专利名称：从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法、药物组合物及其用途的制作方法
从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法、药物组合物及其用途发明领域本发明属于生物医药领域，涉及土鳖虫干粉镇痛单体的制备方法、含所述镇痛单 体或其药学上可接受的盐或药学上可接受的载体的药物组合物及其用途。
背景技术：
疼痛不仅是许多疾病的合并症，而且自身已经被看作是一类疾病。从疾病层面上 讲，由各种各样的疼痛造成的生活质量下降波及了最大量的人群。由于有效的镇痛剂往往 与依赖性相联系，所以发明新的无依赖性的镇痛剂具有重要价值。土鳖虫及土鳖虫干粉在我国传统医学中有广泛的应用。土鳖虫及土鳖虫干粉在我 国传统医学中应用时一般都是经口服给药，土鳖虫及土鳖虫干粉经口服给药的一次剂量在 IOg左右。这样大的剂量使病人感到不便。依据土鳖虫及土鳖虫干粉经口服进入胃肠道可 被胰蛋白酶降解的性质，发明人推测土鳖及土鳖虫干粉的胰蛋白酶酶解物有可能在不减弱 治疗效果的前提下减少服药量。
发明内容
有鉴于上述提及的问题，本发明提供了一种从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法、 含所述镇痛单体或其药学上可接受的盐或药学上可接受的载体的药物组合物及其用途。本发明的主要目的是提供一种从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其中，所述方 法包括如下步骤(1)将土鳖虫干粉的水悬浮液加胰蛋白酶溶液酶解、37°C恒温振荡、抽滤、离心分 离、收集棕黄色上清液，冷冻干燥得到土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉；其中，所述胰蛋白酶溶液 为模拟肠液；所述水为蒸馏水。(2)将所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液通过S印hadex G25柱层析分离得 到胰蛋白酶酶解镇痛单体。所述镇痛单体是3-(2_氯乙基)-1Η-吲哚。其中，所述柱层析 分离的洗脱液为蒸馏水。最好，所述土鳖虫干粉的水悬浮液与所述模拟肠液的体积比为1 1。最好，步骤(1)中恒温振荡时间为6小时，以每5分钟3000转离心分离。最好，Sephadex G25柱为2. 6 X 50cm，用5倍柱体积蒸馏水平衡柱子。最好，步骤(2)中所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液的浓度为50mg/ml。最好，步骤(2)还包括在柱层析分离之前将所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶 液以10000转进行离心分离10分钟，取上清液进行柱层析分离。最好，所述柱层析分离的恒流泵控制流速为0. 5ml/min，每管5ml。本发明的另一目的是提供一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含从土鳖虫 干粉制备镇痛单体的方法得到的治疗有效量的所述镇痛单体或其药学上可接受的盐以及 药学上可接受的载体。本发明的再一目的是提供了一种通过从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法得到的镇痛单体或其药学上可接受的盐在制备用于治疗疼痛相关疾病的镇痛剂中的用途。与现有技术相比，由本发明提供的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方 法获得的胰蛋白酶酶解镇痛单体是3-(2_氯乙基)-1Η-吲哚(英文名称 3-(2-chloroethyl)-lH-indole)(简称PR-TEin)，解决了 口服土鳖虫及土鳖虫干粉时用量 大(比如，一次剂量IOg左右)造成人不适的缺陷，并且不具有依赖性，故有良好的使用前
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图1是从土鳖虫干粉制备镇痛单体的具体实施流程图；图2是在紫外280nm下S印hadexG-25层析分离土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的洗脱 曲线图；图3是镇痛单体PR-TEm的高效液相图谱；
图4是镇痛单体PR-TEm的1HNMR图谱；图5是镇痛单体PR-TEm的13C NMR图谱；图6是镇痛单体PR-TEm的质谱图。
具体实施例方式为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例1 土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的制备根据1995年美国药典提供的模拟肠液配方(6. 8g KH2PO4溶于250ml蒸馏水，振荡， 完全溶解后加190ml NaOH (0. 2M)和400ml双蒸水，加胰蛋白酶10. 0g，混勻，用0. 2M NaOH 调PH值到7. 5 士0. 1，双蒸水定容于1000ml)配制200ml模拟肠液。参见图1，将IOg土鳖虫干粉悬浮于200ml蒸馏水中，得到土鳖虫干粉的水悬浮液， 将该水悬浮液与200ml模拟肠液混合、37°C恒温振荡器中振荡6小时，抽滤除去棕黑色不溶 物后以每5分钟3000转离心分离，收集棕黄色上清液，冷冻干燥得到土鳖虫胰蛋白酶酶解 粗粉，收率57. 64%,4°C保存。实施例2 土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的分离与纯化参见图1，称将溶涨好后的S印hadex G-25悬浮液装柱(2. 6 X 50cm)。用约5倍柱 体积蒸馏水平衡柱子。称取土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉250mg，用5ml蒸馏水溶解，得到土鳖 虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液，将该水溶液以10000转离心分离10分钟，取上清液上样进 行柱层析分离。蒸馏水作为洗脱液。柱层析分离中恒流泵控制流速为0. 5ml/min，每管5ml， IOmin收一管，每管均选用紫外分光光度计光度测量，紫外检测的波长为280nm，记录数据， 用Microsoft Excel做出曲线，见图2所示。按峰收集到PR-TEp PR-TE11和PR-TEm三种胰蛋白酶酶解组分，分别冷冻干燥。 PR-TE1收率为8. 86%，冻干品呈棕黄色絮状物，有粘性，易溶于水；PR-TE11收率为58. 97%, 冻干品呈棕黄色固体粉末，有粘性，易溶于水；PR-TEm收率为1.82%，冻干品呈白色絮状， 有粘性，易溶于水。实施例 3PR_TEm 的 HPLC
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色谱条件Agilent1100 高效液相色谱仪，Agilent C18 (4. 6 X 150mm 5 μ m)色谱 柱，柱温为常温，流动相为甲醇和水，采用等度洗脱(甲醇水=5 95)流速为lml/min， 二极管阵列检测器，紫外检测波长为280nm，进样量10μ 1。得到图2的色谱图，PR-TE111的 保留时间为8. 3min。实施例4PR_TEm 的 1H NMR 谱PR-TEm溶解于DMS0-d6，以四甲基硅烷为内标，在BrukerAMX_500核磁共振仪上测 得图3的1H NMR谱。图谱显示PR-TEm分子含6个芳香质子、4个脂肪质子。意味着PR-TEm 分子既含芳香环，又含脂肪侧链。6个芳香质子中有一个在比较低场，可能连接在芳香杂原 子上。4个脂肪质子都在3-4ppm之间，脂肪侧链除与芳香环连接外，还与杂原子连接。实施例5PR_TEm 的 13C NMR 谱PR-TEm溶解于DMS0-d6，以四甲基硅烷为内标，在BrukerAMX_500核磁共振仪上测 得图4的13C NMR谱。图谱显示PR-TEm分子含8个芳香碳和2个脂肪碳。实施例6PR_TEm 的 ESI-MS 谱PR-TEm溶解于DMS0-d6，以四甲基硅烷为内标，在BrukerAMX_500核磁共振仪上 测得图4的13C NMR谱。图谱显示PR-TEm分子含8个芳香碳和4个脂肪碳；PR-TEmW ESI-MS在MDS SCIEXQSTAR质谱仪上测得图5的质谱。图谱除显示PR-TEm的分子量为m/ el79外，还显示了两个片段，一个为m/e 144，另一个为m/e 116。实施例7PR_TEm的结构式根据PR-TEm的1H NMR谱显示分子含连接6个芳香质子的芳香环及其中1个连 接在芳香杂原子上，以及含连接4个脂肪质子的与芳香环及杂原子连接的脂肪侧链；根据 PR-TE111的1C NMR谱显示分子含8个芳香碳和2个脂肪碳；根据PR-TE111的ESI-MS谱显示 分子为m/e 179，还显示m/e为144，和116两个片段，可以确定PR-TEm的结构式为
NH
N
7.18 H 10.1
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实施例8PR_TEm的镇痛活性采用小鼠光辐射热甩尾法评价PR-TEm的镇痛活性，选择给药后小鼠痛阈变化的 程度作为评价活性的指标。室内温度保持在20士 1°C，将小鼠置于特制固定圆筒内，尾部暴 露在筒外。实验前用75%乙醇擦净鼠尾，尾部下1/3处作标记作为光刺激点。待动物稳定 30min后，采用一特制灯罩使直径为2mm的光束照在标记点处，用秒表计时，从照射开始到 甩尾反应的潜伏期(TFL)作为痛阈，调节光源电压使TFL在2 4s之间，两次测TFL的间 隔为5min，共测4次，取平均值作为基础痛阈。每次试验设生理盐水组作平行对照，为防止 皮肤烫伤光照截止时间为15S。灌胃后间隔半小时复测TFL，即灌胃后30min，60min，90min， 120min，150min, 180min各测一次TFL。观察PR-TE111镇痛的时效关系。根据痛阈提高率％ =(给药后的TFL-基础TFL) +基础TFLX 100%计算镇痛强 度。根据小鼠给药剂量(mg/kg) = 9. OlX人用药剂量(mg/kg)，算出PR-TEm的给药剂量 为llmg/kg(成人服用土鳖虫干粉，剂量为IOg/次)。样品用生理盐水溶解灌胃，空白组使 用生理盐水灌胃。测定的数据列入表1。表IPR-TEm的镇痛活性 需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式
意在证明本发明所提供技术方案的 实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理 内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。
权利要求
一种从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤(1)将土鳖虫干粉的水悬浮液加胰蛋白酶溶液酶解、37℃恒温振荡、抽滤、离心分离、收集棕黄色上清液，冷冻干燥得到土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉；(2)将所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液通过Sephadex G25柱层析分离得到胰蛋白酶酶解镇痛单体。
2.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述镇痛 单体是3-(2-氯乙基)-IH-吲哚。
3.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述胰蛋 白酶溶液为模拟肠液。
4.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述水为 蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述土鳖 虫干粉的水悬浮液与所述模拟肠液的体积比为1 1。
6.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，步骤(1)中 恒温振荡时间为6小时，以每5分钟3000转离心分离。
7.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，Sephadex G25柱为2. 6 X 50cm，用5倍柱体积蒸馏水平衡柱子。
8.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，步骤(2)中 所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液的浓度为50mg/ml。
9.根据权利要求1所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，步骤(2)还 包括在柱层析分离之前将所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液以10000转进行离心分 离10分钟，取上清液进行柱层析分离。
10.根据权利要求1或9所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述 柱层析分离的洗脱液为蒸馏水。
11.根据权利要求10所述的从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，其特征在于，所述柱 层析分离的恒流泵控制流速为0. 5ml/min，每管5ml。
12.—种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1 11任一项所述的 方法制备的治疗有效量的所述镇痛单体或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
13.—种权利要求1 11任一项所述的方法制备的镇痛单体或其药学上可接受的盐在 制备用于治疗疼痛相关疾病的镇痛剂中的用途。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法、含所述镇痛单体或其药学上可接受的盐或药学上可接受的载体的药物组合物及其用途。本发明提供了一种从土鳖虫干粉制备镇痛单体的方法，所述方法包括将土鳖虫干粉的水悬浮液加胰蛋白酶溶液酶解、37℃恒温振荡、抽滤、离心分离、收集棕黄色上清液，冷冻干燥得到土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉；将所述土鳖虫胰蛋白酶酶解粗粉的水溶液通过Sephadex G25柱层析分离得到胰蛋白酶酶解镇痛单体，制得的胰蛋白酶酶解镇痛单体是3-(2-氯乙基)-1H-吲哚。本发明解决了口服土鳖虫及土鳖虫干粉时用量大造成人不适的缺陷，并且不具有依赖性，故有良好的使用前景。
文档编号A61P29/00GK101898994SQ200910119760
公开日2010年12月1日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者彭师奇, 赵明 申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂