专利名称：一种二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的制作方法
技术领域：
本发明属靶向制剂，具体涉及一种二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制剂及其应用。
背景技术：
抗肿瘤光敏剂光动力学治疗(photodynamictherapy， PDT)是20世纪80年代
初兴起并在近年发展迅速的新颖治疗肿瘤的方法。光动力学疗法具有毒性小、收效快的特点。通过生物光动力敏化作用，即在特定波长的激光照射后，光敏剂受到激发，由基态(So)经激发单线态(SO转变为激发三线态(TO，然后由激发三线态(T,)使周围介质中的分子氧成为单线态氧。02)等活性物质，它们与生物分子中的氧化敏感基团作用，导致其氧化失活，最终引起肿瘤细胞死亡而显示其治疗作用。
目前临床上应用的光动力治癌药物如血卟啉衍生物(HpD)、光敏素n等均为成分复杂的卟啉混合制剂，存在着在红光区的吸收系数小、有效光动力效应低、光毒反应大及化学组成不定等缺点。而二氢卟吩e6是叶绿素稳定降解产物中与生物活性联系最广的成分之一，并且已成为光动力治癌新药研究中倍受瞩目的研究对象。有报道表明，二氢卟吩e6吸收波长在红光区(664nm)，单线态氧产率OA较高，对肿瘤的抑制率远好于血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative, HpD )对肿瘤的抑制率。
在动物试验中观察到，二氢叶吩e6的分布特点是血药浓度高、半衰期较长和肿瘤组织中滞留量大且相对时间较长。缺点是二氢叶吩e6呈现长时间皮肤光毒性，且有效剂量大。由于肿瘤组织对光敏剂只是相对的选择性吸收,并不具备特异性，所以正常组织中不可避免地分布有少量的光敏剂，可能产生光毒副作用。当难以把光源局限在靶位组织,如腹腔和胸腔肿瘤时，为了减少对周围正常组织的毒副作用，开发靶向型的光敏剂制剂就显得尤为重要。
近年来，为了提高光敏剂在肿瘤细胞的浓度，许多研究组将第二代光敏剂负载在适当的载体上，制成脂质体、纳米粒等，通过正常生理过程选择性地运送、积集至靶组织，大幅度提高光敏剂抗肿瘤活性，这对提高药物治疗作用，降低毒
副作用，具有十分重要的意义。Richter等]研究发现，苯并卟啉衍生物单环酸A制成脂质体，能介导药物迅速地进入组织。Vargas等将meso-(对羟基苯)卟啉
(p-THPP)制成PLGA纳米粒，可明显增强药物对乳腺癌细胞的作用。Konan-Kouakou等f研究发现，将维替泊芬制成乳酸"4圣乙酸共聚物(PLGA)纳米粒，小粒径的载药纳米粒比药物的DMSO/PBS溶液对乳腺癌EMT-6细胞的光细胞毒性大，并且进入组织的速度明显加快。
聚合物胶团(polymeric micelles, PMs)是近几年正在发展的一类新型纳米载体，具有增溶、靶向、低毒和长循环的优点。聚合物胶团由两亲性的聚合物在水性环境中自发形成，具有独特的核-壳结构。其内核可为难溶性药物提供储库，亲水性外壳则可进行理化性质修饰，负载多肽蛋白类药物及基因药物，并达到体内靶向分布、逃避单核巨噬细胞的吞噬、提高生物膜转运等作用。聚合物胶团自身可通过"增强的透过及滞留效应"(enhanced permeability and retention effect)聚集到肿瘤组织。
壳聚糖是一种具有低毒、高生物相容性、可体内降解的阳离子型载体材料。将硬脂酸(stearic add, SA)嫁接到壳聚糖(chitosan， CSO)的主链上，得到两亲性壳聚糖-硬脂酸嫁接物(stearic acid-grafted chitosan oligosaccharide, CSO-SA)。研
究发现壳聚糖-硬脂酸嫁接物可在水性介质中通过自聚集形成胶束，并具有快速
细胞摄取的功能。
发明内容
本发明的目的是提供二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制剂，与二氢口卜吩e6溶液剂相比，通过二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束给药，可显著提高肿瘤细胞内的药物浓度。
二氢叶吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，由壳聚糖-硬脂酸嫁接物和二氢口卜吩e6组成，其中二氢卟吩e6占总重量的4.76-16.67%;壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量18.0KDa的低分子量壳聚糖，与硬脂酸化学嫁接形成，壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为4.96%,当壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度超过临界胶束浓度时，在水性介质中可自发形成嫁接物胶束，胶束具备被细胞快速摄取的功能。本发明的嫁接物胶束的组成已为专利"表面修饰疏水改性壳寡糖聚合物给药胶团及其制备方法，，(专利号:ZL20061005160L0)所涵盖。
所述二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，通过以下方法制备而得
取40mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入8-32 mL蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，得5 mg/mL的胶束溶液，加入同体积浓度为0.25mg/mL的二氢卟吩乙醇溶液，冰浴条件下探头超声30次(400W，工作2s停3s)，将混合液装入透析袋(MWCO 3.5 iCDa, SpectrumLaboratories, LagunaHills，CA)，用去离子水室温下透析24 h，除去乙醇，将透析液冷冻干燥，得二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束粉末。
本发明的另一个目的是提供二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束在制备革巴向型的光敏剂制剂中的应用。
本发明为分子靶标位于细胞内的二氢卟吩e6提供一种靶向给药载体材料，具体为壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束。壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束具有聚合物胶束体内的被动耙向和肿瘤细胞的快速摄取功能，通过壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束对第二代光敏剂二氢卟吩e6的有效包封，克服了二氢叶吩e6呈现长时间皮肤光毒性，且有效剂量大，对正常组织可能产生光毒副作用等缺点。制备的二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，为细胞内给药制剂，可大大提高分子靶标位于肿瘤细胞内的二氢卟吩e6的细胞内药物浓度，减少对周围正常组织的毒副作用，为后续实现高效低毒的肿瘤光动力学治疗提供可能。提供开发靶向型的光敏剂制剂的依据。
图h二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的二氢卟吩e6体外释放行为。图2:肿瘤细胞内药物浓度的经时变化。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例l:
1)低分子量壳聚糖的制备
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95%) 90g，加至3000mL1.25% (v/v)的盐酸水溶液中，55 6(TC温度条件下，溶涨2小时后，加入5%的纤维素酶(w/w)，在55 6(TC温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖。所得降解反应液，使用50 Kda和10 Kda超滤膜(Biomax-10，Millipore Co. ， USA)超滤分级后，取分子量10 50 Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量，采用TSK-gdG3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸钠(pH6,0)为流动相，以分子量0.73， 5.9， 11.8， 47.3， 212.0, 788.0 Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均分子量为18.0kDa。2) 壳聚糖-硬脂酸嫁接物合成及理化性质测定
取上述壳聚糖O.lg，精密称量，加20mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1 : 100)的碳二亚胺(EDC),搅拌溶解。按照壳寡糖硬脂酸(摩尔比)1 : 25，称取硬脂酸溶于10mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400 rpm磁力搅拌条件下，80 "C恒温反应5小时，冷却至室温(25°C)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳聚糖(0.5~9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4% (w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1X (w/v)的三硝基苯磺酸2mL， 37。C孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳聚糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，领!]定氨基取代度为4.96%。
采用芘荧光法测定壳聚糖-硬脂酸的临界胶束浓度。制备不同浓度壳聚糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7xl(^mol/L )，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定1375/ 1396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为0.036mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位。经测定，lmg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为28.9nm和39.1mV。
3) 二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制备及其理化性质测定取40mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入8mL蒸
馏水(pH为5.7),探头超声20次(500w，工作2s停3s)，得5 mg/mL的胶束溶液。加入0.25 mg/mL 二氢卟吩e6的乙醇溶液8mL，冰浴条件下探头超声30次(400W，工作2s停3s)，将混合液装入透析袋(MWCO 3.5 SpectrumLaboratories, LagunaHills，CA),用去离子水室温下透析24 h，除去乙醇，将透析液冷冻干燥，得二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束粉末。
经测定，1 mg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径为302.6nm，表面电位为40.5mV。药物包封率为100%。药物含量为4.76%。
二氢吓吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的体外释放在37 。C恒温、振荡频率
660 rpm条件下进行。取二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束固体粉末，用去离子水(pH为5.7)分散，得药物浓度为32 |ig/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束溶液，分别取2.5 mL装入透析袋中(MWCO 7.0 XDa， Spectrum Laboratories,Laguna Hills, CA),将透析袋置于含PBS 7.4 (含0.2%吐温80) 20mL的释放管中。定时取样1.0mL， HPLC测定药物浓度，计算累积释放量。二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的二氢卟吩e6体外释放行为见图1。
4) 二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的细胞内药物浓度分布测定取对数生长期肺上皮肿瘤细胞A549细胞，胰酶消化后用培养基调整细胞密度为l.O xl05/mL，按4.0 mL/孔接种于12孔培养板，培养箱内预培养24 h，分别加入二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，恒定药物浓度为12.5 g/mL，并以同浓度的游离药物作对照，于37 。C分别孵育2、 4、 6、 8、 12、 24 h后，用PBS (pH7.4)冲洗细胞三次，用50L胰酶消化，用0.5 mL PBS收集细胞，冰浴探头超声20次(400 W，工作2s,停3s)，得细胞破碎液。取适量细胞破碎液，加入等体积的无水乙醇水浴超声破碎胶团，溶解药物，过0.22m微孔滤膜后进样，测定药物含量。
同步取上述细胞破碎液20 L，加至96孔培养板中，加入200 L的BCA工作液，37。C放置30min以上。用酶联检测仪在570 nm处测定吸光值。根据已知浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)制作标准曲线，并用该曲线计算细胞溶解液中的蛋白质含量(M)。定义参数F， F为不同时间点时，细胞内药物浓度与细胞内蛋白质含量的比值。根据下列公式考察细胞在不同孵育时间的药物摄取能力。
T时刻细胞摄取药物的百分率(％) =F(T)/F(0)xl00% (2)式中，F(T)-T时刻细胞内药物的浓度/T时刻细胞内蛋白质含量，F(0) = 0
时刻药物的初始浓度/o时刻细胞内蛋白质含量
细胞内的药物浓度经时测定结果见图2。结果显示，通过嫁接物胶束介导可显著增加肿瘤细胞内的药物浓度；在短时间内，细胞内药物浓度随着孵育时间的延长而增加。与肿瘤细胞共孵育2小时后，以游离药物形式给药，细胞摄取药物百分率仅为总药物的2.86 %，以嫁接物胶束形式给药，细胞摄取药物百分率可达20.46%以上；与肿瘤细胞共孵育24小时后，以游离药物形式给药，细胞摄取药物百分率仅为总药物的6.61 %，以嫁接物胶束形式给药，细胞摄取药物百分率可达26.85 %以上。实施例2:
1) 低分子量壳聚糖的制备
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95%)卯g，加至3000mL1.25% (v/v)的盐酸水溶液中，55 6(TC温度条件下，溶涨2小时后，加入5%的纤维素酶(w/w)，在55 60'C温度条件下进行降解。控制反应温度和时间，得低分子量壳聚糖。所得降解反应液，使用50 Kda和10 Kda超滤膜(Biomax-lO，Millipore Co. ， USA)超滤分级后，取分子量10 50 Kda超滤液冷冻干燥。凝胶渗透色谱法测定壳聚糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1 mol/L醋酸钠(pH6.0)为流动相，以分子量0.73， 5.9， 11.8， 47.3， 212.0， 788.0 Kda的葡聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的重均分子量为18.0kDa。
2) 壳聚糖-硬脂酸嫁接物合成及理化性质测定
取上述壳聚糖0.1g，精密称量，加20mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量(壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1 : 100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照壳寡糖硬脂酸(摩尔比)1 : 25，称取硬脂酸溶于10mL无水乙醇溶液中。将上述两种溶液的混合液，在400 rpm磁力搅拌条件下，80 'C恒温反应5小时，冷却至室温(25'C)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖-硬脂酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳聚糖(0.5 9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸馏水中，加入4% (w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.lX (w/v)的三硝基苯磺酸2mL， 37。C孵育2小时。加入2N盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳聚糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为4.96%。
采用芘荧光法测定壳聚糖-硬脂酸的临界胶束浓度。制备不同浓度壳聚糖-脂肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7xlO;mol/L )，室温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧光强度，并以测定1375/ 1396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为0.036mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位。经测定，lmg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别为28.9nm禾卩39.1mV。
83) 二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制备及其理化性质测定
取40 mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入16 mL 蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，得2.5 mg/mL的 胶束溶液。加入0.25mg/mL二氢卟吩e6的乙醇溶液16mL，冰浴条件下探头超 声30次(400W，工作2s停3s)，将混合液装入透析袋(MWCO 3.5Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA)，用去离子水室温下透析24 h，除去乙醇，将透 析液冷冻干燥，得二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束粉末。
经测定，1 mg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸 嫁接物胶束的粒径为288.2nm，表面电位为36.5mV。药物包封率为100%。药物 含量为9.09%。
二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的体外释放在37 。C恒温、振荡频率 60 rpm条件下进行。取二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束固体粉末，用去 离子水(pH为5.7)分散，得药物浓度为32 pg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束 溶液，分别取2.5 mL装入透析袋中(MWCO 7.0 AX^， Spectrum Laboratories, LagimaHills, CA)，将透析袋置于含PBS 7.4 (含0.2 %吐温80) 20 mL的释放 管中。定时取样1.0mL， HPLC测定药物浓度，计算累积释放量。二氢卟吩e6 壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的二氢卟吩e6体外释放行为见图1。
4) 二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶朿的细胞内药物浓度分布测定 取对数生长期肺上皮肿瘤细胞A549细胞，胰酶消化后用培养基调整细胞密
度为l.O xl05/mL，按4.0 mL/孔接种于12孔培养板，培养箱内预培养24 h，分 别加入二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，恒定药物浓度为12.5 g/mL， 并以同浓度的游离药物作对照，于37 。C分别孵育2、 4、 6、 8、 12、 24 h后， 用PBS (pH7.4)冲洗细胞三次，用50 L胰酶消化，用0.5 mL PBS收集细 胞，冰浴探头超声20次(400 W，工作2s，停3s)，得细胞破碎液。取适量细胞 破碎液，加入等体积的无水乙醇水浴超声破碎胶团，溶解药物，过0.22 m微 孔滤膜后进样，测定药物含量。
同步取上述细胞破碎液20 L，加至96孔培养板中，加入200 L的BCA 工作液，37 。C放置30 min以上。用酶联检测仪在570 nm处测定吸光值。'根据 己知浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)制作标准曲线，并用该 曲线计算细胞溶解液中的蛋白质含量(M)。定义参数F， F为不同时间点时， 细胞内药物浓度与细胞内蛋白质含量的比值。根据下列公式考察细胞在不同孵育 时间的药物摄取能力。T时刻细胞摄取药物的百分率(％) =F(T)/F(0)xi00% (2) 式中，F(T"T时刻细胞内药物的浓度/T时刻细胞内蛋白质含量，F(0) = 0 时刻药物的初始浓度/0时刻细胞内蛋白质含量
细胞内的药物浓度经时测定结果见图2。结果显示，通过嫁接物胶束介导可 显著增加肿瘤细胞内的药物浓度；在短时间内，细胞内药物浓度随着孵育时间的 延长而增加。与肿瘤细胞共孵育2小时后，以游离药物形式给药，细胞摄取药物 百分率仅为总药物的2.86 %，以嫁接物胶束形式给药，细胞摄取药物百分率可 达20.46%以上；与肿瘤细胞共孵育24小时后，以游离药物形式给药，细胞摄 取药物百分率仅为总药物的6.61 %，以嫁接物胶束形式给药，细胞摄取药物百 分率可达26.85 %以上。
实施例3:
1) 低分子量壳聚糖的制备
取市售分子量为450kDa的壳聚糖(脱乙酰度为95%) 90g，加至3000mL 1.25% (v/v)的盐酸水溶液中，55 6(TC温度条件下，溶涨2小时后，加入5% 的纤维素酶(w/w)，在55 6(TC温度条件下进行降解。控制反应温度和时间， 得低分子量壳聚糖。所得降解反应液，使用50 Kda和10 Kda超滤膜(Biomax-lO， Millipore Co. ， USA)超滤分级后，取分子量10 50 Kda超滤液冷冻干燥。凝胶 渗透色谱法测定壳聚糖分子量，采用TSK-gel G3000SW色谱柱，0.1mol/L醋酸 钠(pH6.0)为流动相，以分子量0.73， 5.9， 11.8， 47.3， 212.0， 788.0 Kda的葡 聚糖标样制备洗脱曲线，用该洗脱曲线计算壳聚糖分子量。经测定所得壳聚糖的 重均分子量为18.0kDa。
2) 壳聚糖-硬脂酸嫁接物合成及理化性质测定
取上述壳聚糖0.1g，精密称量，加20mL蒸馏水搅拌溶解后，加入配比量 (壳寡糖与碳二亚胺的摩尔比为1 : 100)的碳二亚胺(EDC)，搅拌溶解。按照 壳寡糖硬脂酸(摩尔比)1 : 25，称取硬脂酸溶于lOmL无水乙醇溶液中。将 上述两种溶液的混合液，在400 rpm磁力搅拌条件下，80 。C恒温反应5小时， 冷却至室温(25°C)，继续搅拌6小时。将终反应液置透析袋中，蒸馏水透析48 小时。透析液冷冻干燥后，以无水乙醇洗涤去除残留的硬脂酸，得壳聚糖-硬脂 酸嫁接物。
采用三硝基苯磺酸法测定嫁接物的氨基取代度。取不同量壳聚糖 (0.5~9mg)，精密称定，分别溶于2mL的蒸熘水中，加入4% (w/v)的碳酸氢钠溶液2mL和0.1W (w/v)的三硝基苯磺酸2mL， 37。C孵育2小时。加入2N 盐酸2mL，摇匀，在344nm波长处测定吸收值，制备标准曲线。取上述的壳聚 糖-硬脂酸嫁接物4mg溶于2mL蒸馏水，同法操作，测定氨基取代度为4.96%。
采用芘荧光法测定壳聚糖-硬脂酸的临界胶束浓度。制备不同浓度壳聚糖-脂 肪酸嫁接物溶液各10mL，分别加入定量的芘(芘终浓度为7xl(^mol/L )，室 温水浴超声30min。扫描芘的激发光谱和发射光谱，测定在375nm和396nm荧 光强度，并以测定1375/ 1396倾斜率的突然变化确定该嫁接物的临界胶束浓度为 0.036mg/mL。
采用微粒粒度及表面电位分析仪，测定壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和 表面电位。经测定，lmg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的粒径和表面电位分别 为28.9nm和39.1mV。
3) 二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制备及其理化性质测定
取40 mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入32mL 蒸馏水(pH为5.7)，探头超声20次(500w，工作2s停3s)，得1.25mg/mL的 胶束溶液。加入0.25 mg/mL 二氢卟吩e6的乙醇溶液32mL，冰浴条件下探头超 声30次(400W，工作2s停3s)，将混合液装入透析袋(MWCO 3.5 XDa, Spectrum Laboratories, LagunaHills，CA)，用去离子水室温下透析24h，除去乙醇，将透 析液冷冻干燥，得二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束粉末。
经测定，1 mg/mL壳聚糖-硬脂酸嫁接物浓度的二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸 嫁接物胶束的粒径为271.9nm，表面电位为35.0mV。药物包封率为100%。药物 含量为16.67%。
二氢H卜吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的体外释放在37 。C恒温、振荡频率 60 rpm条件下进行。取二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束固体粉末，用去 离子水(pH为5.7)分散，得药物浓度为32 pg/mL的壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束 溶液，分别取2.5 mL装入透析袋中(MWCO 7.0 iiCDa, Spectrum Laboratories, Laguna Hills, CA),将透析袋置于含PBS 7.4 (含0.2%吐温80) 20mL的释放 管中。定时取样1.0mL， HPLC测定药物浓度，计算累积释放量。二氢卟吩e6 壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的二氢卟吩e6体外释放行为见图1。
4) 二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束的细胞内药物浓度分布测定 取对数生长期肺上皮肿瘤细胞A549细胞，胰酶消化后用培养基调整细胞密
度为l.O xl05/mL，按4.0mL/孔接种于12孔培养板，培养箱内预培养24 h，分 别加入二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，恒定药物浓度为12.5 g/mL，并以同浓度的游离药物作对照，于37 °C分别孵育2、 4、 6、 8、 12、 24 h后， 用PBS (pH7.4)冲洗细胞三次，用50L胰酶消化，用0.5 mL PBS收集细 胞，冰浴探头超声20次(400 W，工作2s，停3s)，得细胞破碎液。取适量细胞 破碎液，加入等体积的无水乙醇水浴超声破碎胶团，溶解药物，过0.22m微 孔滤膜后进样，测定药物含量。
同步取上述细胞破碎液20 L，加至96孔培养板中，加入200 L的BCA 工作液，37。C放置30min以上。用酶联检测仪在570 nm处测定吸光值。根据 已知浓度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)制作标准曲线，并用该 曲线计算细胞溶解液中的蛋白质含量(M)。定义参数F， F为不同时间点时， 细胞内药物浓度与细胞内蛋白质含量的比值。根据下列公式考察细胞在不同孵育 时间的药物摄取能力。
T时刻细胞摄取药物的百分率(％) =F(T)/F(0)xiOO% (2) 式中，F(T)-T时刻细胞内药物的浓度/T时刻细胞内蛋白质含量，F(0)-0
时刻药物的初始浓度/o时刻细胞内蛋白质含量
细胞内的药物浓度经时测定结果见图2。结果显示，通过嫁接物胶束介导可 显著增加肿瘤细胞内的药物浓度；在短时间内，细胞内药物浓度随着孵育时间的 延长而增加。与肿瘤细胞共孵育2小时后，以游离药物形式给药，细胞摄取药物 百分率仅为总药物的2.86 %，以嫁接物胶束形式给药，细胞摄取药物百分率可 达20.46%以上；与肿瘤细胞共孵育24小时后，以游离药物形式给药，细胞摄 取药物百分率仅为总药物的6.61 %，以嫁接物胶束形式给药，细胞摄取药物百 分率可达26.85 %以上。
权利要求
1.一种二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量18.0KDa的低分子量壳聚糖，与硬脂酸化学嫁接形成，，壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为4.96％，其特征在于所述胶束由二氢卟吩e6和壳聚糖-硬脂酸嫁接物组成，其中二氢卟吩e6占总重量的4.76-16.67％。
2. 根据权利要求1所述的二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束，其特征 在于通过以下歩骤制备取40 mg壳寡糖-硬脂酸嫁接物，精密称定，置50mL烧杯中，加入8-32 mL 蒸馏水，pH为5.7，探头超声20次，得5 mg/mL的胶束溶液，加入同体积浓 度为0.25mg/mL的二氢卟吩乙醇溶液，冰浴条件下探头超声30次，将混合液 装入透析袋，用去离子水室温下透析24小时，除去乙醇，将透析液冷冻干燥， 得二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束粉末。
3. 根据权利要求1所述的二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束在制备耙 向型光敏剂制剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束制剂，由壳聚糖-硬脂酸嫁接物和二氢卟吩e6组成，其中二氢卟吩e6占总重量的4.76-16.67％；壳聚糖-硬脂酸嫁接物由平均分子量18.0KDa的低分子量壳聚糖与硬脂酸化学嫁接形成，壳聚糖-硬脂酸嫁接物的氨基取代度为4.96％。本发明通过壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束对第二代光敏剂二氢卟吩e6的有效包封，制备二氢卟吩e6壳聚糖-硬脂酸嫁接物胶束细胞内给药制剂，与二氢卟吩e6溶液剂相比，本发明制剂可显著提高二氢卟吩e6在肿瘤细胞内的药物浓度，为后续实现高效低毒的肿瘤光动力学治疗提供可能。
文档编号A61K47/36GK101524326SQ20091009705
公开日2009年9月9日 申请日期2009年3月30日 优先权日2009年3月30日
发明者杜永忠, 胡富强, 弘 袁 申请人:浙江大学