放射线敏感性肿瘤靶向启动子及用途的制作方法

专利名称：放射线敏感性肿瘤靶向启动子及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，更具体涉及一种放射线敏感性肿瘤靶向启动子，即对肿瘤靶向性端粒酶逆转录酶基因启动子进行修饰而得到修饰的启动子，还涉及利用该修饰了的启动子调控辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)自杀基因系统在破坏和抑制宫颈癌、肺癌、肝癌细胞生长的药物中的应用。

背景技术：
纵观国内外的疾病谱变化模式，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的重大疾病。随着分子生物学的进步，基因治疗为战胜肿瘤带来了希望。各国在恶性肿瘤基因治疗方面开展了大量研究并取得了一定成果，部分基因治疗方案已经用于临床，从安全性考虑，可以说适于肿瘤治疗。例如，中国拥有自主知识产权的重组人p53腺病毒注射液已获得国家食品药品监督管理局批准的新药证书，用于治疗头颈部癌症和胃癌等恶性肿瘤。
基因治疗的关键是靶向性问题，也就是把治疗效应限定在特定的靶细胞、靶组织或靶器官内，既达到治疗作用又不影响正常细胞和组织。外源调控在基因治疗中尤为重要。为了能特异而有效地杀伤肿瘤细胞，需要建立一种特异性高、活性强的启动子，来控制下游目的基因的表达。
启动子是基因的组成部分之一，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。基因治疗中，基因表达载体(质粒、病毒载体等)通过启动子调控其下游治疗基因的表达，达到特定的治疗目的。肿瘤特异性启动子能够调控治疗基因只在肿瘤细胞中表达，从而降低对正常细胞的损伤。通过肿瘤特异性启动子调控目的基因的表达被广泛地运用于肿瘤靶向基因治疗的研究中，这种方法遇到的困难在于，1.绝大多数选择性启动子只针对特殊的组织来源，而没有能够适用于不同组织来源的启动子；2.绝大多数选择性启动子启动效力较弱，很难达到治疗水平的转基因表达。到目前为止，几乎没有既有高特异性，又有高活性的肿瘤特异性启动子，这直接阻碍了基因治疗的发展。目前，hTERT基因启动子已被大多数学者公认为是针对恶性肿瘤普遍性较好的肿瘤特异性启动子，是较有希望应用于肿瘤靶向基因治疗的启动子。提高基因治疗中hTERT启动子活性，将有助于下游治疗基因的表达、提高疗效，这一点我们在治疗过程中应当重点考虑。
端粒酶是一种核糖核蛋白复合物，能够维持染色体末端的端粒长度。端粒酶在超过85％的人类恶性肿瘤细胞中具有高活性，而在正常组织(除生殖细胞和有高度复制潜能的体细胞)中被抑制或不表达(见参考文献Shay JW，BacchettiS.A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer，1997，33787-791)。细胞中hTERT的表达是端粒酶活性的主要决定因素，它在大部分肿瘤细胞中高表达(见参考文献Cong YS，Wright WE，Shay JW.Human telomeraseand its regulation.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66407-425)。hTERT基因启动子作为肿瘤特异性启动子被运用到多种肿瘤的靶向基因治疗方案中，但其活性较弱，下游基因表达产物往往难以实现理想的效果(见参考文献Gu J andFang BTelomerase promoter-driven cancer gene therapy.Cancer Biol Ther，2003，2S64-S70)。如果能够增强hTERT基因启动子的活性，必将推动肿瘤靶向治疗的进步，具有重要的理论和临床意义。
hTERT基因启动子虽然具有明显的肿瘤特异性，但其活性较弱，下游基因表达产物往往难以达到理想的效果(见参考文献J.Gu，B.Fang，Telomerasepromoter-driven cancer gene therapy，Cancer Biol Ther，2003，2S64-70；W.N.Keith，A.Bilsland，M.Hardie，T.R.Evans，Drug insightCancer cellimmortality-telomerase as a target for novel cancer gene therapies，NatClin Pract Oncol，2004，188-96)。研究发现射线能够增强人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)启动子活性，在基因治疗时提高其下游治疗基因的表达。在细胞和动物水平，联合治疗组与单纯基因治疗和单纯放疗相比，具有更加明显的杀伤效果(见参考文献廖正凯，周云峰，谢丛华等，γ射线增强喉癌细胞hTERT启动子活性研究，中华放射医学与防护杂志，2008，28；104-107；黄成虎，廖正凯，周福祥等.hTERT启动子在肿瘤基因放疗中的动物研究，中华肿瘤杂志，2008，30；733-736)。Wang等运用SV40增强子，CMV增强子，CMV增强子/启动子及SV40-CMV双增强子分别增强启动子转录活性，调控双自杀融合基因CDTK载体对宫颈癌Hela的杀伤作用，发现均能提高hTERT启动子的活性(见参考文献WANG Lina，ZHANGYakun，ZHOU Yin，et al.In vitro research of enhanced suicide gene vectorfor cervix cancer therapy.ChinMed Eng，2006，14567-570)。可见对hTERT启动子的修饰和改造可能提高其活性，且不影响其肿瘤特异性表达。
在1992年首次证明早期生长反应因子-1(EGR-1)基因启动子辐射反应元件(CArG)赋予了EGR-1基因启动子对X线的敏感性后(见参考文献Datta R，Rubin E，Sukhatme V，et al..Ionizing radiation activates transcriptionof the EGR-1 gene via CArG elements.Proc Natl Acad Sci USA 1992，89(21)10149-10153)，又有证明表明人工合成的CArG启动子经放射线照射后具有有效、特异的启动活性(见参考文献Marples B，Scott SK，Hendry JH，etal.，Development of synthetic promoters for radiation-mediated genetherapy.Cene Ther，2000，7(6)511-517；Scott SD，Marples B，Hendry JH，et al..A radiation-controlled molecular switch for use in gene therapyof cancer.Cene Ther，2000，7(13)1121-1125)，近年来多项研究证实，CArG元件可直接感受电离辐射的刺激而诱导其下游基因的表达(见参考文献MarplesB，Greco O Joiner MC，et al..Molecul arapproaches to chemo-radiotherapy.Eur J Cancer 2002，38(2)231-239；Scott SD，Joiner MC，Marples B.Optimizing radiation-responsive gene promoters for radiogenetic cancertherapy.Gene Ther，2002，9(20)；1396-1402)。人工合成Egr-1启动子比野生型启动子有明显优势。Marples报道人工合成单纯含有若干串联的CArG元件的碱基序列具有与野生型Egr-1启动子相同的放射诱导功能，甚至这种合成的启动子有更强的诱导能力(见参考文献Marples B，Scott SK，Hendry JH，et al.，Development of synthetic promoters for radiation-mediated gene therapy.Cene Ther，2000，7(6)511-517；Scott SD，Marples B，Hendry JH et al..A radiation-controlled molecular switch for use in gene therapy of cancer.Cene Ther，2000，7(13)1121-1125；Weichselbaum RR，Hallahan DE，BeckettMA，et al..Gene therapy targeted by radiation preferentiallyradiosensitizes tumor cells.Cancer Res，1994，54(16)4266-4269；MarplesB，Greco O，Joiner MC，et al..Molecular approaches to chemo-radiotherapy.Eur J Cancer，2002，38(2)231-239；Scott SD，Joiner MC，Marples B.Optimizing radiation-responsive gene promoters for radiogenetic cancertherapy.Gene Ther，2002，9(20)1396-1402)，提示以CArG元件为基础而合成的放射诱导启动子有望在将来基因治疗中发挥重要作用。另一些学者将CArG元件与另一种启动子组成双启动子，发现在CArG元件与CMV核心启动子组成的双启动子中，4个CArG元件可以明显地加强后者的启动作用(见参考文献Marples B，Scott SK，Hendry JH，et al.，Development of synthetic promotersfor radiation-mediated gene therapy.Cene Ther，2000，7(6)511-517)。
国内外目前没有将放射反应元件CArG与端粒酶逆转录酶启动子hTERT串联，以及将嵌合启动子串联CMV启动子的双启动子，并联合放射线提高他们调控下游基因表达的相关研究，但有理由相信，对于启动子的有目的的改造可以有效的提高其启动活性，增加下游治疗基因的表达，是有前景的提高基因治疗疗效的途径。
基因导向性酶前体药物疗法(gene-directed enzymeprodrug therapy，GDEPT)，亦称自杀基因疗法，是目前基因治疗领域研究的热点。其原理为当基因在肿瘤细胞中表达时可将全身给药的无毒性或毒性极低的药物前体转变成毒性代谢产物，在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞，避免全身或局部直接给药的副作用。人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)/丙氧鸟苷(GCV)系统和胞嘧啶脱氨酶(CD)/5-氟胞嘧啶(5-FU)系统都是被广泛研究的自杀基因治疗体系。辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)系统是新一代前药系统，与经典的HSV-TK/GCV系统相比具有更加快速和高效的肿瘤细胞杀伤作用(见参考文献Greco O，Folkes LK，Wardman P，et al.Development of a novel enzyme/prodrug combination forgene therapy of cancerhorseradish peroxidase/indole-3-acetic acid.Cancer Gene Ther，2000，71414-1420)。无毒的HRP/IAA系统显示出不依赖于细胞连接的细胞毒性和旁观者效应，在极端的肿瘤细胞缺氧条件下甚至更加高效，而且它能够有效地增强肿瘤细胞的放射敏感性(见参考文献Greco O，Rossiter S，Kanthou C，et al.Horseradish peroxidase-mediated gene therapychoice of prodrugs in oxic and anoxic tumor conditions.Mol Cancer Ther，2001，1151-160；Greco O，Tozer GM，Dachs GU.Oxic and anoxic enhancementof radiation-mediated toxicity by horseradish peroxidase/indole-3-acetic acid gene therapy.Int J Radiat Biol，2002，78173-81)，HRP/IAA系统是一种理想的基因治疗选择。HRP基因在肿瘤细胞中特异性表达是HRP/IAA系统发挥优势的关键。同时提示了将HRP/IAA系统与放射线的协同作用的诱人前景。


发明内容
本发明的目的是在于提供了放射线可诱导的肿瘤靶向启动子。它在大部分肿瘤细胞具有启动活性，而在正常细胞中活性很低，即具有针对肿瘤细胞的特异性活性。同时，射线照射可提高启动子下游治疗基因的表达。利用放射线的可控性，能够实现靶向增强启动子活性。因此，本发明所述的嵌合启动子(CArG)n-hTERTp以及(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)具有肿瘤靶向和高效的特点，适用于肿瘤靶向基因治疗。
本发明再一个目的是提供了放射线可诱导的肿瘤靶向启动子调控辣根过氧化物酶(HRP)/吲哚乙酸(IAA)自杀基因系统在制备治疗或预防宫颈癌、肺癌、肝癌细胞药物中的应用，即(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA联合放疗作为在制备治疗或预防宫颈癌、肺癌、肝癌细胞药物中的应用。此方案与单用放疗方案、单用(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA、以及两者疗效简单相加比较，对宫颈癌、肺癌、肝癌细胞具有更加明显的杀伤作用。嵌合启动子保证HRP/IAA只在肿瘤细胞局部发挥杀伤作用，具有肿瘤特异性。而且，放射线具有可控性的特点，即增强肿瘤局部疗效的同时不增加对正常细胞的损伤。
本发明采用多种人类肿瘤(宫颈癌、肺癌、肝癌)细胞进行研究，通过放射线联合嵌合启动子(CArG)n-hTERTp或(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)调控的下游荧光素酶报告基因(Luc)的表达，评价启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性，以及射线对嵌合启动子活性的影响。构建含嵌合启动子调控下游HRP基因表达的质粒，通过RT-PCR在mRNA水平、Western blot在蛋白质水平评价嵌合启动子调控下游治疗基因表达的可行性及放射诱导性，并且，通过检测细胞增殖率、细胞凋亡率来评价射线联合嵌合启动子调控HRP/IAA系统的协同杀伤作用和机制。具体发明内容如下 放射线可诱导的肿瘤靶向启动子，其步骤是 A.嵌合启动子(CArG)n-hTERTp的构建 1)在hTERT启动子上下游添加酶切位点Horikawa Izumi教授(NIH/NCI)通过PCR扩增出hTERT启动子全长(-3915至+40)通过酶切截取不同长度的启动子序列并比较它们的启动活性，结果发现含有-385至+40的hTERT启动子具有较高活性(见参考文献Horikawa，I.，Cable，P.L.，Mazur，S.J.et al..DownstreamE-box-mediated regulation of the human telomerase reverse transcriptase(hTERT)gene transcriptionevidence for an endogenous mechanism of transcriptionalrepression.Mol Biol Cell，2002；13(8)2585-2597)，Horikawa Izumi教授提供的质粒pBasic-hTERT promoter中含有-385至+40的hTERT启动子，为了在hTERT前后创造更多的酶切位点以便于后期研究，依据质粒pBasic-hTERT promoter测序结果，参考Genbank数据库中的核酸序列(AF098956)设计引物hTERT-f5’-CTAGCTAGCGGAATTCGTTACCCCACAGCTTAGGCCGATT-3’；hTERT-r5’-CCGCTCGAGAACTGCAGGGCCAGGGCTTCCCACGTG-3’，并送大连宝生物公司合成。
2)PCR扩增hTERT目的片断以质粒pBasic-hTERT promoter作为模板，用合成的引物进行PCR扩增，反应条件为94oC预变性5min；然后进入循环94℃30sec，65℃ 30sec，72℃ 30sec 30个循环；72℃延伸5min。将hTERT启动子的DNA片段扩增出来。用1％(W/V)琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，用DNA纯化回收试剂盒(Qiagen公司)纯化。
3)质粒phTERTp-Luc的构建连接PCR产物至Takara公司的pMD-19Tsimple载体中，筛选出正确的质粒pTS-hTERTp，用NheI/XhoI(Fermentas公司)将pTS-hTERTp及目的载体pGL3-Basic(Promega公司)双酶切，1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，连接反应后将连接产物转化至转化感受态大肠杆菌DH5α(Takara公司)，筛选阳性克隆，将正确的克隆送交Invetrogene公司测序，与Genbank数据库中的核酸序列(AF098956)比对，正确的克隆命名为质粒phTERTp-Luc，含有hTERTp启动子(E0)用于后续研究。
4)(CArG)n序列的设计和合成设计并合成四对互补的寡脱氧核糖核酸链5′-CGCGTGATAT(CCTTATTTGG)n-3′，5′-AATT(CCAAATAAGG)nATATCA-3′)(n＝4、6、8、10)94℃退火合成串联的辐射诱导元件，分别命名为(CArG)4、(CArG)6、(CArG)8、(CArG)10。
5)(CArG)n-hTERTp的构建上下游以Mlu I/EcoR I酶切位点为粘性末端；将辐射诱导元件插入MluI/EcoRI(Fermentas公司)双酶切后的质粒phTERTp-Luc，得到质粒p(CArG)n-hTERTp-luc(n＝4，6，8，10)。将正确的克隆送交测序。测序结果如下 ①.通过测序鉴定(CArG)4-hTERTp启动子(E4)的序列为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。构建过程见实施例1。(CArG)4-hTERTp启动子(E4)具有肿瘤特异性活性，即在正常组织细胞中无活性或活性很低(见实施例2)，而在肿瘤细胞中具有明显的活性(见实施例3、4、5)。构建含有该启动子调控下游HRP基因的质粒p(CArG)4-hTERTp-HRP后，转染不同肿瘤细胞(见实施例1)，发现嵌合启动子(CArG)4-hTERTp可以调控下游HRP治疗基因表达。并且，放射线照射后，嵌合启动子调控下游治疗基因HRP表达量明显升高(见实施例6)。
②.通过测序鉴定(CArG)6-hTERTp启动子(E6)的序列为SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。构建过程见实施例1。(CArG)6-hTERTp启动子(E6)具有肿瘤特异性活性，即在正常组织细胞中无活性或活性很低(见实施例2)，而在肿瘤细胞中具有明显的活性(见实施例3、4、5)。构建含有该启动子调控下游HRP基因的质粒p(CArG)6-hTERTp-HRP后，转染不同肿瘤细胞(见实施例1)，发现嵌合启动子(CArG)6-hTERTp可以调控下游HRP治疗基因表达；放射线照射后，嵌合启动子调控下游治疗基因HRP表达量明显升高(见实施例6)。放射线与p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA联合后对人宫颈癌、肺癌、肝癌细胞的杀伤作用明显增强(见实施例7、8、9)。
③.通过测序鉴定(CArG)8-hTERTp启动子(E8)的序列为SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。构建过程见实施例1。(CArG)8-hTERTp启动子(E8)具有肿瘤特异性活性，即在正常组织细胞中无活性或活性很低(见实施例2)，而在肿瘤细胞中具有明显的活性(见实施例3、4、5)。
④.通过测序鉴定(CArG)10-hTERTp启动子(E10)的序列为SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。构建过程见实施例1。(CArG)10-hTERTp启动子(E10)具有肿瘤特异性活性，即在正常组织细胞中无活性或活性很低(见实施例2)，而在肿瘤细胞中具有明显的活性(见实施例3、4、5)。
B.通过在(CArG)n-hTERTp下游添加CMV启动子序列得到嵌合启动子(CArG)n-hTERTp-CMVp 1)CMV启动子序列的扩增以质粒pCI-neo(Promega公司)为模板PCR扩增CMV启动子核心序列，上下游分别添加Pst I/Xho I酶切位点(框内序列)(上游引物5’-ATTCTGCAGGCGATCGCCGG-3’；下游引物5’-GGCCTCGAGAAGCTTCTAGTGATCT-3’)。
2)质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc的构建用Pst I/Xho I分别双酶切PCR产物和质粒p(CArG)4-hTERTp-luc(见实施例2)，即将CMV启动子序列插入(CArG)4-hTERTp启动子下游得到(CArG)4-hTERTp-CMVp启动子，连接后送交测序，得到的正确克隆命名为质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc。
3)通过测序鉴定(CArG)4-hTERTp-CMVp启动子(ET)序列为SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。构建过程见实施例1。(CArG)4-hTERTp-CMVp启动子(ET)具有肿瘤特异性活性，即在正常组织细胞中无活性或活性很低(见实施例2)，而在肿瘤细胞中具有明显的活性(见实施例3、4、5)。构建质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP后转染不同肿瘤细胞(见实施例1)，发现嵌合启动子(CArG)4-hTERTp-CMVp可以调控下游HRP治疗基因表达，并且，放射线照射后，嵌合启动子调控下游治疗基因HRP表达相应提高(见实施例6)。放射线与p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA联合后对人宫颈癌、肺癌、肝癌细胞的杀伤作用明显增强(见实施例7、8、9)。
C.质粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP、p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP的构建和鉴定 1)pRK-HRP(见实施例1)质粒含有辣根过氧化物酶(HRP)编码序列，由Cutler教授等通过人工合成的方法得到(见参考文献Connolly CN，FutterCE，Gibson A，et al.Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase.J Cell Biol，1994，127(3)641-652)经BamHI单酶切回收得到HRP片段，通过BglII同尾酶分别插入质粒phTERTp-luc、质粒p(CArG)6-hTERTp-luc和质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc中启动子的下游，得到质粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP(见实施例1)。
2)酶切鉴定PstI单酶切质粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP，1.7％(W/V)琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段。
3)实验结果如图1显示，质粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP经酶切后分别得到1040bp，1040bp，1140bp片段，与预期结果相符，说明构建成功。
D.放射线对嵌合启动子(CArG)n-hTERTp，(CArG)n-hTERTp-CMVp活性的增强作用(见实施例3、4、5)如图3所示，质粒p(CArG)n-hTERTp-luc(n＝4、6、8、10，见实施例1)、质粒p(CArG)n-hTERTp-CMVp-luc(n＝4，见实施例1)，质粒pGL3-Basic(阴性对照)和pGL3-control(阳性对照)购于Promega公司，分别和内参质粒pRL-TK(Promega公司)通过脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen公司)共转染人宫颈癌Hela细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌MHCC97细胞(中国典型培养物保藏中心)，细胞转染后24h，分为给予0、2、4、6、8、10Gyγ射线照射，孵育24小时，双荧光试剂盒(Promega公司)检测萤火虫荧光素酶(Luc)和海肾荧光素酶(RL)活性。结果显示嵌合启动子(CArG)n-hTERTp(n＝4、6、8、10，见实施例1)或(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4，见实施例1)在肿瘤细胞Hela，A549，MHCC97细胞中接受放射线照射后活性增强。
E.嵌合启动子(CArG)n-hTERTp、(CArG)n-hTERTp-CMVp的肿瘤特异性(见实施例2)如图2所示，质粒p(CArG)n-hTERTp-luc、质粒p(CArG)n-hTERTp-CMVp-luc，对照质粒pGL3-Basic(阴性对照)和pGL3-control(阳性对照)购于Promega公司，分别和内参质粒pRL-TK(Promega公司)通过脂质体lipofectamine 2000(Invitrogen公司)共转染人胚肺细胞hEL(中国典型培养物保藏中心)，分为0、2、4、6、8、10Gyγ射线照射组，结果嵌合启动子活性在正常细胞株hEL中活性明显低于在对照肿瘤细胞中的活性和放射诱导性，联系嵌合启动子在肿瘤细胞中的活性研究结果，证明嵌合启动子具有肿瘤特异性。
F.放射线与嵌合启动子(CArG)n-hTERTp，(CArG)n-hTERTp-CMVp调控HRP/IAA系统基因治疗对三种肿瘤细胞Hela，A549，MHCC97的协同杀伤作用(见实施例7、8、9)三种肿瘤细胞分为4组A对照组，B放疗组，C基因组，D联合组；基因组和联合组转染p(CArG)n-hTERTp-HRP，p(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP质粒24h后加入终浓度为0.5mmol/L的IAA，放疗组和联合组分别给予6Gy的γ射线照射，孵育24小时，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各组细胞增殖率，结果显示，联合组与放疗组、基因组分别比较，增殖率降低更明显；流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI试剂盒(Invitrogen公司)比较各组细胞凋亡率。结果显示，联合组与其它各组比较，早期凋亡率最高。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果 1、将放射反应元件和hTERT启动子组成的嵌合启动子为国际首创。
2、本发明表明，嵌合启动子(CArG)n-hTERTp、(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)具有肿瘤特异性和较强的启动活性，调控下游基因在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，因此，嵌合启动子介导的基因治疗可以实现肿瘤靶向治疗。(见实施例1、2) 3、放射线能增强嵌合启动子(CArG)n-hTERTp和(CArG)n-hTERTp-CMVp(n＝4、6、8、10)的活性，增强下游基因的表达，日益完善的适形放射技术将射线准确地照射到肿瘤组织，实现外源基因表达的时空调控。(见实施例3、4、5、6) 4、本发明表明，放射线与(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA，(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA联合比单纯射线，单纯phTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA，及两者简单相加获得的杀伤效果都要明显，说明他们具有明显的协同杀伤作用。(见实施例7、8、9) 5、放射治疗是临床治疗肿瘤最常规、最重要的方法，hTERT启动子介导的针对大多数肿瘤细胞的靶向基因治疗方案有数百种，改造后的启动子与hTERT启动子相比具有靶向高效的特点，应用前景广阔。
6、放射线敏感性肿瘤靶向启动子下游可以根据治疗目的携带不同治疗基因，满足多种肿瘤治疗目的需要。而且，联合放疗增强杀伤基因的表达，提高疗效。应用于临床可能实现有效的个体化治疗。



图1嵌合启动子携带下游HRP基因的真核表达载体的酶切鉴定。E0质粒hTERTp-HRP经PstI单酶切后得到1040bp片段；E6质粒p(CArG)6-hTERTp-HRP经PstI单酶切后得到1040bp片段；ETp(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc经PstI单酶切后得到1140bp片段；ControlpGL3-Control-HRP经PstI单酶切后。酶切结果说明成功构建了质粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP。
图2不同剂量放射线照射后人胚肺细胞hEL中各种启动子(E0、E4、E6、E8、E10、ET和阴性对照)调控下游荧光素酶基因的相对表达量明显低于对照组。说明嵌合启动子联合放射线在肿瘤细胞中具有高活性，而在端粒酶阴性的正常细胞中无明显活性，即嵌合启动子具有肿瘤特异性。
图3宫颈癌Hela细胞(A)、肺癌A549细胞(B)和肝癌MHCC97细胞(C)中嵌合启动子(E0、E4、E6、E8、E10、ET和阴性对照)联合不同剂量放射线诱导下游荧光素酶基因的相对表达量。说明放射线对嵌合启动子具有明显的放射可诱导性，且以6Gyγ射线诱导作用最为明显；而且，(CArG)6-hTERTp启动子和(CArG)4-hTERTp-CMVp启动子射线诱导作用最强。
图4宫颈癌Hela细胞(A)、肺癌A549细胞(B)和肝癌MHCC97细胞(C)中各种启动子(E0、E6、ET和阴性对照)联合放射线(0Gy或6Gy照射)调控下游HRP基因mRNA的表达。Hela和A549细胞中，10Gy-EO；20Gy-E6；30Gy-ET；40Gy-阴性对照；66Gy-EO；76Gy-E6；86Gy-ET；96Gy-阴性对照。MHCC97细胞中10Gy-EO；20Gy-阴性对照；30Gy-E6；40Gy-ET；66Gy-EO；76Gy-阴性对照；86Gy-E6；96Gy-ET。结果证明各种嵌合启动子可以调控下游基因表达，放射线照射后，嵌合启动子调控下游治疗基因HRP的mRNA表达升高。
图5宫颈癌Hela细胞(A)、肺癌A549细胞(B)和肝癌MHCC97细胞(C)中各种启动子(E0、E4、E6、ET和阳性对照)联合放射线调控下游HRP基因HRP蛋白的表达。1pGL3-Control-HRP；2p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP；3p(CArG)6-hTERTp-HRP；4phTERTp-HRP；5p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc；6p(CArG)6-hTERTp-luc。结果证明各种嵌合启动子可以调控下游基因表达，放射线照射后，嵌合启动子调控下游治疗基因HRP的蛋白水平表达升高。
图6 MTT法检测放射线联合嵌合启动子携带治疗基因(HRP)加IAA对不同肿瘤细胞的抑制率。结果显示在宫颈癌Hela细胞(A)、肺癌A549细胞(B)和肝癌MHCC97细胞(C)中p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA、p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP联合放射线组中细胞的存活率明显低于单纯放疗和单纯基因治疗组，可见两者联合应用对肿瘤细胞的生长起到更显著的抑制作用。
图7 Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞早期凋亡率。结果显示在宫颈癌Hela细胞(A)、肺癌A549细胞(B)和肝癌MHCC97细胞(C)中p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA、p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP联合放射线组与单纯放疗和单纯基因治疗组分别比较，早期凋亡率升高更显著，可见两者联合应用能更加明显地诱导肿瘤细胞凋亡。

具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 嵌合启动子的构建 1 实验材料 1.1 质粒质粒pBasic-hTERT promoter由Horikawa教授通过PCR扩增出hTERT启动子全长(-3915至+40)后通过酶切截取获得，含有-385至+40的hTERT启动子(见参考文献Horikawa，I.，Cable，P.L.，Mazur，S.J.et al..Downstream E-box-mediated regulation of the human telomerasereverse transcriptase(hTERT)gene transcriptionevidence for anendogenous mechanism of transcriptional repression.Mol Biol Cell，2002；13(8)2585-2597)，载体pGL3-Basic、pGL3-Control购于Promega公司。
1.2 试剂及仪器质粒DNA抽提试剂盒(Tiangen公司)；胶回收试剂盒(Omega公司)；PCRMix(Tiangen公司)；限制性内切酶Mlu I、EcoRI、Pst I、Xho I、BamHI、HindIII、T4连接酶、Marker(Fermentas公司)。

530紫外可见光分光光度计(美国Beckman Coulter公司)。
2 实验方法 1.1 hTERT启动子添加酶切位点为了在hTERT前后创造更多的酶切位点以便于后期研究，方法如下依据质粒pBasic-hTERT promoter测序结果，参考Genbank中的核酸序列(AF098956)设计引物hTERT-f5’-CTAGCTAGCGGAATTCGTTACCCCACAGCTTAGGCCGATT-3’；hTERT-r5’-CCGCTCGAGAACTGCAGGGCCAGGGCTTCCCACGTG-3’，并送大连宝生物公司合成。
1.2 PCR扩增hTERT目的片断以质粒pBasic-hTERT promoter作为模板，用合成的一对引物进行PCR扩增，反应条件为94℃预变性5min；然后进入循环94℃ 30sec，65℃ 30sec，72℃ 30sec 30个循环；72℃延伸5min。将hTERT启动子的DNA片段扩增出来。用1％(W/V)琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，用Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化。
1.3 质粒phTERTp-Luc的构建连接PCR产物至Takara公司的pMD-19T simple载体中，筛选出正确的质粒pTS-hTERTp，用NheI/XhoI(Fermentas公司)将pTS-hTERTp及目的载体pGL3-Basic(Promega公司)双酶切，1％(W/V)琼脂糖凝胶电泳回收纯化酶切片段，连接反应后将连接产物转化至转化感受态大肠杆菌DH5α(Takara公司)，筛选阳性克隆，将正确的克隆送交测序，与Genbank中的核酸序列(AF098956)比对，正确的克隆phTERTp-Luc用于后续研究。
1.4 质粒p(CArG)n-hTERTp-luc的构建设计四对互补的寡脱氧核糖核酸链5′-CGCGTGATAT(CCTTATTTGG)n-3′，5′-AATT(CCAAATAAGG)nATATCA-3′)，n分别为4，6，8，10；94℃退火合成串联的辐射诱导元件(CArG)4，(CArG)6，(CArG)8，(CArG)10，上下游以Mlu I/EcoR I酶切位点为粘性末端；将辐射诱导元件插入MluI/EcoRI双酶切后的phTERTp-Luc载体，得到质粒p(CArG)n-hTERTp-luc(n＝4，6，8，10)。
1.5 质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc的构建以pCI-neo(Promega公司)质粒为模板PCR扩增CMV启动子，上下游分别添加Pst I/Xho I酶切位点(框内序列)(上游引物5’-ATT

GCGATCGCCGG-3’；下游引物5’-GGC

AAGCTTCTAGTGATCT-3’)，用Pst I/XhoI分别双酶切PCR产物和质粒p(CArG)4-hTERTp-luc，连接后得到质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc。
1.6 质粒phTERTp-HRP、质粒p(CArG)6-hTERTp-HRP、质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP的构建pRK-HRP质粒含有辣根过氧化物酶(HRP)编码序列，由Cutler教授等通过人工合成的方法得到(见参考文献Connolly CN，Futter CE，Gibson A，et al.Transport intoand out of the Golgi complex studied by transfecting cells withcDNAs encoding horseradish peroxidase.J Cell Biol，1994，127(3)641-652)经BamHI单酶切回收得到HRP片段，通过BglII同尾酶分别插入质粒phTERTp-luc、p(CArG)6-hTERTp-luc(见实施例1)和质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-luc，分别得到质粒phTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP。
1.7 酶切鉴定双酶切质粒p(CArG)n-hTERTp-Luc，2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段；EcoRV/XhoI双酶切质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc，1.5％(W/V)琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段；PstI单酶切phTERTp-HRP，p(CArG)6-hTERTp-HRP，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP，1.7％(W/V)琼脂糖凝胶电泳观察酶切片段。
2 实验结果 ①.通过测序鉴定(CArG)4-hTERTp启动子(E4)的序列为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，与预期结果一致； ②.通过测序鉴定(CArG)6-hTERTp启动子(E6)的序列为SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，与预期结果一致； ③.通过测序鉴定(CArG)8-hTERTp启动子(E8)的序列为SEQ ID NO3所示的核苷酸序列，与预期结果一致； ④.通过测序鉴定(CArG)10-hTERTp启动子(E10)的序列为SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，与预期结果一致； ⑤通过测序鉴定(CArG)4-hTERTp-CMVp启动子(ET)序列为SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，与预期结果一致； ⑥酶切鉴定结果如图1所示，质粒phTERTp-HRP，p(CArG)6-hTERTp-HRP，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP经酶切后分别得到1040bp，1040bp，1140bp片段，与预期结果一致，说明构建成果。
实施例2 嵌合启动子特异性研究 1 实验材料 1.1 细胞人胚肺细胞hEL，购于中国典型培养物保藏中心。
1.2 质粒嵌合启动子质粒已由申请人成功构建；内参质粒pRL-TK(Promega公司)和对照质粒pGL3-Basic，pGL3-Control(购于Promega公司)。
1.3 试剂脂质体lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，双荧光检测试剂盒购于PROMEGA公司。含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco公司。
1.4 仪器TD-20/20型荧光发光计(美国Tumer Designs公司)，

530紫外可见光分光光度计(美国Beckman Coulter公司)。
2 实验方法 2.1 细胞转染转染前1天，取指数生长期的细胞，胰酶消化，以每孔1×105接种于24孔板，用含5％(V/V)CO2的37℃温箱孵育24h。将嵌合启动子质粒、pGL3-Control(阳性对照)和pRL-TK(做为内对照)共同以脂质体Lipofectamine2000介导转染至hEL细胞，按DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)＝0.42转染，具体操作按脂质体Lipofectamine2000试剂盒说明书进行。细胞转染后放入含5％(V/V)CO2的37℃温箱孵育5h后，换含10％(V/V)的小牛血清的RPMI-1640培养基继续培养。
2.2 放射线处理细胞转染后24h，分为0、2、4、6、8、10Gyγ射线照射组，每组4个平行孔，用含5％(V/V)CO2的37℃温箱继续培养24h，按照双荧光检测试剂盒说明书裂解并收集细胞. 2.3 检测TD-20/20型荧光发光计检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，使用荧光发光计按照双荧光检测试剂盒说明书对裂解细胞进行荧光检测，记录数据。
2.4 统计学处理各组数据用SPSS 13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行方差分析和组间q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果图2结果显示，嵌合启动子活性在正常细胞株hEL中活性明显低于在对照肿瘤细胞中的活性，证明嵌合启动子具有肿瘤特异性。
实施例3 在人宫颈癌Hela细胞中放射线增强嵌合启动子活性的作用 1 实验材料 1.1 细胞人宫颈癌Hela细胞(中国典型培养物保藏中心)，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒质粒p(CArG)n-hTERTp-Luc，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-Luc已由申请人成功构建(见实施例1)，内参质粒pRL-TK、阴性对照质粒pGL3-Basic和阳性对照质粒pGL3-Control购于Promega公司。
1.3 试剂脂质体lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，双荧光检测试剂盒购于PROMEGA公司。含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco公司。
1.4 仪器TD-20/20型荧光发光计(美国Turner Designs公司)，

530紫外可见光分光光度计(美国Beckman Coulter公司)。
2 实验方法 2.1 细胞转染转染前1天，取指数生长期的细胞，胰酶消化，以每孔1×105接种于24孔板，用含5％(V/V)CO2的37℃温箱孵育24h。将嵌合启动子质粒及对照质粒和pRL-TK(做为内对照)共同以脂质体Lipofectamine2000介导转染至Hela细胞，按DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)＝0.42转染，具体操作按脂质体Lipofectamine2000试剂盒说明书进行。细胞转染后放入含5％(V/V)CO2的37℃温箱孵育5h后，换含10％(V/V)的小牛血清的RPMI-1640培养基继续培养。
2.2 放射线处理细胞转染后24h，分为0、2、4、6、8、10Gyγ射线照射组，每组4个平行孔，用含5％(V/V)CO2的37℃温箱继续培养24h，按照双荧光检测试剂盒说明书裂解并收集细胞. 2.3 检测采用TD-20/20型荧光发光计检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性，按照双荧光检测试剂盒说明书对裂解细胞进行荧光检测，记录数据。
2.4 统计学处理各组数据用SPSS 13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行方差分析和组间q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果请见图3A。在Hela细胞中，放射线对嵌合启动子具有明显的放射诱导作用，且以6Gy γ射线诱导作用最为明显。而且，射线对启动子(CArG)6-hTERTp，(CArG)4-hTERTp-CMVp的诱导作用最强。
实施例4 在人肺腺癌A549细胞中放射线增强嵌合启动子活性的作用 1 实验材料 1.1 细胞人宫颈癌Hela细胞(中国典型培养物保藏中心)，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒、试剂和仪器同实施例3。
2 实验方法 2.1 细胞转染方法同实施例3，细胞为人宫颈癌Hela细胞。
2.2 放射线处理、检测和统计学处理同实施例3。
3 实验结果请见图3B。在A549细胞中，放射线对嵌合启动子具有明显的放射诱导作用，且以6Gy γ射线诱导作用最为明显。而且，射线对启动子(CArG)6-hTERTp，(CArG)4-hTERTp-CMVp的诱导作用最强。
实施例5 在人肝癌MHCC97细胞中放射线增强嵌合启动子活性的作用 1 实验材料 1.1 细胞人肝癌MHCC97细胞(中国典型培养物保藏中心)，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒、试剂和仪器同实施例3。
4 实验方法 4.1 细胞转染方法同实施例3，细胞为人肝癌MHCC97细胞。
4.2 放射线处理、检测和统计学处理同同实施例3。
5 实验结果请见图3C。在MHCC97细胞中，放射线对嵌合启动子具有明显的放射诱导作用，且以6Gy γ射线诱导作用最为明显。而且，射线对启动子(CArG)6-hTERTp，(CArG)4-hTERTp-CMVp的诱导作用最强。
实施例6 嵌合启动子调控下游治疗基因HRP表达的研究 1 实验材料 1.1 细胞人宫颈癌Hela细胞、人肺癌A549细胞、人肝癌MHCC97细胞均购自中国典型培养物保藏中心，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒p(CArG)4-hTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP及p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP已由申请人构建(见实施例1)。
1.3 试剂含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco公司，脂质体lipofectamine 2000购于Invitrogen公司，其它试剂见实验方法部分。十二烷基磺酸钠(SDS)购自Sigma公司。聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)购自Sigma公司。
2 实验方法 1.1 逆转录酶PCR(RT-PCR)三种肿瘤细胞利用LipofectamineTM 2000试剂(invitrogen公司)瞬时转染相应质粒载体后24h，用Trizol试剂(MRC公司)提取细胞总RNA，用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)合成cDNA，根据设计的HRP基因引物(正义引物5′CATTCGGGAACGCTAACA3′，反义引物5′CGGACAGAGCCACAAGGT 3′)进行PCR扩增，PCR条件为95°C3分钟，30个循环(94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟)，72℃延伸7分钟。PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶中电泳。电泳结果用Genesnap凝胶成像系统(Syngene公司)拍摄图像，并用Genetools 3.06软件(Syngene公司)进行条带分析。以GADPH作为对照，以HRP与GAPDH产量的比值进行比较 1.2 Western blot三种肿瘤细胞利用LipofectamineTM 2000试剂(invitrogen公司)瞬时转染相应质粒载体后24h，以细胞裂解液(江苏碧云天生物技术研究所)裂解6孔板细胞，提取蛋白，进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)，转移至硝酸纤维素薄膜、封闭、加入兔抗辣根过氧化物酶IgG(北京博奥森生物技术有限公司)40C 5h，漂洗后加入辣根酶标记羊抗兔IgG(Pierce公司)常温2h，漂洗后DAB试剂盒(Zsbio公司)显色，拍照。GADPH作为内参对照。
1.3 统计分析实验数据用SPSS 11.5统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差来表示，两组间比较采用均数t检验，采用双变量相关分析评价两组数据间的相关性，P<0.05表明差异有显著性。
3 实验结果 1.1 嵌合启动子调控下游治疗基因HRP mRNA的表达 RT-PCR检测放射线诱导后mRNA表达的改变，结果见图46Gy剂量照射后，p(CArG)4-hTERTp-HRP(E4)和p(CArG)6-hTERTp-HRP(E6)转染的肿瘤细胞可见明显的HRP mRNA表达升高(照射后与照射前的比值在HeLa细胞中分别为2.16和2.04，A549细胞中分别为1.32和1.64，MHCC97细胞中分别为1.33和1.43)，然而在pGL3-Control-HRP和phTERTp-HRP转染的细胞中未见放射后HRPmRNA的显著升高(照射后与照射前的比值在HeLa细胞中分别为0.997和1.05，A549细胞中为0.66和0.98，MHCC97细胞中为1.02和1.07，均具有统计学差异)。
1.2 嵌合启动子调控下游治疗基因HRP蛋白的表达 Western blotting检测蛋白的表达见图5，p(CArG)4-hTERTp-HRP(E4)，p(CArG)6-hTERTp-HRP(E6)，和phTERTp-HRP转染的三种肿瘤细胞可见到明显的HRP蛋白表达，而pGL3-Control-luc(阳性对照)转染的肿瘤细胞未见HRP表达。
4 实验结论 4.1 构建的质粒p(CArG)4-hTERTp-HRP、p(CArG)6-hTERTp-HRP及p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP中，嵌合启动子(CArG)4-hTERTp、(CArG)6-hTERTp、(CArG)4-hTERTp-CMVp可以调控下游基因表达，可以用于基因治疗； 4.2 放射线照射后，嵌合启动子(CArG)4-hTERTp、(CArG)6-hTERTp、(CArG)4-hTERTp-CMVp活性增高(见实施例3、4、5)，在本实验中证明放射线照射后，嵌合启动子调控下游治疗基因HRP表达相应提高，即射线联合嵌合启动子可以提高治疗基因的表达。
实施例7 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA与放射线联合对人宫颈癌Hela细胞的杀伤作用 1 实验材料 1.1 细胞人宫颈癌Hela细胞，购自中国典型培养物保藏中心，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒质粒p(CArG)6-hTERTp-HRP和p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP已由申请人成功构建(见实施例1)。
1.3 试剂脂质体lipofectamine 2000购于Invitrogen公司。吲哚乙酸购于武汉科瑞公司，凋亡试剂盒Annexin V-FITC试剂盒购于武汉博士德公司，Rnase和PI购于天源生物技术公司，MTT和DMSO购于Amresco公司，含10％(V/V)小牛血清的RPMI-1640培养液购自Gibco公司。
1.4 仪器

530紫外可见光分光光度计(美国Beckman Coulter公司)，FC500全自动流式细胞分析仪(美国Beckman Coulter公司)，RT-6000酶标仪(北京六一仪器厂)。
2 实验方法 2.1 实验分组实验分为四组A对照组，Hela细胞未经任何处理；B放疗组，6Gy γ射线作用于Hela细胞；C基因组，嵌合启动子质粒(p(CArG)6-hTERTp-HRP或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP)转染Hela细胞后，联合吲哚乙酸(IAA)；D联合组，嵌合启动子质粒转染Hela细胞后，联合吲哚乙酸和放射线。
2.2 药物处理IAA溶于灭菌PBS溶液中，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用，细胞转染后24h，在基因组和联合组分别加入终浓度为0.5mmol/L的IAA，未加药组用等体积液体培养基替代IAA。
2.3 放射线处理在细胞转染24h后，给予放疗组和联合组各6Gy γ射线照射。
2.4 MTT检测细胞增殖率检测取指数生长期细胞，胰酶消化后以每孔3×104细胞接种于96孔板(分5组，每组6个平行孔，并设一组空白培养基)，每孔总液量为200ul。用含5％CO2的37℃温箱孵育24h，将嵌合启动子质粒按DNA(μg)METAFECTENE(μl)(Biontex公司)＝25转染介导转染基因组和联合组细胞。转染后24h，处理如2.2，2.3。在处理后24h加入5g/L MTT液20ul，37℃、5％CO2下继续孵育至48h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150ul，振荡10min，于30min内在RT-6000酶标仪上测定每孔492nm光的吸收值(A492)。计算各组增殖率增殖率＝(实验孔A值—空白组A值)/(对照孔A值—空白组A值)×100％。
2.5 Annexin V/PI凋亡检测试剂检测细胞凋亡率转染前1天，取指数生长期的细胞，胰酶消化，以每孔5×105接种于6孔板，用含5％(V/V)CO2的37℃温箱孵育24h。将嵌合启动子质粒以脂质体Lipofectamine2000介导转染细胞，按DNA(μg)Lipofectamine2000(μl)＝25转染，具体操作按脂质体Lipofectamine2000试剂盒说明书进行。细胞转染后放入含5％(V/V)CO2的37℃温箱孵育5h后，换含10％(V/V)的小牛血清的RPMI-1640培养基继续培养。细胞转染后24h，处理如2.2，2.3。用去离子水按14稀释结合缓冲液(20ml结合缓冲液+60ml去离子水)；将每组单细胞悬液离心沉淀(2000rpm，10min)，弃去上清，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250ul结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；取100μl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5ul Annexin V/FITC和10ul 20ug/ml的碘化丙锭溶液；混匀后于室温(20-25℃)避光孵育15min；在反应管中加400ul PBS，流式细胞仪(FCS)分析；本实验每组设三个平行样本，重复三次。
2.6 统计学处理各组数据用SPSS 13.0统计软件(SPSS公司，美国)进行方差分析和组间q检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
3 实验结果 3.1 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用 结果显示，C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞增殖率明显低于A组(对照组)(表1-1，图6-A，p<0.01)，可见HRP/IAA系统能抑制Hela细胞；C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞早期凋亡率明显高于A组(对照组)(图7-A，表1-2，p<0.01)，可见HRP/IAA系统能有效诱导Hela细胞凋亡。
3.2 放射线联合p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA对宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用 结果显示，A组(联合治疗组)细胞增殖率分别高于B(放射治疗组)、C(基因治疗组)两组；D组细胞早期凋亡率分别高于B、C两组(图7-A，表1-2，p<0.01)，可见两者联合应用可进一步诱导细胞凋亡。p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA联合射线组细胞存活率明显低于单纯放疗和单纯基因治疗组(表1-1，图6-A，p<0.05)，可见两者联合应用对宫颈癌Hela细胞的生长起到更显著的抑制作用。
表1-1 Hela细胞增殖率(x±s％，n＝6)
注与A组相比ap<0.01；与B组相比bp<0.05；与C组相比cp<0.05 表1-2 Hela细胞早期凋亡率(x±s％，n＝3)
注与A组相比ap<0.01；与B组相比bp<0.01；与C组相比cp<0.01 实施例8 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA与放射线联合对人肺癌A549细胞的杀伤作用 1 实验材料 1.1 细胞细胞人肺癌A549细胞，购自中国典型培养物保藏中心，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒、试剂、仪器同实施例6。
2 实验方法 2.1 实验分组同实施例6，细胞为人肺癌A549细胞。
2.2 药物处理、放射线处理、MTT检测细胞增殖率检测、Annexin V/PI凋亡检测试剂检测细胞凋亡率同实施例6。
3 实验结果 3.1 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA对人肺癌A549细胞生长的抑制作用 结果显示，C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞增殖率明显低于A组(对照组)(表2-1，图6-A，p<0.01)，可见HRP/IAA系统能抑制Hela细胞；C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞早期凋亡率明显高于A组(对照组)(图7-A，表2-2，p<0.01)，可见HRP/IAA系统能有效诱导肺癌A549细胞凋亡。
3.2 放射线联合p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA对肺癌A549细胞的生长抑制作用 结果显示，A组(联合治疗组)细胞增殖率分别高于B(放射治疗组)、C(基因治疗组)两组；D组细胞早期凋亡率分别高于B、C两组(图7-A，表2-2，p<0.01)，可见两者联合应用可进一步诱导细胞凋亡。p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA联合射线组细胞存活率明显低于单纯放疗和单纯基因治疗组(表2-1，图6-A，p<0.05)，可见两者联合应用对肺癌A549细胞的生长起到更显著的抑制作用。
表2-1 A549细胞增殖率(x±s％，n＝6)
注与A组相比ap<0.01；与B组相比bp<0.05；与C组相比cp<0.05 表2-2 A549细胞早期凋亡率(x±s％，n＝3)
注与A组相比ap<0.01；与B组相比bp<0.01；与C组相比cp<0.01 实施例9 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA或p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA与放射线联合对人肝癌MHCC97细胞的杀伤作用 1 实验材料 1.1 细胞人肝癌MHCC97细胞，购自中国典型培养物保藏中心，常规细胞培养和传代。
1.2 质粒、试剂、仪器同实施例6。
2 实验方法 2.1 实验分组同实施例6，细胞为人肝癌MHCC97细胞。
2.2 药物处理、放射线处理、MTT检测细胞增殖率检测、Annexin V/PI凋亡检测试剂检测细胞凋亡率同实施例6。
3 实验结果 3.1 p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA对人肝癌MHCC97细胞生长的抑制作用 结果显示，C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞增殖率明显低于A组(对照组)(表3-1，图6-A，p<0.01)，可见HRP/IAA系统能抑制Hela细胞；C组(HRP/IAA基因治疗组)细胞早期凋亡率明显高于A组(对照组)(图7-A，表3-2，p<0.01)，可见HRP/IAA系统能有效诱导肝癌MHCC97细胞凋亡。
3.2 放射线联合p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA，p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP/IAA对肝癌MHCC97细胞的生长抑制作用 结果显示，A组(联合治疗组)细胞增殖率分别高于B(放射治疗组)、C(基因治疗组)两组；D组细胞早期凋亡率分别高于B、C两组(图7-A，表3-2，p<0.01)，可见两者联合应用可进一步诱导细胞凋亡。p(CArG)6-hTERTp-HRP/IAA联合射线组细胞存活率明显低于单纯放疗和单纯基因治疗组(表3-1，图6-A，p<0.05)，可见两者联合应用对肝癌MHCC97细胞的生长起到更显著的抑制作用。
表3-1 MHCC97细胞增殖率(x±s％，n＝6)
注与A组相比ap<0.01；与B组相比bp<0.05；与C组相比cp<0.05 表3-2 MHCC97细胞早期凋亡率(x±s％，n＝3)
注与A组相比ap<0.01；与B组相比bp<0.01；与C组相比cp<0.01
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>放射线敏感性肿瘤靶向启动子及用途
<130>放射线敏感性肿瘤靶向启动子及用途
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
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<213>Cloning vector pGL3-Promoter
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<400>权利要求
1.一种嵌合启动子(CArG)4-hTERTp，其序列为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2.一种嵌合启动子(CArG)6-hTERTp，其序列为SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
3.一种嵌合启动子(CArG)8-hTERTp，其序列为SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
4.一种嵌合启动子(CArG)10-hTERTp，其序列为SEQ ID NO4所示的核苷酸序列。
5.一种嵌合启动子(CArG)4-hTERTp-CMVp，其序列为SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
6.一种质粒p(CArG)6-hTERTp-HRP，其结构含有权利要求2所诉的一种嵌合启动子，并含有辣根过氧化物酶(HRP)编码序列。
7.一种质粒p(CArG)4-hTERTp-CMVp-HRP，其结构含有权利要求5所诉的一种嵌合启动子，并含有辣根过氧化物酶(HRP)编码序列。
8.权利要求1或2或3或4或5所述的一种嵌合启动子在通过放射线增强启动子下游基因表达中的应用。
9.权利要求6或7所述的一种质粒在制备治疗或预防宫颈癌药物中的应用。
10.权利要求6或7所述的一种质粒在制备治疗或预防肺癌药物中的应用。
11.权利要求6或7所述的一种质粒在制备治疗或预防肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种放射线敏感性肿瘤靶向启动子及用途，涉及嵌合启动子的构建，放射线对嵌合启动子活性的增强作用，放射线与基因治疗联合用于杀伤肿瘤细胞的协同作用。采用正常细胞和三种不同肿瘤细胞进行研究，通过嵌合启动子调控的下游荧光素酶报告基因的表达，评价嵌合启动子的特异性和放射线对嵌合启动子活性的影响。并通过检测细胞增殖率、细胞凋亡率来评价放射线与嵌合启动子调控HRP/IAA联合使用时的协同杀伤作用。结果证实，嵌合启动子具有肿瘤特异性，同时放射线可以增强嵌合启动子活性，放射线与其联用时对多种肿瘤(宫颈癌、肝癌和肺癌)细胞有显著的杀伤作用。即(CArG)n-hTERTp-HRP/IAA或(CArG)n-hTERTp-CMVp-HRP/IAA联合放疗作为在制备治疗或预防肺癌、肝癌、宫颈癌细胞药物中的应用。
文档编号A61P35/00GK101508989SQ20091006139
公开日2009年8月19日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者周云峰, 廖正凯, 周福祥, 谢丛华, 杰 熊, 孙文洁 申请人:武汉大学