专利名称：一种抑制血管新生十肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的抗血管新生蛋白多肽Kp-lO，以及该蛋白多肽的应用， 属于生物医药技术领域。
背景技术：
癌症与心血管疾病、糖尿病是威胁人类健康的三大疾病。恶性肿瘤是目前大 多数国家疾病性死亡的第一原因，同时，随着环境以及人们生活习惯的改变，癌 症病例数呈上升趋势。
上世纪70年代，哈佛大学医学院Judah Folkman首次提出通过抑制血管新 生来抑制肿瘤的生长和转移。肿瘤在没有养分的供应下，只能长到2—3立方毫 米。如果有新生血管与肿瘤相连，肿瘤获得营养物质与氧气，便能以几何级数迅 速生长；同时肿瘤细胞还可以通过新生的血管转移到其他器官，发生肿瘤转移， 导致人体死亡。由于肿瘤种类繁多，而且肿瘤细胞生长快，极易发生突变，因此 易对药物产生耐药性，而血管的内皮细胞由于遗传稳定，突变概率相对小得多。 因此理论上应用抗血管新生药物不易产生耐药性，而且抗血管新生药物具有广谱 的抗肿瘤活性。
除了肿瘤以外，血管新生失调还会引起关节炎、糖尿病性视网膜病变及老年 黄斑病变动脉粥样硬化、子宫内膜炎、牛皮癣、子宫平滑肌瘤、良性前列腺肥大 等多种疾病。2004年，美国FDA批准第一例血管新生抑制剂用于肿瘤治疗，并 发现血管新生抑制剂可以治疗多种肿瘤，并可用來治疗失明等其他疾病，现有多 种血管新生制剂在进行临床实验。
Kissp印tin-lO (Kp-10)是來源于人类KISS1基因翻译产物的一种十肽，该十 肽通过与G蛋白偶联受体一GPCR54 (G protein—coupled receptor—54)的结合 行使生物学功能，目前国内外没有Kp-10对血管新生以及肿瘤生长方面的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗血管新生的蛋白多肽，该多肽是人(Homo sapien)来源的，氨基酸序列YNWNSFGLRF，分子量为1303.4，命名为Kp-lO，
及其活性片段、衍生物和类似物。
本发明的另一个目的是提供编码该蛋白多肽的多核苷酸片段。 本发明的另一个目的是提供Kp-10在制备治疗与血管新生异常相关的疾病
的药物中的应用。
本发明提供的抑制血管新生十肽是人(Homo sapien)來源的，氨基酸序列 YNWNSFGLRF， 分子量为1303.4 ,命名为Kp-10，本发明还提供了上述抗血
3管新生的蛋白多肽的保守性。
本发明的第二个方面，提供编码抑制血管新生十肽的多核苷酸片段，该多核 苷酸包括一核苷酸,该核苷酸与选自下列一组核苷酸序列有至少70%同源性(1 ) 编码上述抗血管新生肽Kp-10的多核苷酸；(2)与多核苷酸(1)互补的多核苷 酸；
本发明的第三方面，本发明的多肽或其一部分可以用于制备治疗和/或预防 血管新生方面引起的疾病的药物中的应用。
如本文所用，"新的抗血管新生肽"Kp-lO是指抗血管新生蛋白多肽中基本上 不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。
本发明提供了一种新的多肽——抗血管新生多肽Kp-lO。本发明的多肽可以 是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌，酵母，高 等植物，昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组方案所用的宿主，本发明的多 肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。
本发明的多肽还可以包括或是不包括起始的甲硫氨酸残基。 本发明还包括抗血管新生蛋白多肽Kp-10的片段、衍生物和类似物。如本发 明所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的抗血管新生 蛋白多肽Kp-10相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽片段、衍生物和类 似物是指(I )这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸 残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，而且取代的氨基酸可以是也可以不是有 遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个
基团被其它基团取代包含取代基；或是(ni)这样一种，多肽与另一种化合物(比
如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中 附加的氨基酸融合进多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化 此多肽的序列或蛋白原序列)。通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物 被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
"同源性"是指同一袓先来源的物种间生物迸化距离的远近，主要反应在核苷 酸或是氨基酸上。通常将序列排列起来，以获得最大限量的匹配，"同源性"本身 具有本领域认识的意义并且可用公开的技术计算。该术语"同源性"为技术人员周 知。测定同源性或形似性的方法以按规则编在计算机程序中，任选的、用于测量 两个序列间的同源性或相似性的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包。
通过一种多肽进行说明，其所具有的氨基酸序列YNWNSFGLRF与参考氨 基酸序列至少具有70%的"同源性"是指YNWNSFGLRF序列中，该多肽之氨 基酸序列与参考序列至少70%相同的多肽，参考序列中多达25°/。的氨基酸序列 可被删除或被另一氨基酸取代，或可将一些氨基酸序列插入多肽序列中。其中插 入的氨基酸多达参考氨基酸之总氨基酸残基的25%，参考序列的这些突变可发 生在参考序列的氨基或羧基末端位置，或在氨基末端之间的任意地方，它们或单独分散在参考序列的参加中，或在一个或多个附近存在于参考序列中。
本发明在于Kp-10在制备血管新生抑制药物中的应用，尤其是Kp-10在制备 抑制癌症以及类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病综合症、血管瘤等血管新生依赖 性疾病中的相关应用。
根据本发明可以将治疗有效量的Kp-10和药学上允许的任意一种辅料制成 药物组合物，也可以添加其他与Kp-10没有拮抗作用的抗血管新生药物。其制剂 可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口 服液、注射剂、脂质体等。
为实施本发明的方法，Kp-10可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入 式je存器给药。"肠胃外"包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、 滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输入技术。
口服可用固体或液体状的剂量单位，如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、 颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。
末剂是将本发明化合物磨成适当的细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成 适当的细度，然后与同样细度的医药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水 化合物等)混合制成。根据需要，也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、 香料等物质。
胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂和散剂或入片剂部分所述的颗粒化 的物质填充到胶囊外壳中而制成。也可将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质 中，然后在胶囊中进行填充。若添加助溶剂和崩解剂等，如聚乙二醇，碳酸钠， 可改善胶囊摄取时的药效。
本发明的有益结果
本发明公开了蛋白多肽Kp-10及其在制备抗血管新生药物中的应用。在 VEGF(血管内皮细胞生长因子)诱导的系列实验结果表明，Kp-10在人脐带静脉内 皮细胞(HUVEC)增殖实验、迁移实验、微管形成实验、鸡胚尿囊膜血管新生 和小鼠角膜实验中均有明显的抑制作用，可能可用于制备抑制血管新生的药物。
图中均以p<0.05表示有显著差异，*,p<0.05， **，p<0.01， ***,p<0.001。
图l:浓度为1微摩尔/升的Kp-10抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移(左 边为VEGF对照组，右边为VEGF+ Kp-10组)；
图2:浓度为1微摩尔/升的Kp-10抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)Boyden 小室中的迁移(左边为VEGF对照组，右边为VEGF+ Kp-10组)；
图3:浓度为1微摩尔/升的Kp-10抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)微管 形成(左边为未加Kp-10对照组，右边为加Kp-10组)；
图4: 10微克Kp-10抑制鸡胚尿囊膜新生血管新生(左边为生理盐水对照组， 右边为加Kp-10组，箭头所指为新生血管)；图5: l微克Kp-10抑制抑制VEGF诱导的角膜血管新生，箭头所指为缓释 颗粒位置,(左边为VEGF对照组，右边为VEGF+Kp-10组)。
具体实施例方式
实施例l: Kp-10抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖
目的和原理人脐静脉内皮细胞增殖实验采用MTSAssay。 MTS Assay是一 种运用比色法来间接测量活细胞数量的测定方法。CellTiter 96 AQueous单溶液 试剂包含一种四唑化合物(内盐;MTS)和一个电子耦合试剂(乙硫吩嗪，PES)。 MTS可被有代谢活性细胞中脱氢酶作用生成可溶于组织培养基的颗粒，在490nm 测量产物的吸光值与培养物中活细胞的数量直接成正比。
方法向96孔板中加入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，设立对照组和加样组。 对照组加入溶剂，加样组加入不同浓度的Kp-10多肽，每个浓度做三个复孔。孵 育48 — 72小时后，加入细胞增殖检测试剂，再孵育4个小时，用酶标仪在490nrn 处检测吸光值，同样的实验共进行三遍。
结果与评价与实验对照组相比，人脐静脉内皮细胞增殖能力受到抑制，说 明KP-10可以抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。
实施例2:划痕实验中Kp-lO抑制人脐静脉内皮细胞迁移
目的和原理在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的作用下，人脐静脉内皮 细胞可以向没有细胞的划痕区域迁移。通过观察迁入划痕区的内皮细胞量，来评 价KP-10是否有具有抑制人脐静脉内皮细胞迁移的能力。
方法在6孔板中加入人脐静脉内皮细胞，大约长满时，用Tip头划一个十 字形划痕，用PBS洗净划下的细胞，加入含不同药物浓度及VEGF的培养基， 于5%(302培养箱中37'C培养至划线两侧的细胞迁移至划线区域。
结果评价在倒置显微镜下观察拍照统计，结果显示与对照组相比，加入 Kp-10肽后，人脐静脉内皮细胞的迁移受到抑制，说明Kp-10肽可以抑制人脐静 脉内皮细胞的迁移，同样的实验至少进行三遍。
实验实例3: Kp-lO肽抑制人脐静脉内皮细胞Boyden小室迁移
目的和原理Boyden迁移实验基于Boyden小室被微孔分离成两个部分。 细胞置于上面的部分，下面的部分含有趋化因子，在趋化因子的诱导下，上层细 胞可以穿过微孔膜迁移至膜的底部，并贴附在膜的背面，此实验可以检测药物对 内皮细胞穿过微孔膜能力的影响。
方法用明胶将小室包被，培养箱中37'C孵育后，弃明胶。小室外六孔板 中加入含有VEGF的细胞培养基，小室中接入细胞，在培养箱中孵育四小时后， 将所有培养液吸去，将小室在多聚甲醛中固定，用PBS洗三遍，苏木精伊红染 色，用洗液将多余染料洗去，显微镜下拍照计数，统计数据。
结果与评价与对照组相比，给予Kp-10后，人脐静脉内皮细胞穿过Boydeii 小室的能力受到抑制，说明Kp-10可以抑制内皮细胞穿过微孔膜的能力，同样的实验至少进行三遍。
实验实例4:Kp-10抑制人脐静脉内皮细胞成管
目的和原理Matrigel是从小鼠肉瘤中抽提得到的可容性基底膜抽提物，富 含细胞外基质蛋白，人脐静脉内皮细胞可以在Matrigel上贴附成管，可以利用 人脐静脉内皮细胞在Mtrigel上的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的 影响。
方法将Matrigel铺到48孔板上，于培养箱放置30分钟待其凝固。每孔加 入内皮细胞，再加入含有不同浓度Kp-10肽的培养基，于37'C5X培养箱中培养 过夜后在显微镜下观察微管形成情况。每孔选择不同部位，计算微管形成数量并 进行统计学分析，同样的实验至少进行三遍。
结果与评价内皮细胞在Matrigel中生长过夜后，单个细胞延伸形成三维网 状结构。结果显示与对照组相比，给予Kp-10之后，内皮细胞成管过程受到影响， 未能形成完整的网状结构，说明Kp-10可以抑制人微血管内皮细胞微管形成。
实施例5: Kp-10抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成
目的和原理鸡胚尿囊膜模型目前是国内外公认较为理想的血管新生类药物 筛选模型，特点是实验成本低，直观，数据可靠。将含药物的载体置于受精鸡胚 尿囊膜表面的无血管区，可观察到药物对新的微血管生成的影响。
方法将受精的鸡胚置于孵化箱中孵化5天，在超净工作台中，用酒精擦拭
表面，在鸡胚卵壳钝端丌一个小口，将含不同量的Kp-10加到灭菌的滤纸片上， 将滤纸片加在尿囊膜上，用透明胶带封口，放入孵育箱中继续孵育。
结果与评价孵育两天后，揭去透明胶带，在体视显微镜下拍照，用软件计
算滤纸周围一定环形范围内新生微血管数量，统计，结果显示与对照组比较，加
Kp-10之后，新生微血管生成数量较少，说明Kp-10可以抑制鸡胚尿囊膜的血管 新生，每组鸡胚数量为8-10。
实验实例6: Kp-10抑制小鼠角膜新生血管
目的与原理为了确证进一歩确证Kp-10肽对血管新生的影响，我们还用了
另外的体内模型——小鼠角膜模型来检验，虽然操作精细，但该模型是目前世界 研究血管新生的金标准之一，因为小鼠角膜是一个无血管区域，在角膜上诱导出
的血管全部为新生血管，其原理是在小鼠角膜上做一个小袋，植入含有血管内
皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，可以诱导存角巩缘处的血管向含有血管内 皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒的小袋生长。在缓释颗粒上同时加入VEGF 与Kp-10肽，观察这些诱导的血管面积是否有改变。
方法将C57/BL6小鼠麻醉，在小鼠角膜上开一个小口，然后植入含Kp-lO 和VEGF+Kp-10的颗粒，实验后继续饲养一周，然后观察结果。
结果与评价Kp-10可以抑制由血管内皮细胞生长因子缓释颗粒诱导的新生 血管，每组角膜鼠为7-8。
权利要求
1.一种抑制血管新生十肽，其特征在于氨基酸序列为YNWNSFGLRF，分子量为1303.4。
2. 根据权利要求1所述的抑制血管新生十肽，其特征在于包括氨基酸序列 同源性在70%及以上的变体或其衍生物。
3. 根据权利要求1所述的抑制血管新生十肽，其特征在于包括其对应的基 因组序列及其同源性在70%及以上的变体或其衍生物；
4. 权利要求1至3所述的抑制血管新生十肽在制备治疗和/或预防血管新生 疾病的药物中的应用。
5. 如权利要求4所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于制备成含有 该抑制血管新生十肽的药物组合物。
6. 如权利要求4所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于血管新生疾 病包括肿瘤、关节炎、眼病、血管瘤、银屑病。
7. 如权利要求6所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于关节炎是类 风湿性关节炎和炎性关节炎。
8. 如权利要求6所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于眼病包括新 生血管性角膜疾病、视网膜疾病、虹膜疾病、青光眼、脉络膜、白内障、玻璃体 眼病、视神经疾病。
9. 如权利要求8所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于视网膜疾病 为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或者视网膜动脉闭 塞。
10. 如权利要求8所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于脉络膜病为 湿性老年黄斑病变。
11. 如权利要求6所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于肿瘤包括原 发性和继发性的肿瘤。
12. 如权利要求6所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于血管瘤包括 多发性血管瘤、血管母细胞瘤和良性血管增生疾病。
13. 如权利要求4所述的抑制血管新生十肽的应用，其特征在于抑制血管新 生药物为抑制Kaposi' s肉瘤病变组织血管新生的药物，抑制白血病、淋巴瘤、 骨髓瘤血液癌症的药物，以及抑制Paget' s疾病的药物。
全文摘要
本发明涉及一种抑制血管新生十肽及其应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的抑制血管新生十肽是人(Homo sapien)来源的，氨基酸序列YNWNSFGLRF，分子量为1303.4，命名为Kp-10，本发明还提供了上述抗血管新生十肽在制备血管新生抑制药物中的应用，尤其是Kp-10在制备抑制癌症以及类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病综合症、血管瘤等血管新生依赖性疾病中的相关应用。在VEGF(血管内皮细胞生长因子)诱导的系列实验结果表明，Kp-10在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、迁移实验、微管形成实验、鸡胚尿囊膜血管新生和小鼠角膜实验中均有明显的抑制作用，可用于制备抑制血管新生的药物。
文档编号A61P9/00GK101597324SQ20091004687
公开日2009年12月9日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者刘明耀, 易正芳 申请人:华东师范大学