD plus Ιμ , H2O 34.5μ1
^ -__-- >αι 反应程序:^~—
94。c 2 分钟 ^ —^
'94°C 15sΓ 940C 15sp4°C 15s
5个循环58°C^30s 5个循环55°C 30^ 25个循环52°C 30s <
、68°C 60sL 680C 60s68 °C 60s表达载体的构建PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、割胶回收、纯化；利用EcoR I和Xho I (TaKaRa) 分别双酶切各个PCR产物及pTIG-Trx质粒载体。以T4 DNA(TaKaRa)连接酶4°C连接过夜， 连接产物转化E. coli TOPlO感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司)。筛选具有外源DNA插入的阳性克隆。经ABI 3700型测序仪、采用T7pr0m0ter和 T7terminator引物双向测序，结果证明得到了 SEQ ID NO :7核苷酸序列的目的基因。分别转化pTIG-Trx_p43系列缺失体至E. coli BL21 (DE)感受态细胞(天根生化 科技(北京)有限公司)，经小量培养、质粒抽提及EcoR I和Xho I双酶切鉴定具有正确目 的基因插入的单菌落，扩大培养，建立带有SEQ ID NO :7核苷酸序列表达载体的工程菌。将构建好的工程菌接种于液体LB中，200rpm、37°C培养至0. D. 600为0. 4-0. 6，加入 终浓度为ImM的IPTG，200rpm、37°C继续培养4h。离心收集菌体，再以20mM Tris (pH8. 0)重悬菌体，超声裂菌，SDS-PAGE分析表达形式(图2)。扩大培养后收集得到的菌体，加入ImM PMSF冰浴条件下超声破碎菌体， 40C 9000rpm离心30min，收集上清。以HisTrap FF亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，收集 洗脱液，冷冻干燥浓缩，得到SEQ ID N0:2氨基酸序列的缺失型p43蛋白(图3)，具体纯化 流程如图4。^MM 2 制各SEQ ID NO =3 t[某酸序歹U的缺失型p43舶(d43_2)如实施例1相同的方法制备SEQ ID NO 3氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的 是用表2所示的相应引物合成SEQ ID NO :8核苷酸序列的目的基因。实施例3 制备SEQ ID NO 4氨基酸序列的缺失型d43蛋白(D43_3)如实施例1相同的方法制备SEQ ID NO 4氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的 是用表2所示的相应引物合成SEQ ID NO :9核苷酸序列的目的基因。实施例4 制备SEQ ID NO 5氨基酸序列的缺失型d43蛋白(D43_4)如实施例1相同的方法制备SEQ ID NO 5氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的是用表2所示的相应引物合成SEQ ID NO: 10核苷酸序列的目的基因。实施例5 制备SEQ ID NO 6氨基酸序列的缺失型d43蛋白(D43_5)如实施例1相同的方法制备SEQ ID NO 6氨基酸序列的缺失型p43蛋白，不同的 是用表2所示的相应引物合成SEQ ID NO :11核苷酸序列的目的基因。实施彻丨6 :P43系歹1|缺失彳本蛋白抑制肿瘤新生血管牛成实骀材料和方法M199，FBS及胰酶购自 Gibico ；Transwell 购自 corning ；Matrigel 购 自BD Biosciences ；纤维粘蛋白购自Sigma ；荧光染料Calcein AM购自Biotium。细胞培养人脐静脉内皮细胞株(HumanUmbili cal Vein Endothelial Cells, HUVEC)细胞由中国药科大学药物筛选中心袁胜涛副教授惠赠。细胞培养于含10% FBS的 M199培养基中，37°C、5% CO2孵箱中培养。待细胞处于指数生长期时进行实验。内皮细胞管腔形成抑制实验Matrigel胶在冰上融化后，加入预冷的96孔板中(60 μ 1/孔)，37°C放置30分钟 使其凝固。每孔加入用含10% FBS的M199培养液稀释的HUVEC (3. 0 X IO4个细胞/100 μ 1/ 孔)。同时分别加入一系列终浓度为50ymOl/ml的ρ43全长及缺失体样品，37°C孵育4h， 加荧光染料Calcein AM染色，荧光显微镜下观察，随机选三个视野拍照(X100)。实验结果表明p43-l、p43-2、p43-3、p43-4和P43-5缺失型蛋白抑制血管内皮细 胞管腔形成的活性明显高于P43蛋白。p43蛋白作用的管腔还没有完全断裂、有比较完整 的管腔结构，而p43-l、p43-2、p43-3、p43-4和p43_5缺失型蛋白作用的管腔几乎都已断裂 (图 5)。内皮细胞迁移抑制实验以细胞迁移实验作为p43缺失体活性的定量检测方法，迁移抑制率作为活性高低 的评价标准。把缺失体蛋白的迁移抑制率与全长人P43蛋白进行比较。HUVEC经血清饥饿 4-5h。在Transwell的下室面涂上纤维粘蛋白，置超净台内风干。胰酶消化细胞，用PBS润 洗，以含0.2% FBS的M199培养基重悬、计数。取细胞悬液180 μ 1加入内室(105个细胞)。 外室加入10 % FBS的Μ199培养基，540 μ 1/孔。将ρ43全长及缺失体于内室中加入20 μ 1， 外室中加入60 μ 1 (终浓度为50 μ mol/ml)，混勻，并以PBS作为阴性对照。将培养板置于37°C、5% CO2培养箱内培养16-18h。弃去孔中培养液，用90%乙醇固定细胞lOmin。用棉 签轻轻擦去内室上层未迁移的细胞，0. 1%结晶紫室温染色lOmin，用PBS漂净多余染料，以 10%乙酸ΙΟμΙ/孔抽提lOmin。以酶标仪在595nm波长测定光吸收。根据以下公式计算迁 移抑制率迁移抑制率=(A对照-A处理)/A对照X 100%。在相同条件下，p43-l、p43-2、p43_3、p43_4和p43_5缺失型蛋白的血管内皮细胞 的迁移抑制活性明显高于全长的P43蛋白(表3)。表3、p43缺失体对HMEC-I迁移抑制结果A
p43-l p43-2 p43-3 p43-4 p43-5 p43 全长
A0.453 0.375 0.206 0.407 0.332 0.552
A595
^0.4710.40.2970,3610.3370.404
_0.4230.480.2630.3510.3120.414
均值0.4490.4180.2550.3730.3270.457 迁移抑制率
^14.420.351.328.937.713
(%)__
p43-lp43-2p43-3p43-4p43-5p43 全长
1.4531.4630.9151.3250.9021.576
As95 1.4231.3131.0721.670.7371.803
_1,4951.6431.1311.7190.7331.724
均值_1.4571.4731.0391.5710.7911.701
迁移抑制率
23.522.745.417.558.510.7
___(%)_
样品p43-lp43-2p43-3p43-4p43-5ρ 全长
迁移抑制
1921.5 48.4 23.2 48.111.8
率(％)序列表<110>信谊药厂<120>Ν端缺失型ρ43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用
<130)090786<160>11<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>312<212>PRT<213>p43 蛋白<400>1Met Ala Asn Asn Asp Ala Val Leu Lys Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ala151015Glu Ala Asp Gln lie lie Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val Ser Leu Leu202530Lys Glu Lys Ala lie Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu Lys Lys Leu354045Arg Val Glu Asn Ala Lys Leu Lys Lys Glu lie Glu Glu Leu Lys Gln505560Glu Leu lie Gln Ala Glu lie Gln Asn Gly Val Lys Gln lie Ala Phe65707580Pro Ser Gly Thr Pro Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser Glu Asn Val859095lie Gln Ser Thr Ala Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Thr Lys Glu Gln100105110lie Lys Gly Gly Thr Gly Asp Glu Lys Lys Ala Lys Glu Lys lie Glu115120125Lys Lys Gly Glu Lys Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ser lie Ala Gly Ser130135140Ala Asp Ser Lys Pro lie Asp Val Ser Arg Leu Asp Leu Arg lie Gly145150155 160Cys lie lie Thr Ala Arg Lys His Pro Asp Ala Asp Ser Leu Tyr Val165170175Glu Glu Val Asp Val Gly Glu lie Ala Pro Arg Thr Val Val Ser Gly180185190Leu Val Asn His Val Pro Leu Glu Gln Met Gln Asn Arg Met Val lie195200205Leu Leu Cys Asn Leu Lys Pro Ala Lys Met Arg Gly Val Leu Ser Gln210215220Ala Met Val Met Cys Ala Ser Ser Pro Glu Lys lie Glu lie Leu Ala225230 235240Pro Pro Asn Gly Ser Val Pro Gly Asp Arg lie Thr Phe Asp Ala Phe245250255Pro Gly Glu Pro Asp Lys Glu Leu Asn Pro Lys Lys Lys lie Trp Glu260265270
Gln lie Gln Pro Asp Leu His Thr Asn Asp Glu Cys Val Ala Thr Tyr275280285Lys Gly Val Pro Phe Glu Val Lys Gly Lys Gly Val Cys Arg Ala Gln290295300Thr Met Ser Asn Ser Gly lie Lys305310<210>2<211>308<212>PR1<213>p43_l 蛋白<400>2Asp Ala Val Leu Lys Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ala Glu Ala Asp Gln151015lie lie Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val Ser Leu Leu Lys Glu Lys Ala202530lie Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu Lys Lys Leu Arg Val Glu Asn354045Ala Lys Leu Lys Lys Glu lie Glu Glu Leu Lys Gln Glu Leu lie Gln505560Ala Glu lie Gln Asn Gly Val Lys Gln lie Ala Phe Pro Ser Gly Thr657075 80Pro Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser Glu Asn Val lie Gln Ser Thr859095Ala Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Thr Lys Glu Gln lie Lys Gly Gly100105110Thr Gly Asp Glu Lys Lys Ala Lys Glu Lys lie Glu Lys Lys Gly Glu115120125Lys Lys Glu Lys Lys Gln Gln Ser lie Ala Gly Ser Ala Asp Ser Lys130135140Pro lie Asp Val Ser Arg Leu Asp Leu Arg lie Gly Cys lie lie Thr145150155 160Ala Arg Lys His Pro Asp Ala Asp Ser Leu Tyr Val Glu Glu Val Asp
165170175Val Gly Glu lie Ala Pro Arg Thr Val Val Ser Gly Leu Val Asn His180185190Val Pro Leu Glu Gln Met Gln Asn Arg Met Val lie Leu Leu Cys Asn195200205Leu Lys Pro Ala Lys Met Arg Gly Val Leu Ser Gln Ala Met Val Met210215220Cys Ala Ser Ser Pro Glu Lys lie Glu lie Leu Ala Pro Pro Asn Gly225230235 240Ser Val Pro Gly Asp Arg lie Thr Phe Asp Ala Phe Pro Gly Glu Pro245250255Asp Lys Glu Leu Asn Pro Lys Lys Lys lie Trp Glu Gln lie Gln Pro260265270Asp Leu His Thr Asn Asp Glu Cys Val Ala Thr Tyr Lys Gly Val Pro275280285Phe Glu Val Lys Gly Lys Gly Val Cys Arg Ala Gln Thr Met Ser Asn290295300Ser Gly lie Lys305<210>3<211>299<212>PRT<213>p43_2 蛋白<400>3Lys Gly Ala Glu Ala Asp Gln lie lie Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val151015Ser Leu Leu Lys Glu Lys Ala lie Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu202530Lys Lys Leu Arg Val Glu Asn Ala Lys Leu Lys Lys Glu lie Glu Glu354045Leu Lys Gln Glu Leu lie Gln Ala Glu lie Gln Asn Gly Val Lys Gln505560lie Ala Phe Pro Ser Gly Thr Pro Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser657075 80Glu Asn Val lie Gln Ser Thr Ala Val Thr Thr Val Ser Ser Gly Thr
859095Lys Glu Gln lie Lys Gly Gly Thr Gly Asp Glu Lys Lys Ala Lys Glu
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<212>DNA<213>p43-5 核苷酸序列〈400〉11tttccatctggtactccact gcacgctaat tctatggttt ctgaaaatgtgatacagtct60acagcagtaacaaccgtatc ttctggtacc aaagaacaga taaaaggaggaacaggagac120gaaaagaaagcgaaagagaa aattgaaaag aaaggagaga agaaggagaaaaaacagcaa180tcaatagctggaagtgccga ctctaagcca atagatgttt cccgtctggatcttcgaatt240ggttgcatcataactgctag aaaacaccct gatgcagatt ctttgtatgt ggaagaagta300gatgtcggagaaatagcccc aaggacagtt gtcagtggcc tggtgaatcatgttcctctt360gaacagatgcaaaatcggat ggtgatttta ctttgtaacc tgaaacctgcaaagatgagg420ggagtattatctcaagcaat ggtcatgtgt gctagttcac cagagaaaattgaaatcttg480gctcctccaaatgggtctgt tcctggagac agaattactt ttgatgctttcccaggagag540cctgacaaggagctgaatcc taagaagaag atttgggagc agatccagcctgatcttcac600actaatgatgagtgtgtggc tacatacaaa ggagttccct ttgaggtgaaagggaaggga660gtatgtagggctcaaaccat gagcaacagt ggaatcaaa699
权利要求
一种缺失型p43蛋白，它包括SEQ ID NO1所示氨基酸序列中缺失第1-100位氨基酸所得到的蛋白。
2.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括SEQID NO 1所示氨基酸序列中缺失第1-80位氨基酸所得到的蛋白。
3.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括SEQID NO 1所示氨基酸序列中缺失第5-80位氨基酸所得到的蛋白。
4.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括SEQID NO 1所示氨基酸序列中缺失第5-72位氨基酸所得到的蛋白。
5.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白包括下列所 示的蛋白(1)SEQID NO 2 序列(2)SEQ ID NO 3 序列(3)SEQ ID NO 4 序列(4)SEQ ID NO 5 序列(5)SEQ ID NO 6 序列。
6.如权利要求1所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述缺失型p43蛋白与BSA、PEG 和/或人血白蛋白的等分子偶联，形成多肽偶联物。
7.如权利要求6所述的缺失型p43蛋白，其特征在于所述的偶联物由多肽、交联剂和 BSA构成，其中所述的交联剂戊二醛或EDAC。
8.一种抗肿瘤的药物组合物，它包含(a)安全有效量的权利要求1所述的缺失型P43 蛋白、偶联物或其组合；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
9.权利要求1所述的缺失型p43蛋白在制备治疗肿瘤药物中的用途。
10.编码权利要求1所述缺失型p43蛋白的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及缺失型重组人p43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用。通过构建缺失型p43蛋白，能确定特异性抑制新生血管生成的结构域从而减少副作用，此外缺失型p43蛋白的分子量更小，从而易于吸收、具有更高的疗效。
文档编号A61K38/17GK101824082SQ20091004714
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者刑玉华, 刘刚, 刘大涛, 吴光昊, 姚钰舜, 王嬿, 王慧敏, 王渊琦, 胡立德, 谭小钉, 邹亮, 黄相红 申请人:信谊药厂