专利名称：一个木质素二氢黄酮醇在制备抗病毒药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及一个木质素二氢黄酮
醇衍生物即式(I)化合物，(±)~2-[2,3-二氢-2-(3,5-二甲氧基-一羟基苯基)-3-羟甲基—1，4苯并二氧六环—5]—2，3—二氢—3,5,7—三羟基~4 7—1-苯并吡喃~4—酮 或其可药用盐用于制备抑制单纯疱疹病毒药物或用于制备抗流感病毒药物的
用途。
背景技术：
单纯疱疹病毒直径约为120-150微米，含有DNA的核位于中间，向外 依次由包膜、体被、衣壳三种同心结构组成，衣壳表面为162个壳微粒组成 的3 : 3 : 2轴对称的20面体，在低温下可生存数月，湿热50。C及干燥90。C 30 分钟灭活。单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型疱疹病毒(HSV-1) 主要感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官，HSV-1主要通过呼吸道、皮肤和粘 膜密切接触传播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹， 口和口周围发生的疱疹都是由I型疱疹病毒感染引起的。II型疱疹病毒 (HSV-2)主要存在于女性宫颈、阴道、外阴皮肤及男性的阴茎、尿道等处， 是引起生殖器发炎和疱疹的罪魁祸首。
口腔溃疡易反复发作，目前尚无特效治疗方法，临床上主要的治疗措施 包括局部治疗和全身治疗，西医治疗以局部用碘甘油及维生素B1、 B2和维 生素C口服， 一般疗效不甚明显。严重、顽固的口腔溃疡则需内服激素类药 品、抗菌素类药品等，使用此类药物又存在较大的毒副作用和易使病人产生 耐药性和菌群失调的不足之处。中药外用药包括锡类散、冰硼散等外用制剂， 但治疗效果不十分理想；内服药包括牛黄解毒丸、牛黄上清丸等，但对本病 症无显著的针对性。近期出现的不少新的口腔含片类药物制剂如西瓜霜含片、 华素片和溶菌酶含片等分别在口感、杀菌、抗炎方面有所进步，但是有些又 不适于哺乳期妇女、甲状腺功能亢进患者和碘过敏者。因此，应用现代病毒 药理学技术、发掘出治疗口腔溃疡的创新型药物是迫在眉睫的。
HSV-2病毒经性器官接触后，潜伏约2-20天(平均6天)，HSV-2感染引起的生殖器疱疹临床表现中可分为原发和复发两种，患病部位先有烧灼感，
很快在红斑基础上发生3-IO个成群的红色丘疹，伴有瘙痒，丘疹很快变成小 水疱，3-5天后变为脓疱，破溃后形成大片的糜烂和溃疡，自觉疼痛，最后 结痂愈合。整个病程可持续20天左右。男性好发于龟头、冠状沟、尿道口、 阴茎、阴囊、大腿和臂部等处。女性好发于阴唇、阴阜、阴蒂、肛周或阴道; 约90%的病人，病毒可同时侵犯子宫颈，出现阴道分泌物增多或下腹痛，并 可并发宫颈炎和子宫炎。大多数男女病人双侧腹股沟淋巴结肿大。后期炎症 波及尿道、膀胱时，可出现排尿困难、尿痛、尿频、严重者可发生尿潴留等 现象。此外，还可能有其它症状同时出现，如发热、全身不适、头痛、颈项 强直、脑膜炎和骶部神经系统功能不全。
生殖器疱疹病毒与生殖器恶性肿瘤关系密切，引起生殖器疱疹的II型疱 疹病毒可能是宫颈癌的潜在致癌因子。研究发现，患过生殖器疱疹的妇女比 未患过者得宫颈癌的危险性大5-10倍，并且，在宫颈癌组织、剥脱细胞或癌 前期细胞中发现了 II型疱疹病毒特异抗原，从而表明II型疱疹病毒在宫颈癌 的发生过程中起了重要作用。另外，从阴茎癌病人的活检材料中也观察到单 纯疱疹病毒样颗粒。此外，近年来人们也注意到孕妇感染II型疱疹的严重性 对妊娠的患者或无症状排毒来说，最严重的是传染给新生儿，孕妇患生殖器 疱疹可导致胎儿畸形、流产、死产。
对HSV-2感染引起的病毒性疾病目前尚无特效治疗方法，临床上主要 的治疗措施为采用阿昔洛韦等抗病毒药物。此外，人白细胞干扰素也可抑制 病毒繁殖，减少生殖器疱疹的复发率。然而使用此类激素类药品、抗菌素类 药品药物存在较大的毒副作用和易使病人产生耐药性和菌群失调的不足之 处。
中医将II型单纯性疱疹感染疾病称为"阴疮"，其病性早期属热证、实 证，为湿热、毒火阻滞肝脉；后期则伴有肝肾不足。中药外用药包括外用1% 氯锌油，紫草油等方法，但治疗效果不十分理想；常用方药为清毒神圣汤加 减、牛黄解毒丸、六味地黄丸加减和龙胆泻肝汤等，但对本病症无显著的针 对性。
因此，应用现代病毒药理学技术、利用现代药物化学手段，寻找创新性 的先导化合物骨架，开发出既能够避开核苷类抗病毒药物的副作用又能够有 效抑制病毒的新型治疗II型单纯疱疹病毒感染暨防治生殖器疱疹药物是十分 必要的。此外，流感病毒具有高度传染性，所以极易发生流行，甚至是世界范围
的大流行。我国也是流感多发地，自1957年以来的3次世界性大流行都起源 于我国。流感病毒属正粘液病毒科，流感病毒属，包括甲、乙、丙三型，甲 型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年 龄组人群，常引起世界性大流行。由于流感病毒疫苗应用上的一些限制，以 及该疫苗对临床流感患者无效等因素，抗病毒药物治疗在流感的控制中仍然 起着十分重要的作用。抗病毒药物根据它们针对病毒复制的不同环节可分为 离子通道M2阻滞剂、神经氨酸酶抑制剂、流感病毒受体阻断剂和抗流感病 毒反义寡核苷酸等。目前进入临床应用的主要为离子通道M2阻滞剂和神经 氨酸酶抑制剂。离子通道M2阻滞剂主要有两种金刚烷胺和金刚乙胺。他 们均可产生显著的胃肠道、中枢神经系统副反应，如神经质、焦虑、注意力 不集中、头痛、恶心和呕吐等。这些副作用一般较轻，多在用药后几小时内 出现，停药后大多可迅速消失。由于离子通道M2阻滞剂对B型流感病毒缺 乏活性，易产生耐药性，并且耐受性差，故它们没有被广泛应用。神经氨酸 酶抑制剂目前进入临床应用的神经氨酸酶抑制剂有扎那米韦和奥司他韦， 但至今为止尚未发现治疗流感病毒感染疾病的特效药物。
同理，从天然药物模板中寻找并优化新型抗流感先导化合物也是十分迫 切的任务。以阳性药物利巴韦林(病毒唑)为对照，测试化合物对狗肾传代 细胞(MDCK)感染流感病毒IVA (甲型流感病毒)的保护作用是筛选抑制 流感病毒药物先导化合物的一个明确而必要的手段。
黄酮木脂素化合物属于杂木质素类，是由一分子苯丙素和一分子黄酮结 合而成的一类含有C6-C3-C6-C3-C6结构单元的天然产物。其代表性化合物 当属存在于菊科植物水飞蓟的种子中的木质素二氢黄酮醇水飞蓟宾。水飞蓟 已在临床上广泛应用，在市场上其商品名为LegalonTM利肝隆或FlaVObk>nTM。 三十多年的临床实验证明该药具有确切的疗效和低毒性(参阅FloraK.等人， Am. J. Gastroenterol, 1998， 93， 139—143; Sailer R.等人，Drugs, 2001,61(14), 2035-2063)。因此，以水飞蓟宾为代表的黄酮木脂素类化合物引起了越来越 多的关注，如发明人于2006年制备并报道的一系列水飞蓟宾类衍生物也具有 显著的抗氧化活性(杨雷香、赵昱等，"Synthesis and Antioxidant Properties Evaluation of Novel Silybin Analogues", Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2006, 21(4), 399—404)。
水飞蓟宾类化合物具有以上所述之确切的多种疗效，然而其于抗病毒方面包括抑制单纯疱疹病毒、抑制流感病毒的新用途尚未得到有效开发，故此
我们制备了与水飞蓟宾结构有所差异的新的衍生物，也即在黄酮母体B环引 入骈合位置不同的二氧六环取代基，由此便形成了一些新颖结构的木质素二 氢黄酮醇类化合物。针对前述水飞蓟宾衍生物可能的抗病毒应用，我们测试 了其抑制I型单纯疱疹病毒HSV-1、II型单纯疱疹病毒HSV-2以及抑制流感 病毒IVA (FM-1株)复制的药理活性，以期最终获取能够有效抑制上述病 毒感染之自主知识产权的化学实体。试验结果发现本发明中合成得到的木 质素二氢黄酮醇类化合物即(土)-2-[2,3-二氢-2-(3,5-二甲氧基~4~羟基苯 基)-3-羟甲基-1，4苯并二氧六环-5]-2，3-二氢-3,5,7-三羟基~4^-1-苯并吡喃 "4-酮对HSV-1、 HSV-2以及FM-1病毒株均具有确切的抑制活性，可以作 为广谱抗病毒药物先导化合物继续开发，从而完成本发明。
本发明的目的在于提供一个具有式(I)结构的木质素二氢黄酮醇类化合 物即(±)~2-[2,3-二氢-2~(3，5-二甲氧基-4^羟基苯基)-3-羟甲基-1，4苯并二氧 六环-5]—2，3-二氢—3,5，7-三羟基4//—1—苯并吡喃~4—酮或其可药用盐在制备 防治由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡药物的用途。
本发明的再一个目的是提供了一种用于防治由单纯疱疹病毒HSV-1引 发的病毒感染和/或口腔溃疡的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为 活性成分的式(I)化合物或其可药用盐和可药用辅料。根据本发明，该药物 组合物中可加入各种药学上可接受的药用赋形剂，添加剂及载体。
本发明的又一个目的是提供了式(I)化合物用于制备防治由II型单纯 疱疹病毒HSV-2引发的生殖器疱疹病毒感染药物的用途。
本发明的另一个目的是提供了一种用于防治由II型单纯疱疹病毒
发明内容
式(I)HSV-2引发的生殖器疱疹的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活 性成分的式(I)化合物或其可药用盐和可药用辅料。根据本发明，该药物组 合物中可加入各种药学上可接受的药用赋形剂，添加剂及载体。
本发明的再一个目的是提供了式(I)化合物用于制备防治由流感病毒 IVA引发的病毒性感冒药物的用途。
本发明的另一个目的是提供了一种用于防治由流感病毒IVA引发的病 毒性感冒药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的式(I)化 合物或其可药用盐和可药用辅料。根据本发明，该药物组合物中可加入各种 药学上可接受的药用赋形剂，添加剂及载体。
本发明的又一个目的是提供了一种通过化学合成方法制备式(I)化合物 的方法。该方法的合成工艺路线特征是以化合物2，4,6-三甲氧甲氧基苯乙 酮(1)和1，2-二甲氧甲氧基苯甲醛(2)为起始原料，在有机溶剂和碱水溶 液中縮合得到査耳酮(3)，在碱性过氧化氢的作用下环氧化得到环氧査耳酮 (4)，(4)在酸性有机溶剂中环合得到二氢黄酮醇(±)"2-(2,3—二羟基苯基)2,3— 二氢-3,5,7-三羟基~4/7-1-苯并吡喃4-酮(5);在催化剂银盐催化下，(5) 与3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂醇(6)进行自由基偶联反应生成化合物 (±)-2-[2,3-二氢-2-(3,5-二甲氧基-4"羟基苯基)-3-羟甲基-1,4苯并二氧六环 -5]-2,3-二氢-3,5,7-三羟基-4i/-l-苯并吡喃4-酮，具体流程如下所示
OH 、其中，OMOM是指甲氧甲氧基。
本发明的特点是，经药理实验证明全合成得到的木质素二氢黄酮醇类
化合物即式(I)化合物(士卜2-[2，3-二氢-2-(3,5-二甲氧基~4-羟基苯基)-3-羟 甲基_1，4 苯并二氧六环-5]—2,3—二氢一3,5，7-三羟基一4//—1—苯并吡喃~4—酮 对I型单纯疱疹病毒HSV-1、 II型单纯疱疹病毒HSV-2以及流感病毒IVA (FM-1株)复制均有确切抑制作用，说明该化合物有望发展为广谱抗病毒 药物先导化合物及药物。
本发明有益之处在于将天然产物水飞蓟宾的结构优化得到具有抑制 HSV-1病毒、HSV-2病毒和流感FM-1病毒株活性的式(I)化合物，即 (±)~2-[2,3-二氢-2-(3,5-二甲氧基"4-羟基苯基)-3-羟甲基-1,4苯并二氧六环 -5]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基~4//-1-苯并吡喃4-酮，对于开发广谱抑制病毒创 新型药物提供了新的物质基础。该化合物可由简单原料经几步合成改造而得， 原料来源方便易得，制备步骤简便，成本低，产率较高，利于产业化。因此， 本发明具有潜在的社会效益和经济效益。
具体实施例方式
本发明中制备得到的木质素二氢黄酮醇类化合物即式(I)化合物或其可 药用盐用制药领域中的常规方法，结合中、西药制药中常规的可药用辅料， 可以制成各种药物组合物，如注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、 滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用 于防治由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡。
本发明的式(I)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗单纯疱疹 病毒感染、口腔溃疡的常用药物联合或交叉使用，制备得到具有治疗单纯疱 疹病毒感染、口腔溃疡的药物组合物或复方制剂。可组合的药剂例子包括阿 昔络韦(ACV)、万乃洛韦(VCV)、泛昔络韦(FCV)、喷昔洛韦(PCV)、 阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鸟苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔络 韦(GCV)等。此外，其还可以与神经痛镇痛药物以及解热镇痛药物合并用 药。
本发明的式(I)化合物或其可药用盐还可以与现已上市的治疗单纯疱疹 病毒HSV-2感染的常用药物联合或交叉使用，制备得到具有治疗生殖器疱疹 的组合物或复方制剂。本发明的式(I)化合物或其可药用盐可以与药学上常用的辅料或载体结 合，制备得到具有预防和治疗流感病毒引起的病症之药物及药物组合物。
本发明的式(I)化合物或其可药用盐还可以与己上市的流感病毒抑制剂 或其他治疗流感相关病症的治疗药物及其原料药如金刚烷胺、金刚乙胺和/ 或神经氨酸酶抑制剂如扎那米韦和奥司他韦等联合使用或交叉使用，制备得 到具有防治流感病毒感染的药物组合物或复方制剂。
上述各类药物组合物或者复方制剂可以采用片剂、胶囊剂、注射剂、气 雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂等剂型药物，包括采用现已公认的药剂学常识经 由常规制备而得的各种缓释、控释剂型或纳米制剂。
下面通过实施例进一步说明本发明。实施例给出了式(I)化合物的制备 和纯化方法及其相关结构鉴定的数据。必须说明，实施例中所述的制备方法 以及分离纯化方法是用于对本发明的说明而不是对本发明的限制。
为了更好地理解本发明的实质，本发明还通过实施例的方式说明式(I)
化合物对单纯疱疹病毒HSV-1、 HSV-2和流感病毒IVA (FM-1株)抑制作 用的药理实验结果。同样必须说明，本发明的这些药理相关实施例仍是用于 说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单 改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1:式(I)化合物(士>~2-[2，3-二氢-2H:3，5-二甲氧基^MS基苯基)-3-羟甲基-l,4 苯并二氧六环-5]-2,3-二氢-3,5,7-三羟基"4W-1-苯并吡喃~4-酮 的制备
U起始物A-2，4,6-三甲氧甲氧基苯乙酮(1)的制备
将2.6克的氢化钠的40毫升DMF溶液冰水浴冷却，于氮气保护状态下 滴加5.6克2,4,6-三羟基苯乙酮的60毫升苯和7.0毫升DMF的混合溶液，冰 浴冷却下滴加9.0毫升氯甲醚溶液，室温下搅拌24小时。倾入100毫升10 %氢氧化钠水溶液中，乙醚提取3次，每次50毫升，饱和碳酸氢钠洗涤，无 水硫酸钠干燥，过滤，浓縮，40克200~300目硅胶柱层析，石油醚/醋酸乙 酯4: l洗脱，得到7.0克起始物A (2，4,6-三甲氧甲氧基苯乙酮)。黄色油状 物。Rf (石油醚/醋酸乙酯=3 : 1): 0.30;核磁共振氢谱(400MHz，氘代氯 仿)S2.52(单峰，3H,CH3), 3.50 (单峰，9H，OCH3), 5.17 (单峰，6H,OCH20)， 6.52 (单峰，2H， H-3,5)。1.2起始物B — l,2-二甲氧甲氧基苯甲醛(2)的制备-
2，3-二羟基苯甲醛4.8克溶于30毫升丙酮，搅拌10分钟后加入碳酸钾 17.5克，再滴加氯甲醚(MOMC1) 6毫升，加热回流l小时，过滤，滤液浓 縮得到黄色油状物7.0克，直接用于下一步反应。 1.3中间体査耳酮(3)的制备
2.8克氢氧化钾溶入30毫升甲醇中，搅拌状态下滴加1.4克起始物A和 1.3克起始物B的混合甲醇溶液10毫升，室温下搅拌8小时，减压蒸除溶剂， 向残留物中加入20毫升水，醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有机 层，减压蒸除溶剂后，残余物经30克200 300目硅胶柱层析，石油醚/醋酸 乙酯3 : 1洗脱，得到1.76克中间体査耳酮。黄色油状物；Rf (石油醚/醋酸 乙酯=2: 1): 0.38; UV (甲醇)？onax: 209，300nm。用于下一步反应。 1.4环氧查耳酮(4)的制备
1.4克中间体查耳酮溶于25毫升甲醇中，加入1.6毫升2N氢氧化钾水溶 液，再加入1.6毫升30%双氧水溶液，室温搅拌2小时。加入25毫升水，减 压浓縮，用醋酸乙酯提取(3次，每次20毫升)，合并有机层，无水硫酸钠 干燥，过滤，减压蒸除溶剂后，残余物经20克200 300目硅胶柱层析，石 油醚/醋酸乙酯3 : 1洗脱，得到1.1克中间体环氧查耳酮。黄色油状物；Rf (石油醚/醋酸乙酯=2 : 1): 0.33; UV (甲醇)？onax: 210,285nm。用于下 一步反应。
1.5 二氢黄酮醇(±)-2~(2,3-二羟基苯基)2，3-二氢-3，5，7-三羟基^^-l-苯并吡 喃^—酮(5)的制备
1.0克中间体环氧查耳酮溶解于15毫升甲醇中，搅拌状态下加至溶解有 1.5毫升浓盐酸的IO毫升甲醇溶液中，升温60。C反应半小时，撤去加热，冷 却后减压蒸除溶剂，向残余物中加入50毫升水，用醋酸乙酯提取(3次，每 次20毫升)，合并有机层，饱和食盐水洗2次，无水硫酸钠干燥，过滤，减 压蒸除溶剂后，残余物经20克200-300目硅胶柱层析，石油醚/乙酸乙酯3 :1洗脱,得到97毫克(±)-2-(2,3-二羟基苯基)2,3-二氢-3,5,7-三羟基"4/M-苯并吡喃4-酮。黄色油状物。Rf (石油醚/醋酸乙酯=2 : 1): 0.29;直接用
于下一步反应。
1.6式(I)化合物的制备
向干燥的反应瓶中投入碳酸银0.22克，加入20毫升无水苯和5毫升无 水丙酮，室温下滴加90毫克(±)-2-(2,3-二羟基苯基)2,3-二氢-3,5,7-三羟基~4//-1-苯并吡喃~4-酮的无水苯溶液5毫升和89毫克3，5-二甲氧基-4-羟基肉 桂醇(6)的无水丙酮溶液3毫升，在55T时保温反应20小时。冷至室温后 静置，滤去不溶物，母液减压浓缩，得黄色油状物，经20克200 300目硅 胶柱层析，氯仿/甲醇10: l洗脱，得到26毫克式(I)化合物。
Rf (氯仿/甲醇/醋酸乙酯/丙酮/乙酸=11 : 0.5 : 1 : 1 : 0.1): 0.24;核磁
共振氢谱& NMR (400 MHz,気代丙酮)S: 3.92 (多重峰，1H, H-23a), 4.22 (多重峰，1H， H—23b)， 4.78 (多重峰，1H， H-IO), 4.95 (双峰,J =11.2 Hz， 1H， H-3), 5.51 (多重峰，1H, H-ll)， 5.65 (双峰，J =11.2 Hz, 1H, H-2), 5.84 (双峰，J =1.2 Hz， 1H， H—6), 5.88 (双峰，J =1.2 Hz, 1H, H—8)， 6.78~6.93 (多重峰，3H， H—14， 18, 22)， 7.05 (双峰，J =8.0 Hz, 1H， H—15)， 7.11 (双峰，J =8.0 Hz， 1H， H—13), 10.07 (宽单峰，1H, OH-20), 10.41 (宽单峰，1H, OH—7), 12.33 (单峰，1H: 5-OH);电喷雾质谱ESI-MS: 511 (M—l)+。
由于银盐催化下的偶合反应产物以反式构型为主，故本发明得到的优势 产物也为二氧六环11位与12位互为反式构型的消旋体产物。
实施例2:采用MTT法测定式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性，以及用 微量细胞病变抑制(CPE)法研究其对HSV-1的抑制作用试验 2.1实验目的
以HSV-1感染的Vero细胞为模型，筛选抗HSV药物，其中样品来自 实施例l的式(I)化合物样品。 2.2材料
2.2.1病毒和细胞
2.2丄1病毒HSV-1由浙江大学药学院中药与天然药物研究室提供； 2.2丄2细胞Vero细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。 2.3试剂
2.3.1 RPMI 1640培养基Gibco公司产品；
2.3.2 L-谷胺酰氮AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司 分装；
2.3.3 MTT: AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司分装； 2.3.4胎牛血清Gibco公司产品；
2.3.5青霉素钠江西东风药业股份有限公司产品； 2.3.6硫酸链霉素华北制药股份有限公司产品；2.3.7阳性对照药阿昔洛韦(ACV)，湖北科益药业股份有限公司，0.25g/
支。 2.4仪器
2.4.1 C02培养箱美国Shellab公司产品；
2.4.2 XD-2倒置显微镜重庆光电仪器有限公司产品； 2.4.3生物安全柜美国LABCONCO公司产品；
2.4.4 Synergy HT酶标仪美国BIO-TEK公司产品；
2.4.5 LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂产
P
B口 o
2.5细胞培养和病毒传代
将Vero细胞培养于含10%灭活小牛血清，100U/毫升青霉素和100微克 /毫升的RPMI1640培养基中，置37。C， 5%二氧化碳，100%相对湿度的培 养箱中培养。将HSV-1加入长有的Vero的细胞瓶中，置37。C， 5%二氧化 碳，100%相对湿度的培养箱中培养，收集培养上清，置低温下保存。 2.6实验方法
2.6.1采用MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法测定式(I) 化合物对Vem细胞生长的抑制作用
(1) 测试药物实施例1制备得到的式(I)化合物；阿昔洛韦(ACV)为 阳性对照药物。
(2) 取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成1X10V毫升，接 种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37t:， 5%二氧化碳，100%相对 湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的式(I)化合物，浓度分 别为100微克/毫升，20微克/毫升和10微克/毫升，置于培养箱中培养，培 养72小时后，每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基， 每孔加入二甲亚砜200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶 标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。抑制率(％)二 (对照孔 OD值-实验组OD值)/对照孔OD值X100。/。。实验重复三次。根据不同浓 度下对细胞生长的抑制率，计算对细胞生长的半数中毒浓度(TD50)。
2.6.2用微量细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用
取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成lxl0S/毫升，接种 于96孔细胞培养板，37°C， 5%二氧化碳，100%相对湿度培养24小时，加入 lOOTCIDso的病毒100微升，倾出病毒，分别加入不同浓度的式(I)化合物，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37°C， 5%二氧化碳，100%相对湿度 培养48小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变
的标准， 一细胞无变化，分值为8分；+: 25%以下细胞出现病变，分值 为6分；+ + : 25% 50%细胞出现病变，分值为4分；+ + + : 50% 75 %细胞出现病变，分值为2分；+ + + + : 75%以上细胞出现病变，分值为o分。
2.6.3实验结果
式(I)化合物在100微克/毫升浓度下抑制HSV-1复制的百分抑制率为 25%，而阳性对照药物阿昔络韦在100微克/毫升浓度下抑制HSV-1复制的 百分抑制率为100%。 2.6.4 结论
上述试验结果说明，式(I)化合物对I型单纯疱疹病毒有一定的抑制作 用，虽然其抑制强度低于阳性对照药阿昔洛韦，但其为源自天然产物的非核 苷类化合物，属于该类化合物中具有明显效果的HSV-1抑制剂，从而可以 期望其进一步开发成为抑制HSV-1病毒和防治口腔溃疡的药物，或可与已上 市治疗HSV-1病毒感染药物联合使用。
实施例3:微量细胞病变抑制(CPE)法研究式(I)化合物对HSV-2的抑制 作用
3.1实验目的
以HSV-2感染的Vero细胞为模型，筛选抗HSV药物，其中样品来自 实施例1中制得的式(I)化合物样品。 3.2材料
3.2.1病毒和细胞
3.2丄1病毒HSV-2由浙江大学药学院中药与天然药物研究室提供； 3.2丄2细胞Vero细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。 3.2.2试剂
3.2.2.1 RPMI 1640培养基Gibco公司产品；
3.2.2.2 L-谷胺酰氨AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司 分装；
3.2.2.3 MTT: AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司分装； 3.2.2.4胎牛血清Gibco公司产品；3.2.2.5青霉素钠江西东风药业股份有限公司产品； 3.2.2.6硫酸链霉素华北制药股份有限公司产品；
3.2.2.7阳性对照药阿昔洛韦(ACV)，湖北科益药业股份有限公司，0.25g/ 支。
3.2.3仪器
3.2.3.1 C02培养箱美国Shellab公司产品；
3.2.3.2 XD-2倒置显微镜重庆光电仪器有限公司产品； 3.2.3.3生物安全柜美国LABCONCO公司产品；
3.2.3.4 Synergy HT酶标仪美国BIO-TEK公司产品；
3.2.3.5 LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
口
广pm o 3.3方法
3.3.1病毒毒力测定:在长成单层的细胞中加入IO倍连续倍比稀释的病毒液， 从10"到10'9等共9个浓度，在37。C， 5%二氧化碳，100%相对湿度条件下 培养48小时，然后用MTT法比色，测定病毒的毒力，以TCIDso表示。 3.3.2样品毒性测定用培养基将药物连续稀释成4个浓度(100微克/毫升， 10微克/毫升，l微克/毫升)，分别加入细胞已长成单层的96孔培养板中， 每孔200微升，置于37'C， 5%二氧化碳，100%相对湿度的培养箱中培养， 培养72小时后用MTT法测定样品对细胞的毒性，计算半数中毒浓度(TD50)。 3.3.3细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用细胞接种96孔培养板， 37°C， 5%二氧化碳，100%相对湿度培养24小时，加入2X100TCID5o的病 毒100微升，吸附2小时，倾出病毒，分别加入最大浓度为无毒浓度的不同 浓度样品，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37°C， 5%二 氧化碳，100%相对湿度培养72小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五 级标准作为判断细胞病变的标准， 一细胞无变化，分值为8分；+: 25% 以下细胞出现病变，分值为6分；+ + : 25% 50%细胞出现病变，分值为
4分；+ + + : 50% 75%细胞出现病变，分值为2分；+ + + + : 75%以
上细胞出现病变，分值为o分。
3.4结果
式(I)化合物在100微克/毫升浓度下抑制HSV-2复制的百分抑制率为 35%，而阳性对照药物阿昔络韦在100微克/毫升浓度下抑制HSV-2复制的 百分抑制率为100%。3.5结论
上述试验结果说明，式(i)化合物对n型单纯疱疹病毒有一定的抑制作
用，虽然其抑制强度低于阳性对照药阿昔洛韦，但其为源自天然产物的非核
苷类化合物，属于该类化合物中具有明显效果的HSV-2抑制剂，从而可以 期望其进一步开发成为防治生殖器疱疹的药物，或与已上市治疗HSV-2病毒 感染药物联合使用。
实施例4:微量细胞病变抑制(CPE)法研究实施例1制备得到的式(I)化
合物之抗流感病毒作用
4.1实验目的
以甲型流感病毒(IVA)感染的Vero细胞为模型，筛选抗流感病毒药物， 其中样品来自实施例1式(I)化合物样品。 4.2材料
4.2.1病毒和细胞
4.2丄1病毒甲型流感病毒(IVA)由浙江大学药学院中药与天然药物研究 室提供；病毒按照常规接种于9一11日龄的鸡胚尿囊腔中，35°C培养72小时， 4。C冰箱过夜，收集尿囊液。进行红细胞凝集试验，测得病毒效价l 1280。 4.2丄2细胞狗肾细胞MDCK细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。 4.2.2试剂
4.2.2.1 RPMI 1640培养基Gibco公司产品；
4.2.2.2 L-谷胺酰氨AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司 分装；
4.2.2.3 MTT: AMRESCO产品，上海生工生物工程技术服务有限公司分装； 4.2.2.4胎牛血清Gibco公司产品；
4.2.2.5青霉素石家庄制药集团有限公司产品； 4.2.2.6链霉素石家庄制药集团有限公司产品；
4.2.2.7阳性对照药利巴韦林(RBV)，扬州中宝制药有限公司，0.1克/毫 升。
4.2.3仪器
4.2.3.1 C02培养箱美国Shellab公司产品；
4.2.3.2 XD-2倒置显微镜重庆光电仪器有限公司产品； 4.2.3.3生物安全柜美国LABCONCO公司产品；4.2.3.4 Synergy HT酶标仪美国BIO-TEK公司产品；
4.2.3.5 LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂
口
广叩o
4.3方法
4.3.1病毒毒力测定
4.3丄1取对数生长期的细胞一瓶，消化后加入1640培养液，接种于96孔细
胞培养板，每孔100微升，37°C,培养24小时；
4.3丄2次日取出96孔板，弃去培养液后，用Hank's液洗两次；
4.3丄3将病毒从低温冰箱中取出，分别加入10倍连续倍比稀释的病毒液，
从10"到10—9等共9个浓度，在37"， 5%二氧化碳，100%相对湿^^条件下
培养48小时，然后观察细胞病变效应(CPE)，测定病毒的毒力，结果记录
为"++++"为100%病变；"+++"为75%病变；"++"为50%病变；"+ "
为25%病变，"-"为阴性结果。 4.3.2样品毒性测定
4.3.2.1取对数生长期的细胞一瓶，消化后加入1640培养液，接种于96孔细
胞培养板，每孔100微升，37°C，培养24小时；
4.3.2.2次日取出96孔板，弃去培养液后，用Hank's液洗两次；
4.3.2.3用无血清1640培养基将已配好的药物连续稀释成4个浓度(IOOO微
克/毫升，100微克/毫升，10微克/毫升，1微克/毫升)，分别加入细胞已
长成单层的96孔培养板中，每孔100微升，置于37"C， 5%二氧化碳，100
%相对湿度的培养箱中培养，培养72小时；
4.3.2.4在570nm波长下用酶标仪比色，计算每个浓度下的抑制率，计算样
品对细胞的半数中毒浓度(TD5{))。
4.3.3细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用
4.3.3.1取对数生长期的细胞一瓶，消化后加入1640培养液，接种于96孔细
胞培养板，每孔100微升，37°C，培养24小时；
4.3.3.2次日取出96孔板，弃去培养液后，用Hank's液洗两次；
4.3.3.3倾出96孔板中培养液，加入1640稀释后浓度为100 TCID5o病毒液
100微升，37°C， 5%0)2下吸附2小时。
4.3.3.4加入式(I)化合物最大无毒浓度(TD^1600微克/毫升)药液作连续 2倍稀释的6个浓度，每浓度3孑L， 37°C、 5。/。C02下培养3天。加入利巴韦林 (病毒唑)最大无毒浓度(TD。)药液作连续2倍稀释的6个浓度，37°C、5%(302下培养3天。分别设立实验药和阳性药、细胞对照和病毒对照组。3 天后显微镜下观察细胞病变，记录病变程度(CPE)。按Reed-Muench法分 别计算式(I)化合物和利巴韦林的抗病毒效果。
4.4试验结果按照CPE法测出的式(I)化合物的半数有效浓度IC5Q= 218 微克/毫升；治疗指数TI-TD5o/IC5(T 7.3;而阳性对照的利巴韦林的半数有 效浓度5.0微克/毫升；治疗指数TP 253.0。 4.5结论
上述试验结果说明，式(I)化合物对甲型流感病毒有一定的抑制作用， 可以进一步开发成为防治甲型流感的药物，或与已上市治疗甲型流感病毒感 染药物联合使用。
在上述说明书阐述本发明时，同时提供了实施例和药理实施例的目的是 举例说明本发明的实际操作过程和本发明的意义。在进入本发明权利要求和 其等同物范围内时，本发明的实际应用包括所有一般变化、配合，或改进。
权利要求
1.一种式(I)所示结构之化合物(±)-2-[2，3-二氢-2-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-3-羟甲基-1，4苯并二氧六环-5]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可药用盐用于制备治疗由I型单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡的药物的用途； id="icf0001" file="A2009100962910002C1.tif" wi="52" he="54" top= "60" left = "72" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>式(I)其中，式(I)化合物11、12位的立体构型互为反式，也即二者同时是R或同时是S构型。
2. 式(I)所示结构之化合物(±)—2-[2,3_二氢-2《3,5—二甲氧基~4—羟基苯 基)-3-羟甲基-1,4苯并二氧六环-5]-2,3-二氢-3，5,7-三羟基^^-1-苯并吡喃 -4-酮或其可药用盐用于制备治疗由II型单纯疱疹病毒HSV-2引发的生殖器 疱疹的药物的用途。
3. 式(I)所示结构之化合物(±)~2-[2,3-二氢-2-(3，5—二甲氧基4-羟基苯 基)-3-羟甲基-1，4苯并二氧六环-5]-2，3-二氢-3,5,7-三羟基~4//-1-苯并吡喃 4—酮或其可药用盐用于制备防治由流感病毒IVA引发的病毒性感冒的药物的用途。
4. 一种用于防治由I型单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡 的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的(±)~2-[2,3-二氢 -2-(3，5-二甲氧基~4-羟基苯基)-3-羟甲基-1,4苯并二氧六环-5]-2,3-二氢 -3,5，7-三羟基-4^-1-苯并吡喃~4-酮或其可药用盐和可药用辅料。
5. —种用于防治由II型单纯疱疹病毒HSV-2引发的生殖器疱疹的药物或药 物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的(±)"2-[2，3-二氢-2-(3,5-二甲 氧基_4-羟基苯基)-3-羟甲基-1,4苯并二氧六环-5]-2,3-二氢-3,5,7-三羟基 477-1-苯并吡喃"4-酮或其可药用盐和可药用辅料。
6. —种用于防治由流感病毒IVA引发的病毒性感冒的药物或药物组合物， 其含有治疗有效量的作为活性成分的(±)~2-[2,3-二氢-2-(3,5-二甲氧基+羟 基苯基)-3—羟甲基-1，4苯并二氧六环-5]—2，3—二氢—3,5,7—三羟基4H—l—苯并 吡喃~4-酮或其可药用盐和可药用辅料。
7. 根据权利要求4 6任一项中所述的药物或药物组合物，其剂型是注射剂、 片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、膜剂、滴丸剂、外用搽剂，或控释或缓释剂 型或纳米制剂。
全文摘要
本发明涉及一个木质素二氢黄酮醇在制备抗病毒药物中的应用，具体而言，本发明涉及式(I)化合物，即(±)-2-[2，3-二氢-2-(3，5-二甲氧基-4-羟基苯基)-3-羟甲基-1，4苯并二氧六环-5]-2，3-二氢-3，5，7-三羟基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，或其可药用盐用于制备抑制单纯疱疹病毒和/或流感病毒药物的用途。体外药理实验显示式(I)化合物不仅能显著抑制单纯疱疹病毒HSV-1、HSV-2的生长，还可以有效抑制流感病毒IVA。从而可以预期将其开发成为防治I型/II型单纯疱疹病毒感染药物，或防治由IVA病毒感染引起的病毒性流感药物。
文档编号A61P31/16GK101548970SQ20091009629
公开日2009年10月7日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者冯玉冰, 巫秀美, 李校堃, 李海波, 佳 瞿, 昱 赵, 郝小江, 黄可新 申请人:温州医学院;李校堃