专利名称：：藻蓝蛋白用于防治糖尿病的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及藻蓝蛋白在制备预防与治疗糖尿病药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病是由遗传和环境因素相互作用，导致机体胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，分为I型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)和II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病)。I型糖尿病患者体内胰岛细胞受损，导致胰岛素分泌量绝对不足；11型糖尿病患者胰岛素分泌水平正常或稍低，甚至升高，但靶组织对胰岛素敏感性不足，导致胰岛素分泌量相对不足，主要表现为能量代谢紊乱和对胰岛素的敏感性下降。糖尿病可导致感染、心脏病变、脑血管病变、肾功能衰竭、双目失明等而成为致死致残的主要原因。如何预防和治疗糖尿病是当今医学界面临的重大课题。因此，寻找有效的抗糖尿病药物有着积极的意义。藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)主要存在于蓝藻(Cya,hyta)、红藻(Rhodophyta)、隐藻(Cryptophyta)和少数甲藻(Pyrrophyta)中，是这些藻类进行光合作用的捕光色素之一。分离纯化的藻蓝蛋白在溶液中呈亮蓝色，并发出紫色荧光，在波长620nm具有特异吸收峰，可以A620/A280表示其纯度。藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，同时也具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。藻蓝蛋白的药理活性非常广泛，具有抗癌、抗氧化、治疗脑缺血损伤等多种生物活性，但目前尚未见有预防与治疗糖尿病方面的研究工作报道及临床应用。
发明内容本发明公开了藻蓝蛋白的一种新用途，即在制备预防与治疗糖尿病药物中的用途，所述的糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。本发明通过体外实验证实，藻蓝蛋白对四氧嘧啶(alloxan,ALX)损伤的大鼠胰岛瘤细胞株RIN-m5F有明显的修复作用；体外实验还证实藻蓝蛋白能显著促进胰岛素抵抗H印G2细胞模型的葡萄糖消耗，改善糖代谢。本发明通过体内药效学实验证明，藻蓝蛋白有显著的降血糖效果。化学诱导剂四氧嘧啶(alloxan,ALX)可损伤动物的胰脏或胰岛P细胞导致胰岛素缺乏，从而引起实验性糖尿病。四氧嘧啶诱导的糖尿病模型与人类的I型糖尿病类似，在药物研究中常被作为I型糖尿病模型。在四氧嘧啶诱导的小鼠糖尿病模型中，剂量100mg/kg、200mg/kg的藻蓝蛋白能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖和糖化血清蛋白。遗传性II型糖尿病KKay小鼠的糖尿病特征与人类II型糖尿病非常相似，是一种遗传因素和环境因素相互作用的多因素疾病模型。在遗传性II型糖尿病KKay小鼠模型中，单次口服藻蓝蛋白(100mg/kg)观察24h血糖动态变化(即测定0h，4h，8h，12h和24h的随机血糖)，结果表明，给药后8h血糖显著3降低；连续口服藻蓝蛋白(100mg/kg)—周，藻蓝蛋白组随机血糖在0h，4h，8h，12h和24h与模型组相比均显著降低。口服藻蓝蛋白(100mg/kg)l周和2周，测定空腹血糖，2周后测定糖化血清蛋白，与模型组相比，藻蓝蛋白组的空腹血糖和糖化血清蛋白均显著降低。本发明的藻蓝蛋白可以来源于蓝藻(Cyanophyta)、红藻(Rhodophyta)或隐藻(Cryptophyta)，优选蓝藻(如螺旋藻等)的新鲜藻体或干藻粉。藻蓝蛋白制备方法如下藻体悬浮于50mmol/L磷酸盐缓冲中，反复冻融，4。C离心(10000gX10min)，上清加入固体硫酸铵至50X饱和度，4t:静置过夜，离心(10000gX10min)，收集沉淀，溶解于少量磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.0)中，并在此缓冲液中充分透析，透析液过滤，上样于上述磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-S印haroseFF柱，用含0-lmol/LNaCl梯度的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集蓝色洗脱液，收集的洗脱液透析后，上样于上述同样缓冲液平衡的羟基磷灰石柱，10-300mmol/L梯度的磷酸盐缓冲液(pH7.0)梯度洗脱，收集A62。/A28。大于4的蓝色洗脱液，透析后浓縮或冻干即为藻蓝蛋白。以下将通过具体的实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。具体实施方式实施例1藻蓝蛋白对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛瘤细胞株RIN-m5F的修复作用以大鼠胰岛瘤细胞株RIN-m5F为靶细胞，MTT法测细胞存活率。取对数生长期的RIN-m5F细胞，0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)消化后，用含10%新生牛血清的RPMI1640制备成细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100iU，培养12小时细胞贴壁后，各试验孔加入四氧嘧啶使终浓度为5mmol/L，lh后给药组分别加入不同浓度藻蓝蛋白200yg/ml，100yg/ml，50iig/ml，25iig/ml，12.5iig/ml，6.25iig/ml，培养48h，加入5%MTT10ii1/孔，置37°C，5%C02培养箱继续培养4h，弃上清，加入DMSO100y1/孔，振荡器振荡10min，酶联免疫检测仪上测其在570nm处的吸光值A。结果表明，浓度大于12.5iig/ml的藻蓝蛋白均能显著提高细胞的存活率(表1)，说明藻蓝蛋白对四氧嘧啶损伤的大鼠胰岛瘤细胞株RIN-m5F有显著的修复作用。表1藻蓝蛋白对四氧嘧啶损伤的RIN-m5F细胞存活率的影响(又土SD,n=8)4组别剂量(ug/ral)A570存活率(％)正常对照组0.543±0.04*100模型组0.340±0.0363藻蓝蛋白组6.250.391±0.037212.50.424士0.02*78250.444士0.0"82500.481士0.02*881000.523±0.02*962000.550±0.04*101与模型组比较广P<0.01藻蓝蛋白对胰岛素抵抗H印G2细胞模型的葡萄糖消耗量的影响以人肝癌细胞株H印G2为靶细胞，采用高胰岛素诱发H印G2细胞建立胰岛素抵抗模型。取对数生长期的H印G2细胞，0.25%胰蛋白酶(0.02%EDTA)消化后，用含10%新生牛血清的RPMI1640制备成细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔100iU，细胞分为四组未经胰岛素诱导的正常对照组；经胰岛素诱导的模型组；1X10—5mol/L的吡咯列酮阳性组；不同浓度藻蓝蛋白的药物组。培养12小时细胞贴壁后，除正常对照组外，其余各组均加入终浓度为5X10—7mol/L的胰岛素，诱导16h后去上清，PBS洗细胞，并用新鲜培养基孵育20min。然后吡咯列酮阳性组和不同浓度藻蓝蛋白的药物组加入相应药物继续培养24h，用葡萄糖测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定培养基葡萄糖残余量。结果表明，5-80iig/ml藻蓝蛋白均能显著促进胰岛素抵抗H印G2细胞模型的葡萄糖消耗(表2)。表2藻蓝蛋白对胰岛素抵抗H印G2细胞模型的葡萄糖消耗量的影响(又土SD，n=8)组别剂量葡萄糖消耗量(删ol/L)正常对照组5.62±0.30*模型7.45±0.12藻蓝蛋白组(ug/ml)6.60±0.31*106.54±0.14*206.06±0.22*405.89±0.30*806.56±0.51*吡咯列酮(mol/L)lxl(T55,59±0.54*与模型组比较，*P<0.01藻蓝蛋白对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的预防作用40只体重为24±2g的清洁级ICR小鼠(购自扬州大学)随机分为4组正常对照组，糖尿病模型组、藻蓝蛋白低剂量组和藻蓝蛋白高剂量组，每组10只。正常对照组和糖尿病模型组以生理盐水灌胃，藻蓝蛋白低、高剂量组分别以100mg/kg，200mg/kg的剂量灌胃。2周后除正常对照组外，其余各组均腹腔注射四氧嘧啶(150mg/kg)。再继续给药4周，正常对照组和糖尿病模型组以等体积生理盐水灌胃。于腹腔注射四氧嘧啶前一天，后l周、2周、3周和4周分别用葡萄糖测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定血糖含量，结果见表3。试验结束后用糖化血清蛋白测试盒(购自南京建成生物工程研究所)测糖化血清蛋白，结果见表4。试验结果说明，从四氧嘧啶损伤前2周先预防给药，损伤后再继续给药可使小鼠空腹血糖明显降低。另外，糖化血清蛋白测定可反映过去12周平均血糖水平，其测定不受当时血糖浓度的影响，糖化血清蛋白处于较高水平时，说明存在着持续性高血糖。藻蓝蛋白预防组的小鼠糖化血清蛋白与模型组相比显著降低。因此，藻蓝蛋白对I型糖尿病有显著的预防作用。表3藻蓝蛋白对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖(mmol/L)的影响(预防)(又土SD，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01表4藻蓝蛋白(PC)对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠糖化血清蛋白(GSP)的影响(预防)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>又士SD，n二8.与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01藻蓝蛋白对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的治疗作用选取体重为24±2g的清洁级ICR小鼠(购自扬州大学)，禁食16h后，腹腔注射四氧嘧啶(150mg/kg，现配现用)，72h后(禁食10h)眼眶取血，用葡萄糖测定试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定血糖。选取空腹血糖值>11.lmmol/L并出现多饮、多尿的小鼠为糖尿病模型小鼠。选取造模成功的糖尿病小鼠48只，按血糖值随机分为4组，每组12只，分别为模型组(给生理盐水)、阳性组(给格列苯脲5mg/kg)、藻蓝蛋白治疗组藻蓝蛋白低剂量组(100mg/kg)和藻蓝蛋白高剂量组(200mg/kg)。同期另取12只正常小鼠作为正常对照组，试验给药周期为3周，每天1次，灌胃给药。糖尿病模型组以生理盐水灌胃，藻蓝蛋白低、高剂量组分别以100mg/kg，200mg/kg的剂量灌胃。于给药1周、2周和3周分别测定空腹血糖，给药3周用糖化血清蛋白测试盒(购自南京建成生物工程研究所)测糖化血清蛋白。结果见表5和表6。试验结果说明，口服藻蓝蛋白l周以后，四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖明显降低。另外，糖化血清蛋白测定可反映过去12周平均血糖水平，其测定不受当时血糖浓度的影响，糖化血清蛋白处于较高水平时，说明存在着持续性高血糖。口服藻蓝蛋白3周，糖尿病小鼠糖化血清蛋白也显著降低。因此，藻蓝蛋白对I型糖尿病有明显的治疗作用。表5藻蓝蛋白(PC)对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠空腹血糖(mmol/L)的影响(治疗)组别剂量(mg/kg)0周1周2周3周正常组5.49士0.71"5.58±0.47**5.54±0.49**5.42士0.70"模型组16.49±4.4916.54±4.216.93±5.0715.67土楊PC组10016.03±4.3111.21±5.44*11.29士6.0*8.63土4.44*20016.%±5.5910息5，10.19±5.51*8.23±5.06*阳性组515綠3.6911.38土4.94*11,61±5.57*11.11士7.35*疗)x士SD，r^l2.与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01表6藻蓝蛋白(PC)对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠糖化血清蛋白(GSP)的影响(治组别正常组模型组100mg/kgPC200mg/kgPC阳性组GSP2.02±0.12*2.57±0.112.20±0.11*2.08±0.12*2.20±0.14*又土SD，:1=8.与模型组比较，*P<0.05藻蓝蛋白对II型遗传型糖尿病KKay小鼠的治疗作用12周龄的II型遗传型糖尿病KKay小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)于动物房预养3天，便携式血糖仪检测血糖(尾尖取血)，选取血糖值>11.lmmol/L，并出现多饮、多食的KKay小鼠，按血糖值范围随机分为2组，即模型组(灌胃生理盐水)和治疗给药组(灌胃100mg/kgPC)，每组8只。单次给药，于给药前、给药后4h、8h、12h、24h尾尖取血，测定随机血糖值。继续给药l周，再次观察24h血糖的动态变化。口服藻蓝蛋白(100mg/kg)l周和2周，分别测定空腹血糖。给药2周后用糖化血清蛋白测试盒(购自南京建成生物工程研究所)测定糖化血清蛋白。试验结果见表7-10。试验结果表明，单次口服藻蓝蛋白具有降血糖作用，给药后4h和8h血糖下降，以给药后8h降血糖作用最为明显(表7)。连续给药l周可使KKay小鼠一天24h内随机血糖明显下降(表8)，说明连续给药可使一天24小时内随机血糖维持在较低的稳定水平。给药l周和2周测定的空腹血糖，与模型组相比均显著降低(表9)。给药2周后测定的藻蓝蛋白组小鼠的糖化血清蛋白与模型组相比显著降低(表IO)。因此，藻蓝蛋白对II型糖尿病有明显的治疗作用。表7单次给药(藻蓝蛋白)后24hKKay小鼠随机血糖(mmol/L)的变化(又士SD,n=8)组别Oh4h8h12h24h模型组藻蓝蛋白组17.05±4.3717.30±4.0718.13±2.0619.73士4.8518.70士3.716.83±4.3815.93±2.513.60±1.28*19.45±2.5517.05±1.81与模型组比较，*P<0.01表8连续给药(藻蓝蛋白)1周对KKay小鼠24h血糖动态变化的影响(又士SD,n=8)组别Oh4h8h12h24h模型组藻蓝蛋白组20.33±3.2619.37±2.4918.87±2.9326.8±2.9119±3.3812.30±2.01*11.45土2.65'10.25±0.61*'13.85±6.05'10.4±0.95*与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01表9藻蓝蛋白对KKay小鼠的降血糖作用(又士SD,n=8)组别0周1周2周模型组16.13±4.3718.46±3.2619.63±1.39藻蓝蛋白组15.89±4.3811.03±2.01'9.93士1.64'与模型组比较，*P<0.01表10藻蓝蛋白对KKay小鼠糖化血清蛋白(GSP)的影响(又士SD,n=8)组别模型组100mg/kgPCGSP5.93±0.214.67±0.32*与模型组比较，*P<0.01。权利要求藻蓝蛋白用于制备预防与治疗糖尿病药物的用途。2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述的糖尿病是I型糖尿病和II型糖尿病。全文摘要本发明涉及藻蓝蛋白(phycocyanin)的一种医药新用途，即预防与治疗糖尿病的用途。文档编号A61P3/00GK101716332SQ20091021254公开日2010年6月2日申请日期2009年11月12日优先权日2009年11月12日发明者林琳,欧瑜申请人:中国药科大学