专利名称：一种新的制备脑蛋白水解物的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新的制备脑蛋白水解物的方法。
背景技术：
脑蛋白水解物最早由奥地利EBEWE药厂以Cerebrolysin为商品名出售。脑蛋白水 解物是是无蛋白质的标准化器官特异性氨基酸混合物的水溶液，其中含有多种人体必需的 氨基酸、非必需氨基酸、活性多肽、唾液酸等，可用于颅脑外伤、脑血管病后遗症伴有记忆减 退及注意力集中障碍，对于治疗器质性脑性精神综合症、脑血管代偿不足，神经衰竭状态， 幼儿脑发育不全，癫痫中风、脑炎、脑震荡等具有良好的功效。脑蛋白水解物中，游离氨基酸、活性多肽和唾液酸对脑功能障碍的恢复起着不可 忽视的作用，但是现有的制备方法得到的脑蛋白水解物中游离氨基酸含量很低，尤其是游 离氨基酸的含量非常低，达不到国家规定标准，众多脑蛋白水解物产品通过补加外源氨基 酸以达到规定标准的要求，因此，国家药监办2008734号文件要求脑蛋白水解物不得补 加外源氨基酸，所以，急需研发一种符合新修订国家标准，有效成分含量高的安全、有效、质 量可控的天然脑蛋白水解物。
发明内容
本发明采用纳滤技术提供一种从哺乳动物脑组织中制备的脑蛋白水解物，使用该 技术制备的脑蛋白水解物中唾液酸的含量较高，其很大优点在于通过血脑屏障并确保疗 效，对于提高脑蛋白水解物的质量及质量可控性、保证脑蛋白水解物的安全性和有效性、扩 大临床应用具有重要的意义。本发明的技术方案如下一种从哺乳动物脑组织中制备脑蛋白水解物的方法，包括如下步骤(1)胃酶液水解取新鲜冷冻的哺乳动物脑组织，加纯化水或注射用水勻浆，勻浆 液加入胃酶液搅拌均勻，水解，水解完毕加热微沸，过滤，得胃酶水解液；(2)胰酶水解胃酶水解液，加入胰酶搅拌均勻，水解，过滤，得脑蛋白水解物粗提 液；(3)除碱性蛋白；(4)超滤分离；(5)纳虑浓缩；(6)检查细菌内毒素，得脑蛋白水解物精制品。本发明脑蛋白水解物的制备方法，优选为(1)胃酶液水解取新鲜冷冻的哺乳动物脑组织，缓化，按照1 1 2的比例加纯 化水或注射用水，胶体磨勻浆，勻浆液加热80 90°C，保温10 20min，降温至35 40°C， 调PH值为2. 5 3. 5，加入胃酶液搅拌均勻，37 45°C水解12 18h，水解完毕，加热微沸 IOmin, 100目滤布过滤，得胃酶水解液；
(2)胰酶水解胃酶水解液调节pH值7. 5 8. 5，加入胰酶胰酶液，搅拌均勻，45 55°C水解4h，水解完毕，调节pH值为4. 0 5. 0 (按原料重量加入1 %活性炭)，100°C加热 20min，用100目滤布过滤，得脑蛋白水解物粗提液；(3)除碱性蛋白取脑蛋白水解物粗提液，调节pH值为9.0 10.0，加热80 90°C，降温30°C以下，用滤纸过滤，得滤液；(4)超滤分离将(3)中所得滤液调pH值为6. 5 7. 5，用10000分子量的超滤柱 超滤，超滤液冷冻48h;(5)纳滤浓缩、活性炭处理将⑷中所得冷冻的超滤液缓化，用0.8μπι滤膜过 滤，除去溶液中脂肪蛋白及杂蛋白，过滤液纳滤，调pH值为4. 0 5. 0，并加入0. 1 0. 4% 活性炭(w/V)，充分搅拌下保温10 40min，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液补加两种注射用氨 基酸。(6)检查细菌内毒素将(5)中所得滤液调整pH值为7.0 7. 5，再经10000分子 量的超滤柱超滤，超滤液取样检查细菌内毒素，合格后，得脑蛋白水解物精制品。所述的哺乳动物指人除外的其他哺乳动物，包括猪、牛、马、羊、兔、狗等，优选猪、牛。本发明进一步要求通过上述方法制备的脑蛋白水解物，本发明的脑蛋白水解物含 有活性多肽10 12mg/mL和唾液酸0. 1 0. 2mg/mL。本发明进一步要求保护本发明的脑蛋白水解物与一种或多种药用载体和/或稀 释剂制的药物组合物，可以制成药学上可接受的任一剂型。用于口服给药时，可制成常规的固体制剂，如片齐IJ、胶囊齐IJ、丸齐U、颗粒剂等；也可 制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜 的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射 用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制 注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。本发明进一步要求保护本发明的脑蛋白水解物在制备治疗和/或预防脑功能障 碍的药物中的应用。本发明脑蛋白水解物能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经 元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神 经毒素的损害。本发明脑蛋白水解物可通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸 链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其它激素系统， 提供神经递质、肽类激素及辅酶前体。本发明脑蛋白水解物具有下列优点(1)本发明脑蛋白水解物中，活性多肽和唾液酸的含量较现有方法从哺乳动物中 提取的脑蛋白水解物显著提高，符合新规定标准，质量可控性显著提高，大大提高临床用药 的安全性和有效性。(2)本发明脑蛋白水解物中活性多肽、唾液酸、游离氨基酸为天然提取，唾液酸的 检测使脑蛋白水解物组份更加明确，使临床用药更加安全有效。(3)本发明脑蛋白水解物的制备方法简单易行，利于大规模生产。以下通过实验例，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为 本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实验例本发明脑蛋白水解物的呼吸活件比较方法系用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝勻浆的呼吸活力，从测得的耗氧量计算出 呼吸活力QO2 (uL · 02/mg · h)和刺激指数(Si)。仪器瓦氏呼吸检压仪，勻浆器，定时器。
试剂10%氢氧化钠溶液取氢氧化钠10g，加水溶解并稀释至100mL。Soerensen 缓冲液(pH 值 7. 4)取磷酸氢二钠(Na2HPO4 · 2H20) 9. 72g 和磷酸二氢 钾1. 65g，加水溶解并稀释至lOOOmL。Brodie测压液取氯化钠23g，牛胆酸钠5g，伊文氏兰lOOmg，加水溶解并稀释至 500mL。相对密度为 1. 033g/mL。肝勻浆液的制备取体重250g的雄性豚鼠一只，颈部打击处死(处死前需禁食至少 24小时)，立即切断劲动脉放血，打开腹腔取出肝脏，置冰水浴中的Soerensen缓冲液(注 意不要损坏胆囊或胆管)。称取5. 5g的肝脏，并切割为大小相同的7块，每块用7mL的 Soerensen缓冲液勻浆(注意以上操作必须在冰水浴中进行)。测定法(1)预先把测压计反应瓶洗净并干燥，备用。(2)装好测压液于测压管内，调节液面至150mm。(3)反应瓶中先加入Soerensen缓冲液1. lmL，加供试品0. 2mL，然后加肝勻浆液 1. OmL0(4)加10%氢氧化钠溶液0. 2mL于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯。(5)由于肝勻浆本身有耗氧作用，故实验时以Soerensen缓冲液0. 2mL代替供试 品，其余试剂同样品管，作为空白管。(6)将装好的反应瓶按管号与测压计相连(注意密闭，勿使漏气)，置37°C恒温水 浴中。(7)开动振荡器振摇10分钟(75次/分)使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧 柱液面调至150mm，记下左侧液面读数(A)，然后关闭三向活塞，开始计时，反应30分钟后将 测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面除读数(B)。打开三向活塞，重复上述过程， 进行下一个30分钟的反应并记下左侧液面初读数(C)及30分钟后的液面读数(D)。(8)实验过程中必须附加一套供校正用的温压计，在反应瓶中加2. 5mL的 Soerensen缓冲液，使其在与试验管完全相同的条件下试验，观察其压力的变化(△ C)，以 消除实验过程中温度及大气压的影响。(9)取2. OmL肝勻浆，置恒重的装有海沙的称量瓶中，110°C干燥至恒重，计算两次 的重量差AW(mg)。按下式计算QO2(uL · 02/mg · h) =〔(A-B+C-D) XK1-ACXK2) /G/I式中K1为空白或样品的反应瓶常数；K2为温压计的反应瓶常数；G为每ImL肝勻浆的干重，mg，G = AW/2_9. 3，9. 3为Soerensen缓冲液的干重，mg ；I为反应时间，小时。刺激指数(Si)=供试品QO2/空白QO2实验结果应满足以下条件，否则无效； 1.对照品的 QO2 彡 4. OuL · 02/mg · h，并且 SI ^ 2. 5 ；2.空白的 QO2 彡 1. OuL · 02/mg · h。实验结果 本发明脑蛋白水解物的5. 0彡QO2彡7uL · 02/mg · h，并且 2. 5 ^ SI ^ 3. 0。市购4. OuL · 02/mg · hQ02 ( 5. OuL · 02/mg · h,并且 2· 5 彡 SI 彡 3· 0，由实验结果可以看出，本发明脑蛋白水解物与施普善产品相比，刺激指数和呼吸 活性基本相同，表明本发明脑蛋白水解物具有生物活性与施普善产品质量一致。
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。
_2] _仿丨丨1絲日月■舶崖_■禾情影·一、本发明脑蛋白水解物的制备(1)胃酶液制备取猪胃粘膜上绞肉机绞碎勻浆，按照0. 5倍量加入注射用水，再 加入盐酸，按照每千克胃粘膜加入HCL20mL，温度47°C，消化时间3h，即得粗制胃酶液，粗制 胃酶液中含有胃蛋白酶，组织蛋白等多种蛋白水解酶的混合物；(2)胃酶液水解取新鲜冷冻的哺乳动物脑组织，缓化，按照1 1.5的比例注射 用水，胶体磨勻浆，勻浆液加热85°C，保温15min，降温至40°C，用6mol/LHcl调pH值为3. 5， 加入胃酶液搅拌均勻，水解温度40°C，水解16h，加热微沸lOmin，100目滤布过滤，得胃酶水 解液；(3)胰酶水解胃酶水解液调节pH值7. 5 8. 5，加入胰酶(按原料1 %加入)加 入激活剂，0. 04mol/LCaCl2室温放置1小时加入胃酶水解液中，再用5mol/L NaOH调节pH 值为7. 5-8. 0，水解温度48°C水解时间4h，用6mol/LHcl调节pH值为4. O 5. 0，(按原料 总量加入活性炭)加热煮沸100°C 15min，用100目滤布过滤，得脑蛋白水解物粗提液；(4)除碱性蛋白取脑蛋白水解物粗品，调节PH值为9.0 10.0，加热80°C，降温 300C以下，用滤纸过滤，得滤液；(5)超滤分离碱性过滤液调pH值为6. 5 7. 5，用10000分子量的超滤柱超滤， 超滤液装小桶，冷冻48h;(6)纳滤浓缩、活性炭处理将(5)中所得滤液缓化，用0.8μπι滤膜过滤，除去溶 液中脂肪蛋白及杂蛋白，过滤液纳滤，调PH值为4. O 5. 0，并加入0. 1 0. 4%活性炭(w/ w)，充分搅拌下100°C保温30min，0. 45 μ m微孔滤膜过滤，得滤液。(7)检查细菌内毒素将(6)中所得滤液调整pH值为7. 2，再经10000分子量的超 滤柱超滤，超滤液取样检查细菌内毒素，合格后，得脑蛋白水解物精制品。二、本发明脑蛋白水解物的含量测定
多肽取本品制成每ImL约含多肽0. 15mg的溶液，作为供试品溶液，照福林酚测定法测
定。游离氨基酸取本品及标准品氨基酸适量，用适宜的氨基酸分析仪或高效液相色谱仪进行分离 测定，其游离氨基酸含量应为每ImL中含0. 8 1. 2mg。唾液酸参比溶液的制备取唾液酸参比试剂适量，加0. 9%氯化钠溶液制成每ImL中含 50ug的溶液。标准曲线的制备精密量取参比溶液0. OmL,0. 5mL、l. OmLU. 5mL、2. OmL，分别置具 塞试管中，各加水至2. OmL，再分别精密加入间苯二酚溶液(取2%间苯二酚溶液10mL、 2. 5%硫酸铜溶液0. 25mL，盐酸80mL，加水至IOOmL) 2mL，摇勻，置水浴中反应15分钟，取出 置冷水中10分钟，分别精密加醋酸正丁酯-正丁(85 15) 5mL,剧烈振摇后放置15分钟， 取上层液于585nm的波长处测定吸收度以O管作为空白。测得的吸收度与对应的浓度计 算回归方程。测定法取本品，加0. 9%氯化钠制成每ImL中含唾液酸50ug的溶液，作为供试品溶 液。精密量取供试品溶液2mL，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入间苯二酚溶液” 起，依法测定，从回归方程求得供试品溶液的浓度，并乘以稀释倍数，即为唾液酸含量。 _0] ^MM 2本发日月Iig白7k解4俯东干粉针齐I丨的泡丨备处方脑蛋白水解物溶液3000mL 多肽50mg/ml ；唾液酸1. 37mg/ml甘露醇200g_注射用水力Π 2250mL_共制备1500支工艺(1)称取处方量的甘露醇加入注射用水，搅拌使溶解，按照溶液量的0. 1 %加入针 用活性炭，80°C搅拌30min，过滤至溶液澄明，备用；(2)取处方量的脑蛋白水解物溶液，与上述溶液混合，加注射用水至溶液总量的 90 %，调节pH值为7. 0，补注射用水至全量；(3)过0. 2 μ m微孔滤膜，测定含量；(4)灌装；(5)冻干。^MM 3本发日月Iig白7k解物沣射液的泡丨备处方脑蛋白水解物6818mL(多肽 22. Omg/ml ；唾液酸 0. 551mg/ml)补加注射用水8182mL 调pH值7. 2，0. 22um微孔滤膜过滤，充氮灌装封口，110°C灭菌30min灯检、包装。共制备1500支(IOml)。
权利要求
一种从哺乳动物脑组织中制备脑蛋白水解物的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)胃酶液水解取新鲜冷冻的哺乳动物脑组织，加纯化水或注射用水匀浆，匀浆液加入胃酶液搅拌均匀，水解，水解完毕加热微沸，过滤，得胃酶水解液；(2)胰酶水解胃酶水解液，加入胰酶，搅拌均匀，水解，过滤，得脑蛋白水解物粗提液；(3)除碱性蛋白；(4)超滤分离；(5)纳虑浓缩；(6)检查细菌内毒素，得脑蛋白水解物精制品。
2.如权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)胃酶液水解取新鲜冷冻的哺乳动物脑组织，缓化，按照1 1 2的比例加纯化 水或注射用水，胶体磨勻浆，勻浆液加热80 90°C，保温10 20min，降温至35 40°C， 调PH值为2. 5 3. 5，加入胃酶液搅拌均勻，37 45°C水解12 18h，水解完毕，加热微沸 IOmin, 100目滤布过滤，得胃酶水解液；(2)胰酶水解胃酶水解液调节pH值7.5 8. 5，加入胰酶(按原料1 %加入)加入激 活剂，0. 04mol/LCaCl2室温放置1小时加入胃酶水解液中，再用5mol/L NaOH调节pH值为 7. 5-8. 0,45-55 °C水解4h，水解完毕，调节pH值为4. 0 5. 0，按原料总量加入1 %活性炭 100°C加热15min，用100目滤布过滤，得脑蛋白水解物粗提液；(3)除碱性蛋白取脑蛋白水解物粗提液，调节pH值为9.0 10.0，加热80 901， 保温lOmin，降温30°C以下，用滤纸过滤，得滤液；(4)超滤分离将(3)中所得滤液调pH值为6.5 7. 5，用10000分子量的超滤柱超 滤，超滤液冷冻48h;(5)纳滤浓缩、活性炭处理将(4)中所得冷冻的超滤液缓化，用0.8μπι滤膜过滤，除 去溶液中脂肪蛋白及杂蛋白，过滤液纳滤，纳滤液用6mol/LLHcl调pH值为4. O 5. 0，并加 入0. 1 0. 4%活性炭(w/w)，充分搅拌下100°C保温10 40min，0. 45 μ m微孔滤膜过滤， 滤液补加两种注射用氨基酸。(6)检查细菌内毒素将(5)中所得滤液调整pH值为7.0 7.5，再经10000分子量的 超滤柱超滤，超滤液取样检查细菌内毒素，合格后，得脑蛋白水解物精制品。
3.如权利要求1或2制备的脑蛋白水解物，其特征在于，含有活性多肽10 12mg/mL 和唾液酸0. 1 0. 2mg/mL。
4.如权利要求2(5)(6)所述的脑蛋白水解物与一种或多种药用载体和/或稀释剂制的 药物组合物，可以制成药学上可接受的任一剂型。
5.如权利要求2(5)(6)所述的脑蛋白水解物在制备治疗和/或预防脑功能障碍的药物 中的应用。
全文摘要
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新的制备脑蛋白水解物的方法，通过本发明的方法制备的脑蛋白水解物，含活性多肽10～12mg/mL和唾液酸0.1～0.2mg/mL。通过本发明方法制备的脑蛋白水解物有效成分含量高，安全可控。
文档编号A61K35/30GK101940596SQ20091007248
公开日2011年1月12日 申请日期2009年7月9日 优先权日2009年7月9日
发明者张树信, 王佰荣 申请人:张树信