专利名称：Peg10基因的双链小干扰rna在制备治疗或预防肝癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医用医药，更具体涉及一种基因干扰序列在制备治疗和预防肝癌 药物中的应用。遗传印记基因10 (PEG10基因)的小干扰RNA(siRNA)可以抑 制肝癌细胞的生长，促进肝癌细胞凋亡，从而达到治疗肝癌的目的，适用于原发 性肝细胞癌，原发性混合细胞癌等的预防和治疗。
背景技术：
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其恶性度高、病情进展快，病人早期一 般没有什么不适， 一旦出现症状就诊，往往已属中晚期。故治疗难度大、疗效差， 一般发病后生存时间仅为6个月，人称"癌中之王"。
肝癌的发病率和死亡率均较高，发病率在我国居第五位，死亡率在恶性肿瘤 中居第三位。原发性肝癌的发病率又是肝脏恶性肿瘤之首。本病多发于男性，男
女之比约为4:i，且男性患病后，病情发展及死亡率也较女性凶险。研究发现，
肝癌组织中雄激素受体(AR)的含量远高于癌旁肝组织，癌组织AR含量与肿 瘤大小及分化程度有关，肝癌发展及预后与AR的含量存在一定的相关性。多数 学者认为性激素在肝脏中可能通过非特异性药理作用或受体介导作用影响肝脏 功能。有研究认为肝癌细胞能主动摄取雄激素，如睾酮等，且摄取量与AR的浓 度成正相关。因此，肝癌被认为是一种雄激素依赖性肿瘤，但目前对于雄激素 及其受体的表达与肝癌发生发展之间关系的分子机制仍不十分明了。
尽管手术切除和肝移植是有望使肝癌获得根治的治疗手段，但实际上，大部分肝癌病例在临床确诊时已不适合手术切除或行肝脏移植治疗；且切除或肝移植 术后肝癌的复发率高，大部分患者带瘤生存，生活质量较差。而且各种治疗方式 对于肝癌患者生存率的提高并无太大帮助。并且在临床上，肝癌临床病理和生物 学表型不同，且不同种类肝癌的发病机理亦有差异。现在人们已经发现了一些导 致肝癌形成的基因，但绝大多数基因在肝癌形成中的作用有限。因此，寻找一种 能够在大多数肝癌细胞中高度特异性表达的新的靶分子从而达到治疗肝癌的目 的，这是一个具有十分重要的理论和实际意义的问题。
基因治疗是目前肿瘤治疗研究的重要组成部分，也是多年来肝癌基因治疗研 究的重点之一。基因治疗是导入外源遗传物质，达到治疗疾病的一种方法。对于 遗传病，基因治疗将成为极为有效的治疗手段。但对于其它疾病，如恶性肿瘤， 基因治疗将可能成为外科手术、放疗、化疗外的新武器。
但肝癌的情况非常特殊，它在瘤体不太大的时候就发生血管内侵犯，门静脉 瘤栓形成，同时肝内的播散以及原有肝硬化的基础上新的癌病灶的出现等等。这 些因素严重影响了现有治疗手段对肝癌的疗效及预后。因此，针对肝癌来说，基 因治疗有可能成为治疗肝癌的一个重要手段。
尽管肝癌的基因治疗在某些方面已取得一定的进展，许多I期至III期临床 试验在全世界范围内已经或正在进行中，但许多关键性的理论和技术问题仍有 待进一步深入研究和突破。比如如何鉴定理想的肝癌治疗基因或基因组合等，都 是肝癌基因治疗中尚待解决的问题。
2001年，日本学者研究发现了一种新基因——遗传印记基因IO (paternally expressed gene 10， PEGIO)，它定位于染色体7q21 (Ono R, Kobayashi S, Wagatsuma H, et al. A retrotransposon-derived gene, PEG 10, is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q21. [J]. Genomics, 2001, 73: 232—237)。 Northern blot检测表明PEG10基因在正常组织中仅表达于胎盘、睾丸和卵巢等性 腺组织中(Okabe H, Satoh S, Furukawa Y， et al. Involvement of PEG10 in human hepatocellular carcinogenesis through interaction with SIAH1. [J]. Cancer Res， 2003, 63: 3043-3048)。通过cDNA微阵列的方法，Okabe发现绝大部分肝癌细胞高表 达PEG10基因，而正常肝细胞则很少表达(Okabe H, Satoh S， Kato T, et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas usingcDNA microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression. [J]. Cancer Res, 2001, 61: 2129—2137)。另外，再生的正常肝细胞也高 表达PEG10基因，且PEG10基因对于细胞的生长有明显的促进作用。因此，对 于PEG10基因在肝癌中的异常高表达机制的深入研究有助于避免目前内分泌治
疗的盲目性，并为肝癌的临床诊断及治疗提供新的思路。
端粒是真核细胞线性染色体末端的结构，对染色体末端起保护作用。在 人类同源染色体中，端粒由数千个6碱基重复序列(TTAGGG)组成。端粒 末端转移酶是一种延长端粒、保持基因组完整性的核糖核蛋白复合物。人类 端粒酶由具有催化活性的亚单位(hTERT)、端粒酶模板RNA和端粒结合蛋 白组成。其中hTERT作为逆转录酶(RT)的亚型，是调节端粒末端转移酶活 性的关键因子。测定端粒末端转移酶的活性具有重要的临床意义，它可以作 为肝细胞癌诊断和治疗的一个指标。研究发现，肝癌细胞中端粒末端转移酶 的活性较高，而在正常肝细胞中则检测不到端粒末端转移酶活性。端粒酶与 肝癌关系密切，端粒酶的活性与凋亡抑制之间的关系也开始被人们所关注， 开发针对端粒酶的抗肿瘤药物成为近年来肿瘤治疗的又一热点。(YoussefN， Paradis V， Ferlicot S, et al. In situ detection of telomerase enzymatic activity in human hepatocellular careinogenesis. [J]. J Pathol, 2001, 194: 459-465. ; Komine F, Shimojima M, Moriyama M， et al. Telomerase activity of needle-biopsied liver samples :its usefulness fot diagnosis and judgement of efficacy of treatment of small hepatocellular carcinoma. [J]. J Hepato, 2000, 132: 235-241. ; Zhang RG, Wang X"W， Yuan JH, et al. Using a non-radioisotopic， quantitative TRAP-based method detecting telomerase activities in human hepatoma cells. [J]. Cell Res, 2000, 10: 71-77. ; Wege H， Chui MS, Le HT, et al. SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity. [J], Nucleic Acids Res, 2003, 31: E3-3.)。
RNA干预(RNA-mediated interference, RNAi)作为目前研究较多的一门 新兴技术，现逐渐成为基因功能研究的重要工具。RNAi主要通过双链RNA 的介导，特异性地降解相应序列的靶mRNA，从而阻断相应基因表达的转录 后水平的基因沉默。RNAi在特异并高效抑制基因活性方面展示出了广阔的前景。
现介绍一下目前国内外治疗或预防肝癌基因药物的现状及研发情况
1免疫基因治疗主要集中在细胞因子治疗和基因修饰树突状细胞肿瘤疫苗
两方面。细胞因子治疗既将IL-2， IL-12, IFN等细胞因子和/或共刺激因子B7 等到导入免疫活性或肿瘤细胞，增强免疫活性细胞的抗肿瘤活性，使肿瘤局部细 胞因子浓度增高，MHC类抗原分子表达增加、肿瘤细胞的免疫原性增强，有效 激活肿瘤特异性免疫反应。其缺点是特异性较差，副作用大。
2抑癌基因治疗抑癌基因是一类存在于正常细胞，与原癌基因共同调节细 胞生长和分化的基因，已发现的抑癌基因有Rb， NF， DDC， nm23， p53气p46 等。目前在大多数肿瘤中发现p53突变。现认为野生型p53突变或丧失功能，可 能导致肿瘤的发生和肿瘤细胞对化疗药物的抵抗。其缺点是单纯针对某一抑制基 因的治疗往往效果不理想，并且设计针对肝癌的特异性抑制基因也比较困难。
3反义基因治疗主要包括反义DNA、反义RNA和核酶三类，Xing等利 用AFP的反义寡核苷酸治疗体外和裸鼠的SMMC-7721肝癌模型取得了明显的 抗癌作用，Su等用人端粒酶反转录酶的反义寡核普酸(As-hTERT)处理Hep2215 细胞后发现肿瘤细胞的端粒酶活性被抑制、致癌作用降低，提示As-hTERT具有 抗肿瘤作用。但反义基因治疗的缺点是反义核酸并不能与所有的耙基因mRNA 结合，即其抑制作用并不完全。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)作为制 备治疗或预防肝癌的药物中的应用。PEG10基因在胎盘、睾丸和卵巢中显著高 表达，而在肝脏和其它一些组织中则无表达，同时，PEG10基因可高表达在大 多数人肝细胞癌(HCC)细胞和小鼠再生的肝G2/M期细胞中。肝癌是一种雄激 素依赖性肿瘤，PEG10基因与雄激素及其受体在肝癌的发生发展中到底如何作 用，对端粒酶活性又有何影响，目前国内外尚无相关报道。PEG10基因在性腺 组织的特殊分布及已观察到的PEG10基因具有促进肝癌细胞生长的特性引起申 请者的研究兴趣。研究表明PEG10基因很大程度上参与肝癌的形成，而遗传印 记基因PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)则抑制了肝癌细胞的生长，可以作为在制备治疗和预防肝癌的药物中的应用。
在本实验研究中主要采用RNA干预作为基因功能研究的重要工具，通过有 效的下调AR基因和PEG10基因的表达，首次将PEGIO基因与雄激素及其受体 联系起来，研究两者的相互作用及与肝癌生长和凋亡之间的联系。首次具体研究 了两者的相互作用及与端粒酶之间的关系，并探讨了其在肝癌的发生发展中的作 用及可能机制。
首先比较了正常肝细胞及三种不同的肝癌细胞中AR表达的差异，并证实 AR高表达的肝癌细胞在雄激素DHT的存在下，能明显促进肿瘤细胞的生长、 抑制细胞凋亡，有效的促进肝癌的形成。目前有研究认为AR作为一种转录活化 因子，可能影响肝细胞或肝癌细胞中的某些癌基因，通过调节与细胞分裂有关的 信号传递系统而影响肝癌的发生发展，促进肝癌细胞的增殖。据此申请人认为， PEGIO基因在性腺组织的特殊分布可能受到激素的影响从而被激活，最终影响 肝癌的发生发展。结果发现在高表达AR的肝癌细胞中，DHT能显著增加癌细 胞中PEGIO基因的表达，且肿瘤细胞出现明显的生长加速和凋亡细胞数目的减 少。同时在AR表达量较低的肝癌细胞中，加入DHT对PEGIO基因的表达及肝 癌细胞的生长无明显影响。
实验结果显示在雄激素DHT存在的条件下，BEL细胞中人类端粒酶逆转录 酶(hTERT)的表达水平明显升高。但是当PEGIO基因表达下调后，DHT的存 在对于hTERT的表达水平无明显影响。在共转染了 AR和PEGIO基因的人胚肾 HEK293T细胞(ATCC， Rockville， MD)中，同样观察到在DHT存在的条件下， 细胞中hTERT的表达水平明显升高。
然后，申请人采用RNAi技术，通过有效的下调AR基因和PEGIO基因的 表达，进一步证明两者之间的相互关系及其与肝癌发生发展之间的联系。研究发 现，DHT能使AR表达量较高的肝癌细胞生长加速以及产生抗凋亡作用，且 siRNA AR对AR表达的下调作用不仅是剂量依赖性，而且是序列特异性的。高 剂量的siRNAPEGlO基因能选择性的阻断雄激素的促生长作用。高剂量的siRNA AR在下调AR表达的同时也有效降低了 PEGIO基因的表达，提示AR的表达与 PEGIO基因有着密切的关系。而将AR基因转染低表达AR的HepG2细胞(ATCC， Rockville， MD)后，在DHT作用下，PEGIO基因的表达虽无变化，但细胞也能出现明显的生长加速和凋亡细胞数目的减少。
其技术方案如下
A.细胞培养、试剂和质粒-
人肝癌细胞株BEL-7404(来自生物化学和细胞生物学协会的细胞库，SIBS， CAS，上海，中国)、HuH7、 HepG2和人胚肾细胞株HEK293T来自美国细胞典 藏中心ATCC (The American Type Culture Collection, Rockville， MD)在含10 ^的胎牛血清DMEM的培养基中，37。C ， 5。/。C02培养。DMEM高糖细胞培养 基为杭州吉诺生物公司的无菌DMEM高糖无血清培养基，加入新生牛血清(56'C 灭活30min)使终浓度达到10%， 4。C保存备用。正常人肝细胞(NML)取自无 肝疾病、意外腹部外伤部分肝切除的病人。双氢睾酮(DHT)、氟他胺(FLU)和 丙戊酸盐(VPA， ref. M3)购自Sigma-Aldrich。 RA的兔的单抗购于Abeam Inc. (Cambridge, UK)。雄、激素受体的抗体购于Rockland Immunochemicals Inc. (Gilbertsville， PA)。
人PEG10基因的开放阅读框架(ORF)序列来自Genebank NM 015068 (来 Ml，包含235个氨基酸，从BEL-7404细胞中分离相应的PEG10基因ORF全 长cDNA,并将其克隆到质粒pcDNA3.0质粒(Invitrogen)的Hind III禾卩EcoR I 位点之间。用序列测定来分析重组载体pcDNA3.0-PEG10基因的方向和正确的框 架。具体步骤如下
1.总RNA提取
由于RNA酶广泛存在，玻璃器皿洗干净后置于20(TC烘箱中烘烤6小时以 除去RNA酶，塑料用具(枪头和EP管等)要浸泡在0.1XDEPC溶液中过夜， 高压灭菌。试剂用0.1 %DEPC处理过的RNase free水配制。
用TRIzol试剂提取细胞总RNA:
(1) 取50(^1 TRIZOL加入细胞中，用移液器吹打几次(lml/10cn^细胞)；
(2) (15-30) 。C孵育5min;
(3) 移入1.5ml离心管中，加入100pl氯仿，剧烈摇动15s， (15-30) °C 孵育(2-3) min;
(4) 4°C， 12000rpm离心15 min，将上层水相移入新的RNase-free的管中；
(5) 加入250W异丙醇沉淀脂A, (15-30) 'C孵育10min;(6) 4°C， 12000rpm离心10min，弃上清；
(7) 用75%乙醇500pl清洗沉淀，4°C， 12000rpm离心5min，弃上清；
(8) 真空抽干5min;
(9) 用RNase-free的ddH20 30|al溶解RNA沉淀，于(55-60)。C孵育10 min。 2.RT-PCR扩增目的片段
用TRIzol试剂抽提得到人肝癌细胞株BEL的总RNA后，首先用DNase消 化，去除抽提物中残存的DNA。然后以01igo(dT)2o为引物，按Promega公司逆 转录试剂盒的说明合成cDNA，再用TaKaRa公司PCR试剂盒扩增目的DNA。
2.1去除抽提物中残存的DNA
RQ1 RNase-Free DNase 37°C孵育60 min， 65。C灭活10 min。 2.2逆转录反应
用M-MLV反转录酶进行逆转录反应，反应体系为25fil
(1) RNA (2昭) 2pl Oligo(dT)20 (0.5吗/txl):
Nuclease-free ddH2C): 12|jJ
(2) 7(TC孵育5加in，立即放于冰上
(3) 5 xM-MLV Reaction Buffer: 5|il lOmMdNTPmix: lpl M-MLV Reverse Transcriptase (200u/pd): 0.5^1 RNase Inhibitor (40u^l): 0.5^1 Nuclease-free ddH2O: 3 pi
(4) 42'C孵育60min，迅速放于冰上 2.3目的基因的PCR扩增
Template (反转录产物) 5|il
10 x Ex Taq Buffer: 5|il
2.5mMdNTPmk: 争
Forward primer (2 5 (aM): 2 (al
Reverse primer (2 5 (jM) : 2
Ex Taq (5u/pl): 0.5^1ddH20: 31.75pl 反应条件为94。C预变性4min， 94。Clmin， 60°C lmin， 72。Clmin30s， 35个 循环，最后于72"延伸10min,保存于4。C。
3. 琼脂糖凝胶电泳
lg Agarose加入100ml 0.5XTBE，加热煮沸，待温度降至55。C左右，加入 溴化已锭，混匀后倒入水平电泳槽中，插入梳齿。胶凝固后，上样，120v， 60mA 电泳约30min，凝胶成像仪中观察目的条带。
4. 胶回收(上海申能博彩生物工程公司试剂盒)
(1 )用Agarose胶电泳将目的条带与其它DNA尽量分开，然后用干净的手 术刀片切下含所要回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中，称重；
(2) 按每100mg胶加入400^1 Solution SN，置于(55-65) 。C水浴中5min， 中途混匀几次，至胶完全融化。胶融化后每400^1 Solution SN加入100^1 Solution B混匀；
(3) 将3S柱放入2ml收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子 开着，室温20-25。C放置2 min。盖上离心管盖，10000rpm室温离心1 min;
(4) 取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入 600^1 Wash Solution, 10000rpm室温离心lmin;
(5) 重复步骤(4) 一次；
(6) 取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中， 10000rpm室温离心2min;
(7) 将3S柱放入一根新的1.5ml离心管中，在3S柱子膜中央加3(^lddH20， 室温放置2min;
(8) 盖上离心管盖，10000rpm室温离心lmin，离心管中的液体即为回收的 DNA片段，-20。C保存。
B.siRNAs和转染
siRNA寡核苷酸的正义和反义链的设计和合成是由国家分子生物学重点实 验室完成的(中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所，SIBS， CAS)， 95 °C退火l min,然后在退火缓冲液中37'C孵育l h [2 x退火缓冲液(200 mM醋 酸钾，4mM醋酸镁，60mMHepes-OH， pH7.4)](15)。根据PEG10基因的基因序列同时设计了三对针对PEG10基因的siRNAs核苷酸序列(SEQIDNO: 1 ， SEQIDNO:2 ， SEQIDNO:3 )， 一种针对雄激素受体的siRNA核苷酸序列 (SEQIDNo:4)。针对PEG10基因的siRNAs分别称为PEG10基因siRNA A， PEG10 基因siRNA B和PEG10基因siRNA C。为了证实抑制的特异性，在实验中采用随 机序列的siRNA作为阴性对照。 SiRNA的序列如下
1. 针对PEG10基因的siRNA (—种RNA序列) PEG10基因siRNA A(SEQIDNo:l)
正义5' gagcaccagggauuucucaTT 3' 反义5'ugagaaaucccuggugcucTT 3' PEG10基因siRNA B (SEQIDNo:2) 正义5' gucgcugucugcucugauuTT 3' 反义5， aaucagagcagacagcgacTT 3' PEG10基因siRNA' C (SEQIDNo:3) 正义5' cuucauugaucacgaauauTT 3' 反义5， auauucgugaucaaugaagTT 3'
2. 针对雄激素受体的siRNA (—种RNA序列) ARsiRNA(SEQIDNo:4)
正义5'gggaaacagaaguaccuguTT3' 反义5， acagguacuucuguuucccTT3'
3. 阴性对照siRNA (SEQIDNo:5)
正义5 ， ugaaggaguuccugaucuuTT3'
反义5， agaagaucaggaacuccuuTT3'
转染前一天将细胞接种于6孔板，控制浓度使第二天转染时细胞密度约 70%左右。用Opti-MEM I (Invitrogen)稀释siRNAs， Oligofectamine (Invitrogen)作用后将其瞬时转染到BEL-7404细胞中，然后用无血清的DMEM清洗细胞， 转染6小时之后再加入10%的胎牛血清。Lipofectamine 2000 (Invitrogen)可带血 清转染，将重组载体pcDNA3.0-PEG10基因瞬时转染到HEK293T细胞。
细胞活力检测是将细胞消化后，进行台盼蓝染色后用血球计数器进行计数。 C. Northern blot分析
每个样本的总RNA均在1%的琼脂糖甲醛凝胶中电泳分离，然后印迹到 Nytran膜(Amersham Pharmacia Biotech)上，紫外线照射进行交联。PEG10基因 ORF编码序列是通过BEL-7404细胞总RNA的PCR扩增得到的。放射性标记 探针采用Klenow Fragment体系，7核苷酸随机引物标记同位素[oc-32P]dATP进 行制备。杂交过程为在杂交溶液(PerfectHybTM Hybridizaition Solution, TOYOBO) 中68。C预杂交1小时后，加入标记探针，68。C杂交过夜。需要注意的是，在用 Phosphorlmager (Storm860, Amersham Bioscience Company, USA)矛3描前要3每膜 洗净。具体步骤如下
(1) 细胞总RNA，溶于2.5^d去离子甲酰胺；
(2) RNA处理
10XMOPS:' 0.5^1 甲醛 0.875pl Nuclease-free ddH20: 1.125^1
溶解RNA的去离子甲酰胺 2.5pl
(3) 65°C lmin，迅速放于冰上；
(4) 每孔加入O. 5^d IOX上样buffer;
(5) 1%甲醛Agarose电泳；
(6) 125V， 50mA，预电泳5min，电泳2h;
(7) 转膜(所用膜为带正电的尼龙膜)，胶正面向上，切除多余部分，平放 在滤纸上，赶走气泡，加上膜并再次赶走气泡，四周用保鲜膜覆盖，依 次加入双层滤纸、5-8cm厚吸水纸、玻璃板及重物，转膜过夜；
(8) 膜用6XSSC漂洗，RNA面向上晾千，紫外125mJ交联；
(9) 交联好的尼龙膜用5X冰乙酸固定5min， 0.04%亚甲蓝染色至有条带出 现，用流水终止反应，沥干，拍照，以28S的表达量作为内参照；(10)杂交探针
a、探针标记
采用Kle加w Fragment体系，7核苷酸随机引物标记同位素 [oc-32P]dATP。 DNA模板为PCR得到的PEG10基因全长。
模板DNA (25ng): 5^1
7核苷酸随机引物(lnM4il): 2jil
ddH20: 7^1 95。C孵育3min,立即置于冰上5min。 随后，在反应体系中依次加入下述试剂
10 X Klenow Fragment Buffer: 2 5 |ul
dGTP、 dTTP、 dCTP (0.2mMeach): 2》1
10 ^Ci [a-32P]dATP (比活性〉3000Ci/mM): 5^1
Klenow Fragment (2U/5|_d): 5 pi 37°C反应3h， 65°C 5min终止反应。 b、 Sephadex制备及柱层析
在100ml小齒杯中将lg Sephadex G-50缓慢加入15ml ddH20，ddH20 洗漆溶涨的凝胶数次以去除可溶的葡聚糖。取约2cm高Sephadex G-50 至专用离心柱，1100g离心2min，弃掉液体及Ep套管。换上干净Ep套 管，将标记好的探针加入离心后的Sephadex G-50， 1100g离心5min，将 过柱后的标记探针一2(TC保存备用。
(11) 杂交液PerfectHybTM Hybridizaition Solution,在68。C杂交炉中预杂交 lh，加入探针杂交过夜；
(12) 杂交过夜的尼龙膜，2XSSC0.1%SDS 5min、 15min洗膜各两次；
(13) 沥干后用保鲜膜包裹，压磷屏5h;
(14) Phosphorimager扫描磷屏。 D. Western blot分析
细胞提取物用SDS loading buffer [2 x SDS loading buffer (4% SDS， 1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl， pH 7.4)]和1 mM DTT进行配制。蛋白用12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离，并转印至PVDF膜上。然后用5%脱脂乳T-TBS (0.1%Tween-20，lOOmM Tris-HCl， 0.9%NaC l)封闭膜，并与兔抗PEG10多抗一起孵育。然后加 入过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (Rockland),用SuperSignal West Pico试剂盒 (Pierce)检测系统进行检测。GAPDH为内参照。
E. 流式细胞术
将细胞接种在6孔板(5 x io5个细胞/孔)中进行转染(如B. siRNAs和转染所 述)。转染24小时后，直接在DMEM培养基中加入5-氟尿嘧啶诱导凋亡。72小时 后，胰蛋白酶消化收集细胞，PBS洗两次。将细胞固定，PI染色，上机分析。步 骤为
1. 细胞的收集
(1) 收集6孔细胞培养板内的培养基，细胞用胰酶消化，然后用收集的培 养基悬起消化好的细胞，2000rpm， 5min.每样本细胞数应达到1X106/
孑L;
(2) 弃掉培养基，用预冷的无菌PBS洗涤，4'C2000rpm离心5min。
2. 细胞的处理
(1) 弃掉PBS，用中科院上海细胞所流式细胞仪室自行配制的预冷柠檬酸 缓冲液(citrate buffer) 4。C固定细胞10min;
(2) 加入PI(propidiumiodide)染液4。C避光孵育30min;
(3) 4'C1000rpm离心5min弃去染液；
(4) 加入FITC-conjugated Annexin V染液，4。C避光孵育30min。
3. 流式细胞仪分析
流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC 荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
F. 实时定量RT-PCR分析
用TRIZOL试剂(Invitrogen)和RQ1 DNase (RNase free) (Promega)提取样本 的总RNA。 DNase在65°C热灭活10 min。 RNA用oligo (dT)M和逆转录酶 (Promega)进行逆转录，进行逆转录时先在42'C 孵育60min，然后加热至95°C 5min, 0-5°C 孵育5 min。 95°C 5 min将会灭活AMV逆转录酶，防止它与 cDNA结合。实时定量PCR采用SYBR Green I荧光标记，并用ABI PRISM 7700 系统检测。每一个PCR循环中产生的荧光信号为实时定量PCR提供信息。特异性引物的序列如下(SEQIDNo:6) AR正义5'-AAGGCTATGAATGTCAGCCCA-3'， AR反义5'-CATTGAGGCTAGAGAGCAAGGC-3，； PEG10基因正义5'-ATGATGACATCGAGCTCCG隱3，； PEG10基因反义5，-GCTGGGTAGTTGTGCATCA-3，;. hTERT正义5，-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'; hTERT反义5'-GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3 ，； GAPDH正义5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3，； GAPDH反义5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3，；反应体系为:
SYBR Green (20X ):0，
cDNA:2^1
10 X Ex Taq Buffer ( Mg2+Free):2jxl
MgCl2 (25mM):0、1
dNTPmix (2.5mM):1.6nl
Forward primer (25pM):
Reverse primer (25)_iM):
Ex Taq (5u/]il):0.5)il
ddH20:IO単
GAPDH为内参照。PCR的过程为94 °C 2 min， 94°C 45秒42个循环， 每个循环中60°C 45秒，72°C 90秒。
在正常的肝细胞和不同的肝癌细胞中AR的表达有明显差异。申请人检测 了在正常的肝细胞NML和不同的肝癌细胞HepG2、HuH7及BEL细胞中AR 在mRNA及蛋白水平的表达。同时抽取不同组细胞的RNA，用SYBR Green 染料进行real-time RT-PCR检测，图1A显示的是real-time RT-PCR的实验结 果。可见在正常肝细胞中AR表达量极低，HuH7细胞AR表达量中等(/Kft05)， 而BEL细胞高表达AR 。相对于其它肝癌细胞株，HepG2细胞中
AR表达量较低，接近于正常肝细胞水平。为了证实以上的结果，对正常的肝 细胞和不同的肝癌细胞中AR的表达进行了 Northern blot和Western blot的检 测，实验结果与real-time RT-PCR中所观察到的结果一致，详见图1B。G. 细胞生长测定
细胞常规培养，即:用含10%胎牛血清、0.04X谷氨酰胺的RPMI-1640培养 液于37。C、 5XC02培养，通过血球计数器观察细胞生长情况。软琼脂生长测定 法细胞增殖后，将其接种在直径35-mm的平皿中，用含3%琼脂的完全培养基 进行培养，孵育5天后计数(m2)。为了检测雄激素DHT对细胞生长的影响，细 胞(2 x 104)接种在无雄激素的12孔板中[在阻断实验中加入拮抗剂FLU (1 ^M) 或VPA(IOO pM)]， 24小时后，换用DHT培养基培养48小时，48小时后，将 BEL-7404、 HuH7、 HepG2和人胚肾细胞株HEK293T再用低DHT的DMEM培 养基培养，5天后测细胞总数。
H. AR转染
为了分析HCC中AR的作用，瞬时转染不同浓度的含质粒的AR进行实验。 将人AR的表达质粒pSVhAR(Invitrogen)克隆到CMV早期启动子下游的 pCDNA3.0 (Invitrogen)上。转染细胞用于进一步的研究。
首先将针对AR的siRNAAR导入BEL细胞下调AR的表达，可见转染 48h后高剂量的siRNAAR (2吗/ml)能完全抑制BEL细胞中AR在mRNA及 蛋白水平的表达(i 〈ftOW) ， real-time RT-PCR、 Northern blot和Western blot 的检测结果一致。而较低剂量的siRNAAR (0.02吗/ml)不能抑制AR的表达， 对照用negative siRNA即使以2吗/ml的剂量转染对AR的表达也无任何抑制 作用，见图2A,2C。其中vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control 表示导入对照negative siRNA (2 (ag/ml)， siRNAARl和siRNAARh分别表示 导入低剂量的siRNAAR,艮卩siRNAARl— (0.02吗/ml)和高剂量的siRNAAR, 即si認AARh (2(ig/ml)。
结果提示siRNAAR对AR表达的下调作用不仅是剂量依赖性，还是序列 特异性的。同时观察到高剂量的siRNAAR在下调AR表达的同时还有效降低 了PEG10基因的表达(; 〈ft仍)，见图2B,2D。提示AR的表达与PEG10基 因有着密切的联系。
雄激素DHT能引起AR表达量较高的BEL肝癌细胞的生长加速和对凋亡 的抵抗作用，高剂量的siRNAAR能选择性的阻断雄激素的这种促生长作用， 但较低剂量的siRNAAR和对照用negative siRNA则无此作用，见图3A,3B。图3A中(■)、 (□)、 (*)和(〇)分别表示在雄激素DHT存在的条件下， 分别导入空载体vector的空白对照，对照negative siRNA(2 pg/ml)、 siRNAARI (0.02昭/ml)和siRNAARh (2吗/ml)后，BEL细胞的生长情况。可以观察 到，在雄激素DHT存在的条件下，细胞导入高剂量的siRNAAR后生长明显 减慢，细胞数目减少(/KO.OW)，对给予较低剂量的siRNAAR细胞稍有影响， 而对导入空载体vector和negative siRNA的对照组BEL细胞生长影响不大。 图3B中，BEL细胞分别给予以下处理空白对照、仅导入空载体vector的空 白对照，导入对照negative siRNA (2 ng/ml)、 siRNAARI (0.02 pg/ml)和 siRNAARh (2 ng/ml)。 ( )表示空白对照的细胞给予雄激素DHT的处理。 可以观察到，雄激素DHT能有效的抵抗5 —氟尿嘧啶诱导的细胞凋亡，凋亡 细胞数目明显减少。但当导入高剂量的siRNAAR有效抑制AR的表达后，BEL 细胞中凋亡细胞数目明显增多。给予较低剂量的siRNAAR细胞中凋亡细胞数 目稍有增多，而对导入空载体vector和negative siRNA的对照组BEL细胞凋 亡影响不大。
在图可见4 (A， B, C， D， E， F) si咖APEG10基因导入BEL细胞下 调PEG10基因的表达，转染48h后高剂量的siRNAPEG10基因(2吗/ml ) 能有效的抑制肝癌细胞的生长，增加凋亡细胞数目。雄激素DHT能引起AR 表达量较高的BEL肝癌细胞的生长加速和对凋亡的抵抗作用，高剂量的 siRNAPEG10基因也能选择性的阻断雄激素的这种促生长作用，但较低剂量的 siRNAPEG10基因和对照用negative siRNA则无此作用。在图4A, 4B, 4C中， vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control表示导入)(寸照negative siRNA (2 pg/ml)， siRNAPEG10基因1和siRNAPEG10基因h分别表示导入 低剂量的siRNAPEG10基因(0.02吗/ml)和高剂量的siRNAPEG10基因(2 吗/ml)。导入高剂量的siRNAPEG10基因后BEL肝癌细胞生长明显减慢 (p<0.05),加入雄激素DHT后细胞生长明显增加，但导入高剂量 siRNAPEG10基因的细胞生长仍然缓慢(;Kft0W)，而对给予较低剂量的 siRNAPEG10基因细胞、导入空载体vector和negative siRNA的对照组BEL 细胞生长影响不大。
图4D， 4E， 4F中，BEL细胞分别给予以下处理仅导入空载体vector的空白对照，导入对照negative siRNA (2jag/ml)、 siRNAPEG10基因1 (0.02 吗/ml)和siRNAPEG10基因h (2吗/ml)。可以观察到高剂量的siRNAPEG0 基因能使肝癌细胞凋亡细胞数目增加。雄激素DHT能有效的抵抗5 —氟尿嘧 啶诱导的细胞凋亡，凋亡细胞数目明显减少，但导入高剂量的siRNAPEG10 基因有效抑制PEG10基因的表达后，BEL细胞中凋亡细胞数目仍多。给予较 低剂量的siRNAPEG10基因细胞、导入空载体vector和negative siRNA的对 照组BEL细胞凋亡数目无明显影响。
另夕卜，在高表达AR和PEG10基因的HuH7细胞中也观察到了相似的结 果。由此，可以认为雄激素DHT通过调节PEG10基因的表达影响肝癌细胞生 长和凋亡。
为进一步确认雄激素DHT抑制细胞凋亡作用的具体分子机制，申请人检测 了肝癌细胞中端粒酶基因hTERT的表达水平。从图5A,5C中可看出，在雄激素 DHT存在的条件下，BEL细胞中hTERT的表达水平明显升高。但在经过 siRNAPEG10基因下调PEG10基因表达的BEL细胞中，雄激素的DHT存在对 于hTERT的表达水平无明显影响(图5B,5D)。 AR抑制剂FLU能完全抑制DHT 引起的hTERT表达的变化。单独加入FLU对正常的肝细胞和肝癌细胞中PEG10 基因的表达无影响。另夕卜，在高表达AR和PEG10基因的HuH7细胞中也观察 到了相似的结果。
在共转染了 AR和PEG10基因(各600ng)的人胚肾HEK293T细胞中，同 样观察到在雄激素DHT存在的条件下，细胞中hTERT的表达水平明显升高， 见图6A,6B。
结果提示雄激素DHT与其受体结合后，可通过增加PEG10基因的表达明显 上调hTERT的表达，从而促进肝癌细胞生长，抑制肝癌细胞凋亡的发生。这些 结果也部分的解释了PEGIO基因在促进肝癌形成中的可能作用机制。
根据以上的实验研究结果，遗传印记基因10 (PEG10基因)的双链小干扰 RNA(siRNA)作为制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1将表达反义RNA的基因以合适的载体导入到病变部位,使其在病变的原 位生成反义RNA，并发挥抗mRNA的作用,这就是反义技术的基因治疗策略。通过这种方法可避开反义分子难以大量纯化、制备的难题。
2 PEG10基因的表达不但具有比AFP更高的肝癌组织特异性,而且具有相对 器官组织特异性,这也是用PEG10基因的双链小千扰RNA(siRNA)抑制肝癌细胞
预防和治疗肝癌的一大优点。
图1为正常的肝细胞和不同的肝癌细胞中AR的表达
其中A是real-time RT-PCR的实验结果。与正常肝细胞(NML)中AR表 达量相比，*表示； <6 .05; **表示； <0.00/。
B中上图为Northern blot检测结果，下图为Western blot检测结果。28S及 Actin分别作为Northern blot检测和Western Wot检测的内参照。
图2 siRNAAR对BEL肝癌细胞AR和PEG10基因的表达的影响
图2显示siRNAAR转染48h后BEL细胞中AR(图2A)及PEG10基因(图 2B)的表达情况。图2A， 2B为real-timeRT-PCR的结果，图2C， 2D中从上至 下依次Northern blot和Western blot的检测结果，其中28S及Actin分别作为 Northern blot检测和We纟tern blot检测的内参照。vector表示的是导入空载体vector 的空白对照，control表示导入对照negative siRNA (2 (xg/ml)， siRNAARl和 siRNAARh分别表示导入低剂量的siRNAAR(0.02 (ag/ml)和高剂量的siRNAAR (2 jig/ml)。与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞的AR及PEG10基 因的表达量相比，*表示/ <0.05;**表示"<6 .卯/。
图3雄激素DHT与siRNAAR对BEL肝癌细胞生长和凋亡的影响
其中A为显示siRNAAR转染48h后在雄激素DHT存在的条件下，BEL 肝癌细胞生长变化情况图，在雄激素DHT存在的条件下，翻一导入空载体vector 的空白对照，□ 一对照negative siRNA (2吗/ml) 、 一 siRNAARl (0.02 pg/ml)、 〇一siRNAARh (2pg/ml)后，BEL细胞的生长情况。；
B为显示siRNAAR转染48h后在雄激素DHT存在的条件下，BEL肝癌细 胞凋亡变化情况图，令表示空白对照的细胞给予雄激素DHT的处理。Un-treated 表示的是未经处理的BEL肝癌细胞，vector表示的是导入空载体vector的空白 对照，control表示导入对照negative siRNA (2 pg/ml)， siRNAARl和siRNAARh分别表示导入低剂量的siRNAAR (0.02 (ig/ml)和高剂量的siRNAAR (2 jag/ml)。 与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞的数目相比，**表示p《.0W。； 图4雄激素DHT与siRNAPEGlO基因对BEL肝癌细胞生长和凋亡的影响 其中A为在DHT不存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细 胞的生长变化情况图；B为在DHT存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL 肝癌细胞的生长变化情况图；C为在FLU/DHT都存在条件下siRNAPEGlO基因 转染48h后BEL肝癌细胞的生长变化情况图；D为在DHT不存在条件下 siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的凋亡变化情况图；E为在DHT存 在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的凋亡变化情况图；F为 在FLU/DHT都存在条件下siRNAPEGlO基因转染48h后BEL肝癌细胞的凋亡 变化情况图；vector表示的是导入空载体vector的空白对照，control表示导入对 照negative siRNA (2 (ig/ml)， siRNAPEGlO基因1和siRNAPEGlO基因h分别 表示导入低剂量的siRNAPEGlO基因(0.02 |ag/ml)和高剂量的siRNAPEGlO基 因(2吗/ml)。与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞PEG10基因的表 达量相比，与导入空载体vector空白对照的BEL肝癌细胞的生长数目和凋亡细 胞数目相比，*表示/ <0.05;**表示； <0力^。
图5雄激素DHT与BEL细胞中端粒酶基因hTERT的表达水平 其中A为用real-time RT-PCR检测正常的BEL肝癌细胞中DHT与hTERT 表达的变化；B为用real-time RT-PCR检测经过siRNAPEGlO基因下调PEG10基 因表达的BEL细胞中DHT与hTERT表达的变化;C为用Northern blot的检测正常 的BEL肝癌细胞中DHT与hTERT表达的变化；D为用Northern blot的检测经过 siRNAPEGlO基因下调PEG10基因表达的BEL细胞中DHT与hTERT表达的变 化。
显示在DHT+、 DHT或FLUVDHr、 FLU/DHT+不同条件下BEL肝癌细胞 中端粒酶基因hTERT表达的变化。上图为real-time RT-PCR的检测结果，下图 为Northern blot的检测结果，其中28S作为Northern blot检测的内参照。 BELPEG10基因+表示正常的BEL肝癌细胞，BELPEG10基因'表示经过 siRNAPEGlO基因下调PEG10基因表达的BEL细胞。与FLU/DHT—情况下，细 胞中hTERT基因表达量相比，*表示； <0.05;**表示/Kft0W。图6雄激素DHT与HEK293T细胞中端粒酶基因hTERT的表达水平 图中显示在DHT+、 DHT—或FLU+/DHr、 FLU/DHT+不同条件下共转染了 AR和PEG10基因的HEK293T细胞中端粒酶基因hTERT表达的变化。其中A 为real-time RT-PCR的检测结果，B为Northern blot的检测结果，其中28S作为 Northern blot检测的内参照。与FLU/DHT情况下，细胞中hTERT基因表达量相 比，*表示； <0.05;**表示；K0.(9W。
具体实施例方式
实施例1 (PEG10基因)的双链小干扰RNA(siRNA)对于小鼠肝癌动物模型 肝癌形成的抑制和作为制备治疗或预防肝癌的药物中的应用
:图为AR的促效剂，拮抗剂，siRNAAR，和siRNAPEG10基因对
肝癌形成的影响。
裸鼠肝癌形成为了检测雄激素一雄激素受体复合物和/或siRNAs的体内作 用，申请者从Jackson实验室(Bar Harbor, ME)购得裸鼠(CBy. Cg-Foxnlnu)，将人 肝癌细胞株(HepG2和BEL细胞)分别注射入裸鼠左侧大腿的皮下(每只鼠5 x 106细胞，6只一组)。注射40天后处死裸鼠取出肿瘤，测量肿瘤的直径和体积(见 表l)。
表1 AR的促效剂、拮抗剂，siRNAAR和siRNAPEG10基因对肝癌形成的影响
HepG2" BELa
PEG10基 Original6 PEG10基
因-c 因-c
DeWeDWDWDWDWDW
None 10.y 1.27 13.7 2.2 7.5** 0.7" 13.6 2.1 12.6 1.7 8.6** 0.8 DHTrf 11.0 1.4 16.2* 3.7* 7.8" 0.8** 18.8* 5.9* 12.8 1.8 9.8" 1.0 FLUrf -g -10.0 1.6 - -12.2 1.9 - -8.8** 0.9
AR+
Treat-men " . . ，a t Original腳+ 87* 07*
DHTrf 9.5* 0.9* 7.9" 0.8*
VPA+ 7 Q*0 6*
DHTrf 陽 _ _ _10.4* 1.4* _ _9.5** 1.1*
fl: HepG2和BEL-7404 (BEL)人肝癌细胞注射裸鼠形成肝癌模型.6:细胞未经基因转染或siRNAs基因敲除处理.c:细胞经基因转染或siRNAs基因敲除处理后.细胞经AR促效剂DHT和或拮抗剂FLU ,VPN处理.e: D,肿瘤直径(xmm); W,肿瘤重量(x g)./ 数据用平均数±标准差表示.为了表格的简洁，标准差未标明.-，未测.* p < 0.001， n = 6， AR促效剂，拮抗剂组与未处理组比较；**p<0.001,n = 6, siRNAs基因敲除组与versus未处理细胞组比较.
用HepG2和BEL细胞处理过的裸鼠所形成的肿瘤，其平均直径和体积与未经处理组相比有显著差别。雄激素DHT处理能有效的增加肿瘤的大小，特别是注射了 AR高表达的BEL细胞的小鼠。导入AR基因的HepG2细胞在经过雄激素DHT处理后，肿瘤生长明显加速。在转染siRNAPEG10基因的HepG2和BEL细胞中，肿瘤生长明显减慢，即使给予雄激素DHT处理，肿瘤生长也不明显。雄激素受体抑制剂FLU或VPA都能有效减慢裸鼠肿瘤的生长。结果提示在体内实验中，雄激素DHT也能通过增加PEG10基因的表达影响，肿瘤的形成和生长。本动物模型模拟了肝癌的形成和肝癌细胞的生长过程，证明在PEG10基因在肝癌的形成发展中具有重要作用，而PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)显著抑制了肝癌的形成和肝癌体积的大小。
综上所述，研究者认为PEGIO基因在肝癌的发生发展中发挥着重要的作用。本研究的初步实验结果提示，雄激素DHT与其受体AR结合后，在AR表达量较高的肝癌细胞中通过增加PEG10基因的表达，显著促进了肝癌细胞的生长并可诱导其抗凋亡作用；对于低表达AR的肝癌细胞，将AR基因转染后对PEGIO基因的表达量无明显影响，其在雄激素DHT的作用下能出现的生长加速和凋亡细胞数目减少的作用，可能是通过活化PEG10基因，从而上调hTERT的表达，导致肝癌细胞生长加速及对凋亡的抵抗作用。通过干扰RNA的方法用PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)处理肝癌细胞,能抑制肝癌细胞的生长,促进肝癌细胞地凋亡。SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120> PEG10基因的双链小干扰RNA在制备治疗或预防肝癌药物中的应用
<130> PEGIO基因的双链小干扰RNA序列和雄激素受体AR的双链小干扰RNA序列
<160> 8
< 170> Patentln version 3.1
<210><211><212><213><400>
1
21
DNA
Homo sapiens1
gagcaccagg gauuucucat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
ugagaaaucc cuggugcuct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
gucgcugucu gcucugauut t 21
<210> 4
<211> 21<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aaucagagca gacagcgact t
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cuuc肌ugau cacgaauaut t
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
auauucguga ucaaugaagt t
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
gggaaacaga aguaccugut t
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens<400> 8
acagguacuu cuguuuccct t 2权利要求
1、一种RNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示。
全文摘要
本发明公开了一种PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)在制备治疗或预防肝癌药物中的应用，该研究表明在肝癌细胞中雄激素可上调遗传印记基因10(PEG10基因)的表达水平，而雄激素诱导的PEG10基因的高表达能上调人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)的表达，因此其可能通过抑制凋亡来参与肝癌的形成。这些发现证明PEG10基因在肝癌细胞抵抗凋亡的过程中发挥着重要作用，用PEG10基因的双链小干扰RNA(siRNA)可以诱导肝癌细胞凋亡，预防肝癌的形成，有效减慢肿瘤的生长速度，缩小癌组织的体积，表明该siRNA可以作为治疗或预防肝癌的药物制品。
文档编号A61P35/00GK101684467SQ20091020333
公开日2010年3月31日 申请日期2006年9月29日 优先权日2006年9月29日
发明者张秋萍, 洁 熊, 谭锦泉 申请人:武汉大学